Зачетное задание по блоку 1 II семестра. Белок NadB_Ecoli. И.Поверенная, студентка 1 курса Рекомендуемое название белка, данного мне на изучение, - L-аспартат оксидаза (L-aspartate oxidase). Также используются краткое название LASPO и альтернативное название хинолинат синтетаза B (Quinolinate synthetase B). Третичная структура белка NadB_Ecoli. Изображение экспортировано из RasMol. Общая информация. L-аспартат оксидаза - фермент, катализирующий окисление L-аспартата в иминоаспартат при синтезе пиридина. Вследствие его каталитической активности происходит реакция: L-аспартат + H2O + O2 = оксалоацетат + NH3 + H2O2. У фермента есть кофактор - ФАД (флавинадениндинуклеотид); белок участвует в его биосинтезе. Также L-аспартат оксидаза принимает участие в таких процессах как: биосинтез NAD+ и получение иминоаспартата из L-аспартата . NadB_Ecoli принадлежит к семейству ФАД-зависимая оксидоредуктаза 2, подсемейству Nadb. Белок находится в цитоплазме клетки бактерии Escherichia coli (штамм K12), список таксонов которой приведен далее: Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Escherichia. Состав и структура белка. Аминокислотная последовательность белка в fasta-формате: >NADB_ECOLI Quinolinate synthase, L-aspartate oxidase (B protein) subunit MNTLPEHSCDVLIIGSGAAGLSLALRLADQHQVIVLSKGPVTEGSTFYAQGGIAAVFDET DSIDSHVEDTLIAGAGICDRHAVEFVASNARSCVQWLIDQGVLFDTHIQPNGEESYHLTR EGGHSHRRILHAADATGREVETTLVSKALNHPNIRVLERSNAVDLIVSDKIGLPGTRRVV GAWVWNRNKETVETCHAKAVVLATGGASKVYQYTTNPDISSGDGIAMAWRAGCRVANLEF NQFHPTALYHPQARNFLLTEALRGEGAYLKRPDGTRFMPDFDERGELAPRDIVARAIDHE MKRLGADCMFLDISHKPADFIRQHFPMIYEKLLGLGIDLTQEPVPIVPAAHYTCGGVMVD DHGRTDVEGLYAIGEVSYTGLHGANRMASNSLLECLVYGWSAAEDITRRMPYAHDISTLP PWDESRVENPDERVVIQHNWHELRLFMWDYVGIVRTTKRLERALRRITMLQQEIDEYYAH FRVSNNLLELRNLVQVAELIVRCAMMRKESRGLHFTLDYPELLTHSGPSILSPGNHYINR Ссылка на последовательность на моем сайте: http://kodomo.cmm.msu.ru/~ipoverennaya/nadb_ecoli.fasta Либо на сайте UniProt: http://www.uniprot.org/uniprot/P10902.fasta В белке всего одна цепь A, состоящая из 540 аминокислотных остатков. Ее молекулярная масса равна 60337 а.е.м. Белок относится к типу альфа+бета: в нем 20 альфа-спиралей (на картинке показаны малиновым цветом), 38 бета-тяжей (желтым цветом) и 55 бета-поворотов (синим цветом). Таблица их месторасположения в цепи (основана на информации с документа P10902.txt из банка UniProt - http://www.uniprot.org/uniprot/P10902.txt): Элемент начало конец Элемент начало конец Фрагмент цепи, неполярно взаимодействующий с ФАД активный центр 12 26 альфа-спираль 217 219 альфа-спираль 223 230 244 244 бета-тяж 241 248 активный центр 263 263 альфа-спираль 260 264 конфликтный участок 160 160 бета-тяж 268 270 конфликтный участок 485 485 альфа-спираль 278 280 бета-тяж 6 8 альфа-спираль 285 287 бета-тяж 10 14 альфа-спираль 290 304 альфа-спираль 18 27 бета-тяж 309 312 бета-поворот 28 30 альфа-спираль 319 324 бета-тяж 33 36 альфа-спираль 326 333 альфа-спираль 60 73 бета-поворот 334 336 бета-поворот 74 76 бета-поворот 339 341 альфа-спираль 80 99 бета-тяж 344 354 альфа-спираль 145 150 бета-тяж 356 358 бета-тяж 154 157 бета-тяж 366 368 бета-тяж 159 167 бета-тяж 370 372 альфа-спираль 168 170 альфа-спираль 374 376 бета-тяж 178 186 бета-тяж 380 382 бета-поворот 187 190 альфа-спираль 390 409 бета-тяж 191 196 альфа-спираль 430 450 бета-тяж 198 202 бета-тяж 451 455 альфа-спираль 208 210 альфа-спираль 457 478 бета-тяж 211 215 альфа-спираль 485 506 Как ясно из таблицы, в белке 2 активных центра (244 и 263 аминокислотные остатки). Потенциально неполярное взаимодействие с флавинадениндинуклеотидом происходит на участке цепи 12-26. Также в белке есть 2 конфликтных участка: 160, где серин может быть замененным на треонин, и 485 - аспарагин на аспарагиновую кислоту соответственно. Белок содержит следующие низкомолекулярные вещества: ID Название Формула Число копий Комментарии NA Sodium ion Na1+ 1 ион натрия FAD Flavin-adenine dinucleotide C27H33N9O15P2 1 флавинадениндинуклеотид SIN succunic acid C4H6O4 1 янтарная кислота HOH water H2 O 20 вода Немного истории: Белок был исследован с помощью рентгеновского излучения. Впервые документ P10902.txt из банка UniProt, содержащий информацию о моем белке был создан 1.07.1989. С тех пор это описание претерпело некоторые изменения (историю изменений можно увидеть здесь: http://www.uniprot.org/uniprot/P10902?version=*), и на данный момент существует 99 версия документа (от 3.03.2009). Источники информации: 1.RSBM Protein Data Bank – a resource for studying biological macromolecules. : http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1KNP http://www.rcsb.org/pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=1KNP (здесь есть очень интересное отображение расположения вторичных элементов последовательности, на мой взгляд, оно лучше чем в SRS или UniProt) 2. UniProt - The Universal Protein Resource http://www.uniprot.org/uniprot/P10902 3. EBI – Европейский институт биоинформатики. http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz?-id+3uOgV1ZRPkj+e+[SWISSPROT:%27NADB_ECOLI%27]+-qnum+1+-enum+17 В UniProt о данном белке было найдено 8 статей: [1] "Molecular biology of pyridine nucleotide biosynthesis in Escherichia coli. Cloning and characterization of quinolinate synthesis genes nadA and nadB." Flachmann R., Kunz N., Seifert J., Guetlich M., Wientjes F.-J., Laeufer A., Gassen H.G. Eur. J. Biochem. 175:221-228(1988) [PubMed: 2841129] [Abstract] Cited for: NUCLEOTIDE SEQUENCE [GENOMIC DNA], PROTEIN SEQUENCE OF 1-19. [2] Kunz N. Submitted (APR-1989) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases Cited for: SEQUENCE REVISION. [3] "Non-ribosomal proteins affecting the assembly of ribosomes in Escherichia coli." Nashimoto H. (In) Nierhaus K.H. (eds.); The translational apparatus, pp.185-195, Plenum Press, New York (1993) Cited for: NUCLEOTIDE SEQUENCE [GENOMIC DNA]. Strain: K12. [4] Nashimoto H., Saito N. Submitted (SEP-1995) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases Cited for: NUCLEOTIDE SEQUENCE [GENOMIC DNA]. Strain: K12. [5] "The complete genome sequence of Escherichia coli K-12." Blattner F.R., Plunkett G. III, Bloch C.A., Perna N.T., Burland V., Riley M., Collado-Vides J., Glasner J.D., Rode C.K., Mayhew G.F., Gregor J., Davis N.W., Kirkpatrick H.A., Goeden M.A., Rose D.J., Mau B., Shao Y. Science 277:1453-1474(1997) [PubMed: 9278503] [Abstract] Cited for: NUCLEOTIDE SEQUENCE [LARGE SCALE GENOMIC DNA]. Strain: K12 / MG1655 / ATCC 47076. [6] "Highly accurate genome sequences of Escherichia coli K-12 strains MG1655 and W3110." Hayashi K., Morooka N., Yamamoto Y., Fujita K., Isono K., Choi S., Ohtsubo E., Baba T., Wanner B.L., Mori H., Horiuchi T. Mol. Syst. Biol. 2:E1-E5(2006) [PubMed: 16738553] [Abstract] Cited for: NUCLEOTIDE SEQUENCE [LARGE SCALE GENOMIC DNA]. Strain: K12 / W3110 / ATCC 27325 / DSM 5911. [7] "Expression of the E. coli nadB gene and characterization of the gene product L-aspartate oxidase." Seifert J., Kunz N., Flachmann R., Laeufer A., Jany K.-D., Gassen H.G. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 371:239-248(1990) [PubMed: 2187483] [Abstract] Cited for: CHARACTERIZATION, PARTIAL PROTEIN SEQUENCE. [8] "Structure of L-aspartate oxidase: implications for the succinate dehydrogenase/fumarate reductase oxidoreductase family." Mattevi A., Tedeschi G., Bacchella L., Coda A., Negri A., Ronchi S. Structure 7:745-756(1999) [PubMed: 10425677] [Abstract] Cited for: X-RAY CRYSTALLOGRAPHY (2.2 ANGSTROMS). Аннотацию первой статьи из данного списка смотрите в приложении 1. В PubMed было найдено 29 статей связанных с белком NadB_Ecoli. Их список можно посмотреть, пройдя по ссылке: http://kodomo.cmm.msu.ru/~ipoverennaya/nadbpubned.txt Приложение 1. Копия аннотации статьи. Molecular biology of pyridine nucleotide biosynthesis in Escherichia coli. Cloning and characterization of quinolinate synthesis genes nadA and nadB. Flachmann R., Kunz N., Seifert J., Guetlich M., Wientjes F.-J., Laeufer A., Gassen H.G. The two genes, nadA and nadB, responsible for quinolinate biosynthesis from aspartate and dihydroxyacetone phosphate in Escherichia coli were cloned and characterized. Quinolinate (pyridine2,3-dicarboxylate) is the biosynthetic precursor of the pyridine ring of NAD. Gene nadA was identified by complementation in three different nadA mutant strains. Sequence analysis provided an 840-bp open reading frame coding for a 31,555-Da protein. Gene nadB was identified by complementation in a nadB mutant strain and by the L-aspartate oxidase activity of its gene product. Sequence analysis showed a 1620-bp open reading frame coding for a 60,306-Da protein. For both genes, promoter regions and ribosomal binding sites were assigned by comparison to consensus sequences. The nadB gene product, L-aspartate oxidase, was purified to homogeneity and the N-terminal sequence of 19 amino acids was determined. The enzyme was shown to be specific for L-aspartate. High-copy-number vectors, carrying either gene nadA, nadB or nadA + nadB, increased quinolinate production 1.5-fold, 2.0-fold and 15-fold respectively. Both gene products seem to be equally rate-limiting in quinolinate synthesis.