Выявление уровня кальпротектина в

Проект
Клинические рекомендации
ВЫЯВЛЕНИЕ УРОВНЯ КАЛЬПРОТЕКТИНА В
КОПРОФИЛЬТРАТАХ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ
ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИРОВАНИЯ
ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ С
ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ КИШЕЧНИКА
Москва 2015
2
Содержание
Стр.
Разработчики……………………………………………………………………..
3
1. Введение……………………………………………………………………….
4
2. Методология…………………………………………………………………..
5
3. Описание медицинской разработки.………………………………………..
8
3.1 Общая схема метода……………………………………………………….
8
3.2 Процедура исследования…………………………………………………..
8
3.3 Результаты научно-исследовательской работы………………………
9
3.4 Сведения о патентовании………………………………………………
11
3.5 Степень готовности медицинской технологии к внедрению……….
11
3.6 Область применения медицинской технологии…………………….
11
3.7 Реализация в практике………………………………………………..
11
4. Заключение……………………………………………………………………
11
Список литературы………………………………………………………………..
13
3
Разработчики: д.м.н., профессор Исаков В.А., д.м.н., проф. Т.Б. Сенцова, к.м.н. Морозов
С.В., к.м.н. Шаховская А.К., к.м.н. И.В. Ворожко, к.м.н. В.И. Соломатина, О.О. Черняк,
Н.Э. Фукс, В.И.Соломатина
Организация-разработчик: Федеральное государственное бюджетное научное
учреждение «Научно-исследовательский институт питания»
4
1. Введение
На данный момент проблема изучения хронических воспалительных заболеваний
кишечника
остается
распространением,
весьма
высоким
актуальной.
и
постоянно
Это
обусловлено
растущим
повсеместным
уровнем
их
заболеваемости,
малоизученным этиопатогенезом, сложными прогнозом, диагностикой, что, в свою очередь,
неразрывно
связано
с
точностью
выбора
тактики
лечения.
Распространенность
воспалительных заболеваний кишечника повсеместно растет и, по данным разных авторов,
составляет от 9 до 48 % от общего количества больных, обращающихся к врачу с жалобами
кишечного характера (1,2,3). К хроническим воспалительным заболеваниям кишечника
(ХВЗК) относят болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК). ХВЗК
характеризуются наличием воспалительно-деструктивных изменений в кишечнике и
рецидивирующим
течением.
БК
развивается
сегментарно,
во
всех
отделах
пищеварительного канала и поражает все слои стенки кишечника. НЯК, как правило,
начинается с прямой кишки и оттуда распространяется на все отделы толстой кишки,
поражая в основном его слизистую оболочку. Распространенность НЯК составляет 70—150
на 100 тыс. населения в странах Западной Европы. Ежегодно регистрируется 6—15 новых
случаев заболевания на 100 тыс. населения (4). Количество больных БК в мире несколько
меньше, 50—70 случаев на 100 тыс. населения, но ситуация прогрессивно ухудшается, и за
послед нее десятилетие их количество выросло в несколько раз (5,6). Этиология и патогенез
ХВЗК по-прежнему являются причинами многочисленных дискуссий ученых всего мира. И
на данный момент наиболее объективной является иммунологическая концепция, согласно
которой патогенетический каскад воспаления начинается с внедрения в кишечник антигена,
которым могут являться как пищевые компоненты, так и инфекционные агенты. У
пациентов с ХВЗК первичной является стимуляция IgG продуцирующих иммунных клеток,
в свою очередь IgG антитела запускают вторичные факторы воспаления, что приводит к
деструкции кишечной стенки. В дополнение к этому нарушается баланс между
воспалительными и противовоспалительными цитокинами. Дисрегуляция иммунных
реакций служит причиной избыточной активации воспалительных цитокинов. Также
высказывалось мнение, что среди патогенетических механизмов НЯК и БК существенную
роль играет нарушение серотонинового, гепаринового и гистаминового обменов в
слизистой оболочке кишки (7,8,9). Диагностика ХВЗК базируется на повсеместно принятых
5
стандартах: физикальные методы обследования, лабораторные исследования (ОАК, С
реактивный белок, печеночные и почечные пробы, копрограмма, бактериологический посев
кала на микрофлору кишечника), эндоскопическое исследование с морфологическим
исследованием биоптатов, УЗИ органов брюшной полости, ирригография. Также
разработано несколько индексов оценки активности воспаления, таких как предложенный
Best индекс активности (10, 11, 12, 13).
Кальпротектин представляет собой кальций и цинк связанный белок, определяемый во всех
клетках, тканях и жидкостях организма. Он содержит одну легкую и две тяжелые
полипептидные цепочки, с общей молекулярной массой 36,5 кДа (14). Основная его
концентрация сосредоточена в нейтрофилах и составляет приблизительно 60 % от общего
количества цитоплазматических белков (15). В меньшем количестве он также обнаружен в
моноцитах и активированных макрофагах. Методом гибридной технологии получены
высокоспецифичные моноклональные антитела к кальпротектину человека. Данные
моноклональных антител использованы для иммуноцитохимического выявления белка.
Установлена стадия дифференцировки клеток миелоидного ряда, на которой начинается
экспрессия
кальпротектина.
Так,
исследование
клеток
крови
больных
острым
промиелоцитарным лейкозом показало, что в цитоплазме промиелоцитов данного белка нет.
Кальпротектин
экспрессируется
в
миелоцитах,
метамиелоцитах,
палочко
и
сегментоядерных нейтрофилах, что было установлено при исследовании периферической
крови
доноров
и
гематологических
больных
(16).
Кальпротектин
обладает
иммуномодуляторным, антипролиферативным, бактериостатическим и фунгицидным
эффектами,
сопоставимыми
антибиотиков.
Недавние
с
минимальными
исследования
ингибирующими
показали,
что
его
концентрациями
ингибирующий
антибактериальный эффект связан с наличием цинка в его молекуле.
Основной задачей предлагаемой технологии является разработка метода выявления
кальпротектина в копрофильтратах, позволяющая с большой точностью осуществить
дифференциальную диагностику воспалительных заболеваний кишечника.
2. Методология
Методы, использованные для сбора/селекции доказательств:

поиск в электронных базах данных.
Методы, использованные для оценки качества и силы доказательств:
6

оценка значимости в соответствии с уровнями доказательности и классами рекомендаций
(табл.1, 2).
Таблица 1. Уровни доказательности
Уровень
1
2
3
4
Источник доказательств
Проспективные рандомизированные контролируемые исследования.
Достаточное количество исследований с достаточной мощностью, с участием
большого количества пациентов и получением большого количества данных.
Крупные мета-анализы.
Как минимум одно хорошо организованное рандомизированное контролируемое
исследование.
Репрезентативная выборка пациентов
Проспективные с рандомизацией или без исследования с ограниченным количеством
данных.
Несколько исследований с небольшим количеством пациентов.
Хорошо организованное проспективное исследование когорты.
Мета-анализы ограничены, но проведены на хорошем уровне.
Результаты непрезентативны в отношении целевой популяции.
Хорошо организованные исследования «случай-контроль»
Нерандомизированные контролируемые исследования.
Исследования с недостаточным контролем.
Рандомизированные клинические исследования с как минимум 1 значительной или
как минимум 3 незначительными методологическими ошибками.
Ретроспективные или наблюдательные исследования.
Серия клинических наблюдений.
Противоречивые данные, не позволяющие сформировать окончательную
рекомендацию
Мнение эксперта/данные из отчета экспертной комиссии, экспериментально
подтвержденные и теоретически обоснованные
Таблица 2. Уровни рекомендаций.
Уровень
A
B
Описание
Рекомендация основана на высоком уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 1 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
Рекомендация основана на среднем уровне
доказательности (как минимум 1 убедительная
публикация 2 уровня доказательности,
показывающая значительное превосходство
пользы над риском)
Расшифровка
Метод/терапия первой линии;
либо в сочетании со
стандартной
методикой/терапией
Метод/терапия второй линии;
либо при отказе,
противопоказании, или
неэффективности стандартной
методики/терапии.
7
Рекомендуется
мониторирование побочных
явлений
C
Рекомендация основана на слабом уровне
доказательности (но как минимум 1
убедительная публикация 3 уровня
доказательности, показывающая значительное
превосходство пользы над риском) или
нет убедительных данных ни о пользе, ни о
риске)
D
Отсутствие убедительных публикаций 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающих
значительное превосходство пользы над риском,
либо убедительные публикации 1, 2 или 3
уровня доказательности, показывающие
значительное превосходство риска над пользой
Нет возражений против
данного метода/терапии
или нет возражений против
продолжения данного
метода/терапии.
Рекомендовано при отказе,
противопоказании или
неэффективности стандартной
методики/терапии, при
условии отсутствия побочных
эффектов
Рекомендация основана на
мнении экспертов, нуждается
в проведении исследований
Методы, использованные для анализа доказательств:

Обзоры опубликованных мета-анализов;

Систематические обзоры с таблицами доказательств.
Описание методов, использованных для анализа доказательств:
Были использованы: Costa F., Mumolo M.G., Ceccarelli L. et al. Calprotectin is a stronger
predictive marker of relapse in ulcerative colitis than in Crohn’s disease // Gut.— 2005.— N 54.—
P. 364—368.; Kronborg O., Ugstad M., Fuglerud P. et al. Faecal calprotectin levels in a high risk
population for colorectal neoplasia // Gut.— 2000.— N 46 (6).— P. 795—800.; Белоусова Е.А.
Иммунные механизмы при воспалительных заболеваниях кишечника и методы селективной
иммунокоррекции // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол.— 1999.— Т. 9, № 4,
прил. 7.— С. 48—57.
Основные рекомендации:
 Сила рекомендаций (A-D) приводятся при изложении текста технологии.
8
3. Описание медцинской разработки
Разработана
диагностическая
технология
для
дифференциальной
диагностики
воспалительных заболеваний кишечника.
Выявление
уровня
кальпротектина
в
копрофильтратах
осуществляется
иммуноферментным методом.
Преимущества метода:
1.
Метод
имеет
высокую
диагностическую
ценность,
низкая
концентрация
кальпротектина в кале означает отсутствие органического заболевания кишечника.
Чувствительность для БК до 100%, специфичность 90%. Для СРК чувствительность 85%,
специфичность 71% (уровень В).
2. Высокая стабильность кальпротектина в кале – в течение нескольких дней.
3. Неинвазивность метода.
3.1.Общая схема метода
После
процедуры
экстракции,
производится
количественное
опредление
кальпротектина с помощью твердофазного иммуноферментного метода с использованием
микропланшета. Антитела к гетеро- и полимерным комплексам кальпротектина нанесены
на лунки микропланшета. Калибраторы, контроли и экстракты инкубируются при
комнатной температуре. После процедуры отмывки фосфатным буферным раствором
добавляется коньюгат меченных пероксидазой хрена антител к кальпротектину. После
промывания фосфатным буфером и добавления тетраметилбензидина происходит развитие
окраски, которая пропорциональна количеству связанного кальпротектина. Абсорбция
учитывается на вертикальном спектрофотометре при длине волны 450 нм после добаления
0,25 М серной кислоты.
Разведение копрофильтратов осуществляется с помощью буферного раствора в 2500
раз.
Уровни свыше 200мкг/г являются индикаторами активного воспалительного процесса.
3.2 Процедура исследования:
В зависимости от количества определяемых образцов подготовить соответствующее
количество реагентов, которые перед проведением анализа должны быть тщательно
9
перемешаны и доведены до комнатной температуры.
Необходимо приготовить разведение образца кала в 2500 раз (50 мг фекалий в 2.5 мл
буфера).
Затем внести во все лунки по 0,010 мл
образцов, стандартов и контролей.
Внесение образцов не должно занимать более 15 мин.
Инкубировать стрипы при
температуре 25С в течение 1 часа со встряхиванием. По
окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки пять
раза. При каждой промывке во все лунки добавить по 0,3 мл промывочного буфера,
встряхнуть рамку на шейкере в течение 5-10 сек с последующим декантированием. При
каждом декантировании тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием
рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.
Внести во все лунки по 0,010 мл раствора коньюгата. Инкубировать стрипы при
температуре 25С в течение 60 мин. со встряхиванием. По окончании инкубации лунки
промыть. За 5 минут до окончания инкубации приготовить необходимое количество
субстратной смеси. Реакцию остановить добавлением 0,010 мл 0,25 М серной кислоты через
15 мин. Учет проводить на вертикальном спектрофотометре при длине волны 450 нм.
В
качестве
маркера
интестинального
воспаления
позволяющего
неинвазивно
дифференцировать синдром раздраженного кишечника и воспалительные заболевания
кишечника предложен кальпротектин (уровень В). Выявление кальпротектина в
копрофильтратах дает возможность получить первые результаты без радиологического
и/или эндоскопического исследования поскольку уровень фекального кальпротетина
коррелирует с гистологической и эндоскопической оценкой активности болезни Крона и
язвенного колита.
3.3 Результаты научно-исследовательской работы:
Средние концентрации кальпротектина в образцах стула у больных с НЯК и БК составили
151,1±14,5 мкг/г и 193,4±22,06 мкг/г соответственно, что существенно отличалось от их
референтных значений (p<0,001). Высокий уровень кальпротектина отмечался у 71%
больных НЯК и у 75% пациентов с БК. При этом значимых различий концентраций
кальпротектина у больных с НЯК и БК не отмечено.
При повышении клинической активности заболевания, как у больных НЯК, так и у
пациентов с БК отмечалось значимое увеличение содержания кальпротектина в образцах
10
стула, при этом его концентрации у этих больных были существенно повышены по
сравнению с уровнем у пациентов в период ремиссии НЯК и БК (табл. 1).
Таблица 1.
Изменения содержания кальпротектина при различной активности у больных НЯК и
БК (M±m)
Клиническая
активность
ВЗК
Ремиссия
Низкая активность
Умеренная
активность
Высокая активность
Контроль
n
23
12
7
Концентрации кальпротектина, мкг/г
НЯК
n
БК
94,43±13,23*
3
36,83±8,88
193,14±24,02*
5
253,17±26,85*
208,6±34,42*
11
12
33,27±6,64
226,2±23,55*
Примечание: *- уровни значимости различий показателей по сравнению с контролем
(p<0,05)
Нами установлена также умеренная корреляция между показателями содержания
кальпротектина и клинической активности заболевания при НЯК и БК (rs=0,72, p<0,0001 и
rs=0,63, p<0,01 соответственно).
Вместе с тем, у больных НЯК в период клинической ремиссии содержание кальпротектина
в образцах стула было в 2,8 раза (p<0,05) большим, чем у детей референтной группы, что
свидетельствует о сохраняющейся активности воспалительного процесса, несмотря на
отсутствие клинических симптомов.
У больных с БК в период ремиссии концентрации кальпротектина достигали референтных
значений и значимо отличались от аналогичных показателей в период обострения (p<0,05).
Вероятно, это связано с тем, что все больные с клинической ремиссией БК имели и
эндоскопическую ремиссию заболевания. В группе больных с ремиссией НЯК только 4
(17%) пациента имели эндоскопическую ремиссию.
11
3.4 Сведения о патентовании: нет
3.5 Степень готовности разработки к внедрению: научно-исследовательская разработка
может быть внедрена в практику лечебно-профилактических учреждений, центров
здоровья, диетологических кабинетов лечебно-профилактических учреждений в Российской
Федерации в виде методических указаний по выявлению уровня кальпротектина в
копрофильтратах.
3.6 Область применения разработки:
- здравоохранение: внутренние болезни, диетология, гастроэнтерология, терапия, обучение
студентов высших медицинских учебных заведений, курсантов сертификационных и
тематических циклов усовершенствования и специализации врачей по диетологии,
нутрициологии, аллергологии.
3.7 Где реализовано в практике: клиника ФГБНУ «НИИ питания», кафедра диетологии
ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава
России, кафедра диетологии и нутрициологии ГБОУ ВПО «Российский национальный
исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России.
4. Заключение.
Описанный способ диагностики опробован при обследовании и лечении 268 пациентов с
воспалительными заболеваниями кишечника в возрасте от 18 до 62 лет ( 158 мужчин и 110
женщин), что позволило разработать индивидуальные ротационные диеты для каждого
больного и рекомендации по проведению диетотерапии у этого контингента пациентов.
Исследование проводилось на базе лаборатории клинической биохимии, иммунологии и
аллергологии и отделения гастроэнтерологии и гепатологии ФГБУ «НИИ питания» с
использованием спектрофотометра «Sunrise» Tecan (Австрия), биохимического анализатора
Konelab 60i (Финляндия).
12
На основе предложенного способа выявления уровня кальпротектина в копрофильтратах
осуществлялась персонализация диетотерапии пациентов, что позволило сократить сроки
госпитализации и редукцию клинической симптоматики.
13
Список литературы
1. Адлер Г. Болезнь Крона и язвенный колит / Пер. с нем.—М.: Гэотар-Мед, 2001.— 528 с.
2. Дзяк Г.В., Залевский В.И., Степанов Ю.М. Функціональні захворювання кишечнику.—
Дніпропетровськ: ПП «Ліра ЛТД», 2004.— 200 с.
3. Best W.R., Becktel J.M., Singleton J.W. et al. Development of a Crohn’s disease activity index.
National Cooperative Crohn’s Disease Study // Gastroenterol.— 1976.— N 70.— P. 439—444.
4. Степанов Ю.М., Щербинина М.Б., Кононов И.М. Сучасні методи дослідження в
гастроентерології: Метод пособ.—Днепропетровск, 2006.— 155 с.
5. Златкина А.Р. Синдром раздраженного кишечника // Рос.журн. гастроэнтерол., гепатол.,
колопроктол.— 2000.—Т. 10, № 1.— С. 13—17.
6. Drossman D.A. The functional gastrointestinal disorders and the Rome III process //
Gastroenterol.— 2006.— Vol. 130.— P. 1377—1390.
7. Белоусова Е.А. Иммунные механизмы при воспалительных заболеваниях кишечника и
методы
селективной
иммунокоррекции
//
Рос.
журн.
гастроэнтерол.,
гепатол.,
колопроктол.— 1999.— Т. 9, № 4, прил. 7.— С. 48—57.
8. Grill B.B., Hillemeier A.C., Gryboski J.D. Fecal a1antitrypsin clearance in patients with
inflammatory bowel disease // J. Pediatr. Gastroenterol Nutr.— 1984.— N 3.— P. 56—61.
9. Kronborg O., Ugstad M., Fuglerud P. et al. Faecal calprotectin levels in a high risk population
for colorectal neoplasia // Gut.— 2000.— N 46 (6).— P. 795—800.
10. Григорьева Г. Функциональный запор и синдром раздраженного кишечника:
дифференциальная диагностика и лечение // Врач.— 2006.— № 2.— С. 3—6
11. Крилова О.О. Зміни біохімічних показників при хворобі Крона і неспецифічному
виразковому коліті // Клін. хір.—2003.— № 11.— С. 153—155.
12. Roseth A.G., Aadland E., Fagerhol M.K. et al. Assessment of neutrophil dominating protein
calprotectin in feces // Scand. J. Gastroenterol.— 1992.— N 27.— P. 793—798.
13. Scholmerich J. Future developments in diagnosis and treatment of iflammatory bowel disease
// HepatoGastro enerology.— 2000.— Vol. 47, N 31.— P. 101—114.
14. Costa F., Mumolo M.G., Ceccarelli L. et al. Calprotectin is a stronger predictive marker of
relapse in ulcerative colitis than in Crohn’s disease // Gut.— 2005.— N 54.— P. 364—368.
15. 42. Van Hees P.A.M., Van Elteren P.H., Van Lier H.J.J. et al. An index of inflammatory
activity in patients with Crohn’s disease // Gut.— 1980.— N 21.— P. 279—286.
14
16. Saverymuttu S.H. Clinical remission in Crohn’s disease assessment using fecal Indium
111!Granulocyte excretion // Digestion.— 1986.— N 33.— P. 74—79.