Индукция фоллистатина при помощи оксида азота через цГМФ сигнальный... контролирует слияние миобластов.

Индукция фоллистатина при помощи оксида азота через цГМФ сигнальный путь, который
контролирует слияние миобластов.
Скелетная мышечная ткань состоит из многоядерных волокон, которые возникают в
определенные периоды эмбриогенеза от слияния миобластов (Buckingham соавт., 2003). В
частности, эмбриональных и фетальных миобластов, происходящих из различных популяций миобластов (Cusella-De Angelis и др., 1994;.. Relaix и др., 2005), приводят к появлению
первичных(примерно [E] 11-12 эмбрионального развития) и вторичных (около E15-16) волокон,
соответственно (Ontell и Kozeka, 1984). Впоследствии, мышечная масса подвергается
экстенсивному росту в пренатальный и послеродовой период, и этот рост поддерживают
специализированные клетки, клетки-сателлиты, расположенные в нише между плазмалеммой и
базальной пластинкой волокон (Таджбахш, 2003). На протяжении миогенеза баланс между
пролиферацией, дифференцировкой и слиянием необходим для правильного формирования
окончательных структур мышцы (Тацуми и др., 2002;.. Букингемского и др., 2003). Многие
положительные и отрицательные сигналы, ответственные за регулирование такого тонкого
баланса, действующие на эмбриональном/ пренатальном этапе и после родов. Они включают в
себя факторы транскрипции, такие как MyoD, Myf5, MRF4, и миогенин, а также внеклеточные
агонисты и антагонисты, такие как члены семейства инсулиноподобного фактора роста IGF и
TGF, FGF, фактора роста гепатоцитов, и костного морфогенетического белка (BMP) и его
антагонистов (Balemans и Ван Хул, 2002;. Parker и др., 2003). Оксид азота (NO) регулирует
основные функции взрослых скелетных мышц, такие, как деятельность нервно-мышечного
синапса, связь возбуждение-сокращение, расширение кровеносных сосудов, глюкозы, функции
митохондрий и биогенез, гликолиз (Wang и др. ., 1995; Balon и Надлер, 1997; Клементи и
Meldolesi, 1997; Wolosker и др., 1997;. Bredt, 1998; Stamler и Мейснер, 2001; Eu и др., 2003;. Nisoli
и др., 2004). О возможности того, что NO играет важную роль в скелетном миогенезе можно
судить по наблюдениям, что он участвует в активации спутниковых клеток (Anderson, 2000;.
Тацуми и др., 2002), а его синтез фермента NO-синтазы (СОС), которая регулирует развитие и
может привести к активации миогенной программе IGF-II (Lee и др., 1994;. Blottner и удачи, 1998;
El Dwairi и др., 1998;.. Калиман и др., 1999). Точная роль NO в миогенезе и сигнальных путях,
однако, не известно. В настоящей работе мы исследовали эти аспекты, как в пробирке и в
естественных условиях, на разных этапах миогенеза. Наши результаты показывают, что NO
непосредственно стимулирует слияние миобластов до регулирования фоллистатином. Мы также
обнаружили, что действие NO ограничено определенным временным окном и опосредовано через
жесткую регуляцию активации гуанилатциклазы и генерации циклического гуанозинмонофосфата
(цГМФ) (Монкада и соавт., 1991). цГМФ сигнализация при лечении 8 Br-цГМФ приводит к
увеличению процессов слияния с образованием гипертрофических миотуб и мышечных волокон в
пробирке и в естественных условиях. В целом, наши результаты свидетельствуют о ключевой
роли NO / цГМФ в регуляции слияния миобластов во время мышечного развития.
Результаты
Экзогенная и эндогенная NO увеличивает спутниковую активацию в пробирке в определенном
временном окне. Для изучения влияния NO на дифференциацию и слияние миобластов,
спутниковые клетки, выделенные у новорожденных мышей и нанесенные низкой плотностью на
пластины (6 × 103 клеток/см2), поддерживали в течение 48 ч в питательной среде, а затем
перенесли в среду дифференциации в присутствии или отсутствии повышенной концентрации
донора NO (Z) -1 - [2 - (2-аминоэтил)-N-(2-ammonioethyl) амино] diazen-1-ий-1 ,2-diolate] (DETANO), , который высвобождает NO постоянно и в определенных концентрациях (Клементи и соавт.,
1998), или Nω-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME), который является ингибитором
широкого спектра NOS (Монкада и соавт., 1991). Индекс слияния измеряют через 24, 48 или 72
часов. Как показано на рис. 1 A, DETA-NO увеличилась, в то время как L-NAME снизилась,
индекс слияния измерялся способами в зависимости от концентрации. Эти эффекты были
конкретными, поскольку соответствующий амин, DETA, не дают значительного эффекта и
действия L-NAME ингибируется 5 мМ L-аргинином (неопубликованные данные). Стимуляция
DETA-NO и ингибирование L-NAME были четко обнаружены через 24 ч и увеличили
дифференциацию, которая становится статистически значимой после 48 и 72 ч инкубирования
культуры (рис. 1, B и C). Через 72 часа почти нет событий слияния среди миозинэкспрессирующих клеток-сателлитов в присутствии 5 мМ L-NAME (Рис. 1 C). Тот факт, что
последствия DETA-NO и L-NAME влияния на слияние присутствовали уже после 24 ч лечения,
предполагает, что эти события имели место на ранней стадии дифференциации. Для установления
временного окна, 5 мМ L-NAME и 50 мкМ DETA-NO (уступая концентрации 120 ± 5 нм, N = 5,
измеренная с NO электродом;. Клементи и др., 1998) были добавлены к дифференцирующимся
клеткам сателлиттам в различные моменты времени. Индекс слияния оценивали после 72 часов.
Как показано на рис. 1 D, как DETA-NO и L-NAME были максимально эффективны в укреплении
и предотвращения слияния, соответственно, при добавлении в начале процесса дифференцировки.
Соединения были все менее эффективными при добавлении в более поздние моменты времени и
почти полностью неэффективными, когда добавлялись после 16 часов. Последовательно мы
обнаружили, что процесс дифференциации сопровождается ранним повышением активности NOS,
пик которого пришелся на 8 часов, а потом снижалсь, вернувшись в базальным уровням после 48 ч
(рис. 1 E). Мы обнаружили, что клетки-сателлиты экспрессируют эндотелиальную (NOS III) и
мышечную (NOS Iμ) вариантов нейронных NOS. Уровни экспрессии NOS III и Iμ были
неизменными на протяжении процесса дифференцировки (рис. 1 F), указывая, что изменения в
активности NOS были последствиями активации и ингибированием активности фермента, а не
изменения в экспрессии белка. NOS II экспрессия не была обнаружена на протяжении всего
времени анализа (неопубликованные данные).
Спутниковые клетки культивировали в пробирке асинхронно, небольшая часть из них все еще
сохранялась, как недифференцированные клетки даже после нескольких дней в
дифференцирующей среде (Cossu и др., 1980;. Ontell и Kozeka, 1984). Увеличение слияния клетоксателлитов вызваное NO может быть связано с влиянием этого посланника на сам процесс или
вторичным по отношению к NO-зависимым недифференцированным
клеткам в стадии терминальной дифференцировки (Anderson, 2000). Это должно привести к
увеличению MyoD экспрессии и соответствующему снижению клеточной пролиферации. Чтобы
различать эти возможности, мы изучили влияние NO на эти процессы. Как показано на рис. 1 G,
воздействие на спутниковые клеточные культуры в течение 24 часов либо 5 мМ L-NAME или 50
мкм DETA-NO не изменило ни экспрессии MyoD маркером, ни ДНК-полимеразы δ кофактора
(PCNA), который экспрессируется в S фазе клеточного цикла. Мы не обнаружили ни
увеличения, ни распространения, измеренные путем подсчета числа ядер во всех клетках, или
числа ядер, присутствующих в миозин-позитивных клетках (неопубликованные данные). Это
исключает возможность того, что образование миотубы с увеличенным количеством ядер и с
увеличенным размером явилось следствием увеличения числа недифференцированных клеток в
стадии терминальной дифференцировки, предполагая, что не было никаких актов
непосредственно в качестве индуктора слияния миобластов. Процесс, при котором клетки
переходят в мышечные волокна, является следствием начального слияния между двумя
миобластами и последующим слиянием новых клеток (Заряд и Рудницкий, 2004). Как показано на
рис. 1 Н, 5 мМ L-NAME увеличило, в то время как 50 мкМ DETA-NO уменьшило долю
мононуклеарных клеток. Кроме того, DETA-NO увеличил образование двуядерных клеток и
многоядерных мышечных трубок, в то время как L-NAME сократило число миотуб. Результаты,
представленные на рис.1 показали, что активность NOS и генерация NO которые жестко
регулировались во время спутниковой дифференцировки клеток и не вызывали и не усиливали
слияние без влияния на другие события в программе дифференциации этих клеток. Тот факт, что
экзогенный NO не является эффективным, когда NOS блокирована, предпологает, что NO
сигнализация регулируется не только на уровне своего уровня NOS, но и ниже его.
Влияние NO на слияние спутниковых клеток зависит от цГМФ. Далее мы проанализировали
зависимость эффектов NO на активацию гуанилатциклазы и генерацию цГМФ(Монкада и соавт.,
1991). Как показано на рис. 2 A, дифференциации клеток-сателлитов в культуре сопровождается
генерацией цГМФ, происходящей в 4-24-ч, в соответствии с временным окном влияния NO (рис. 1
E). Большое значение придается способности DETA-NO увеличивать концентрацию циклических
нуклеотидов, что значительно выше при введении в течение первых 12 часов процесса
дифференцировки (рис. 2, сравнить время 72 ч со временем 0). Эти результаты позволяют
предположить, что в сателлитных клетках чувствительность гуанилатциклазы к NO регулируется
и ее активации происходит на начальных этапах дифференцировки. Поскольку уровни экспрессии
гуанилатциклазы подвидов α и β не меняется со временем (рис. 2 Б), кажется, что такое
регулирование происходит через каскад посттрансляционных событий
Для оценки роли цГМФ в области слияния спутниковых клеток мы изучали влияние клеточной
мембраны, 8 Br-цГМФ (0,3-5 мм) и ингибитора гуанилат циклазы 1Н-
(1,2,4) оксадиазоло [4,3-α] хиноксалин-1-он (ODQ, 3 мкм), которые были введены в временное
окно 4-24-ч, в котором эти клетки генерируют цГМФ. Слияние спутниковых клеток измеряли
после 72 часов. Как показано на рис. 2 (C-E), 8 BrcGMP и ODQ имитировали эффект DETA-NO и
L-NAME, соответственно. Эти результаты ясно показывают, что эффект NO на слияние
спутниковых клеток зависит от активации гуанилатциклазы и генерации цГМФ. Результат
изображен на рис. 1, свидетельствует об отсутствии сигнализации не только на уровне своего
поколения NOS, но и далее по ходу каскада реакций от нее. Результаты на рис. 2, показывающие
зависимость эффекта NO на цГМФ и зависящие от времени изменения в чувствительности
гуанилатциклазы, показывают, что основным в этом каскаде является цГМФ.
Стойкость цГМФ в дифференцировке спутниковых клеток и эмбриональном миогенезе приводит
к гипертрофии. Мы исследовали, является ли жестким регулирование NO / цГМФ сигнализации
при дифференциации , чтобы предотвратить разрастание нефизиологических миофибрилл. Мы
исследовали эту возможность, как в пробирке и в естественных условиях. Для имитации
нерегулируемой цГМФ сигнализации в клетках-сателлитах, дифференциация была выполнена в
постоянном присутствии 0.3-3 мм 8 Br-цГМФ. Кроме того, спутниковые клетки высевали при
высокой плотности (3 × 104 клеток/см2) для слияния. Через 48 ч дифференциации в этих условиях,
спутниковые клетки имели признаки гипертрофической миотубы (рис. 3). Индуцированная
гипертрофия зависит от концентрации, как это было с увеличением экспрессии миозина (рис. 3
C).Миотубы в 8-Br-цГМФ обработанных культурах считаются гипертрофированными, потому что
их среднее число ядер и измерения размера волокна (рис. 3 б) и общее количество миозина (рис.
3 C) были значительно выше по сравнению с контрольной группой. Такая гипертрофия и
увеличение миозина не наблюдалось в
спутниковых клетках, дифференцировавшихся в
присутствии 50-300 мкм DETA-нет, даже при более высоких концентрациях (рис. 3,-C, и не
изображены).
Дифференцировкиа спутниковых клеток происходит через сигнальные пути схожие, но не
идентичны тем, которые наблюдались во время эмбрионального развития скелетных мышц (Заряд
и Рудницкий, 2004). Поэтому мы оценили роль NO-цГМФ пути и его дерегулирования в
эмбриональном и фетальном миогенезе. Пресомитная мезодерма (PSM) или хвостовые сомиты (IIII) (MLC1/3F)-nLacZ 9,5-D эмбрионов трансгенных мышей, в которых ген LacZ находится под
контролем транскрипционных факторов MLC1/3F (Kelly и соавт., 1995), были выращены в
качестве эксплантов в культуру в присутствии или в отсутствии 50-300 мкм DETA-NO, 1-3 мм 8
Br-цГМФ, или 5 мм L-NAME. После введения всего лишь 2 г в культурах, дифференцированные
мононуклеарные миоциты полученны из PSM эксплантов, и отмечено увеличение числа клеток
после дополнительных 2 г (рис. 3, D и E). Ни 50-300 мкм DETA-NO, ни L-
NAME не давали соответствующего воздействия на время появления и количество миоцитов
после 4 дней испытания при любой концентрации (рис. 3, D и E, а также не показан), в отличие от
3 мм 8 Br-цГМФ, что вызвало формирование миотуб, события, которые не происходят в
физиологических PSM эксплантах культур (Cossu и Biressi, 2005), что свидетельствует об
ограничении слияния при помощи циклических нуклеотидов (рис. 3 D). Эффект от 8 Br-цГМФ
зависит от концентрации (рис. 3 E). Сходные результаты были получены в сомитах эксплантов
(неопубликованные данные).Для изучения миогенеза в конце развития эмбриона и плода,
MLC1/3F-nLacZ беременных мышей лечили с или без 8 Br-цГМФ (3 г / кг массы тела) на 10-й
день беременности либо 12,5 или 15,5. Затем миогенной клетки эмбрионов были выявлены путем
окрашивания LacZ. Как показано на рис. 3 F, 8 Br-цГМФ-обработанные эмбрионы показали
расширенное окрашивания LacZ, указывая на повышенный уровень миогенеза в обеих временных
точках. Эти результаты ясно показывают, что постоянное присутствие цГМФ увеличивается
размер и приводит к гипертрофии мышц и о том, что жесткое регулирование его концентрации
необходимо для нормального процесса.
NO / цГМФ сигнализация в миогенезе опосредовано регулирует экспрессию фоллистатина через
активацию транскрипции опосредовано NFAT / CREB / MyoD. Мы были заинтересованы в
выявлении молекулярных эффекторов NO / цГМФ сигнализации и оценке насколько молекулы ,
такие как IGF-I , интерлейкина-4 (ИЛ-4;. Хорсли и др., 2003), или follistatin (. Iezzi и др., 2004),
играют важную роль в мышечной гипертрофии. Таким образом, выполняется
полуколичественный ОТ-ПЦР на РНК, выделенной из дифференцированных клеток спутника,
PSM эксплантов, или мышц на
эмбриональном и фетальном этапах, которые были
культивированы с 3 мм 8 Br-цГМФ, 50 мкМ DETA-NO, или 5 мм L-NAME использованием
праймеров, специфичных для IGF-I, IL-4, фоллистатина, миостатина, и скелетных мышц MLC1/3F
(рис. 4). Параллельно мы исследовали экспрессию IGF-I, IL-4, фоллистатина, миостатина, и
тяжелой цепи миозина методом вестерн-блоттинга (рис. 4 B). Количественная оценка и
статистический анализ полученных результатов показан на рис. S1 (доступно на
http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200507083/DC1).
Хотя L-NAME не имел эффекта в любых условиях, мы наблюдали повышение уровня
транскриптов легких цепей миозина вах 8 Br-цГМФ-и DETA-NO-обработанных культур и
эмбрионах. В сателлитных клетках это сопровождалось заметным увеличением в экспрессии
фоллистатина. Важное значение в PSM эксплантах и эмбрионах - экспрессия фоллистатина
увеличилась только в присутствии 8 Br-цГМФ, в то время как DETA-NO не оказали
существенного влияния (рис. 4 и рис. S1). Уровни белка миостатина не
оказывают существенного влияния, даже если бы было снижение уровня мРНК. Мы также
отметили, что мРНК и уровни IGF-I были немного увеличены при обработке 8 Br-цГМФ. Эти
изменения, однако, не были значимыми (рис. 4 и рис. S1). Никаких изменений в уровнях IL-4 не
было обнаруженыо(неопубликованные данные). Эти результаты позволяют предположить, что
увеличение фоллистатина имеет отношение к NO / цГМФ сигнализации во время дифференциации
миобластов. Фоллистатин недавно был описан как центрального медиатора фузогенного
эффекта, который оказывает ингибитор дезацетилазы на слияние миобластов в миотубы через
пути отличны от тех, которыми действует или IGF-I или IL-4 (Iezzi и соавт., 2004). В частности,
регулирование ингибиторами дезацетилазы фоллистатина, как представляется, совместно
активирует MyoD, ядерный фактор активированных Т-клеток (NFAT) и цАМФ связывающий
белок (CREB;. Iezzi и др., 2004).Для исследования того, может ли NO-цГМФ путь активации
промоутера фоллистатина действовать тем же путем, мы использовали миогенную клеточную
линию C2C12. Как и сателлитные клетки, миобласты C2C12 привели к образованию
гипертрофическоих миотуб при культивировании в постоянном присутствии 8 Br-цГМФ (рис. 5,
А и B). Это сопровождалось зависимостью от концентрации увеличения уровня фоллистатина
(рис. 5 C). Для изучения влияния на транскрипцию фоллистатина , промоутер связанный с геном
люциферазы (FS-Luc) трансфицировали в C2C12 клетки (Iezzi и соавт., 2004). 8 Br-цГМФ
активировал транскрипцию Fs-Luc (рис. 5 D). Чтобы установить, является ли активация
промотора
фоллистатина
цГМФ опосредованной
MyoD, CREB, и NFAT, FS-Lucтрансфицированные C2C12 были дифференцированы в присутствии 8 Br-цГМФ и / или
трансфицированные негативным регулятором MyoD; Id1 (Iezzi и др., 2004);.. или доминантнонегативной формой CREB, A-CREB (Herzig и др., 2001), или Vivit, который представляет собой
пептид, блокирующий NFAT-зависимоую транскрипцию (Aramburu и др., 1999).. Мы заметили,
что 8-Br-цГМФ-зависимой активации Fs-Luc подавляется в присутствии любого из этих
ингибиторов (рис. 5 D). Таким образом, NFAT, MyoD, и CREB оказывают опосредованные
эффекты 8 Br-цГМФ на транскрипцию фоллистатина. Предыдущие исследования других типов
клеток показали, что CREB и NFAT активируются через цГМФ, протеинкиназу G-зависимого
фосфорилирования (Гуди и др., 1996;. Pilz и Casteel, 2003; Гонсалес Боск и др., 2004.).
Соответственно, мы обнаружили, что 3 мкМ каждого из двух ингибиторов структурно связаных
протеинкиназ G, KT5823 и 8-( chlorophenylthio) гуанозин 3 ', 5'-циклического монофосфоротиоат
([Rp]-8-pCPT-cGMPS;. Смоленский и др., 1998 ), позволили индукцию FS-Luc (рис. 5 D). В
гладких мышцах цГМФ может действовать через протеинкиназу А, фермента, который играет
важную роль в выбранном миогенном пути (Корнуэлл и др., 1994;.. Chen и др., 2005).
Возможность участия протеинкиназы в посредничестких эффектах цГМФ, однако, была
исключена в связи с отсутствием ингибирующих эффектов при 3 мкМ ингибиторов KT5720 и
(Rp)-8-pCPT (рис. 5 D) .
Затем мы изучали может ли гипертрофический эффект 8 Br-цГМФ быть исключительно зависит
от активации транскрипции фоллистатина, IGF-I был также вовлечен в силу небольших, но
обнаруживаемых изменений в уровне IGF-I транскриптов индуцированных при воздействии 8 BrцГМФ (рис. 4). Мы культивировали как спутниковые, так и C2C12 клетки в присутствии 8 BrцГМФ и либо антител, направленных против фоллистатина, чтобы нейтрализовать его (Iezzi и
соавт., 2004) или фосфатидилинозитол-3 "ингибитора киназы LY294002, который ингибирует IGF1 сигнализацию в мышцах (Ибарра и соавт., 2004). Нейтрализующие антитела к фоллистатину
ингибируют действие 8 Br-цГМФ без значительного воздействия на спутниковые клетуи (рис. 5,
А и Е) и C2C12 клетки (рис. 5 б). Эти результаты показывают, что эффект цГМФ в основном
опосредован активацией фоллистатина. В соответствии с этим, LY294002 не изменяет эффекты 8
Br-цГМФ в то время как ингибирование IGF-I в спутниковых клетках и C2C12 (рис. 5 F). Для
оценки эффекта клеточной специфичности цГМФ на фоллистатин, мы исследовали, может ли он
также увеличивать экспрессию фоллистатина в клетках немышечных линий, а именно
эмбриональных клеток карциномы (P19), взрослых (NIH 3T3) и эмбриональных (10 T1 / 2)
фибробластов, мезангиобластов, полученных предшественников гладких мышц (D351;. Brunelli и
др., 2004), а также первичных культур кардиомиоцитов. 8 Br-цГМФ не имел влияния на уровни
фоллистатина в любой из этих клеток, в то время как постоянно возрастающая индукция
фоллистатина
в C2C12 клетках использовали в качестве контроля (рис. S3,
http://www.jcb.org/cgi/content/full / jcb.200507083/DC1).
Дискуссия
Рост скелетной мышечной массы контролируется главным образом посредством регулирования
размера мышечных волокон как во время эмбриогенеза так и в постнатальном периоде. Это
регулирование происходит за счет двух основных и различных механизмов. Один полагается на
регулирование объема цитоплазмы, связанного с отдельными миоядрами, и этот путь, повидимому, включает регуляцию белкового синтеза и деградацию белков (Glass, 2003;. Stitt и др.,
2004). Второй механизм связан с контролем числа миоядер в мышечных волокнах. В этом случае,
рост мышечных волокон во время эмбрионального и постнатального развития зависит от наличия
одиночных клеток, эмбриональных или фетальных миобластов и сателлитных клеток,
соответственно,
которые
должны быть проинструктированы когда делиться и
дифференцироваться, либо соединятьмся с уже существующими волокнами или между собой,
чтобы создать новый слой (Cossu и Biressi, 2005).Слияние миобластов состоит из нескольких
этапов с участием клеточной миграции, согласования, признания, адгезии и слияние мембран
(Wakelam, 1985; Chen и Olson, 2004), и несколько молекул были определены как играющие
важную роль в одном или нескольких из этих процессов, в том числе IL-4, ИФР, интегрины, и
металлопротеаз ы(Galliano и др., 2000;.. Роммеля и др., 2001; Хорсли и др., 2003;. Schwander и др.,
2003;.. Yi и др., 2005). Механизмов и сигнальных путей, лежащих в основе роли этих молекул
управлением слияния миобластов, однако, до сих пор не выяснена. Мы показали, что генерация
NO имеет решающее значение для слияния миобластов у млекопитающих. Мы обнаружили, что
действие NO имеет несколько важных характеристик. (А) Оказывают влияние на критических
этапах пре-и постнатального развитие мышц. (Б) Он работает через те же сигнальные пути на всех
этапах, т.е. активация гуанилатциклазы, с образованием цГМФ и индукции фоллистатина (С) Это
характерно для процесса собственного синтеза NO, потому что не влияет на клеточную
дифференцировку и / или распространение. Это определяет в первый раз общий спусковой
механизм для синтеза и является первым свидетельством того, что процесс слияния может
осуществляться через тот же процесс в эмбрионах и у новорожденных. Мы обнаружили, что
регулирование не влияет на слияние, которое произошло на двух различных ранних этапах с
участием сигнального каскада, т.е. ферментативной деятельности NOS и гуанилатциклазы,
которые регулируются в отсутствие обнаруживаемых изменений в уровне белка. Регулирование
гуанилатциклазы представляется особенно важным, поскольку активация фермента не может быть
увеличена даже путем введения экзогенного NO. Мы еще не определили, какие события среди тех,
что предложены, могут
вызвать десенсибилизацию гуанилатциклазы, например,
фосфорилирование протеинкиназы или даже прямого действия NO (Беллами и др., 2000;. Friebe и
Koesling, 2003), играющего роль в десенсибилизации, наблюдаемой здесь. Физиологическое
значение этого события, однако, ясно, потому что дерегулирование цГМФ сигнализации приводит
к гипертрофии мышц как в сателлитных клетках, так и в эмбрионах. Более поразительно то, что
миобласты дифференцировались от PSM, как известно, некомпетентных
для синтеза (Cossu и Biressi, 2005), которые смогли приобрести такие возможности в присутствии
цГМФ, что позволяет предположить, что NO-цГМФ путь не только имеет решающее значение для
стимулирования слияния, но также может быть его пусковым механизмом . Из трех изоформ NOS
мышиных (и человека) скелетных мышц экспрессируются Iμ NOS и III, в то время как экспрессия
индуцибельной NOS II явно обнаруживается только при наличии воспаления или других
патологических состояниях (Thompson и др., 1996;. Stamler и Мейснер, 2001). Соответственно, мы
обнаружили, что клетки-сателлиты и скелетные мышцы из эмбрионов (неопубликованные
данные) экспрессируют NOS Iμ и III. Тем не менее, можно предположить, что оба фермента могут
играть определенную роль, поскольку оба NOS Iμ и III активируются при увеличении
внутриклеточной концентрации кальция (Alderton и соавт., 2001), т. е. сигнализации событий,
вызванных многими раздражителями (Guttridge, 2004; Хорсли и Pavlath, 2004). Кроме того, нет
очевидных дефектов развития мышц, зарегистрированных при блокаде NOS I или III у мышей.
Также интересным в этом отношении является тот факт, что экспрессия и деятельность обеих
NOS Iμ и III являются регулируемой(Blottner и удачи, 1998;. El Dwairi и др., 1998).Выявление
связи между фоллистатином и NO / цГМФ-зависимой слиянием добавляет новую важную
информацию для биологии скелетной мышцы. Фоллистатин представляет собой белок, который
взаимодействует и регулирует биологическую активность TGF, в том числе BMP-4, BMP-7, и
активинов (Iemura и др., 1998;.. Amthor и др., 2002). Фоллистатин может также блокировать
активность миостатина, негативного регулятора массы скелетных мышц, что приводит к
гипертрофии мышц (Lee и McPherron, 2001). Путь индукции фоллистатина NO / цГМФ найден
привлечь MyoD, NFAT, и CREB. Предыдущая работа показала, что оба CREB и NFAT
непосредственно активировались
NO / цГМФ через протеинкиназы G-зависимого
фосфорилирования (Гуди и др., 1996;.. Фидлер и др., 2002; Pilz и Casteel, 2003;. Гонсалес Боск и
др., 2004). Тот факт, что ингибирование протеинкиназы G предотвратит индукцию фоллистатина,
согласуется с этими результатами и еще раз подтверждает роль CREB и NFAT. Мы обнаружили,
что экспрессия MyoD не влияет на NO / цГМФ, будь это транскрипционный фактор активации
NO / цГМФ через фосфорилирование, как и другие раздражители активирующие MyoD, еще
предстоит установить. Биологическое значение каждого из этих транскрипционных факторов в
опосредованном влиянии NO / цГМФ, однако, ясно вытекает из наших результатов. В самом деле,
специфическое ингибирование MyoD, NFAT, или CREB было достаточно, чтобы предотвратить
транскрипционную функцию цГМФ. Кроме того, эти результаты показывают, что
транскрипционные эффекты NO / цГМФ могут быть более сложными, чем предполагалось ранее.
Тот факт, что MyoD, CREB, и NFAT представляется необходимыми посредниками
транскрипционных эффектов NO / цГМФ напоминает ситуацию уже описанную для стимуляции
слияния миобластов с ингибитором TSA (Iezzi и соавт., 2004). Сходство между действием ВСТ и
NO / цГМФ и последние данные показывают, что TSA способен регулировать экспрессию NOS III
в неэндотелиальных клетках,что показывают, что NO / цГМФ участвует в регуляции процесса
ацетилирования. Интересно, что эффект от NO / цГМФ, похож на TSA (Iezzi и соавт., 2004), был
ограничен клетками скелетных мышц. Эта клеточная специфичность интригует, и механизмы за ее
пределами должны быть предметом дальнейшего исследования.
Кроме того, цГМФ-зависиая индукция фоллистатина может взаимодействовать с другими цГМФсамостоятельными действиями NO, которые могут играть роль в развитии мышц, таких как
ингибирование цитохромоксидазы и контроль дыхания митохондрий и S-нитросилирование (
Stamler и Мейснер, 2001; Монкада и Ерусалимский, 2002).
Ссылки
↵ Alderton, W.K., C.E. Cooper, and R.G. Knowles. 2001. Nitric oxide synthases: structure, function and
inhibition. Biochem. J. 357:593–615. CrossRef
Medline
↵ Amthor, H., B. Christ, F. Rashid-Doubell, C.F. Kemp, E. Lang, and K. Patel. 2002. Follistatin regulates
bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) activity to stimulate embryonic muscle growth. Dev. Biol.
243:115–127. CrossRef
Medline
↵ Anderson, J.E. 2000. A role for nitric oxide in muscle repair: nitric oxide-mediated activation of muscle
satellite cells. Mol. Biol. Cell. 11:1859–1874. Abstract/FREE Full Text
↵ Aramburu, J., M.B. Yaffe, C. Lopez-Rodriguez, L.C. Cantley, P.G. Hogan, and A. Rao. 1999. Affinitydriven peptide selection of an NFAT inhibitor more selective than cyclosporin A. Science. 285:2129–
2133. Abstract/FREE Full Text
↵ Balemans, W., and W. Van Hul. 2002. Extracellular regulation of BMP signaling in vertebrates: a
cocktail of modulators. Dev. Biol. 250:231–250. CrossRef
Medline
↵ Balon, T.W., and J.L. Nadler. 1997. Evidence that nitric oxide increases glucose transport in skeletal
muscle. J. Appl. Physiol. 82:359–363. Abstract/FREE Full Text
↵ Bellamy, T.C., J. Wood, D.A. Goodwin, and J. Garthwaite. 2000. Rapid desensitization of the nitric oxide
receptor, soluble guanylyl cyclase, underlies diversity of cellular cGMP responses. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 97:2928–2933. Abstract/FREE Full Text
↵ Bilezikjian, L.M., A.Z. Corrigan, A.L. Blount, Y. Chen, and W.W. Vale. 2001. Regulation and actions of
Smad7 in the modulation of activin, inhibin, and transforming growth factor-β signaling in anterior
pituitary cells. Endocrinology. 142:1065–1072. Abstract/FREE Full Text
↵ Blottner, D., and G. Luck. 1998. Nitric oxide synthase (NOS) in mouse skeletal muscle development and
differentiated myoblasts. Cell Tissue Res. 292:293–302. CrossRef
Medline
↵ Bredt, D.S. 1998. NO skeletal muscle derived relaxing factor in Duchenne muscular dystrophy. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 95:14592–14593. FREE Full Text
↵ Brunelli, S., E. Casey, D. Bell, R. Harland, and R. Lovell-Badge. 2003. Expression of Sox3 throughout the
developing central nervous system is dependent on the combined action of discrete, evolutionarily
conserved regulatory elements. Genesis. 36:12–24. CrossRef
Medline
↵ Brunelli, S., E. Tagliafico, F.G. De Angelis, R. Tonlorenzi, S. Baesso, S. Ferrari, M. Niinobe, K. Yoshikawa,
R.J. Schwartz, I. Bozzoni, and G. Cossu. 2004. Msx2 and necdin combined activities are required for
smooth muscle differentiation in mesoangioblast stem cells. Circ. Res. 94:1571–1578. Abstract/FREE Full
Text
↵ Buckingham, M., L. Bajard, T. Chang, P. Daubas, J. Hadchouel, S. Meilhac, D. Montarras, D. Rocancourt,
and F. Relaix. 2003. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J. Anat. 202:59–68. CrossRef
Medline
↵ Bulotta, S., R. Barsacchi, D. Rotiroti, N. Borgese, and E. Clementi. 2001. Activation of the endothelial
nitric-oxide synthase by tumor necrosis factor-alpha. A novel feedback mechanism regulating cell death.
J. Biol. Chem. 276:6529–6536. Abstract/FREE Full Text
↵ Charge, S.B., and M.A. Rudnicki. 2004. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.
Physiol. Rev. 84:209–238. Abstract/FREE Full Text
↵ Chen, A.E., D.D. Ginty, and C.M. Fan. 2005. Protein kinase A signalling via CREB controls myogenesis
induced by Wnt proteins. Nature. 433:317–322. CrossRef
Medline
↵ Chen, E.H., and E.N. Olson. 2004. Towards a molecular pathway for myoblast fusion in Drosophila.
Trends Cell Biol. 14:452–460.
↵ Clementi, E., and J. Meldolesi. 1997. The cross-talk between nitric oxide and Ca2+: a story with a
complex past and a promising future. Trends Pharmacol. Sci. 18:266–269. Medline
↵ Clementi, E., G.C. Brown, M. Feelisch, and S. Moncada. 1998. Persistent inhibition of cell respiration by
nitric oxide: crucial role of S-nitrosylation of mitochondrial complex I and protective action of
glutathione. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:7631–7636. Abstract/FREE Full Text
↵ Cornwell, T.L., E. Arnold, N.J. Boerth, and T.M. Lincoln. 1994. Inhibition of smooth muscle cell growth
by nitric oxide and activation of cAMP-dependent protein kinase by cGMP. Am. J. Physiol. 267:C1405–
C1413.
↵ Corradi, N., B. Borgonovo, E. Clementi, M. Bassetti, G. Racchetti, G.G. Consalez, W.B. Huttner, J.
Meldolesi, and P. Rosa. 1996. Overall lack of regulated secretion in a PC12 variant cell clone. J. Biol.
Chem. 271:27116–27124. Abstract/FREE Full Text
↵ Cossu, G., and S. Biressi. 2005. Satellite cells, myoblasts and other occasional myogenic progenitors:
possible origin, phenotypic features and role in muscle regeneration. Semin. Cell Dev. Biol. 16:623–631.
CrossRef
Medline
↵ Cossu, G., B. Zani, M. Coletta, M. Bouche, M. Pacifici, and M. Molinaro. 1980. In vitro differentiation of
satellite cells isolated from normal and dystrophic mammalian muscles. A comparison with embryonic
myogenic cells. Cell Differ. 9:357–368. CrossRef
Medline
↵ Cossu, G., F. Eusebi, F. Grassi, and E. Wanke. 1987. Acetylcholine receptor channels are present in
undifferentiated satellite cells but not in embryonic myoblasts in culture. Dev. Biol. 123:43–50. CrossRef
Medline
↵ Cossu, G., R. Kelly, S. Tajbakhsh, S. Di Donna, E. Vivarelli, and M. Buckingham. 1996. Activation of
different myogenic pathways: Myf5 is induced by the neural tube and MyoD by the dorsal ectoderm in
mouse paraxial mesoderm. Development. 122:429–437. Abstract
↵ Cusella-De Angelis, M.G., S. Molinari, A. Le Donne, M. Coletta, E. Vivarelli, M. Bouche, M. Molinaro, S.
Ferrari, and G. Cossu. 1994. Differential response of embryonic and fetal myoblasts to TGFβ: a possible
regulatory mechanism of skeletal muscle histogenesis. Development. 120:925–933. Abstract
↵ El Dwairi, Q., Y. Guo, A. Comtois, E. Zhu, M.T. Greenwood, D.S. Bredt, and S.N. Hussain. 1998.
Ontogenesis of nitric oxide synthases in the ventilatory muscles. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 18:844–
852. Abstract/FREE Full Text
↵ Eu, J.P., J.M. Hare, D.T. Hess, M. Skaf, J. Sun, I. Cardenas-Navina, Q.A. Sun, M. Dewhirst, G. Meissner,
and J.S. Stamler. 2003. Concerted regulation of skeletal muscle contractility by oxygen tension and
endogenous nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100:15229–15234. Abstract/FREE Full Text
↵ Fiedler, B., S.M. Lohmann, A. Smolenski, S. Linnemuller, B. Pieske, F. Schroder, J.D. Molkentin, H.
Drexler, and K.C. Wollert. 2002. Inhibition of calcineurin-NFAT hypertrophy signaling by cGMPdependent protein kinase type I in cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:11363–11368.
Abstract/FREE Full Text
↵ Fish, J.E., C.C. Matouk, A. Rachlis, S. Lin, S.C. Tai, C. D'Abreo, and P.A. Marsden. 2005. The expression
of endothelial nitric-oxide synthase is controlled by a cell-specific histone code. J. Biol. Chem.
280:24824–24838. Abstract/FREE Full Text
↵ Friebe, A., and D. Koesling. 2003. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circ. Res. 93:96–
105. Abstract/FREE Full Text
↵ Galliano, M.F., C. Huet, J. Frygelius, A. Polgren, U.M. Wewer, and E. Engvall. 2000. Binding of ADAM12,
a marker of skeletal muscle regeneration, to the muscle-specific actin-binding protein, α-actinin-2, is
required for myoblast fusion. J. Biol. Chem. 275:13933–13939. Abstract/FREE Full Text
↵ Gan, Y., Y.H. Shen, J. Wang, X. Wang, B. Utama, and X.L. Wang. 2005. Role of histone deacetylation in
cell-specific expression of endothelial nitric-oxide synthase. J. Biol. Chem. 280:16467–16475.
Abstract/FREE Full Text
↵ Glass, D.J. 2003. Signalling pathways that mediate skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Nat. Cell
Biol. 5:87–90. CrossRef
Medline
↵ Gonzalez Bosc, L.V., M.K. Wilkerson, K.N. Bradley, D.M. Eckman, D.C. Hill-Eubanks, and M.T. Nelson.
2004. Intraluminal pressure is a stimulus for NFATc3 nuclear accumulation: role of calcium,
endothelium-derived nitric oxide, and cGMP-dependent protein kinase. J. Biol. Chem. 279:10702–10709.
Abstract/FREE Full Text
↵ Gudi, T., I. Huvar, M. Meinecke, S.M. Lohmann, G.R. Boss, and R.B. Pilz. 1996. Regulation of gene
expression by cGMP-dependent protein kinase. Transactivation of the c-fos promoter. J. Biol. Chem.
271:4597–4600. Abstract/FREE Full Text
↵ Guttridge, D.C. 2004. Signaling pathways weigh in on decisions to make or break skeletal muscle. Curr.
Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 7:443–450. CrossRef
Medline
↵ Herzig, S., F. Long, U.S. Jhala, S. Hedrick, R. Quinn, A. Bauer, D. Rudolph, G. Schutz, C. Yoon, P.
Puigserver, et al. 2001. CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature.
413:179–183. CrossRef
Medline
↵ Horsley, V., and G.K. Pavlath. 2004. Forming a multinucleated cell: molecules that regulate myoblast
fusion. Cells Tissues Organs. 176:67–78. CrossRef
Medline
↵ Horsley, V., K.M. Jansen, S.T. Mills, and G.K. Pavlath. 2003. IL-4 acts as a myoblast recruitment factor
during mammalian muscle growth. Cell. 113:483–494. CrossRef
Medline
↵ Ibarra, C., M. Estrada, L. Carrasco, M. Chiong, J.L. Liberona, C. Cardenas, G. Diaz-Araya, E. Jaimovich,
and S. Lavandero. 2004. Insulin-like growth factor-1 induces an inositol 1,4,5-trisphosphate-dependent
increase in nuclear and cytosolic calcium in cultured rat cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 279:7554–7565.
Abstract/FREE Full Text
↵ Iemura, S., T.S. Yamamoto, C. Takagi, H. Uchiyama, T. Natsume, S. Shimasaki, H. Sugino, and N. Ueno.
1998. Direct binding of follistatin to a complex of bone-morphogenetic protein and its receptor inhibits
ventral and epidermal cell fates in early Xenopus embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:9337–9342.
Abstract/FREE Full Text
↵ Iezzi, S., M. Di Padova, C. Serra, G. Caretti, C. Simone, E. Maklan, G. Minetti, P. Zhao, E.P. Hoffman, P.L.
Puri, and V. Sartorelli. 2004. Deacetylase inhibitors increase muscle cell size by promoting myoblast
recruitment and fusion through induction of follistatin. Dev. Cell. 6:673–684. CrossRef
Medline
↵ Kaliman, P., J. Canicio, X. Testar, M. Palacin, and A. Zorzano. 1999. Insulin-like growth factor-II,
phosphatidylinositol 3-kinase, nuclear factor-κB and inducible nitric-oxide synthase define a common
myogenic signaling pathway. J. Biol. Chem. 274:17437–17444. Abstract/FREE Full Text
↵ Kelly, R., S. Alonso, S. Tajbakhsh, G. Cossu, and M. Buckingham. 1995. Myosin light chain 3F regulatory
sequences confer regionalized cardiac and skeletal muscle expression in transgenic mice. J. Cell Biol.
129:383–396. Abstract/FREE Full Text
↵ Lee, K.H., M.Y. Baek, K.Y. Moon, W.K. Song, C.H. Chung, D.B. Ha, and M.S. Kang. 1994. Nitric oxide as a
messenger molecule for myoblast fusion. J. Biol. Chem. 269:14371–14374. Abstract/FREE Full Text
↵ Lee, S.J., and A.C. McPherron. 2001. Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 98:9306–9311. Abstract/FREE Full Text
↵ Moncada, S., and J.D. Erusalimsky. 2002. Does nitric oxide modulate mitochondrial energy generation
and apoptosis? Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3:214–220. CrossRef
Medline
↵ Moncada, S., R.M. Palmer, and E.A. Higgs. 1991. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and
pharmacology. Pharmacol. Rev. 43:109–142. Medline
↵ Musaro, A., and N. Rosenthal. 1999. Maturation of the myogenic program is induced by postmitotic
expression of insulin-like growth factor I. Mol. Cell. Biol. 19:3115–3124. Abstract/FREE Full Text
↵ Nisoli, E., S. Falcone, C. Tonello, V. Cozzi, L. Palomba, M. Fiorani, A. Pisconti, S. Brunelli, A. Cardile, M.
Francolini, et al. 2004. Mitochondrial biogenesis by NO yields functionally active mitochondria in
mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101:16507–16512. Abstract/FREE Full Text
↵ Ontell, M., and K. Kozeka. 1984. The organogenesis of murine striated muscle: a cytoarchitectural
study. Am. J. Anat. 171:133–148. CrossRef
Medline
↵ Parker, M., P. Seale, and M.A. Rudnicki. 2003. Looking back to the embryo: defining transcriptional
networks in adult myogenesis. Nat. Rev. Genet. 4:497–507. Medline
↵ Pilz, R.B., and D.E. Casteel. 2003. Regulation of gene expression by cyclic GMP. Circ. Res. 93:1034–
1046. Abstract/FREE Full Text
↵ Relaix, F., D. Rocancourt, A. Mansouri, and M. Buckingham. 2005. A Pax3/Pax7-dependent population
of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435:948–953. CrossRef
Medline
↵ Rommel, C., S.C. Bodine, B.A. Clarke, R. Rossman, L. Nunez, T.N. Stitt, G.D. Yancopoulos, and D.J. Glass.
2001. Mediation of IGF-1-induced skeletal myotube hypertrophy by PI(3)K/Akt/mTOR and
PI(3)K/Akt/GSK3 pathways. Nat. Cell Biol. 3:1009–1013. CrossRef
Medline
↵ Schwander, M., M. Leu, M. Stumm, O.M. Dorchies, U.T. Ruegg, J. Schittny, and U. Muller. 2003. Beta1
integrins regulate myoblast fusion and sarcomere assembly. Dev. Cell. 4:673–685. CrossRef
Medline
↵ Smolenski, A., A.M. Burkhardt, M. Eigenthaler, E. Butt, S. Gambaryan, S.M. Lohmann, and U. Walter.
1998. Functional analysis of cGMP-dependent protein kinases I and II as mediators of NO/cGMP effects.
Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 358:134–139. CrossRef
Medline
↵ Stamler, J.S., and G. Meissner. 2001. Physiology of nitric oxide in skeletal muscle. Physiol. Rev. 81:209–
237. Abstract/FREE Full Text
↵ Stitt, T.N., D. Drujan, B.A. Clarke, F. Panaro, Y. Timofeyva, W.O. Kline, M. Gonzalez, G.D. Yancopoulos,
and D.J. Glass. 2004. The IGF-1/PI3K/Akt pathway prevents expression of muscle atrophy-induced
ubiquitin ligases by inhibiting FOXO transcription factors. Mol. Cell. 14:395–403. CrossRef
Medline
↵ Tajbakhsh, S. 2003. Stem cells to tissue: molecular, cellular and anatomical heterogeneity in skeletal
muscle. Curr. Opin. Genet. Dev. 13:413–422. CrossRef
Medline
↵ Tatsumi, R., A. Hattori, Y. Ikeuchi, J.E. Anderson, and R.E. Allen. 2002. Release of hepatocyte growth
factor from mechanically stretched skeletal muscle satellite cells and role of pH and nitric oxide. Mol.
Biol. Cell. 13:2909–2918. Abstract/FREE Full Text
↵ Thompson, M., L. Becker, D. Bryant, G. Williams, D. Levin, L. Margraf, and B.P. Giroir. 1996. Expression
of the inducible nitric oxide synthase gene in diaphragm and skeletal muscle. J. Appl. Physiol. 81:2415–
2420. Abstract/FREE Full Text
↵ Wakelam, M.J. 1985. The fusion of myoblasts. Biochem. J. 228:1–12. Medline
↵ Wang, T., Z. Xie, and B. Lu. 1995. Nitric oxide mediates activity-dependent synaptic suppression at
developing neuromuscular synapses. Nature. 374:262–266. CrossRef
Medline
↵ Wolosker, H., J.B. Rocha, S. Engelender, R. Panizzutti, J. De Miranda, and L. de Meis. 1997.
Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase isoforms: diverse responses to acidosis. Biochem. J.
321:545–550.
↵ Yi, H., J. Gruszczynska-Biegala, D. Wood, Z. Zhao, and A. Zolkiewska. 2005. Cooperation of the
metalloprotease, disintegrin, and cysteine-rich domains of ADAM12 during inhibition of myogenic
differentiation. J. Biol. Chem. 280:23475–23483. Abstract/FREE Full Text
Оригинал статьи: http://jcb.rupress.org/content/172/2/233.long
Переведено проектом МОЙМИО: www.mymio.org