Афлятунова Светлана Фанильевна
реклама
На правах рукописи АФЛЯТУНОВА СВЕТЛАНА ФАНИЛЬЕВНА ОСОБЕННОСТИ ИММУНОПАТОГЕНЕЗА И КЛИНИКОИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология 14.01.04 - внутренние болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Уфа - 2011 Работа выполнена на кафедре внутренних болезней в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития России» Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Ганцева Халида Ханафиевна доктор медицинских наук Азнабаева Лилия Фаритовна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Еникеева Светлана Ахметовна доктор медицинских наук, доцент Мавзютова Гузель Анваровна Ведущая организация- Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития России». Защита состоится «___»___________2011г. в _______часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития России» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития России» Автореферат разослан «___»__________ 2011 года Ученый секретарь диссертационного совета Лукманова К.А. 2 Список сокращений и обозначений, встречающихся в тексте диссертации ВПГ – вирус простого герпеса ВЭБ – вирус Эпштейна – Барра ИАН – индекс активации нейтрофилов ИЛ - интерлейкин ИФА – иммуноферментный анализ КОН-А – конкавалин А НСТ – тест восстановления нитросинего тетразолия ОФЕ – общая фагоцитарная емкость ПЭГ – полиэтиленгликоль РБТЛ – реакция бласттрансформации ФГА – фитогемагглютинин ФСБР – фосфорно – буферный раствор ХОБЛ – хроническая обструктивная болезнь легких ЦМВ – цитомегаловирус FITC – флюоресцеинизотиоцианат G1 – фаза – предсинтетическая фаза клеточного цикла IF – γ - интерферон – γ МСР – 1 – моноцитарно – хемотаксический белок – 1 РЕ – фикоэритрин PWM – митоген лаконоса 3 Общая характеристика работы Актуальность темы Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) - заболевание, которое можно предотвратить и лечить, характеризующееся существенными внелегочными проявлениями, способными дополнительно отягощать течение болезни у отдельных пациентов. Её легочная составляющая характеризуется ограничением скорости воздушного потока, которая обратима не полностью. Ограничение скорости воздушного потока обычно прогрессирует и связано с патологическим воспалительным ответом легких на действие ингалируемых патогенных частиц или газов [GOLD, 2008]. Хроническая обструктивная болезнь легких занимает ведущее место в структуре болезней органов дыхания, на долю которой приходится около 55 % случаев Хроническая обструктивная болезнь легких занимает ведущее место в структуре болезней органов дыхания, на долю которой приходится около 55 % случаев [Чучалин А.Г., 2003]. В России на сегодняшний день зарегистрировано более 2,4 млн пациентов с ХОБЛ, но предполагается, что их реальное количество более чем в 10 раз выше [Архипов В.В., 2010]. Поскольку ХОБЛ обычно развивается у длительно курящих лиц в среднем возрасте, такие пациенты часто страдают различными другими заболеваниями, связанными или с курением, или с возрастом [Soriano J.B., Visick G.T. et al., 2005]. Наличие ХОБЛ может повышать риск и других заболеваний; это особенно выражено при сочетании ХОБЛ и рака легких [Stavem K., Aaser E. et al., 2005]. Пока не установлено, обусловлена ли эта взаимосвязь общими факторами риска (например, курением), участием генов, определяющих склонность к заболеваниям, или нарушением выведения канцерогенов [GOLD, 2008]. Хроническая обструктивная болезнь легких - полиэтиологичное заболевание. Имеются многочисленные исследования, посвященные этиологии, патогенезу, предложены различные способы лечения, но остаются недостаточно изученными вопросы иммунопатогенеза при изолированной и сочетанной с абсцессом или раком легкого хронической обструктивной болезни легких. 4 Изучению иммунологических механизмов воспалительного процесса и его проявлений и посвящена наша работа. Цель исследования Определение особенностей иммунопатогенеза при хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести и сочетании её с абсцессом или раком легкого. Задачи исследования 1 Изучить клинико - иммунологические проявления хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести, в том числе при наличии сочетанной легочной патологии (рак, абсцесс легкого). 2 Изучить показатели врожденного и адаптивного иммунитета по данным общего анализа крови и иммунограммы, цитокиновую регуляцию (интерлейкин-6, моноцитарно-хемотаксический фактор - 1, интерлейкин - 4, интерферон - гамма) при изолированной форме хронической обструктивной болезни легких. 3 Определить особенности иммунного реагирования у больных с сочетанными с абсцессом или раком легкого формами хронической обструктивной болезни легких. 4 Исследовать содержание антител острого периода к вирусам семейства Herpesviridae (цитомегаловирус, вирус Эпштейна - Барр, вирус простого герпеса) в сыворотке крови у больных изолированной хронической обструктивной болезнью легких средней степени тяжести и сочетанной с абсцессом или раком легкого. 5 На основании изученных показателей врожденного, адаптивного иммунитета, антител к вирусам семейства Herpesviridae, разработать алгоритм дифференциальной диагностики различных форм хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести (изолированной и сочетанной с абсцессом и раком легкого). Научная новизна Впервые проведено исследование иммунопатогенеза хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести путем оценки количественных и функциональных показателей иммунной системы при 5 изолированной и сочетанной с абсцессом или раком легкого формах заболевания. Впервые описана параклиническая семиотика хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести в сочетании с абсцессом и раком легкого в виде иммунологических синдромов, характеризующихся изменениями врожденного и адаптивного противоинфекционного иммунитета. Установлены особенности иммунного реагирования у больных в виде снижения функциональной активности клеток иммунной системы (фагоцитов, Т - и В-лимфоцитов). Впервые показано значение моноцитарно-хемотаксического фактора-1 у больных хронической обструктивной болезнью легких средней степени тяжести в качестве регулятора активности воспалительного процесса. Установлена сопряженность признаков активации вирусов семейства Herpesviridae с развитием сочетанных с абсцессом и раком легкого форм хронической обструктивной болезни легких. Впервые установлена диагностическая значимость определения отдельных показателей иммунной системы при различных формах хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести (патенты РФ на изобретение: №2407013, №2407010, №2400149, №2407012). Практическая значимость Разработан алгоритм дифференциальной диагностики хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести изолированной и сочетанной с абсцессом или раком легкого. Показана значимость герпесвирусной инфекции при сочетанных формах хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести. Внедрение результатов исследования в практику Научные положения, выводы и рекомендации работы используются в клинической практике торакального хирургического отделения Клиник ГБОУ ВПО «БГМУ Минздравсоцразвития России», республиканского клинического онкологического диспансера, включены в программы подготовки студентов на кафедре внутренних болезней, получено 4 патента РФ на изобретение (№2407013, №2407010, №2400149, №2407012). 6 Положения, выносимые на защиту 1 Клинико - иммунологические проявления хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести характеризуются изменениями врожденного и адаптивного противоинфекционного иммунитета в виде активации нейтрофилов и продукции провоспалительных цитокинов – моноцитарно–хемотаксического белка-1, интерлейкина-6, интерферона-γ, снижение синтеза интерлейкина-4, угнетении пролиферативной способности Т-лимфоцитов и недостаточности В - звена. 2 Сочетанные с абсцессом или раком легкого формы хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести проявляются более выраженными изменениями показателей иммунной системы: увеличением содержания в крови CD8+ - лимфоцитов, снижением кислородзависимой метаболической активности нейтрофилов, уменьшением силы взаимосвязей цитокина – моноцитарно – хемотаксического белка - 1 с показателями факторов врожденного и адаптивного иммунитета и наличием антивирусных антител острого периода. У больных сочетанной с раком легкого хронической обструктивной болезнью легких в крови наблюдается наличие антител к двум и более вирусам, наиболее частыми из которых являются антитела к цитомегаловирусной инфекции и вирусу Эпштейна - Барра. 3 Алгоритм обструктивной клинико-иммунологической болезни легких средней диагностики степени хронической тяжести включает определение в крови содержания CD8+ - лимфоцитов, пролиферативной активности Т-лимфоцитов в реакции бласттрансформации, маркеров цитомегаловирусной инфекции, вируса Эпштейна - Барра. Апробация работы Материалы исследования доложены на XIX Российском Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009), конференции, посвященной актуальным проблемам управления здоровьем населения (Нижний Новгород, 2009), 74 республиканской научной конференции студентов и молодых ученых (Уфа, 2009), конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010), расширенном заседании кафедр внутренних болезней, онкологии, фтизиопульмонологии, 7 госпитальной хирургии, факультетской терапии, терапии и сестринского дела ГБОУ ВПО «БГМУ Минздравсоцразвития России» (Уфа, 2011), на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при ГБОУ ВПО «БГМУ Минздравсоцразвития России». Публикации Материалы диссертации опубликованы в 14 научных работах, из них 5 - в рецензируемых научных журналах, рекомендованных в перечне ВАК Министерства образования и науки РФ, новизна исследования подтверждена 4 патентами РФ на изобретение. Объем и структура работы Объем диссертации - 125 страниц, иллюстрирован 21 таблицами, 28 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список литературы содержит 181 источник (105 отечественных и 76 зарубежных). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Под наблюдением находилось 90 мужчин - больных ХОБЛ средней степени тяжести. Группа контроля состояла из 24 практически здоровых лиц. Больные ХОБЛ были разделены на 3 группы: 1 – 30 человек с ХОБЛ средней степени тяжести в возрасте (52,8±4,03) лет, находившихся на лечении в терапевтическом отделении Клиник ГБОУ ВПО «БГМУ Минздравсоцразвития России»; 2 – 30 человек с ХОБЛ средней степени тяжести в сочетании с абсцессом легкого в возрасте (53,9±5,05) лет, проходивших лечение в отделении торакальной хирургии Клиник ГБОУ ВПО «БГМУ Минздравсоцразвития России»; 3 – 30 человек с ХОБЛ средней степени тяжести в сочетании с раком легкого в возрасте (54,6±0,98) лет (Республиканский клинический онкологический диспансер, г.Уфа). Критериями исключения больных из исследования были: женский пол; возраст<40 и >60 лет; профессиональные заболевания (силикоз, 8 профессиональный бронхит); наличие в анамнезе туберкулеза органов дыхания, типичных приступов удушья и/или атопии, других заболеваний, сопровождающихся одышкой и кашлем (бронхоэктатическая болезнь, заболевания сердца с левожелудочковой недостаточностью); дыхательная недостаточность III стадии; сопутствующие хронические заболевания в фазе обострения; больные с пневмонией; леченые в течение последнего года иммуномодулирующими препаратами. Для обследования инструментальные, больных использовались иммунологические и клинические, лабораторные методы исследования. У всех пациентов проводили сбор анамнеза, общий осмотр, пальпацию, перкуссию, аускультацию по системам. Использовали инструментальные методы исследования (спирометрическое исследование, рентгенография и компьютерная томография органов грудной клетки, фибробронхоскопия, ЭКГ, ЭХО-кардиография), бактериологическое исследование мокроты. Лабораторные методы исследования включали определение общего анализа крови, иммунограммы. Определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и маркеры их активации (СD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD23+, CD25+, CD95+, HLA-DR+, СD45RA+, CD45RO+) с использованием флюоресцирующими моноклональных метками FITC и антител PE с (FITC двумя – флюоресцеинизотиоцианат, РЕ – фикоэритрин) (BeckmanCoulter, США). Результаты учитывались на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Анализ клеточного цикла проводился с использованием метода окрашивания ДНК клетки с помощью проточного цитофлюориметра. В данной работе использовался метод оценки апоптоза по структурным изменениям ядерной ДНК путём окрашивания клеток йодистым пропидием [Сибиряк С.В. и др., 2008]. Поглотительную активность фагоцитов определяли по способности клеток поглощать частицы латекса. Определяли функциональную активность нейтрофилов с расчетом общей фагоцитарной емкости крови (ОФЕ): 9 ОФЕ лейкоциты (абс) х фагоцитарный индекс х фагоцитарное число 100 [www.lab7.html]. Общую окислительно - восстановительную активность нейтрофилов определяли в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) [Нагоев Б.С., Оразаев Н.Г., 2000]. НСТ - тест проводили традиционным способом с расчетом индекса активации нейтрофилов (ИАН) [Карпищенко А.И, 2002]. Функциональную активность лимфоцитов оценивали в реакции бласттрансформации (РБТЛ) с использованием митогенов: фитогемагглютинин (ФГА) – для стимуляции преимущественно CD8+ лимфоцитов, конкавалин А (КОН - A) – CD4+ - лимфоцитов, митоген лаконоса – Т - зависимых В - лимфоцитов. Для оценки роли вирусной инфекции в патогенезе ХОБЛ в сыворотке крови больных определяли наличие антител острого периода к вирусам семейства Herpesviridae класса М (IgM): вирусу простого герпеса (ВПГ) типа 1 и 2; цитомегаловирусу (ЦМВ), а также иммуноглобулинов классов G и M (IgG и IgM) к предраннему белку цитомегаловируса (IEA), IgM к капсидному белку и IgG к раннему антигену (EA) вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих тестсистем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирская область, Россия). Количественное определение уровня интерлейкина-6 (IL - 6) в сыворотке крови проводили на анализаторе АССECS 2 (Beckman Coulter, США). Для определения моноцитарно - хемотаксического белка - 1 (МСР - 1), уровня спонтанной и индуцированной (ФГА в дозе 10 мкг/мл) продукции цитокинов клетками крови (интерлейкин – 4 (IL – 4), интерферон – γ (IF – γ)) использовали трехфазный иммуноферментный метод с использованием тест - систем ЗАО «Вектор Бест» (Новосибирская область, Россия). Статистическую обработку проводили путем вычисления средней арифметической величины (М), стандартной ошибки показателя средней (m), критерия хи - квадрат (χ2) для таблицы сопряженности 2х2 и достигнутого уровня значимости (с поправкой Иэйтса на непрерывность). При сравнении данных двух групп рассчитывали критерий Стьюдента, тогда 10 как при сравнении трех групп и более по одному признаку применяли дисперсионный анализ и критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони. Производилась оценка статистики связи - отношения шансов (odds ratio, ОR) и границ 95% - ных доверительных интервалов для них. Статистически значимыми различиями принимались данные при достоверности р<0,05 (www mailto: point @ statleo. tomsk. su). Для изучения взаимосвязи признаков применен корреляционный анализ с определением коэффициента парной линейной корреляции (Пирсона). Результаты собственных исследований и их обсуждение При анализе симптомов болезни в трех группах нами были выявлены общие клинические признаки, такие как кашель, сухие хрипы, одышка. Установлены различия между группами больных ХОБЛ средней степени тяжести: боли в грудной клетке были характерны для формы, сочетанной с раком легкого (40% по сравнению с 6,67% в группе изолированной ХОБЛ, χ2=7,55, р=0,007), а кровохарканье наблюдалось лишь в данной группе. Округлая тень на рентгенограмме была более характерна для абсцесса легкого (100% по сравнению с 43,3% в группе ХОБЛ в сочетании с раком легкого, χ2=21,013, р=0,0005) (рис.1). При анализе показателей гемограммы у больных ХОБЛ было выявлено значимое увеличение абсолютного количества лейкоцитов до (8,73±0,68) х109/л против (5,71±0,26) х109/л в группе контроля (р<0,001), в том числе сегментоядерных нейтрофилов - до (5,18±0,11) х109/л по сравнению с (3,14±0,09) х109/л в группе контроля (р<0,001), лимфоцитов - до (2,67±0,02) х109/л против (1,99±0,03) х109/л в группе контроля (р<0,001), моноцитов - до (0,46±0,01) х109/л по сравнению с (0,34±0,02) х109/л в группе контроля (р<0,001). При анализе функциональной активности нейтрофилов у больных с изолированной ХОБЛ было выявлено увеличение общей фагоцитарной емкости (ОФЕ) крови до (20,37±1,50) ед. против (9,36±1,31) ед. в группе контроля (р<0,01) и снижение резервных возможностей лейкоцитов, выявленное по показателю индуцированного индекса активации нейтрофилов (ИАН) – (0,58±0,06) против (0,80±0,01) в группе контроля 11 (р<0,01). Кашель с мокротой Одышка при физ.нагрузке Сухие хрипы *** ** Кровохарканье Боль в грудной клетке ** Округлая тень на рентгенограммме *** *** 0 20 ХОБЛ+рак 40 60 80 ХОБЛ+абсцесс 100 % 120 ХОБЛ Рисунок 1 – Сравнительная характеристика объективных и субъективных симптомов у больных хронической обструктивной болезнью легких в трех группах Примечание: различие с группой контроля статистически значимо: ** - р<0,01; *** р<0,001 Были изучены изменения содержания основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных ХОБЛ, регулирующих функциональное состояние клеток фагоцитарного звена иммунитета (МСР 1 и IL - 6). При исследовании содержания МСР - 1 и IL - 6 в сыворотке крови у больных изолированной ХОБЛ средней степени тяжести было установлено статистически значимое их повышение относительно группы контроля (рис.2). Полученные данные в сочетании с выявленным лейкоцитозом характеризуют активацию миграции фагоцитов в очаг воспаления под влиянием МСР - 1 и IL - 6. 12 пг/мл пг/мл * * 400 10 300 200 5 100 0 0 группа контроля ХОБЛ группа контроля МСР-1 ХОБЛ IL-6 Рисунок 2 - Содержание МСР-1 и IL-6 в сыворотке крови у больных хронической обструктивной болезнью легких Примечание: * различие с группой контроля статистически значимо, р<0,05 При анализе содержания в крови цитокинов, определяющих направленность иммунного ответа (Th1 или Th2 - тип) у больных ХОБЛ было установлено увеличение стимулированной продукции IF - γ до (440,32±48,43) пг/мл против (301,22±36,72) пг/мл в группе контроля (р<0,05) при снижении спонтанной продукции IL - 4 до (15,78±2,41) пг/мл по сравнению с (30,21±6,20) пг/мл в группе контроля (р<0,05). Эти данные свидетельствуют о реагировании иммунной системы у больных ХОБЛ преимущественно по Th1 - пути (рис.3). При исследовании популяционного состава лимфоцитов установлено выраженное увеличение содержания Т -, NK-клеток и снижение количества В – лимфоцитов (рис.4) в крови больных ХОБЛ. Анализ состояния Т- звена иммунитета у больных ХОБЛ показал увеличение в крови количества Т - лимфоцитов, которое происходило в основном за счет повышения CD4+ - субпопуляции до (1,15±0,11) х109/л по сравнению с (0,81±0,04) х109/л в группе контроля (р<0,01) и в меньшей степени - CD8+ - лимфоцитов, что приводило к возрастанию соотношения CD4+ / CD8+ до (2,28±0,20) против (1,77±0,07) в группе контроля (р<0,05). 13 IF-γ спонт 1,6 1,2 0,8 0,4 IL-4 стим 0 IF-γ стим * группа контроля ХОБЛ IL-4 спонт * Рисунок 3 - Продукция IF - γ и IL - 4 клетками крови больных хронической обструктивной болезнью легких (спонтанная и стимулированная ФГА) (данные приведены по отношению к группе контроля). Примечание: * различие с группой контроля статистически значимо, р<0,05 % 80 * 70 60 50 40 30 ** 20 *** 10 *** 0 CD3+ CD16- CD19+ CD19+CD23+ группа контроля CD3-CD16+ CD3+ CD16+ ХОБЛ Рисунок 4 - Содержание лимфоцитов в крови у больных хронической обструктивной болезнью легких (%) Примечание: различие с группой контроля статистически значимо: * - р<0,05; ** - р<0,01; ***-р<0,001 Оценка функциональной активности Т-лимфоцитов выявила признаки их ранней активации в виде увеличения содержания CD4+CD25+ - клеток до (12,13±1,67) % по сравнению с (6,10±2,00) % в группе контроля (р<0,05), некоторое увеличение количества клеток, находящихся в G1 - фазе (предсинтетической) клеточного цикла до (1,92±0,44) % против (1,49±0,16)% 14 в группе контроля (р>0,05), что свидетельствует о готовности лимфоцитов к пролиферации. В то же время, по данным реакции бласттрансформации (РБТЛ) (рис.5) у больных ХОБЛ отмечалось снижение пролиферативной способности CD8+ - лимфоцитов, выявляемое по снижению фитогемагглютинин (ФГА) - зависимого ответа до (2,15±0,29) против (3,20±0,20) в группе контроля (р<0,01), что свидетельствует об отсутствии передачи активационного сигнала к пролиферации клеток. Анализ показателей гуморального звена иммунитета у больных ХОБЛ свидетельствовал о снижении как количественных, так и функциональных параметров В-звена по сравнению с данными контроля. Отмечалось уменьшение количества CD19+ - лимфоцитов до (7,36±1,20) % против (12,55±0,36) % в группе контроля (р<0,001), в том числе активированных СD19+CD23+ до (3,04±0,60) % по сравнению с (6,50±0,68) % в группе контроля (р<0,001), уровня антител класса М до (0,87±0,13) г/л против (1,75±0,23) г/л в группе контроля (р<0,01) (рис. 6). 3,5 3 2,5 ** 2 группа контроля 1,5 ХОБЛ 1 0,5 0 Митоген лаконоса ФГА КОН-A Рисунок 5 - Способность лимфоцитов крови к пролиферации в реакции бласттрансформации у больных хронической обструктивной болезнью легких (индекс пролиферации) Примечание: **-различие с группой контроля статистически значимо, р<0,01 У больных ХОБЛ имело место также снижение количества циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови (рис. 6) высокомолекулярных до (7,70±2,33) 15 у.е., среднемолекулярных до (14,10±1,25) у.е. и низкомолекулярных до (63,3±6,34) у.е. по сравнению с (45,40±1,7) у.е. (р<0,001); (77,65±6,39) у.е. (р<0,001); (152,70±8,43) у.е. (р<0,001) соответственно в группе контроля. В то же время, у обследованных больных наблюдалось увеличение содержания в крови иммуноглобулинов (Ig) класса A до (4,86±0,77) г/л против (2,88±0,31) г/л в группе контроля (р<0.05) (рис.6) и Ig Е до (263,58±53,18) МЕ/мл по сравнению с (75,00±6,90) МЕ/мл в группе контроля (р<0.01), что косвенно свидетельствует о напряженности иммунитета слизистых оболочек. 14 у.е. 270 12 240 г/л 210 10 180 8 150 120 * 6 *** 90 4 60 ** 2 30 *** *** 0 0 IgG IgM группа контроля Высокомолек-е Среднемолек-е Низкомолек-е IgA группа контроля ХОБЛ ХОБЛ Рисунок 6 – Содержание иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови у больных хронической обструктивной болезнью легких Примечание: различие с группой контроля статистически значимо: * - р<0,05; ** р<0,01; ***-р<0,001 Таким образом, полученные данные отражают развитие у больных ХОБЛ иммунологических изменений, характерных для воспалительной реакции: лейкоцитоза, повышения уровня CD4+ - лимфоцитов, соотношения CD4+ / CD8+, общей фагоцитарной емкости, преимущественной активации Th1 – типа иммунного реагирования. Сопоставление показателей иммунной системы при изолированной ХОБЛ и при её сочетанных формах с абсцессом или раком легкого выявило их общность и вместе с тем некоторые особенности (рис.7). 16 Общность реакций иммунной системы при этих состояниях характеризуется развитием иммунного ответа преимущественно по Th1 пути. При сочетанных формах ХОБЛ наблюдалось увеличение количества CD8+ - лимфоцитов в крови, тогда как при изолированной ХОБЛ повышалось количество CD4+ - лимфоцитов. NK * РБТЛ (PWM) РБТЛ (ФГА) NКакт 3 2,5 * лейкоциты * моноциты G1-фаза 2 *СD4+CD25+ * CD3+CD8+ нейтрофилы 1,5 ИЛ-6 1 0,5 * CD3+CD4+ * * МСР-1 * 0 ФИ * CD3+ CD16- НСТ-сп * IgE ИАН-инд * IgA * ЦИК низком * ЦИК среднем * ЦИК высоком CD19+ CD19+CD23+ IgG IgM группа контроля АБСЦЕСС ХОБЛ РАК Рисунок 7 - Профиль иммунного реагирования у больных хронической обструктивной болезнью легких Примечание: * - различие с группой контроля статистически значимо в трех группах. РБТЛ (ФГА) – ответ на фитогемагглютинин; РБТЛ (PWM) – ответ на митоген лаконоса; МСР-1 – моноцитарно-хемотаксический белок-1; ИАН – индекс активации нейтрофилов; G1-фаза- предсинтетическая фаза клеточного цикла; ФИ – фагоцитарный индекс; НСТсп – тест восстановления нитросинего тетразолия спонтанный Признаки недостаточности факторов врожденного иммунитета при сочетанных формах ХОБЛ были более выраженными. Так, при сочетании ХОБЛ с абсцессом легких, показатели метаболической активности лейкоцитов были ниже в сравнении с изолированной формой ХОБЛ. В этой группе больных отмечалось снижение не только индуцированного ИАН до (0,54±0,05) по сравнению с (0,8±0,01) в группе контроля (р<0,001), но и 17 спонтанной активности (НСТ - спонт) до (6,78±2,01) % против (11,40±0,40) % в группе контроля (р<0,05). Аналогичные изменения наблюдались и у больных ХОБЛ в сочетании с раком легкого: значения индуцированного ИАН у этих больных составили (0,66±0,06) по сравнению с (0,8±0,01) в группе контроля (р<0,05). CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD4+CD25+ 0,66 0,44 CD4+RO+ CD4+RA+ 0,7 CD4+CD95+ 0,51 Моноциты% 0,63 0,67 0,59 0,46 0,46 0,49 0,64 0,59 CD4+HLADR+ Лейкоциты NK+ 0,37 0,72 0,57 0,55 МСР-1 CD19+CD23+ 0,49 0,81 0,62 IgM IgE ЦИК среднемол ЦИК низкомол IgM ЦМВ IgM ВПГ TNK+ А) CD4+RA+ РБТЛ спонт РБТЛ ConA РБТЛ ФГА Фагоцитарный индекс 0,58 0,59 0,47 0,65 0,49 МСР-1 0,6 0,59 0,44 0,4 РБТЛ (PWM) IgG ЦИКсреднемол ЦИК низкомол Б) CD4+HLADR+ 0,3 нейтрофилы% -0,39 МСР-1 CD19+ 0,37 0,31 -0,38 CD19+CD23+ РБТЛ (PWM) 0,24 Моноциты В) Рисунок 8 – Корреляции показателя МСР-1 с факторами иммунного реагирования у больных с изолированным ХОБЛ (А) и в сочетании ХОБЛ с абсцессом легкого (Б) или раком легкого (В) Оценка корреляции МСР - 1 в сыворотке крови больных с изученными показателями иммунной системы выявила, что при изолированной ХОБЛ (рис.8А) отмечалась его положительная корреляция с изменениями 18 показателей факторов врожденного и адаптивного (Т - и В – звеньев) иммунитета. При сочетании ХОБЛ с абсцессом легкого (рис.8Б) высокий уровень МСР - 1 характеризовался наличием корреляции с изменениями показателей только фагоцитарного и Т - звеньев иммунитета. У больных ХОБЛ в сочетании с раком легкого не было выявлено статистически значимых связей МСР - 1 с другими показателями иммунной системы (рис.8В), что может говорить о нарушении регулирующего влияния МСР - 1. Определение содержания в крови антител острого периода к герпесвирусам выявило более высокую частоту их обнаружения у больных ХОБЛ с сочетанными формами заболевания (у 66,7% больных, как при абсцессе, так и при раке легкого, против 14,3% в группе контроля, χ2=11,66 при p=0,001 OR=12,0) (рис.9). *** % *** 70 60 50 группа контроля ХОБЛ 40 абсцесс рак 30 20 10 0 1 Рисунок 9 - Выявляемость серологических маркеров герпесвирусных инфекций у больных хронической обструктивной болезнью легких изолированного течения и в сочетании с абсцессом или раком легкого Примечание: различие с группой контроля статистически значимо:*** - р<0,01 Наиболее часто, по сравнению с группой контроля (9,5 % больных) выявлялись антитела острого периода к ЦМВ (у 38,0 % больных, р<0,05), реже – к ВЭБ (28,0% против 4,60% в группе контроля, р<0,05) и ВПГ (16,0% и 0% в группе контроля, р>0,05). Оценка данных ассоциированности герпесвирусной инфекции (выявление антител к двум или трем вирусам одновременно) показала статистически значимое, по сравнению с группой 19 контроля, увеличение частоты инфицированности только в группе больных ХОБЛ в сочетании с раком легкого (23,3%; χ2=3,65 при p=0,05; OR=63,6). Суммируя вышеизложенное, можно сделать заключение о том, что иммунопатогенез ХОБЛ характеризуется активацией факторов врожденного иммунитета (нейтрофилы, провоспалительные цитокины – МСР - 1, IL - 6), направленностью иммунного ответа преимущественно по Th1 - пути (увеличение IF - γ, снижение IL - 4), угнетением пролиферативной активности Т-лимфоцитов (СD8+) и недостаточностью В - звена (низкий уровень CD19+, CD19+CD23+ - лимфоцитов, IgM, циркулирующих иммунных комплексов). Маркеры активации герпесвирусной инфекции выявлялись в большей степени в группах больных с сочетанной патологией, а наличие антител к двум и более вирусам – в группе больных ХОБЛ в сочетании с раком легкого. На основании полученных данных был разработан алгоритм диагностики ХОБЛ средней степени тяжести для раннего выявления её сочетанных форм (рис.10). Было установлено, что среди иммунологических показателей у больных ХОБЛ наиболее значимыми для диагностики являются повышение уровня СD8+ - лимфоцитов в крови, снижение пролиферативной способности CD8+ - лимфоцитов (ФГА – зависимый ответ), метаболической активности нейтрофилов и наличие антител острого периода к ЦМВ и /или ВЭБ, при выявлении которых необходимо проведение обследования больных с использованием методов нейровизуализации с целью исключения очаговых изменений в легких. Таким образом, проведенные исследования состояния иммунной системы у больных ХОБЛ позволили установить особенности иммунного реагирования, иммунитета, проявляющиеся недостаточности активацией В – факторов звена, врожденного преимущественной направленностью иммунного ответа по Тh1 – пути. При сочетанных с абсцессом или раком легкого формах ХОБЛ иммунное реагирование отличалось повышением уровня CD8+ - лимфоцитов в крови, снижением кислородзависимой метаболической активности нейтрофилов. 20 ХОБЛ (ОФВ1/ФЖЕЛ<0,7 50%≤ОФВ1<80%) иммунологические тесты адаптивный иммун. ответ CD8+лимф ФГА-ответа герпесвирусы врожденный иммун.ответ метаболической активности нейтрофилов ЦМВ ВЭБ дополнительное обследование для выявления сочетанных форм ХОБЛ (абсцесс, рак) - КТВР Рисунок 10 - Алгоритм диагностики изолированного и сочетанных форм хронической обструктивной болезни легких Примечание: КТВР - компьютерная томография высокого разрешения Выводы: 1 Клинико - иммунологическими особенностями изолированной и сочетанной с абсцессом и раком легкого хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести являются изменения врожденного и адаптивного противоинфекционного иммунитета. 2 Иммунопатогенез хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести характеризуется активацией факторов врожденного иммунитета (нейтрофилы, NK - клетки и провоспалительные цитокины – моноцитарно – хемотаксический белок - 1, интерлейкин - 6), угнетением пролиферативной активности CD8+ - лимфоцитов, недостаточностью В звена (низкий уровень CD19+, CD19+CD23+, IgM), направленностью иммунного ответа преимущественно по Th1 - пути (увеличение продукции клетками крови интерферона - γ, снижение интерлейкина - 4). 3 Иммунное реагирование у больных с сочетанными с абсцессом или раком легкого формами хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести характеризуется более 21 выраженными изменениями показателей состояния иммунной системы: увеличением в крови содержания CD8+ - лимфоцитов, снижением кислородзависимой метаболической активности нейтрофилов. 4 При сочетанных с абсцессом или раком легкого формах хронической обструктивной болезни легких наблюдается повышение частоты выявления у больных антивирусных антител острого периода (IgM, IgG к ранним белкам вирусов) до 66,7% как при абсцессе, так и при раке легкого (по сравнению с 23,3% при изолированной форме заболевания). У больных хронической обструктивной болезнью легких средней степени тяжести в сочетании с раком легкого выявляются несколько сывороточных маркеров вирусной инфекции, наиболее частыми из которых являются антитела к цитомегаловирусу и вирусу Эпштейна - Барр. 5 Алгоритм клинико - иммунологической дифференциальной диагностики изолированной и сочетанных форм хронической обструктивной болезни легких средней степени тяжести включает определение содержания в крови CD8+ - лимфоцитов, пролиферативной активности Т-лимфоцитов в реакции бласттрансформации, антител острого периода к цитомегаловирусу и вирусу Эпштейна - Барр, что необходимо для обследования больных с целью исключения очаговых изменений в легких. Практические рекомендации 1 Повышение количества CD8+ - лимфоцитов, снижение пролиферативной способности CD8+ - лимфоцитов (ФГА – зависимый ответ), метаболической активности нейтрофилов и выявление антител острого периода к ЦМВ и /или ВЭБ у больных хронической обструктивной болезнью легких средней степени тяжести является основанием для назначения современных методов нейровизуализации с целью исключения сочетанных форм заболевания. 2 В случаях сочетания хронической обструктивной болезни легких с абсцессом или раком легкого необходимо исследовать больных на возможность инфицированности вирусами семейства Herpesviridae (цитомегаловирус и вирус Эпштейна - Барр) для решения вопроса о 22 необходимости комплексной терапии со включением специфических противовирусных лекарственных средств. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1 Афлятунова С.Ф., Ганцева Х.Х., Габитова Д.М. Способ дифференциальной диагностики круглых теней в легком у больных хронической обструктивной болезнью легких: патент РФ №2400149 / Бюллетень изобретений Роспатента. - 2010. - №27. 2 Афлятунова С.Ф., Ганцева Х.Х., Габитова Д.М. Способ прогнозирования развития абсцесса легкого при хронической обструктивной болезни легких: патент РФ №2407010 / Бюллетень изобретений Роспатента. - 2010. - №35. 3 Афлятунова С.Ф., Ганцева Х.Х., Габитова Д.М. Способ прогнозирования возникновения хронической обструктивной болезни легких: патент РФ №2407012 / Бюллетень изобретений Роспатента. - 2010. - №35. 4 Афлятунова С.Ф., Ганцева Х.Х., Рахматуллина И.Р. Способ прогнозирования возникновения рака легкого у больных хронической обструктивной болезнью легких: патент РФ №2407013 / Бюллетень изобретений Роспатента. - 2010. - №35. 5 Ганцева Х.Х., Габитова Д.М., Афлятунова С.Ф. К патогенетическому единству в развитии хронической обструктивной болезни легких и рака легкого / Креативная хирургия и онкология. - 2010. - №4. - С.17 - 23. 6 Ганцева Х.Х., Азнабаева Л.Ф., Афлятунова С.Ф. Герпесвирусные инфекции при хронической обструктивной болезни легких / Фундаментальные исследования. - 2011. - №1. - С.49 - 55. 7 Азнабаева Л.Ф., Ганцева Х.Х., Афлятунова С.Ф. Моноцитарный хемотаксический фактор в иммунопатогенезе изолированной хронической обструктивной болезни легких / Креативная хирургия и онкология. - 2011. - №1. - С.85 - 89. 8 Азнабаева Л.Ф., Ганцева Х.Х., Афлятунова С.Ф. Роль герпесвирусов в иммунопатогенезе хронической обструктивной болезни легких, в том числе сочетанной с абсцессом и раком легкого / Иммунология. - 2011. - №3. – С. 139-142. 9 Ганцева Х.Х., Азнабаева Л.Ф., Ханова А.К., Афлятунова С.Ф. Табакокурение – герпесвирусные инфекции, хроническая обструктивная болезнь легких – рак легкого / Креативная хирургия и онкология. – 2011. №2. – С.45 – 48. 10 Афлятунова С.Ф. Клинико-эпидемиологическая оценка нагноительных заболеваний легких в г. Уфа / Актуальные проблемы управления здоровьем населения. Сборник научных трудов, выпуск II. - Н.Новгород. - 2009. - С. 41 45. 11 Афлятунова С.Ф. Гнойно-деструктивные заболевания легких в городе нефтеиндустрии / Вопросы теоретической и практической медицины. Материалы 74 республиканской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной Году молодежи в России и Году поддержки и развития молодежных инициатив в РБ. - Уфа. - 2009. - Т.I. - С.35 - 37. 23 12 Ганцева Х.Х., Габитова Д.М., Афлятунова С.Ф. Хроническая обструктивная болезнь легких и рак легкого как хроническое системное прогрессирующее воспалительное заболевание курильщиков / XIX Национальный конгресс по болезням органов дыхания. Сборник трудов конгресса. - Москва. - 2009. - С. 372. 13 Ганцева Х.Х., Габитова Д.М., Афлятунова С.Ф. Некоторые вопросы патогенеза хронической обструтивной болезни легких / XIX Национальный конгресс по болезням органов дыхания. Сборник трудов конгресса. - Москва. - 2009. - С.388. 14 Gantseva Kh.Kh., Aflyatunova S.F., Gabitova D.M. Clinical-immunological parallels when chronic obstructive pulmonary disease in lung cancer patients / European Journal of natural history. – 2010. - №2. - Р.20 - 22. Подписано в печать 22.07.11 г. Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 525. Гарнитура «TimesNewRoman». Отпечатано в типографии ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123 24 25
