Лекция 6 Антитела2

1
ЛЕКЦИЯ 6
АНТИТЕЛА
Классы иммуноглобулинов
1Неполные и полные антитела
2 Структурные и функциональные особенности иммуноглобулинов разных
классов
3 Теории образования иммуноглобулинов в клетках
Разделение иммуноглобулинов млекопитающих на классы, структурные и
функциональные особенности иммуноглобулинов разных классов.
Гены, кодирующие вариабельные и константные домены цепей иммуноглобулинов.
Генетические механизмы формирования классов иммуноглобулинов и разнообразия их
антигенсвязывающих участков.
Неполные и полные антитела
Виды антител IgG, IgM, IgA реагируют с детерминантами антигенов
всеми имеющимися в их молекуле антигенсвязывающими центрами.
Вследствие этого в растворах образуются крупные конгломераты
веществ. Антитела, вызывающие видимые реакции, называют полными. В
противоположность этому некоторые иммуноглобулины-мономеры реагируют с антигеном лишь одним паратопом, видимых реакций не дают и
поэтому называются неполными антителами. Если же реакция взаимодействия этих антител происходит в крови и не вызывает каких-либо нарушений
в организме, их называют антителами-свидетелями. Последние блокируют
антиген, а нередко одновременно связывают комплемент, вследствие чего
называются блокирующими и комплементсвязывающими. Реагирование IgE и
IgG с антигенами может приводить к развитию аллергий. При незначительных, бесследно исчезающих проявлениях аллергии на кожных покровах
аллергические антитела называют реагинами, а при ярко выраженных повреждениях клеток кожи — агрессинами или кожно-сенсибилизирующими
антителами. '
1
2
Биологические
особенности
Касаясь
биологических
свойств
иммуноглобулинов, нужно отметить, что содержание их в крови непостоянно
и колеблется
от 0,3-0,4 мг% (IgE) до 50-420 мг% (IgA, IgM) и 800-1680 мг% (IgG).
IgM
Из всех иммуноглобулинов IgM организован наиболее сложно и имеет
наибольшую мол. массу 950 кД. Он состоит из пяти мономеров, каждый из
которых включает две тяжелые цепи (μ- цепи) и две легкие цепи (κ- или λтипов). Мономеры объединены в единую пентамерную молекулу
дисульфидными связями (-S-S-) и J-цепью. Пять мономерных субъединиц
расположены радиально. При этом Fc-фрагменты направлены в центр круга,
a Fab-фрагменты — кнаружи. В состав μ-цепи входит четыре С- домена (Сн1,
Сн2, СнЗ и Сн4), но при этом в структуре тяжелой цепи отсутствует
шарнирный участок. В какой-то степени его функцию выполняет Сн2-домен,
имеющий остатки пролина. Предполагается, что именно этот домен явился
эволюционным предшественником шарнирной области у- и а-цепей IgG и
IgA соответственно.
Предпоследний остаток цистеина в хвостовом С-концевом отрезке,
содержащем 18 аминокислотных остатков, очевидно, необходим для
полимеризации мономеров в пентамер с помощью J-цепи.
Каждая μ -цепь имеет по пять олигосахаридов; один — в Сн1, три — в
СнЗ и один — в хвостовой части.
На первичное введение в организм антигена вырабатываются IgM. Они
отличаются выраженной авидностью; обладая 10 антигенсвязывающими
центрами, образуют прочные соединения с антигенами, несущими
множественные эпитопы; вызывают агглютинацию; обеспечивают
2
3
устойчивость к бактериальным инфекциям. Сохраняются IgM, однако
недолго, и период их полувыведения не превышает 5 дней.
В процессе гуморального иммунного ответа наиболее ранние антитела
относятся к IgM-классу. Они же первыми появляются в онто- и филогенезе.
Наибольшую активность IgM проявляет в антибактериальном иммунитете и
при некоторых аутоиммунных заболеваниях.
Авидность — суммарная сила множественных ("многоточечных") взаимодействий между
клетками или молекулами, что отличает этот показатель взаимодействия от аффинности
как силы взаимодействия отдельного участка в системе рецептор-лиганд.
IgG
В количественном отношении доминирует.
Среди всех классов иммуноглобулинов в сыворотке млекопитающих
он составляет около 75% от общего количества этих белков. Отдельная молекула включает две тяжелые у-цепи и две легкие обоих типов.
Молекулярная масса IgG равна приблизительно 150 кД. У человека и мыши
описаны по четыре подкласса IgG, которые впервые были обнаружены
серологическими методами. Тяжелые цепи этих подклассов обозначаются
как γl, γ2, γЗ и γ4. Порядковый номер указывает на количественное
содержание каждого подкласса в сыворотке: в наибольшем количестве
представлен IgGγl , в наименьшем — IgGγ4. Степень гомологии между
разными подклассами человека высока и составляет 90-95%. Различия
связаны в основном с шарнирной областью, хотя в С-доменах также
встречаются отдельные аминокислотные замены.
Шарнирная область характеризуется значительным числом остатков
пролина и цистеина, что определяет ее гибкость. Количество дисульфидных
связей этой части молекулы варьирует от одного подкласса к другому. Так, в
γl- и γ4-цепях таких связей две, в γ2-цепях — четыре, а в γЗ-цепях —
одиннадцать. Именно эти -S-S- связи обеспечивают взаимодействие двух
тяжелых цепей.
Биологическая роль IgG разнообразна. При повторном попадании
антигена в организм происходит бурная выработка IgG, обеспечивающих
нейтрализацию бактериальных токсинов и вирусов. Связываясь с
микроорганизмами, IgG активируют комплемент, вызывают хемотаксис
нейтрофилов. Микрофаги быстро поглощают бактерии, обработанные IgG и
комплементом, так как имеют рецепторы к Fc-фрагменту антител и СЗвсубфракций комплемента. IgG легко проникают через барьеры, в частности
сквозь плаценту, попадая в кровь плода. В последующем их титр
пополняется при кормлении ребенка грудью, что обеспечивает ему
иммунитет в первые недели жизни. Период полувыведения IgG – 24 дня.
IgA, IgAS, IgE вырабатываются как на первичное, так и на вторичное
воздействие антигена.
IgA
Доминирующим иммуноглобулином секретов желез организма
(слюны, пищеварительного сока, выделений слизистой носа и молочной
железы) является IgA. В сыворотке крови его содержание незначительно и
3
4
составляет всего 10-15% от общего количества всех иммуноглобулинов.
Мономерная форма IgA построена по классическому типу. Тяжелая цепь
включает V-область, три домена С-области и шарнирный участок. У человека
известно два подкласса этого иммуноглобулина: IgAl и IgA2.
Соответствующее обозначение тяжелых цепей: αl и α2. Без учета шарнирного
участка степень гомологии между al и а2 очень высока и составляет около
95%. Кроме того, подкласс IgA2 имеет два аллельных варианта — аллотипы
А2m(1) и А2m(2).
За исключением шарнирного участка различия между подклассами IgAl
и IgA2 касаются 14 положений аминокислотных остатков в С-областях
тяжелых цепей. При этом различия между аллотипами А2m(1) и А2m(2) в
этих положениях отсутствуют, но они представлены в других участках
тяжелых цепей, вблизи шарнирного участка. Именно эти положения
определяют серологически выявляемые различия между аллотипами.
Шарнирные области al- и а2-цепей значительно отличаются друг от
друга. al-Цепь имеет в этом месте на 13 аминокислотных остатков больше,
чем а2-цепь. В слюне и содержимом толстого кишечника человека
представлены протеолитические ферменты, способные расщеплять IgAl
именно в дублированной части цепи. Подобной же активностью обладают
протеолитические ферменты некоторых бактерий, таких как Streptococcus
sanguis, Neisseria gonorrhea, N.meningitidis. В то же время делеция 13
аминокислот у IgA2 в данном месте шарнира обеспечивает устойчивость
этого подкласса IgA по отношению к бактериальному протеолизу. Вероятно,
IgA2 эволюционно возник в результате способности избегать бактериального
ферментативного разрушения. Благоприобретенность подобного признака
кажется очевидной.
Структурными особенностями IgA являются наличие в молекуле J-цепи
и секреторного компонента. J-Цепь, как и у IgM, служит для полимеризации
молекулы. Молекулярная масса цепи незначительна и составляет около
15 кДа. Данный полипептид не имеет гомологии с иммуноглобулинами, а
кодирующий его ген локализован в хромосоме, не содержащей генов
иммуноглобулинов. На заключительном этапе синтеза J-цепь взаимодействует с СООН-концевым участком тяжелой цепи через дисульфидные связи. В
результате образуются полимерные формы IgA, представляющие собой в
основном димеры, хотя в незначительном количестве имеются и
мультимерные молекулы, включающие три и более мономера.
Сывороточные IgA накапливаются в крови. Биологическая роль их до
конца не изучена. Секреторные IgAS продуцируются в слизистых оболочках
кишечника, верхних дыхательных и мочевыводящих путей, содержатся в
глазной жидкости, слюне, молоке и обеспечивают местный иммунитет
тканей. Период полувыведения — 6 дней.
Для IgA, представленного в секретах, характерно наличие секреторного
компонента. При специфическом взаимодействии димера (IgA)2-J с
секреторным компонентом на клеточной поверхности образуется комплекс,
который после эндоцитоза перемещается в цитоплазме к апикальной части
4
5
клетки. Здесь комплекс подвергается действию протеолитических
ферментов, что позволяет ему высвобождаться в секреты субэпителиального
пространства.
Функционально IgA выступает в качестве первой линии защиты на
слизистых поверхностях, препятствуя проникновению вирусов в организм.
Хотя IgA не связывает комплемент и в силу этого не обладает бактерицидной
активностью, он играет важную роль в нейтрализации бактериальных
токсинов. Кроме того, у млекопитающих, включая человека, секреторный
IgA хорошо представлен в молозиве и обеспечивает таким образом
специфический иммунитет новорожденных.
IgE
Содержание IgE в сыворотке крайне мало, хотя удельный вес этих
иммуноглобулинов в аллергических реакциях является доминирующим. IgE
представляет собой мономер с мол. массой около 190 кД, включающий две
тяжелые цепи (ε-цепи) и две легкие. ε -Цепь, как и m-цепь, содержит пять
доменов: один V8- и четыре С -домена.
Функциональная активность IgE проявляется в развитии аллергических
реакций. Данный иммуноглобулин способен взаимодействовать с тучными
клетками и базофилами посредством Fc- области и соответствующего
рецептора на этих клетках. После связи IgE с антигеном (аллергеном) тучные
клетки получают сигнал к секреции вазоактивных аминов и других
фармакологически значимых соединений, что собственно и приводит к
развитию аллергической реакции.
Период полувыведения — 2,5 дня.
IgD
Иммуноглобулин класса D находится на поверхности В-лимфоцитов и
вместе с мономерными IgM составляет основную часть их рецепторов.
Иммуноглобулин D был открыт как необычный миеломный белок.
Затем его обнаружили в сыворотке крови в очень небольшом количестве. У
человека 5-цепь включает три С-домена в отличие от IgD мышей,
содержащего только два С-домена: Сσ1 и Сσ3. Вопрос о форме участия IgD в
иммунных процессах остается открытым.
Теории образования иммуноглобулинов в клетках
В самой сжатой форме все появившиеся со времен П. Эрлиха
гипотетические построения, касающиеся феномена иммунологической
специфичности, можно разбить на две группы: инструктивные и
селективные.
Инструктивные теории рассматривали антиген в качестве пассивного
материала — матрицы, на которой формируется антигенсвязующий участок
антител. По этой теории все антитела имеют одну и ту же
последовательность аминокислотных остатков. Различия касаются третичной
структуры и возникают в процессе окончательного формирования молекулы
антитела вокруг антигена. В настоящее время инструктивные теории
5
6
полностью оставлены и имеют лишь исторический интерес. Они не
выдержали проверки временем и вошли в противоречие с данными как
иммунологии, так и молекулярной биологии. С иммунологических позиций
они не объясняли, во-первых, почему количество антител в молярном
отношении значительно больше количества проникшего в организм
антигена, и, во-вторых, не отвечали на вопрос, за счет чего формируется
иммунологическая память. С позиций молекулярной биологии они
противоречили основной догме биологии, гласящей, что специфичность
белка строго закодирована в последовательности нуклеотидов ДНК в
хромосоме, а третичная структура связана с первичной структурой и не
может в определенных пределах свободно меняться под влиянием факторов
внешней среды без нарушения или полной потери функции.
Более плодотворными оказались селективные теории вариабельности
антител. История развития иммунологической мысли в направлении
селективных теорий началась с первого построения П.Эрлиха. В основе всех
селективных теорий лежит представление о том, что специфичность антител
предопределена, и антиген выступает лишь в качестве фактора отбора
соответствующих по специфичности иммуноглобулинов.
В 1955 г. вариант селективной теории выдвинул Н.Ерне (1955). По его
представлениям, в организме постоянно присутствуют антитела самой
разнообразной специфичности. Антитело после взаимодействия с
соответствующим
антигеном
поглощается
фагоцитирующими
мононуклеарами, что приводит к активной продукции этими клетками
антител исходной специфичности.
Особое место в иммунологии занимает клонально-селекци онная теория
иммунитета М. Бернета (1959). Он использовал представления П. Эрлиха и
Н. Ерне о предсуществовании антител разной специфичности, но указывал на
то, что каждое специфическое антитело синтезируется отдельным клоном
клеток. По М. Бернету, при дифференцировке лимфоцитов от стволовой
кроветворной клетки и при параллельном процессе мутационных изменений
в генах, контролирующих синтез специфических антител, возникают клоны
клеток, которые способны взаимодействовать только с антигеном
соответствующей специфичности. В результате такого взаимодействия
формируется отобраный по специфичности клон, который либо секретирует
антитела заданной специфичности, либо обеспечивает строго специфическую
клеточную реакцию. Клонально-селекционный принцип организации иммунной системы, выдвинутый М. Бернетом, полностью подтвердился в
настоящее время. Недостатком теории являются представления о том, что
многообразие антител возникает только за счет мутационного процесса.
В то время, когда М. Бернет разрабатывал свою теорию, ничего не было
известно о генах иммуноглобулинов и их рекомбинации в процессе
созревания В-клеток. Основной принцип селекции специфических клонов
сохранен в теории зародышевой линии Л. Худа и соавт. (1971). Однако
первопричину многообразия клонов авторы видят не в повышенной
мутабельности иммуно глобулиновых генов, а в исходном зародышевом их
6
7
предсуществовании. Весь набор V-генов, контролирующих вариабельную
область иммуноглобулинов, представлен изначально в геноме и передается
от поколения к поколению без изменений. В процессе развития В-клеток
происходит рекомбинация иммуноглобулиновых генов, так что отдельно
взятая созревающая В-клетка способна синтезировать иммуноглобулин
одной специфичности. Такая моноспецифическая клетка становится
источником клона В-клеток, продуцирующих определенный по
специфичности иммуноглобулин.
Таким образом, теоретическая мысль в иммунологии развивалась от
представлений П. Эрлиха о предсуществовании специфических антител и
выдвижения клонально-селекционного принципа М. Бернетом до
представлений о том, что клональность развития В-клеток предопределена в
зародышевой линии и формируется в результате рекомбинации
иммуноглобулиновых генов. Объединяющим моментом всех этих
теоретических построений является убежденность в том, что антиген —
лишь фактор селекции, но не участник формирования специфичности.
ГЕНЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
На основании данных о двойственности в строении иммуноглобулинов
— наличии вариабельной и константной областей в структуре молекулы —
Дрейер и Беннет еще в 1965 г. высказали предположение об участии двух
генов (V и С) в построении единой тяжелой или легкой цепей молекулы.
Для млекопитающих известны три группы сцепления иммуноглобулиновых генов, расположенных на разных хромосомах: группы
сцепления для двух легких цепей и группа сцепления для тяжелых цепей.
В незрелых В-клетках или в любых других клетках V-гены и С-гены
той или иной группы сцепления, находясь на одной и той же хромосоме,
удалены друг от друга на значительное расстояние. Подобная нативная
локализация генов для иммуноглобулинов определяется как состояние
зародышевой линии (англ. "germline"). Однако по мере созревания В-клеток
от некоммитированных предшественников к зрелым формам происходит
реорганизация генома, так что пространственно удаленные генные сегменты
оказываются в непосредственной близости друг от друга, образуя единый
информационный участок. Этот процесс перестройки генетического
материала получил название соматической рекомбинации. Он связан только с
соматическими клетками (в случае с иммуноглобулиновыми генами —
только с В-клетками), не наследуется и, следовательно, не затрагивает
половые клетки.
Вариабельность иммуноглобулинов, точнее V-доменов тяжелых (IgH)
и легких (IgL) цепей этих молекул, зависит от нескольких внутриклеточных
явлений:
1)
наличия в геноме множества V-генов как для IgH, так и для
IgL, каждый из которых кодирует самостоятельный и отличающийся по
специфичности V-домен;
7
8
процесса соматической рекомбинации: поскольку V-локус
включает не только собственно V-гены, но и несколько дополнительных
генных сегментов — D и J, то образование зрелого V-гена (VDJ для IgH или
VJ для IgL) является результатом случайного сочетания в процессе
рекомбинации одного из V-генов с одним из D- и J-генных сегментов;
У некоторых видов, например птиц, наблюдается явление генной
конверсии — включение в состав активного V-гена нуклеотидов из
псевдогенов («молчащих» генов), что, естественно, меняет специфичность
основного гена;
4) ошибок рекомбинации: в процессе рекомбинации — объединения
одного из V-генов с одним из D- и J-генных сегментов, когда идет процесс
делеции («вырезания» некодируемой части Д НК , расположенной между
генными сегментами), возможен захват пограничных для V-, D-, J-генных
сегментов нуклеотидов, ошибки рекомбинации также вносят свой вклад в
разнообразие зрелых V-генов;
5) взаимодействия IgH с IgL при внутриклеточном образован и и
иммуноглобулина: поскольку сформировавшаяся иммуноглобулиновая
молекула состоит из Н- и L-полипептидов, V-домены которых совместно
образуют антигенраспознающий участок, а в клонах В-клеток специфичность
таких V-доменов случайна, то случайной будет и специфичность всей
молекулы;
6) явления соматического мутагенеза — точечных замен в
последовательности нуклеотидов V-генов при созревании В-клеток.
2)
8