АРТЮШЕНКО Сергей Владимирович ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ
реклама
На правах рукописи АРТЮШЕНКО Сергей Владимирович ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ В ОТНОШЕНИИ ПАРАМИКСО – И ОРТОМИКСОВИРУСОВ (КОРЬ И ГРИПП) 03.02.02 – вирусология 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Научные руководители: доктор биологических наук Надежда Васильевна Юминова кандидат биологических наук Николай Александрович Контаров Официальные оппоненты: доктор биологических наук Виктор Николаевич Ляпустин кандидат биологических наук Анатолий Ахсарбекович Катаев Ведущее учреждение: ФБГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России Защита состоится «24» ноября 2011 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. Автореферат разослан «21» октября 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.В. Яковлева Актуальность проблемы Известно, что ряд веществ обладает повреждающим действием на вторичную структуру белков и ферментов (Дурденко Е.В. и др., 2011). Одними из таких веществ являются полиэлектролиты (ПЭ) - полимеры, в состав молекул которых входят группы, способные в растворе к ионизации. Известно, что ПЭ обладают повреждающим действием на вторичную структуру белков и ферментов. Также известно, что некоторые ПЭ обладают выраженным иммуностимулирующим действием в отношении Т- и Влимфоцитов (Р.М. Хаитов и др., 2003). Однако, на данный момент практически ничего не известно о влиянии используемых в работе ПЭ на вирусные белки и вирусную оболочку. В ряде работ (Haldar J, An D, 2006, Slita А.V., 2007) указывается на наличие у определенных ПЭ антимикробной активности и вирусингибирующего действия в отношении вируса простого герпеса 1 типа, но отсутствует подробное описание механизмов наблюдаемых явлений. В нашей работе было изучено взаимодействие ПЭ с поверхностными антигенными белками и вирусной оболочкой, а также противовирусная активность полиэлектролитов в отношении вирусов гриппа и кори. Грипп – высококонтагиозное вирусное заболевание людей, птиц и млекопитающих. Грипп обладает уникальными инфекционными свойствами, а именно склонностью к крупным вспышкам (эпидемиям и даже пандемиям), и является единственной инфекцией, вызывающей в последние столетия пандемии. Гриппозные пандемии характеризуются глобальным распространением болезни с поражением всех возрастных групп населения. В России на грипп и ОРВИ ежегодно приходится 90% регистрируемой инфекционной заболеваемости (до 30 млн. больных, из них 45-60% дети). Экономический ущерб, причиняемый гриппом и ОРВИ, составляет 87% от экономических потерь, наносимых инфекционными болезнями. В течение 2005-2011 гг. выявлены изменения в эпидемиологии гриппа животных. 1 Продолжают возникать случаи заболевания людей, вирус распространился географически на новые страны. Новый штамм вируса гриппа А/H1N1/California/04/09 впервые выделен весной 2009 года в Калифорнии и Мексике. Быстрое распространение нового вируса послужило причиной объявления Всемирной организацией здравоохранения VI фазы развития пандемии. На сегодняшний день трудно назвать в мире страну, в которой не были бы отмечены случаи заболевания гриппом, вызванным пандемическим вирусом H1N1 – 2009 (Johnson N.P et al.,2010). Эффективность современных вакцин ограничивается постоянно меняющимся антигенным разнообразием вируса гриппа. Поэтому при появлении нового штамма необходимо заниматься созданием новой вакцины, что экономически невыгодно. В связи с этим появление нового класса препаратов с вирусингибирующим действием на полиэлектролитной основе может решить данную проблему за счет его сочетанного воздействия как на вирусные антигенные белки вне зависимости от подтипов гемагглютинина (H) и нейраминидазы (N), так и на фосфолипидную мембрану вирионов, липидный состав которых практически не изменяется в процессе эволюции вирусов. Корь — заболевание, острое, высококонтагиозное, распространяющееся антропонозное воздушно-капельным вирусное путём, и проявляющееся общей интоксикацией, характерной макуло-папулёзной сыпью на коже, катаром верхних дыхательных путей и конъюктив. Восприимчивость к кори всеобщая, контагиозный индекс составляет 95-96%. Заболеваемость наиболее высока в детском возрасте. В довакцинальный период корь была распространена повсеместно и являлась одной из основных причин смертности детей раннего возраста. В настоящее время в России реализуется программа элиминации кори и уровень заболеваемости этой инфекцией низок. Вместе с тем отмечается немало случаев заболеваний среди подростков и взрослых лиц, особенно в регионах Африки, их доля в общей заболеваемости высока. По данным ВОЗ в мире ежегодно 2 регистрируется до 30 млн. случаев заболевания корью, из которых более 500 тыс. заканчиваются летальным исходом (WНО, 2010). Одновременной элиминации кори во всех 6 регионах мира не произойдёт (Зверев В.В., Юминова Н.В. и др., 2011). Еще в течение 7-15 лет в Европейском, Американском, Тихоокеанском и других регионах мира будет существовать серьёзная опасность заноса на эти территории неэндемичных диких штаммов вируса кори и возможно, возникновение вспышек этого тяжелого вирусного заболевания особенно среди взрослого населения. В этой связи, разработка новых химиопрепаратов, основой которых являются ПЭ, будет способствовать повышению эффективности методов лечения вирусных инфекций, за счёт комплексного, одновременного воздействия ПЭ на антигенные белки и вирусную мембрану, приводящая к инактивации вируса. Цель исследования Разработка теоретических и научно-практических основ химиотерапии оболочечных вирусов для создания и применения ПЭ, направленных на лечение высококонтагиозных вирусных инфекций на примере вирусов гриппа и кори. Задачи исследования 1. Изучение полиэлектролитов, обладающих наиболее выраженным вирусингибирующим действием и выбор оптимальных нетоксических концентраций исследуемых полиэлектролитов. 2. Использование методов кругового дихроизма и белковой флуоресценции для оценки структурно-функциональной целостности поверхностных вирусных белков. 3 3. Разработка методики для оценки кинетических параметров нейраминидазной активности после взаимодействия с ПЭ. 4. Количественный анализ противовирусной активности ПЭ по отношению к вирусам гриппа и кори. 5. Выявление возможных механизмов вирусингибирующего действия выбранных ПЭ на различные штаммы вирусов гриппа и кори. Научная новизна Впервые изучено влияние ПЭ полистиролсульфоната (ПСС) с различными степенями полимеризации и полиаллиламина (ПАА) с молекулярными массами 6 и 8 кДа на инфекционность различных штаммов вирусов гриппа и кори. Показано выраженное вирусингибирующее действие ПСС-8 и ПАА (6 кДа) в отношении вирусов гриппа и кори, характеризующееся достоверным снижением инфекционного титра вирусов. Определён диапазон нетоксических концентраций для ПСС-8 - 1-40 мМ, и ПАА (6 кДа) - 1-40 мкМ, с IC50 = 3,8 ± 0,19 мМ и 1,8 ± 0,09 мкМ, соответственно. Впервые для оценки воздействия ПЭ на структурно-функциональные состояния антигенных вирусных белков были использованы методы кругового дихроизма и белковой флуоресценции. Для изучения изменения физикохимических параметров вирусной мембраны после взаимодействия с используемыми в работе ПЭ впервые в качестве экспериментальных моделей были использованы плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ). Определены константы скорости инактивации нейраминидазы ПСС-8 и ПАА. Определен тип ингибирования нейраминидазы указанными ПЭ. Выявлены возможные механизмы вирусингибирующего действия ПЭ на поверхностные вирусные белки и фосфолипидную мембрану вирионов. 4 Практическая значимость работы Использованные в работе методические приемы могут быть использованы исследователями для изучения структурно-функциональных изменений вирусных белков и оболочки вирусов. Полученные автором данные позволяют научно обосновать перспективу создания новых лекарственных средств на основе исследованных в работе полиэлектролитов для борьбы с высококонтагиозными вирусными инфекциями. Апробация материалов диссертации и публикации Материалы диссертации доложены на Международной конференции «Развитие научных заболеваниями» конференции исследований (Санкт-Петербург, и надзор 2010), «Вакцинология за научно 2010. инфекционными – практической Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010), научной конференции молодых учёных НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (Москва, 2011). Апробация диссертации состоялась 14 июня 2011 г. на научной конференции отдела вирусологии НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН. Основные положения диссертации изложены в 7 печатных работах, в том числе в 3 журналах, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 94 страницах машинописного текста, иллюстрированы 2 таблицами, 17 рисунками. 5 Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов и выводов. Список цитируемой литературы включает 120 работ отечественных и зарубежных авторов. Содержание работы Материалы и методы исследования Вирусы. В работе использовались очищенные штаммы вируса гриппа: А/ВЧП/Вейбридж (Н7N7), А/Маллард Пенсильвания/10218/84 (H5N2), A/NIBRG-14 (H5N1) и вирус кори штамм Л-16 с исходным инфекционным титром 4,5 lg ТЦД50/мл и 3,0 lg ТЦД50/мл, соответственно. ПЭ: Растворы ПСС со степенями полимеризации 8, 31, 77, 170, 360 и 430 («Sigma», США) готовили на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащим 0,5 мМ ЭДТА. Раствор ПАА с молекулярной массой 6 и 8 кДа («Sigma», США), готовили на 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 9,0, содержащим 0,5 мМ ЭДТА. Концентрацию ПЭ в растворе рассчитывали относительно заряженных групп, конечная концентрация ПЭ составляла 180 мМ для ПСС и 1-80 мкМ для ПАА. ПЭ представлены на рис.1. и Рис.1 ПАА ПСС 6 Спектры флуоресценции флуоресценции и поверхностных кругового вирусных дихроизма. белков Спектры регистрировали на спектрофотометре Zenith 200st (РФ) в термостатируемой кювете с длиной оптического пути 1,0 см при возбуждении светом с длиной волны 295 нм. Спектры кругового дихроизма регистрировали на дихрографе Jasco J-810 (Япония) в термостатируемой кювете с длиной оптического пути 0,1 см при длине волны 222 нм. Титрование вирусов. Титрование вируса кори осуществлялось в перевиваемой культуре клеток Vero (состав поддерживающей среды: питательная среда ДМЕМ (ФГУП “НПО “Микроген” РФ), пенициллинстрептомицин (Gibco, США), 10% фетальная бычья сыворотка (Gibco, США), концентрация клеток составляла 2,5·106 кл/мл. С целью определения ЦПД вирусы гриппа титровали в перевиваемой культуре клеток линии MDCK (состав поддерживающей среды: питательная среда RPMI-1640 (ФГУП “НПО “Микроген” РФ), ТРСК — трипсин (три-тозил-1-фенилаланилхлорэтилкетон) в конечной концентрации 2 мкг/мл, пенициллин - стрептомицин (Gibco, США), 10% фетальная бычья сыворотка (Gibco, США), концентрация клеток составляла примерно 2,0·106 кл/мл, инфекционный титр по ЦПД рассчитывался по методу Рида-Менча в модификации Томпсона (Tompson et al., 1948). Добавление ПЭ в поддерживающую среду проводили через 30 мин после инфицирования клеточного монослоя. Исследование за кинетикой снижения инфекционного титра проводилось в течение 7 суток. Множественность заражения для всех вирусов составляла 0,01 ТЦД50/кл. Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов осуществляли с применением методов параметрической статистики и однофакторного дисперсионного анализа, используя пакет программ Statistica 6,0. Получение вирусных белков. Поверхностные вирусные белки, используемых в работе вирусов (гемагглютинин вируса гриппа – Н, F – белок вируса кори), получали с помощью инкубирования их в водном растворе 7 октил-β-D-глюкопиранозида. Нуклеопротеид отделяли от смеси вирусных белков с помощью ультрацентрифугирования. Детергент удаляли диализом против бидистиллированной воды. Неструктурные белки вирусов изолировали с помощью препаративного электрофореза вирусных белков в полиакриламидном геле после дезинтеграции вирионов в додецилсульфате натрия. Додецилсульфат натрия удаляли диализом против бидистиллированной воды. Чистоту препарата контролировали с помощью диск-электрофореза. Бислойные липидные мембраны. БЛМ формировали по методу Мюллера (Mueller P. et al.,1968) на отверстии в тефлоновой кювете диаметром 0,5 мм в растворе 0,2 М КСl + 5 мМ трис - НСl, pH – 7,4. Для формирования БЛМ использовали раствор азолектина в н-гептане концентрации 26 мг/мл. Все измерения проводились при 250С. Вирусные белки и ПЭ добавляли к БЛМ с одной стороны кюветы в количествах соответствующих конечным концентрациям 10-6 – 3,2·10-6 М и 30·10-3 М, соответственно. Концентрации вирусных белков определяли по методу Лоури (Lowry O. et al. 1951). Коэффициент поверхностного натяжения. Измерения коэффициента поверхностного натяжения БЛМ основывалось на несимметричном изменении гидростатического давления буферного раствора при опускании электрода в одну из сторон кюветы. При этом избыточное гидростатическое давление компенсируется действием сил поверхностного натяжения: gh 4 , R где - плотность раствора, g – ускорение свободного падения, h – разность уровней, R – радиус мембраны, - коэффициент поверхностного натяжения. Цитотоксичность препаратов. Цитотоксичность действия полимеров оценивали по жизнеспособности клеток, которую определяли с помощью MTT — теста (колориметрический тест определения митохондриальных 8 дегидрогеназ) (Niks M, Otto M, 1990). Клетки рассеивали в 96-луночные планшеты по 2,5·104 клеток линии MDCK и Vero в лунку в питательной среде RPMI-1640. Через одни сутки её удаляли и добавляли питательную среду без сыворотки с исследуемыми ПЭ (конечная концентрация от 1 до 80 мМ для ПСС и от 1 до 80 мкМ для ПАА) или без них. После 1,5 часов инкубации клеток при 370С инкубационную среду удаляли и вносили свежую среду. В каждую лунку добавляли 0,5 мг/мл диметилтиазолил)-2,5-дифенилтетразолий MTT бромид) – реагента («Sigma», (3-(4,5США) в фосфатно-буферном растворе и инкубировали 2 часа 40 минут при 370С в атмосфере 5% CO2. О количестве жизнеспособных клеток судили по изменению величины оптической плотности на спектрофотометре Zenith 200st (РФ) при длине волны 570 нм. Оценка выживаемости клеток. Выживаемость клеток оценивали с использованием трипанового синего. Клеточную суспензию вносили по 105 клеток линии MDCK и Vero в лунку планшета в питательной среде без сыворотки и инкубировали с ПЭ (конечная концентрация 1-80 мМ для ПСС и 1-80 мкМ для ПАА (6 кДа)) или без них при 370С в течение 30, 60 или 90 минут. Затем клетки окрашивали 0,2%-ным трипановым синим и через 5 минут подсчитывали количество живых (с интактной мембраной) и неживых (с повреждённой мембраной и потому окрашенных) клеток, используя камеру Горяева. Определение IC50. С целью определения IC50 ПЭ использовали ПАА (6 кДа) и ПСС–8 в диапазоне конечных концентраций 1-40 мкМ и 1-40 мМ, соответственно. IC50 определяли как концентрацию ПЭ, при которой инфекционный титр вируса по ЦПД уменьшался на 50% от исходного. Определение активности нейраминидазы вируса гриппа. Использовали штаммы вируса гриппа после удаления низкомолекулярных ингибиторов нейраминидазы диализом против бидистиллированной воды. Субстратом нейраминидазы являлся фетуин («Sigma», США) в конечных концентрациях от 0,052 до 1,2 мкМ для ПАА (6 кДа) и от 0,052 до 1,2 мМ 9 для ПСС-8. Для построения калибровочной кривой готовили ряд пробирок, содержащих от 5 до 40 мкг N-ацетилнейраминовой кислоты («Sigma», США) в 0,2 мл 0,2 М фосфатно-буферного раствора, рН = 6,0. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 0,1 мл перийодатного реагента, тщательно перемешивали и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. К смеси добавляли 1,0 мл арсенитного реагента и перемешивали до тех пор, пока выпавший в осадок йод не растворится вновь. К смеси добавляли 2,5 мл тиобарбитуратного реагента, перемешивали и помещали на 15 мин в кипящую водяную баню. При этом смесь становилась темно-розовой, но при охлаждении бледнела. К смеси добавляли 4 мл бутанолового реагента (N-бутанол, содержащий 5% по объему концентрированной HCl) и интенсивно встряхивали, чтобы экстрагировать окрашенное вещество. Пробирки центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге при комнатной температуре, отбирали водную (нижнюю) фазу и определяли на спектрофотометре Zenith 200st (РФ) величину поглощения при длине волны 549 нм с соответствующим контролем (Мейхи Б., 1988). Определение типа ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа ПЭ комбинированным методом Диксона и ЛайнуивераБерка. Метод Диксона обладает тем преимуществом по сравнению с методом Лайнуивера-Берка, что он позволяет определять значение константы ингибирования непосредственно из кинетических данных, не прибегая к дополнительным построениям. С другой стороны, график в координатах Диксона не позволяет отличить смешанный тип ингибирования от конкурентного или неконкурентного ингибирования, как это можно сделать в координатах Лайнуивера-Берка. Поэтому в ряде случаев ингибирования наиболее эффективным методом обработки экспериментальных данных является совместный анализ графиков Лайнуивера-Берка (Butterworth P., 1972). 10 в координатах Диксона и Результаты собственных исследований и их обсуждение 1. Исследование токсичности используемых полиэлектролитов. Оценка токсичности полиэлектролитов ПСС со степенями полимеризации 8, 31, 77, 170, 360 и 430, ПАА с молекулярной массой 6 и 8 кДа проводилось по данным выживаемости и жизнеспособности клеток линии MDCK и Vero. Жизнеспособность клеток оценивали по результатам MTT–теста. Выживаемость клеток оценивали путём подсчёта клеток, окрашенных трипановым синим, в камере Горяева. На основе данных по жизнеспособности клеток линии MDCK был определён нетоксический диапазон концентраций для ПСС всех степеней полимеризации, который составил 1-40 мМ (Рис. 2, данные приведены для ПСС-8). Рис.2 Жизнеспособность клеток линии MDCK по данным МТТ - теста (оценка активности митохондриальных дегидрогеназ) после добавления различных концентраций ПСС - 8 (p<0,05) Доля живых клеток,% 120 100 80 60 40 20 0 к 1 10 20 30 40 50 60 70 80 Концентрация ПСС,С, мМ Оценка жизнеспособности клеток после взаимодействия с ПАА с молекулярными массами 6 и 8 кДа показала, что для ПАА (6 кДа) характерен нетоксический диапазон 1-40 мкМ (рис.3), в то время как ПАА (8 кДа) оказывал выраженный токсический эффект на клетки уже при концентрации 30 мкМ (рис.4). В результате исследований была также получена зависимость 11 доли живых клеток от степени полимеризации ПСС для различных концентраций (1-80 мМ) по данным окрашивания клеток трипановым синим (табл.1). Таблица 1 Зависимость выживаемости клеток линии MDCK от концентрации ПСС и ПАА (6 кДа) (окрашивание трипановым синим). Доля живых клеток, % Концентрация ПЭ, мМ (для ПСС), мкМ (для ПАА) ПСС-8 ПСС31 ПСС77 ПСС170 ПСС360 ПСС430 ПАА (6 кДа) 0 100 100 100 100 100 100 100 1 100 98± 2 97± 3 97±2 96 ± 2 96± 2 95±2 10 100 95±2 95±1 95±2 95±1 94±2 100 20 100 90±2 87±2 84±2 80±2 80±2 100 30 97±1 85±1 80±2 74±2 67±1 61±2 99±1 40 85±2 74±2 71±1 60±2 57±3 52±1 90±2 50 80±2 65±2 59±2 54±1 49±2 46±2 86±2 60 52±2 40±1 38±2 37±2 32±1 28±2 54±2 70 36±1 35±2 31±2 28±2 26±2 22±2 41±2 80 29±2 25±2 20±2 16±2 14±2 10±2 34±2 12 Рис. 3 Жизнеспособность клеток линии MDCK по данным МТТ - теста после добавления различных концентраций ПАА (6 кДа) (p<0,05) 120 Доля живых клеток,% 100 80 60 40 20 0 к 1 10 20 30 40 50 60 70 80 Концентрация ПАА (6 кДа), С, мкМ Из полученных данных можно заключить, что наибольший процент выживших клеток после взаимодействия с ПСС с различными степенями полимеризации и ПАА (6 кДа) наблюдается при концентрациях 1-40 мМ для ПСС и 1-40 мкМ для ПАА (6 кДа). ПАА (8 кДа) обладал высокой токсичностью при более низких концентрациях (начиная с 30 мкМ), чем ПАА (6 кДа) и поэтому не использовался в последующих исследованиях. Для клеток линии Vero получены идентичные результаты по выживаемости клеток для ПСС и ПАА. 13 оценки жизнеспособности и Рис.4 Жизнеспособность клеток линии MDCK по данным МТТ - теста после добавления различных концентраций ПАА (8 кДа) (p<0,05) 120 Доля живых клеток,% 100 80 60 40 20 0 к 1 10 20 30 40 50 60 70 80 Концентрация ПАА (8 кДа), С, мкМ Дальнейшим этапом исследований явилось изучение вирусингибирующего действия указанных ПЭ в отношении вирусов гриппа и кори. 2. Изучение влияния ПЭ на инфекционность вирусов кори и гриппа. В последние годы появилось большое количество исследований, посвященных изучению взаимодействия различных ПЭ с белками и ферментами. В отношении изучения влияния ПЭ на вирусные белки на данный момент практически ничего не известно. Чтобы восполнить этот пробел в представленной работе было впервые подробно изучено взаимодействие ПСС и ПАА (6 кДа) с поверхностными белками вирусов кори и гриппа. Используемые в работе ПЭ выбраны не случайным образом. Известно, что ПЭ имеющие неполярный остов и, соответственно, высокую гидрофобность способны к разрушению структуры белка, в то время как ПЭ с полярным остовом, наоборот, защищают белковые структуры от повреждения. Одним из таких веществ является, например, декстрансульфат. В настоящей работе было изучено 14 влияние данных ПЭ на инфекционность вирусов кори и гриппа. После взаимодействия ПСС и ПАА (6 кДа) с вирусами кори и гриппа наблюдалось снижение инфекционного титра в среднем на 3,0 lg ТЦД50/мл. С помощью методов белковой флуоресценции и кругового дихроизма выявлено разрушающее действие ПСС и ПАА (6 кДа) на поверхностные белки вирусов кори и гриппа. По результатам оценки ЦПД вирусов кори и гриппа в культуре клеток Vero и MDCK после взаимодействия с 30 мМ ПСС со степенями полимеризации 8, 31, 77, 170, 360 и 430 наиболее выраженным вирусингибирующим действием обладает ПСС-8. Взаимодействие вирусов кори и гриппа и ПСС с другими степенями полимеризации не приводило к достоверному снижению инфекционного титра вируса. ПАА (6 кДа) в концентрации 30 мкМ обладал еще более выраженной противовирусной активностью (рис.5а, 5б). Отсутствие противовирусной активности у ПСС, имеющих степени полимеризации больших восьми, связано с уменьшением подвижности данных ПЭ при связывании с противоионами поддерживающей среды клеточных культур. Анализ спектров кругового дихроизма показал, что ПСС-8 и ПАА (6 кДа) оказывают выраженное повреждающее действие на - спирали поверхностных белков вирусов кори и гриппа. На рис. 6а, 6б приведены спектры кругового дихроизма, на которых видно уменьшение эллиптичности при длине волны 222 нм, при которой определяются спиральные участки белков. Как видно из рис. 7а, 7б, интенсивность флуоресценции вирусных белков падает при добавлении ПСС-8 и ПАА (6 кДа) по сравнению с контролем, что также указывает на повреждение вторичной структуры поверхностных вирусных белков. 15 Рис.5а Кинетика снижения инфекционного титра вируса кори Инфекционный титр, lg ТЦД50/мл 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 1 4 5 6 Время инкубации, сут. 2 3 4 5 6 7 7 8 8 1- добавление к вирусу 30 мкМ ПАА (6 кДа), 2 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8, 3 – добавление к вирусу 30 мМ ПСС-31, 4 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-77, 5 добавление к вирусу 30 мМ ПСС-170, 6 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-360, 7 добавление к вирусу 30 мМ ПСС-430, 8 - контроль вируса. Рис.5б Инфекционный титр, Ig ТЦД 50/мл Кинетика снижения инфекционного титра вируса гриппа 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время инкубации, сут. 1 2 3 4 5 6 7 8 1- добавление к вирусу 30 мкМ ПАА (6 кДа) , 2 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8, 3 – добавление к вирусу 30 мМ ПСС-31, 4 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-77, 5 добавление к вирусу 30 мМ ПСС-170, 6 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-360, 7 добавление к вирусу 30 мМ ПСС-430, 8 - контроль вируса. 16 Рис.6а 1 – контроль вируса, 2 – добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8, 3 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-77, 4 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-170, 5 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-360, 6 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-430, 7 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС31, 8 - добавление к вирусу 30 мкМ ПАA (6 кДа). Рис.6б 1 – контроль вируса, 2 – добавление к вирусу 30 мМ ПСС-31, 3 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-77, 4 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-170, 5 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-360, 6 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-430, 7 - добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8, 8 - добавление к вирусу 30 мкМ ПАA (6 кДа). 17 Рис.7а 1 - контроль вируса, 2 – добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8, 3 – добавление к вирусу 30 мкМ ПАА (6 кДа). Рис.7б 1 - контроль вируса, 2 – добавление к вирусу 30 мМ ПСС-8, 3 – добавление к вирусу 30 мкМ ПАА (6 кДа). 18 Из полученных результатов можно сделать вывод, что механизм вирусингибирующего действия ПСС-8 и ПАА (6 кДа), который проявляется достоверным снижением инфекционного титра вирусов кори и гриппа, заключается в повреждении исследуемыми ПЭ вторичной структуры вирусных белков, а именно их - спиральных участков. Можно предложить два механизма разрушительного действия ПСС-8. Первый механизм заключается в связывании данного ПЭ с противоположно заряженными группами белка, что, в свою очередь, приводит к образованию крупных петель либо массивных «хвостов», которые в силу высокого вращательного момента становятся разрушительными. Второй механизм, касающийся не только ПСС-8, но и ПАА (6 кДа), основан на повреждающем действии вторичной структуры поверхностных вирусных белков с помощью гидрофобного остова указанных ПЭ с образованием ПЭ – белковых комплексов. Таким образом, полученные в данной работе результаты указывают на наличие как у поликатионов, так и у полианионов выраженного вирусингибирующего действия, что может послужить основанием для разработки нового противовирусного лекарственного препарата на основе вышеуказанных соединений. Методы белковой флуоресценции и кругового дихроизма можно рекомендовать к применению с целью выяснения повреждающего действия вторичной структуры белков, входящих в состав различных иммунобиологических препаратов, например вакцин. 3. Изучение влияния ПЭ на физико-химические свойства бислойной липидной мембраны. Перед исследованием взаимодействия ПСС-8 и ПАА (6 кДа) с БЛМ было изучено влияние вирусных белков на поверхностное натяжение БЛМ. При встраивании F – белка вируса кори и Н вируса гриппа в БЛМ обнаружено увеличение коэффициента поверхностного натяжения мембраны (рис.8), что может быть связано с глубоким проникновением 19 указанных белков в фосфолипидный слой БЛМ. Вследствие этого происходит изменение упаковки липидных молекул и соответствующее увеличение поверхностной энергии бислоя. При исследовании взаимодействия соединений ПСС-8 и ПАА (6 кДа) с БЛМ было показано, что препараты изменяют упругость бислоя и нарушают встраивание поверхностных белков в БЛМ клетки. Увеличение коэффициента поверхностного натяжения мембраны в присутствии ПЭ (ПСС-8 - 2,4·10-7 Дж/см2, ПАА (6 кДа) - = 2,5·10-7 Дж/см2) в 2,5 раза по сравнению с контролем может существенно влиять на изменение локальной кривизны мембраны и образования спикул в местах адсорбции белков, что наряду с изменением упругости бислоя может затруднять слияние вириона с клеточной мембраной и препятствовать самосборке вирусной оболочки и отпочковыванию вириона от мембраны. Рис. 8 Изменение поверхностного натяжения БЛМ при адсорбции различных концентраций вирусных белков. 20 Изменение поверхностного натяжения мембраны и ее упругости в результате адсорбции вирусных белков ведет к изменению поверхностной энергии монослоев, что, в свою очередь, влияет на изменение упругой энергии и может приводить к локальному изменению спонтанной кривизны мембраны, а также к нарушению адсорбции вирусных белков в билипидную мембрану в областях контакта с ПЭ. В результате такого изгиба БЛМ выпуклым будет монослой с меньшим поверхностным натяжением. Все описанные выше процессы также приводят, в свою очередь, к невозможности слияния вируса с клеткой и самосборке вирионов. Таким образом, проведенное исследование по изучению взаимодействия ПСС-8 и ПАА (6 кДа) с БЛМ выявило принципиально новый механизм ингибирования вирусной активности ПЭ, основанный на изменении механических свойств мембран. 4. Изучение ингибирования нейраминидазы (N) ПЭ ПСС-8 и ПАА. Причиной снижения инфекционности служит не только повреждение вторичной структуры гемагглютинина вируса гриппа, но и повреждение нейраминидазы, проявляющееся в ингибировании ее ферментативной активности. В связи, с чем было необходимо количественно оценить минимальную ингибирующую концентрацию IC50 (табл.2). Таблица 2 Определение IC50 для ПСС-8 и ПАА (6 кДа). IC50, мМ (для ПСС-8), мкМ (для ПАА) ПСС-8 ПАА (6 кДа) Штаммы вирусов гриппа А/ВЧП/Вейбридж (Н7N7) 4,0 ± 0,5 2,0 ± 0,5 А/Маллард Пенсильвания/10218/84 (H5N2) 3,8 ± 0,3 1,8 ± 0,4 A/NIBRG-14 (H5N1) 3,7 ± 0,5 1,65 ± 0,2 Полученные результаты указывают на достаточно эффективное ингибирование нейраминидазной активности ПСС-8 и ПАА (6 кДа). Определение наличия ингибирования нейраминидазы после взаимодействия 21 с указанными ПЭ показало необходимость выявления и типа ингибирования нейраминидазной активности. 5. Определение типа ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа ПЭ ПСС-8 и ПАА (6 кДа). С целью определения типа ингибирования нейраминидазной активности ПСС-8 и ПАА (6 кДа) был использован комбинированный графический метод Диксона и Лайнуивера - Берка. Исходя из анализа полученных зависимостей можно сделать вывод о неконкурентном типе ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа со средней константой ингибирования КI=1,6±0,08 мкМ для ПАА (6 кДа) и К I=1,7±0,085 мМ для ПСС-8 (рис.9). Рис. 9 Определение в координатах Диксона константы неконкурентного ингибирования ПАА (6 кДа) нейраминидазы вируса гриппа штамма A/NIBRG-14 (H5N1) Обратная скорость реакции ингибирования N ,1/v, усл.ед. 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -3 -2 -1 0 -0,5 1 1 2 2 3 4 3 4 [ПАА], мкМ 5 Концентрации субстрата (фетуин) 1 – 0,052 мкМ, 2 – 0,092 мкМ, 3 – 0,27 мкМ, 4 – 1,2 мкМ В данном нейраминидазной случае неконкурентный активности вирусов механизм гриппа ингибирования ПЭ объясняется повреждением последними вторичных структур фермента и/или ферментсубстратного комплекса. 22 Выводы: 1. Выявлено выраженное ингибирующее действие полиэлектролитов ПСС-8 и ПАА (6 кДа) в отношении вирусов гриппа и кори. Показано, что снижение противовирусной активности связано с уменьшением подвижности ПЭ в растворе при увеличении их степени полимеризации и молекулярной массы. 2. Показано, что наиболее выраженным вирусингибирующим действием в отношении вирусов гриппа и кори обладают ПСС-8 в нетоксическом диапазоне концентраций 1-40 мМ и ПАА (6 кДа) – 1-40 мкМ. 3. Рассчитаны средние значения IC50 для ПСС-8 и ПАА (6 кДа) равные 3,8 ± 0,19 мМ и 1,8 ± 0,09 мкМ, соответственно. 4. Выявлены и изучены механизмы взаимодействия указанных ПЭ с поверхностными заключающиеся вирусными в белками повреждении вирусов поверхностных гриппа вирусных и кори, белков гидрофобным остовом ПЭ и увеличении поверхностного натяжения в вирусной оболочке. 5. Показана наибольшая эффективность методов кругового дихроизма и белковой флуоресценции, по сравнению с вирусологическими методами, в определении структурно-функциональной целостности вирусных белков. 6. Выявлен неконкурентный тип ингибирования нейраминидазной активности вируса гриппа ПЭ со средней константой ингибирования К I = 1,6 ± 0,08 мкМ для ПАА (6 кДа) и К I = 1,7 ± 0,085 мМ для ПСС-8. 7. Определён возможный механизм инактивации нейраминидазы гриппа ПЭ, заключающийся в последовательной инактивации олигомеров фермента. 8. На основании результатов расчета констант скоростей прямой реакции инактивации нейраминидазы, показано, что при увеличении концентрации ПСС-8 и ПАА (6 кДа) происходит увеличение скорости инактивации фермента. 23 Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Контаров Н.А. Изучение вирусингибирующего действия бораадамантана в отношении вируса гриппа / Юминова Н.В., Контарова Е.О., Артюшенко С.В., Балаев Н.В., Зверев В.В.// Инфектология. — 2009. – Т.1. — №.2. — С.35-36. 2. Артюшенко С.В. Математический анализ эффективности элиминации кори в России / Контаров Н.А., Юминова Н.В., Зверев В.В. // Инфектология. — 2010. – Т.2. — №.3. — С.49. 3. Юминова Н.В. Вакцинопрофилактика кори, эпидемического паротита и краснухи в России / Контарова Е.О., Артюшенко С.В., Зверев В.В., Сидоренко Е.С. // Научно – практическая конференция Вакцинопрофилактика, проблемы и перспективы развития 28 октября 2010 г.Пермь. – С.148-152. 4. Юминова Н.В. Вакцинопрофилактика кори эпидемического паротита и краснухи: проблемы и реалии / Контарова Е.О., Сидоренко Е.С., Балаев Н.В., Контаров Н.А., Артюшенко С.В., Зверев В.В. // Материалы научно – практической конференции «Вакцинология 2010 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» 9-10 ноября 2010 г.Москва. – С.133. 5. Юминова Н.В. Вакцинопрофилактика кори, эпидемического паратита и краснухи: задачи, проблемы и реалии. /Контарова Е.О., Балаев Н.В., Артюшенко С.В. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2011. – №8. – С.40-44. 6. Артюшенко С.В. Влияние полиэлектролитов на инфекционность вируса кори / Контаров Н.А., Юминова Н.В.; Зверев В.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 2011. — №.4. — С.36-40. 7. Артюшенко С.В. Изучение взаимодействия полистиролсульфоната со степенью полимеризации 8 и полиаллиламина с бислойными липидными мембранами. / Контаров Н.А., Юминова Н.В. // Биофизика. – 2011. – T.56. – №6 – С.995-998. 24
