Занятие 1. Методы иммунодиффузии
advertisement
Иммунитет Достаточно условно все исследования в иммунологии делятся на две большие группы. Первая из них связана с решением общих иммунологических проблем, вторая включает изучение частных проблем иммунологии. Примеров единения теории и практики в иммунологии достаточно много. Вот два из них. Немецкий иммунолог Г. Келер и англичанин Ц. Милыптейн задались целью получить прямые доказательства повышенной мутабельности генов, контролирующих специфичность антител. Для решения этой чисто теоретической задачи им необходимо было иметь клон долгоживущих клеток, продуцирующих антитела одной, узкой специфичности. Такие клоны были получены, и продукт этих клонов — моноклональные антитела, стали доступны в неограниченном количестве для исследования. Сравнительное структурное изучение "ранних" и "поздних" антител, продуцируемых клоном, позволяло получить ответ на основной вопрос: подвержены ли повышенной мутабельности гены, контролирующие синтез иммуноглобулинов? Возможность неограниченного получения моноклональных антител оказала неоценимую услугу практической медицине. Вопервых, меченые моноклональные антитела стали использовать с диагностической целью. Например, моноклональные антитела, специфичные к опухолевым антигенам, применяют для определения метастазов у больных со злокачественными новообразованиями. Вовторых, ведутся практические исследования по использованию моноклональных антител в качестве вектора, доставляющего токсические соединения в злокачественно трансформированные или вирусинфицированные клетки. Если исследования Г. Келера и Ц. Милыптейна шли от теории к практике, то работы английского иммунолога П. Медавара имели обратное направление — от практической необходимости к теоретическому обобщению. В период второй мировой войны П. Медавар работал в клинике ожоговых поражений и неоднократно наблюдал отторжение кожных лоскутов, пересаживаемых от здорового донора на пораженные участки ожоговых больных. Он задался целью разобраться в причинах такого отторжения. Простое практическое наблюдение стимулировало постановку опытов на лабораторных животных, которые показали в результате иммунологическую природу реакции отторжения. Ход дальнейших рассуждений по природе конфликта привел его к открытию индуцируемой иммунологической толерантности — специфической ареактивности иммунной системы. Параллельно исследованиям П. Медавара проблемой толерантности занимался другой выдающийся иммунолог — М. Вернет. Выдвинув концепцию, по которой иммунитет есть реакция организма, дифференцирующая все "свое" от всего "чужого", он утверждал, что состояние толерантности к "своему" формируется в раннем онтогенезе. Не вдаваясь в подробности всего хода исследований проблемы толерантности, следует лишь подчеркнуть, что, по современным представлениям, естественная толерантность к "своему" и индуцируемая искусственно толерантность к "чужому" — суть явления одного порядка, включающие в работу сходные механизмы. Определяющим звеном в реализации этих механизмов является тимус, способный проводить отрицательную селекцию антигенспецифических лимфоцитов, т.е. исключать из работы клоны, способные взаимодействовать с собственными антигенами или толерогенами. Этот последний пример ясно показывает, как чисто практическая необходимость стимулировала целый каскад фундаментальных исследований, вскрывших одну из принципиальных сторон работы иммунной систем. Антитела — основные участники зашиты организма от бактериальных инфекций — были обнаружены на заре становления иммунологии. Однако долгое время ничего не было известно об их организации и характере взаимодействия с антигеном. Только к середине 50-х годов создались условия для широкого изучения их молекулярных свойств. В настоящее время известны не только особенности строения различных классов 1 иммуноглобулинов, локализации участков, способных взаимодействовать с антигеном, но выяснены, что крайне важно, генетические основы удивительно широкого многообразия антител. Если иммуноглобулины распознают антигенную детерминанту непосредственно, без участия каких-либо дополнительных структур, то Т-клеточный антигенраспознающий рецептор (ТКР) взаимодействует с комплексом антигенный пептид молекулы I или II классов МНС того организма, в котором развивается иммунный ответ. Этот своеобразный механизм распознавания "измененного своего", т.е. распознавания собственных молекул МНС, комплексированных с чужеродным пептидом, был открыт в самом конце 70-х годов и наиболее активно разрабатывался в 80-е годы. Обнаружение в середине 60-х годов клеточного взаимодействия при развитии иммунного ответа вскрыло большую группу молекулярных факторов, регулирующих иммуногенез. Эти эндогенные иммунорегуляторы получили общее название — цитокины. В настоящее время известно более 30 таких цитокинов. Для некоторых из них, имеющих наибольшее значение в клинике, получены генноинженерные аналоги. Особое место в молекулярной иммунологии занимает большая группа структурно близких белков, которые в той или иной степени участвуют в иммунном реагировании. Это группа гомологичных белков объединена в единое суперсемейство иммуноглобулинов. Сам по себе факт наличия у высших позвоночных животных, включая человека, такого суперсемейства крайне интересен. Во-первых, он указывает на удивительную сложность, многофакториальность работы иммунной системы и, вовторых, говорит о филогенетическом единстве молекулярных участников процесса. Задача иммунологов — попытаться определить возможные филогенетические связи в суперсемействе и установить его эволюционное происхождение. Иммунная система, как и любая другая система организма, помимо арсенала эффекторных и регуляторных молекул имеет свои собственные клетки, ткани и органы. Центральной фигурой системы является лимфоцит. Неслучайно М. Бернет в свое время дал ему название — иммуноцит. Эволюционно он возник специально для осуществления надзора за генетической целостностью организма, а понятия "лимфоидный" и "иммунный" — суть синонимы, определяющие одну и ту же систему организма. Определение растворимых иммунных комплексов Принцип метода. Экзо- или эндогенные антигены могут образовывать в организме иммунные комплексы (ИК) с соответствующими антигенами. Этот процесс может стать причиной системной или органной патологии. Судьба циркулирующих иммунных комплексов зависит от их величины и от индивидуальной активности фагоцитирующей системы. Aнтитела в составе иммунных комплексов могут включать каскад активации комплемента; кроме того, IgG- и IgM-антитела могут оказывать влияние на функции клеток, связываясь с их Fc-рецепторами. Во многих работах описано повышение концентрации циркулирующих иммунных комплексов при системных, аутоиммунных и инфекционных заболеваниях (лепра, шистосомиаз), а также при злокачественных новообразованиях. Значение анализа растворимых иммунных комплексов для постановки диагноза и понимания патогенеза еще раскрыто не до конца. Величина и состав растворимых иммунных комплексов зависят как от свойств антигенов, так и от свойств антител и в то же время от их относительной и абсолютной концентрации. В некоторых случаях в составе иммунных комплексов находили ДНК, инсулин, IgG и антигены вирусов гепатита; и все же антигенный состав иммунных комплексов, как правило, не удается охарактеризовать полностью. Специфические антигены можно обнаружить только в случае довольно ограниченного числа заболеваний. Принято считать, что иммунные комплексы, возникающие в условиях небольшого избытка антигена, 2 представляют наибольшую опасность ввиду длительности их циркуляции и высокой комплемент активирующей способности. Фотометрическое определение иммунных агрегатов Принцип метода. Инкубация раствора антигенов с моноспецифической сывороткой приводит к образованию иммунных агрегатов. Эта разновидность иммунных комплексов рассеивает проходящий световой поток, интенсивность которого можно измерить прямо или косвенно. При турбодиметрических измерениях определяют разность ΔU между исходной величиной Uo и получаемой величиной U1 светового потока. В случае нефелометрии определяют количество света, отраженного под определенным углом к направлению падения светового потока. Интенсивность рассеянного света, или разность светового потока, прямо пропорциональна числу и величине иммунных комплексов. Соблюдая постоянные объемы реагирующих растворов, разведение сыворотки, время и температуру инкубации, можно определять концентрацию антигена в растворе при помощи калибровочной кривой. Калибровочную (стандартную) кривую получают, измеряя рассеяние света в растворах с известным содержанием антигена. На рисунке представлен ход лучей в лазерном нефелометре. Ход лучей в лазерном нефелометре Особая геометрия устройства позволяет улавливать свет, рассеиваемый иммунными комплексами (ИК), под очень небольшими углами. В современных лазерных нефелометрах достигается полное поглощение света, идущего в прямом направлении; этого эффекта не удается достичь с обыкновенными лампами ввиду непараллельности их лучей. Высокое постоянство излучения лазера позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты. На других факторах, влияющих на воспроизводимость (длина волны, качество фотодиодов, обусловленное кюветой рассеяния), мы не будем останавливаться, так как они влияют на методику косвенным образом. Следует упомянуть о том, что при турбидиметрических измерениях рекомендуется пользоваться по возможности коротковолновым светом, поскольку он лучше рассеивается по разным направлениям. Особенно важно избегать при работе длины волн, совпадающие с областями поглощения гемоглобина (400—420 и 500 нм). Хорошо воспроизводимые результаты были получены нами при длине волны 450 нм. Определение циркулирующих иммунных комплексов Находящиеся в сыворотке иммунные комплексы могут быть определены при помощи преципитации полиэтиленгликоля 6000 (см. раздел Определение растворимых иммунных комплексов). Исследуемые образцы сывороток после обработки фреоном (см. выше) разводят боратным буфером в соотношении 1 + 2. Состав буфера: 6,7 г Н3В03, 13,4 г Na2B407-ЮН20 растворяют в 1000 мл Н20; рН 8,4. Смешивают 200 мкл разведенной сыворотки с 2 мл боратного буфера, во втором сосуде смешивают 200 мкл разведенной сыворотки с 2 мл боратного буфера, содержащего 4% полиэтиленгликоля 6000. Инкубируют 45 мин при комнатной температуре. Проводят измерения на лазерном нефелометре. Значения контроля (исследуемая сыворотка+ боратный буфер) не должны 3 превышать 0,3 В. Значения светорассеяния в пробах, содержащих ПЭГ, соответствуют концентрации иммунных комплексов. Результаты можно оценивать косвенно по калибровочной кривой с искусственно полученными иммунными комплексами с известным содержанием белка. Чаще всего используют преципитирующие in vitro комплексы бычий сывороточный альбумин— анти-БСА. Для получения таких комплексов смешивают равные количества бычьего сывороточного альбумина 0,15 М NaCl и антиБСА крысы, инкубируют в течение 30 минут при 37 °С и разводят в соответствии с геометрическим рядом. Диффузия и преципитация в геле При концентрации агара 20 г/л средний размер пор геля составляет 3 нм. Можно считать достоверным, что обычно применяемые концентрации геля от 3 до 15 г/л существенно не влияют на диффузию большинства компонентов реакции антигенантитело. Поэтому для всех компонентов процесса до их соединения справедливы законы свободной диффузии. Факторы, влияющие на преципитацию. Образование первичных комплексов после контакта антигенов и антител происходит в течение нескольких минут. Для полной преципитации необходимо 24—48 часов. Для высокомолекулярных компонентов при наличии «слабых» сывороток время полной преципитации увеличивается до 8 дней. Температура не играет особой роли, она может быть 0—4 °С, 20 °С или 37 °С. Антисыворотки лошади дают лучшую преципитацию при температуре, ниже комнатной; эта закономерность отсутствует при использовании сыворотки морской свинки. Колебания рН в пределах 6,4—8,5 на процесс преципитации влияния не оказывают. АС млекопитающих дают оптимальную преципитацию при физиологических концентрациях NaCl; АС птиц лучше преципитируют специфические антигены в средах с высокой ионной силой, например, в 1,2 М NaCl. Наличие детергентов, органических растворителей, мочевины и других соединений может препятствовать образованию иммунных агрегатов. Они могут вызывать денатурацию или распад молекул белка на субъединицы. АС лошади, как правило, дают преципитацию в зоне эквивалентности (обычно довольно широкая), они образуют резкие тонкие полосы. Преципитаты, образуемые АС морских свинок или АС «типа морских свинок» со специфическими антигенами, образуют более широкие зоны. При избытке антител такого типа образуются так называемые «флаги», «шлейфы» и др. Преимуществом сывороток «типа морской свинки» является возможность исследовать с их помощью обширную область концентраций, так как даже при избытке антител возникают преципитирующие комплексы. Классификация методов иммунодиффузии Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент, во втором оба, в зависимости от того происходит ли диффузия по одной общей оси или во все стороны радиально, из резервуара в среду. иммунодиффузии называется линейной или радиальной. Даже расположенные под углом друг к другу резервуары представляют известные удобства для определенных целей. Общая схема методов диффузии представлена на рисунке: Схема классификации методов иммунодиффузии по Ухтерлони 4 Темные области — растворы антигенов; заштрихованные области — антитела или гель с антисывороткой; белые области — нейтральный гель. Системы антиген—антитело В зависимости от состава различают простые, сложные и множественные системы. В простых системах антиген, несущий детерминанту «а», реагирует с антителом, несущим антидетерминанту «анти-а». В результате взаимодействия антигенов с антителами в геле появляется линия преципитации. Если молекула антигена содержит несколько детерминант различной структуры (а, b, с), к каждой из которых в сыворотке имеются соответствующие антитела со специфичностью А, В, С, то в этом случае образуется только одна линия преципитации, т. е. система является простой. К сложным системам относят такие, в которых ввиду структурного сходства различных молекул антигенов наблюдаются перекрестные реакции. О множественных системах говорят в тех случаях, когда одновременно происходят реакции нескольких простых или сложных систем. Эти данные приведены на рисунке. Варианты систем антиген-антитело при постановке реакции иммунодиффузии Специфичность, чувствительность, ошибки метода. Высокая специфичность представляет собой важнейшее преимущество методов иммунологического анализа. Для количественного или качественного определения 5 изучаемого антигена в растворе нескольких веществ необходимо иметь соответствующие моноспецифические сыворотки. Моноспецифичность проверяют в данном случае методом двойной радиальной иммунодиффузии или методом иммуноэлектрофореза, при необходимости нежелательные антитела устраняются адсорбцией. Что касается чувствительности методов иммунодиффузии, то, согласно мнению многих авторов, при концентрации белка 50—5 мкг/мл в соответствующих системах антиген-антитело еще можно наблюдать образование преципитатов. Если в лунку вносят 2—10 мкл раствора, то удается определить присутствие белка в растворе в количестве 10—500 нг. Разброс данных при постановке серии количественных определений составляет около 5% (3—7%). Простая радиальная иммунодиффузия На плоской поверхности создают равномерный слой геля, содержащего антисыворотку. Из лунок, проштампованных в геле и заполненных раствором антигена, молекулы АГ диффундируют в гель и образуют кольца преципитации с соответствующими AT. Диаметр колец преципитации увеличивается до тех пор, пока не истощится раствор антигена. Этот метод впервые описал Манчини (Mancini) в 1963 г. Известны многочисленные модификации этого метода, мы приводим описание, основанное на методике, изложенной в монографии Mayer и Walker. Материалы и оборудование. Для работы необходимы моноспецифические антисыворотка, стандартные препараты, контрольные сыворотки, буферные растворы, агар, рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, измерительное устройство с точностью до 0,1 мм, микро-шприцы для внесения объемов 1—10 мкл. Последовательность этапов исследования. Растворяют 1,5 г агара в 100 мл буфера на водяной бане, охлаждают до 48 °С и смешивают с антисывороткой, желательно подогретой до той же температуры, в небольшой пропорции. Наносят пипеткой 2 мл смеси на предметное стекло, установленное строго горизонтально на подставке, нагретой до 35—40 °С. Золь агара, содержащий антитело, распределяется по поверхности предметного стекла и застывает слоем толщиной приблизительно 1 мм. Рекомендуют также наносить на предметные стекла по 1 мл горячего раствора агара (10 г/л) и высушивать их при 70 °С перед использованием. Если пластины для простой радиальной иммунодиффузии будут храниться перед употреблением в течение 2—3 недели (во влажной камере при 4°С), то к гелю добавляют консерванты (мертиолят, 0,1 г/л, азид натрия, 0,2 г/л). На предметном стекле в слое геля вырезают по 8 лунок при помощи отшлифованной стеклянной трубки, соединенной с водоструйным насосом (таким образом создают пониженное давление). В каждую из лунок вносят по 2 мкл раствора антигена. Реакцию простой радиальной иммунодиффузия проводят во влажной камере. Если линии преципитации достаточно выражены, оценку результатов можно проводить прямо на влажной пластинке. В тех случаях, когда оценку проводят немедленно, пластинки с гелем отмывают 2—3 раза в 0,15 М NaCl; каждая отмывка длится 12 часов. Этим достигается удаление непреципитировавших белков. После отмывки препараты высушивают и окрашивают, например, амидочерным 10 В. Последовательность операций представлена на рисунке: Простая радиальная иммунодиффузия. Этапы работы 6 Калибровочная кривая К моменту завершения диффузии наблюдается прямая линейная зависимость между исходной концентрацией антигена и площадью преципитата. Это можно видеть на примере графика определения IgA: Простая радиальная иммунодиффузия. Кривая для определения IgA 7 D2 — квадрат диаметра диффузии Снижая уровень антисыворотки в геле, можно последовательно увеличивать диаметр зоны преципитации. При этом К возрастает и увеличивается экономичность концентрации реагентов возможно только до определенных пределов, так как может возникнуть ослабление преципитации. В каждом отдельном случае концентрацию антисыворотки в геле подбирают в зависимости от титра антител. Обычно рекомендуют использовать 1—5% антисыворотки. Подготовка пластин для иммунодиффузии. Во избежание погрешностей следует обращать особое внимание на поддержание температуры расплавленного агара при внесении антисыворотки (48°С, максимально 50°С), на правильный расчет концентрации антисыворотка в геле, на количество агара, наносимое на каждую пластину, и на строго горизонтальное расположение пластины. Поскольку толщина слоя геля уменьшается по направлению к периферии пластины, то следует добиваться того, чтобы кольца преципитации располагались не ближе 5 мм от края. Значение свойств антигена. Как правило, иммунохимические и физико-химические свойства стандартного и исследуемого антигенов должны быть сходны. Иногда это требование трудновыполнимо. Например, диффузионные свойства могут изменяться, когда молекулы антигена обладают склонностью к агрегации или, наоборот, к диссоциации. Это приводит к изменению условий диффузии, возможно даже к маскировке одних детерминант антигенов и демаскировке других. Тенденцию к агрегации можно наблюдать, в частности, в очищенных препаратах сывороточного альбумина после их повторного растворения. Если 8 такой раствор предназначен для использования в качестве стандартного при калибровке, то агрегаты удаляют гельфильтрацией на сефадексе G-200. IgA содержится в сыворотке в виде молекул с различной степенью полимеризации. Обычно соотношение моно-, ди- и тримеров неизвестно. Приходится в данном случае ориентироваться на усредненные результаты анализов большого числа сывороток нормальных доноров или на существующие стандарты ВОЗ. В некоторых случаях завышенные результаты получаются вследствие преобладания быстро диффундирующих фрагментов (субъединиц). Это наблюдение справедливо для IgM, при работе с которым наблюдаются по меньшей мере две линии преципитации. Длительное хранение сывороток при 4°С может приводить к частичному распаду белков вследствие остаточной протеолитической активности. Приготовление геля и проведение иммунодиффузии Расплавляют 1,5 г агара в 100 мл буфера (одного из трех предложенных) на водяной бане. Порциями по 3 мл горячий агаровый золь наносят на строго горизонтально установленные предметные стекла, для того чтобы получить равномерный слой агара толщиной приблизительно 1,5 мм. После застывания агара пластинки готовы к употреблению. Рекомендуется сначала наносить на стекла по 1 мл горячего золя агарозы (10 г/л), который затем высушивают при 70 °С. Образующаяся при высушивании пленка агара, усиливает сцепление геля с поверхностью стекла. В зависимости от характера иммунохимических исследований в агаре делают лунки для антигена или антитела при помощи готовых штампов или вырезают их стеклянной (можно металлической) трубочкой. Лунки должны отстоять друг от друга, по меньшей мере, на 4 мм, расстояние более 10 мм употребляется редко. На рисунке схематично представлены возможные варианты расположения лунок в слое геля. Двойная радиальная иммунодиффузия: возможные варианты расположения резервуаров для растворов антигена (заштрихованы) и сыворотки (черные) После внесения растворов иммунодиффузию проводят во влажной камере при температуре 4°, 20° или 37 °С. Продолжительность диффузии зависит от целей исследования, она должна быть не менее 24 ч и в некоторых случаях может достигать 6— 7 дней. Более продолжительная инкубация не приводит к изменениям преципитатов. В случае продолжительной иммунодиффузии пластины следует ежедневно контролировать. По окончании иммунодиффузии можно либо непосредственно оценивать результаты по влажному препарату, либо сначала отмыть непреципитирующие субстанции. Для этого 9 замачивают пластины 2—3 раза на 12 ч в 0,15 М растворе NaCl. Затем на поверхность геля кладут фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, и гель высушивают при 40—50 °С или при комнатной температуре. Высушенные пластины геля окрашивают обычно амидочерным 10 В, после чего оценивают результаты иммунодиффузии. Оценки результатов. Количество линий преципитации. Во множественных системах всегда существует вероятность того, что два или более комплекса антиген-антитело вследствие одинаковой скорости диффузии будут образовываться в одном и том же участке геля, формируя, следовательно, одну линию преципитации. Кроме того, концентрация антител и антигенов или соотношение компонентов реакции может быть настолько неблагоприятным, что видимые преципитаты не будут образовываться. Поэтому число видимых линий преципитацпи, как правило, меньше числа систем антиген-антитело или в лучшем случае равно ему. Расположение преципитатов между лунками. При оптимальном соотношении между антигенами и антителами после окончания диффузии линия преципитации располагается примерно на середине расстояния между лунками. Если один из компонентов реакции присутствует в большем количестве, чем другой, то линия преципитации сдвигается в сторону лунки с меньшим содержанием реагента. Если соотношение концентраций реагентов может измениться в месте первичного выпадения предметов, например, вследствие избыточного поступления одного из компонентов, это приводит к смещению линии преципитации. Часть иммунных агрегатов, особенно в зоне избытка антител, может оставаться на старом месте в виде вуали и расширения линии преципитации. Именно возможность возникновения таких процессов обусловливает необходимость ежедневных проверок пластин геля при длительно протекающей иммунодиффузии. Взаимное расположение линий (сравнительный анализ). Для выявления полной или частичной идентичности обычно располагают лунки в углах треугольника, в две помещают растворы сравниваемых антигенов, в третью — антисыворотку. Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации: 1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это говорит об идентичности обоих антигенов. 2. Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реагирующие с антисывороткой детерминанты антигены неидентичны и, следовательно, сами антигены различны. 3. Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой "шпоры". "Шпора" часто бывает тоньше основной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с антигенами сливается с первой линией. Это означает, что оба антигена обладают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответствующими антителами иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из антигенов имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответствующих антител в антисыворотке приводит к образованию "шпоры". 4. Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются одновременно. Это означает, что оба антигена содержат как одинаковые, так и различные детерминанты, которые вступают в реакцию с антителами полиспецифической антисыворотки. Основные типы преципитации представлены на рисунке: 10 Расположение линий преципитации при сравнительных исследованиях методом двойной радиальной иммунодиффузии а — 1—4 варианты преципитации; б — анализ органоспецифических антигенов. В центре— антисыворотка к экстракту почек (АСЭП): ЭП — экстракт почек; СЧ— сыворотка человека. В сыворотке человека и в экстракте почек присутствует один общий антиген (идентичная реакция). Второй антиген присутствует только в экстракте почек (перекрестная реакция с первым аг) (препарат проф. Friemel)» Модификация метода. Вышеописанная методика иммунодиффузии на предметных стеклах представляет собой микровариант метода, предложенного Ухтерлони в 1949 г. В условиях макрометода слой геля, создаваемый в чашках Петри, составляет 2—3 мм, лунки и соответственно объемы реагентов довольно велики, лунки отодвинуты друг от друга на значительные расстояния, линии преципитации длинные и хорошо выраженные. Титрование. Для титрования растворов антигенов или антисывороток располагают лунки так, как показано на рисунке: Двойная радиальная иммунодиффузия. Титрование раствора антигена (титр 1 : 16) Одинаковые объемы растворов антигена, приготовленных двукратным разведением, вносят в периферические лунки. Такой же объем антисыворотки вносят в центральную лунку. При оценке иммунодиффузии учитывают: 1. Расстояние от линии преципитации до центральной и периферической лунок. 2. Наибольшее разведение антигена, при котором еще заметно образование преципитата. 3. Интенсивность и ширину полос преципитации. Наибольшее разведение, при котором еще образуются видимые преципитаты, дает значение титра. Этим способом 11 можно также определять количество преципитирующих антител в различных антисыворотках, которые, например, можно сравнивать в реакции иммунодиффузии со стандартным раствором антигенов. Полуколичественное определение антигенов. Титрование часто используют для полуколичественного определения антигена. Вокруг центральной лунки с антисывороткой формируют четыре лунки для антигена. Чем выше концентрация антигена, тем ближе к центральной лунке будут расположены полосы преципитации. Путем сравнения со стандартным раствором антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена в исследуемой пробе. Оценка метода Двойная радиальная иммунодиффузия представляет собой прежде всего метод количественного анализа. Ее применяют для определения количества антигена в жидкостях (сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, экстракты тканей). Ее также применяют для проверки чистоты препаратов, при получении антисывороток животных и оценке эффективности иммунизации. Титрование и полуколичествеиное определение антигенов расширяет возможности применения метода. Определение отдельных антигенов в многокомпонентных растворах требует применения моноспецифических антисывороток. Метод двойной радиальной иммунодиффузии можно использовать также для анализа трудно-растворимых субстанций, таких, как кератин и прокератин, с условием предварительной их солюбилизации ДСН, гуанидин-хлоридом (до 6 М), мочевиной (до 8 М). После солюбилизации эти вещества продолжают реагировать с соответствующими антителами в геле агарозы. 12
