на правах рукописи - Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН
advertisement
на правах рукописи Парфенов Игорь Александрович ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ И ИХ РОЛЬ В ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЕ РАСТЕНИЯ специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в лаборатории биохимии протеолиза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А. Н. Баха РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т. А. Валуева Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская доктор биологических наук, профессор М. А. Белозерский Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Карельского научного центра РАН Защита состоится «22» марта 2012 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждение науки Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071,Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2. С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33. строение 1. Автореферат разослан «21» февраля 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А. Ф. Орловский 2 Общая характеристика работы Актуальность темы. Протеолитические ферменты (протеиназы, протеазы или пептидазы) – это группа ферментов, которые катализируют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Регулирование активности протеиназ имеет решающее значение в обмене веществ животных и растений. Один из путей регуляции протеолитических ферментов включает присутствие в клетках животных, растений и микроорганизмов специфических молекул, подавляющих их активность, в том числе и белковой природы. Белки-ингибиторы протеиназ представлены во всех типах живых организмов, число видов которых составляет около двух тысяч [Rawlings et al., 2004]. Белковые ингибиторы протеиназ представляют собой большую и разнообразную в структурном отношении группу белков, способных образовывать стехиометрические комплексы с протеолитическими ферментами, в результате чего последние утрачивают ферментативную активность. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что структуры молекул ингибирования и белковых природа их ингибиторов комплексов протеиназ, с механизм ферментами крайне разнообразна [Валуева, Мосолов, 1999; Otlewski et al., 2005]. В связи с этим, изучение новых белковых ингибиторов представляет особый интерес. В настоящее время известно несколько тысяч аминокислотных последовательностей белков, обладающих способностью ингибировать протеиназы [Rawlings et al., 2004]. Несмотря на то, что установлена структура большого числа ингибиторов и механизмы их взаимодействия с протеиназами, для большинства из них точная физиологическая функция не установлена или является малоизученной. Белковые ингибиторы протеиназ принимают непосредственное участие в регуляции многих биохимических процессов [Wei et al., 2009]. Так, в растениях они могут обладать несколькими функциями: выступать в роли запасных белков, контролировать активность эндогенных протеиназ, а также участвовать в защитных реакциях растений. Показано, что белки-ингибиторы растений способны in vivo подавлять активность экстрацеллюлярных протеиназ патогенных микроорганизмов и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых-вредителей [Lawrence, Koundal, 2002; Мосолов, Валуева, 2005]. В связи с развитием современных методов молекулярной биологии и генной инженерии по созданию растений, устойчивых к действию патогенов, 3 изучение белков-ингибиторов имеет важное не только теоретическое, но и практическое значение для сельского хозяйства. К настоящему времени проведено много исследований и накоплено достаточное количество данных о белках-ингибиторах, представленных в картофеле (Solanum tuberosum L.), который является одной из важнейших мировых сельскохозяйственных культур [Bauw et al., 2006]. Часть этих белков объединяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz-type proteinase inhibitors). Установлено, что белки PKPI представлены многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и C-концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере, пять различных структурных групп, три из которых – PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C – относительно хорошо изучены [Ishikawa et al., 1994; Heibges et al., 2003; Bauw et al., 2006]. Однако структурные особенности белков PKPI, определяющие специфичность их взаимодействия с различными ферментами остаются малоизученными. Несмотря на то, что накоплено достаточное количество данных о свойствах белков PKPI, выделенных из клубней различных сортов картофеля, их первичная структура, как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически отсутствуют данные об их свойствах. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI является актуальной задачей современной биохимии. Кроме того, информация о структуре и функциях ранее не изученных белков, принадлежащих к данному семейству, а также генов, кодирующих их, позволит судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo. Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение из клубней картофеля сорта Юбилей Жукова и характеристика новых белков, действующих как высокоэффективные ингибиторы сериновых протеиназ, и кодирующих их генов, а также исследование взаимосвязи структуры и специфичности действия продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи. 1. Провести скрининг белков, обладающих способностью ингибировать сериновые протеиназы, в клубнях картофеля нового сорта Юбилей Жукова, созданного российскими селекционерами. Исходя из 4 полученных данных, идентифицировать белки, относящиеся к подсемейству PKPI. 2. Выделить высокоэффективный ингибитор сериновых протеиназ подсемейства PKPI и охарактеризовать специфичность его действия на протеолитические ферменты: α-химотрипсин, трипсин, субтилизин и папаин. Установить N-концевую последовательность нового белка, изучить его физико-химические свойства и возможное участие в защитной системе картофеля. 3. Выделить и охарактеризовать кДНК, кодирующую новый белок, выделенный из клубней олигонуклеотидные картофеля. праймеры для Для этого амплификации синтезировать кДНК из генома картофеля. 4. Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии выделенной кДНК в Escherichia coli. Получить рекомбинантный белок, кодируемый новой, ранее неизвестной кДНК, и охарактеризовать специфичность его действия на протеиназы. Научная новизна и практическая значимость работы: Из картофеля сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок, обозначенный PKCI (potato Kunitz-type chymotrypsin inhibitor), который одинаково эффективно действовал на α-химотрипсин и трипсин и обладал способностью одновременно связывать оба фермента, образуя с ними тройные комплексы. Таким образом, выделенный белок PKCI, является «двуглавым» ингибитором трипсина и химотрипсина, который содержит два независимых и одновременно действующих реактивных центра. Установлена N-концевая последовательность белка PKCI, что позволило отнести его к структурной группе PKPI-B. Исследованы физикохимические свойства белка PKCI и показано, что он обладает высокой термо- и pH-стабильностью. Показано, что ингибитор угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Bary, поражающих растения картофеля. Это свидетельствует о возможном его участии в защитной системе растения. Определена нуклеотидная последовательность кДНК, обозначенной как PKPIJ-B. Разработан метод экспрессии этой кДНК в E. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделен, очищен и охарактеризован рекомбинантный белок PKPIJ-B. Показано, что рекомбинантный белок одинаково эффективно подавляет активность α-химотрипсина и трипсина и 5 так же, как и белок PKCI, обладает способностью образовывать с этими ферментами тройные комплексы. Сделано заключение, белок PKPIJ-B идентичен белку PKCI, который кодируется в геноме картофеля кДНК PKPIJ-B. Сравнительный анализ восстановленных аминокислотных последовательностей белка PKCI с последовательностями белков группы PKPI-B, присутствующих в клубнях различных сортов картофеля и действующих как ингибиторы протеиназ, показал, что наиболее вариабельным является С-концевой участок их молекул, расположенный между остатками Cys147 и Cys164, в котором локализован реактивный центр, ответственный за связывание α-химотрипсина. Сделано заключение, что в состав реактивного центра, ответственного за связывание трипсина, входят остатки Arg68-Phe69, а в центре, ответственном за связывание химотрипсина, находятся остатки Met153Ser154. Полученные данные позволяют сделать заключение, что отсутствие или присутствие определенных аминокислотных остатков в первичной структуре ингибиторов PKPI определяет специфичность их действия. Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченной к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009); XXII и XXIII Зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, 2010, 2011); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010" (Москва, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации" (г. Екатеринбург, 2010); I Всероссийской виртуальной интернет – конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (г. Казань, 2010); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Петрозаводск, 2011); Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва, 2011). Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, 8 тезисов в материалах конференций. 6 Структура и объем работы: Диссертация изложена на 135 страницах; содержит 22 рисунка и 6 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 232 наименований. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы. В обзоре литературы рассматривается структура, механизм действия и функции сериновых протеиназ. Подробно рассматривается классификация, молекулярная структура и механизмы действия белковых ингибиторов протеиназ, а также их различные функции в растениях. Делается акцент на ингибиторах семейства SKTI, а также, подсемействе PKPI из картофеля. Глава 2. Основные результаты и их обсуждение Выделение и очистка белка-ингибитора α-химотрипсина Для первичного скрининга белковых ингибиторов, белки, осажденные сульфатом аммония (75% насыщения) из сока картофеля (S. tuberosum, сорт Юбилей Жукова), разделяли методом гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-75. В полученных фракциях измеряли ингибиторную активность по отношению к сериновым протеиназам. В результате гель-хроматографии были получены три белковых компонента: I, II и III. В компоненте I присутствовали высокомолекулярные белки, большая часть которых является представителями семейства пататинов (Mr ~ 50000). Белки, содержащиеся в компоненте II (Mr ~ 2025000), обладали способностью эффективно ингибировать α-химотрипсин. В состав компонента III входили белки (Mr ~ 10000), не действующие на αхимотрипсин. Белки компонента II разделяли с помощью ионообменной хроматографии на КМ-сефарозе CL-6B, уравновешенной 0,4 М Naацетатным буфером, pH 4,3. Связавшиеся с сорбентом белки элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCI от 0 до 0,5 M в стартовом буфере. Белки разделялись на три основных компонента, обозначенных как Iа, IIа и IIIа (рис. 1А, кривая 1). Все три белковых компонента эффективно подавляли активности α-химотрипсина и трипсина, в то же время значительно слабее действовали на субтилизин Карлсберг (рис. 1А, кривые 2-4 соответственно). 7 Диск-электрофорез полученных компонентов в Ds-Na-ПААГ показал, что только компонент IIIа, элюировавшийся при концентрации NaCl, равной 0,38 M, содержал единственный белок с молекулярной массой 23 ± 1 кДа, молекула которого состоит из одной полипептидной цепи (рис. 1В). Это дало основание предположить, что выделенный белок является представителем подсемейства PKPI. Рис. 1. А - Ионообменная хроматография белков с молекулярной массой 20-25 кДа из клубней картофеля на КМ-сефарозе CL-6B и Ds-NaПААГ-электрофорез (Б) компонентов, обладающих активностью ингибиторов протеиназ А - Ia,IIa,IIIa, – белковые компоненты, 1 – А280; 2-4 – активность ингибиторов трипсина, αхимотрипсина и субтилизина соответственно (в % от исходной активности фермента), в качестве субстратов использовали BAPA, Suc-GGF-pNa и Z-AAL-pNa; 5 - концентрация NaCl [M]. Б - М – белки-маркеры, I – компонент Iа; II – компонент IIа; III – компонент IIIа. Было изучено влияние белка PKCI на активность сериновых протеиназ (рис. 2). Ингибитор слабо подавлял активность субтилизина Карлсберг и не действовал на цистеиновую протеиназу, папаин (рис. 2, кривые 3 и 4 соответственно), но в равной степени эффективно подавлял активность α-химотрипсина и трипсина. Зависимости степени их ингибирования от количества внесенного ингибитора сохраняли линейный характер практически до полного угнетения (рис. 2, кривые 1 и 2). Расчеты показали, что с 1 молем ингибитора связывается 1 моль, как αхимотрипсина, так и трипсина. 8 Оказалось, что с α-химотрипсином белок PKCI связывается несколько сильнее, чем с трипсином, поскольку для него линейный характер данной зависимости сохраняется на более протяженном участке вплоть до 85% ингибирования. Рис. 2. Влияние белка PKCI на активность трипсина (1), α-химотрипсина (2), субтилизина Карсберг (3) и папаина (4) Измеряли остаточную активность ферментов (% от исходной) при различных соотношениях ингибитор/фермент. Для определения активностей трипсина, α-химотрипсина, субтилизина и папаина использовали в качестве субстратов BAPA, SucGGF-pNa, Z-AAL-pNa и pGFL-pNa соответственно. Расчет равновесных константы диссоциации (Кi) комплексов αхимотрипсин/трипсин-PKCI показал, что для α-химотрипсина значение Кi, рассчитанное при гидролизе Suc-GGF-pNa (0,3 мМ), составило величину, равную 0,3 ± 0,1 нМ, а для трипсина - 1,2 ± 0,1 нМ при гидролизе BAPA (1,35 мМ) (табл. 1). Это подтверждает сделанное выше заключение о том, что белок PKCI сильнее связывает α-химотрипсин, чем трипсин. Таблица 1. Константы диссоциации (Кi) комплексов PKCI с исследуемыми ферментами Фермент (нM)* α-химотрипсин (13,95) Трипсин (4,71) Субстрат (мM) Suc-GGF-pNa (0,3) BAPA (1.35) Ki, нM 0,3 ± 0,1 1,2 ± 0,1 * - реальные концентрации активных ферментов, определенные титрованием активных центров [Shonbaum et al., 1961: Chase, Shaw, 1967]. 9 Рис. 3. ВЭЖХ белка PKCI (A) и его смесей с ферментами (Б и В) Оптическую плотность измеряли при 280 нм, Б - смесь эквимолярных количеств трипсина и PKCI: В- смесь эквимолярных количеств трипсина, α-химотрипсина и PKCI. Белкимаркеры: I – БСА (67 кДа), II – яичный альбумин (43 кДа), III – химотрипсиноген (25 кДа) Определение ингибитора и молекулярной массы его с комплексов α- химотрипсином и трипсином При ВЭЖХ ингибитор PKCI элюировался в виде одного гомогенного белкового компонента (рис. 3А). Рассчитанное значение его молекулярной массы 23 ± 1 кДа соответствовало величине, определенной методом электрофореза. молекулярной Ds-Na-ПААГ- Совпадение массы, значений полученных двумя различными способами, подтверждало, что молекула белка состоит из одной полипептидной цепи. При ВЭЖХ смесей, содержащих избыток белка PKCI и α-химотрипсин или трипсин, в элюатах присутствовали более тяжелые компоненты. Их молекулярные массы составляли величины 46 и 45 (± 1) кДа (рис. 3Б), что практически равно сумме молекулярных масс белка PKCI и α-химотрипсина/трипсина, соответственно. Это указывает на то, что ингибитор взаимодействует с ферментами в соотношении 1:1, образуя с ними стехиометрические комплексы (моль/моль), устойчивые в условиях ВЭЖХ. При ВЭЖХ смесей, содержащих избыток белка PKCI, α-химотрипсин и трипсин, элюировался только один тяжелый компонент с молекулярной массой 63 ± 1 кДа (рис. 3В), представляющий собой вероятнее всего тройной комплекс ингибитора с ферментами, в котором с одной молекулой белка PKCI связывались одновременно одна молекула α-химотрипсина и одна молекула трипсина. Это давало основания предположить, что ингибитор является «двуглавым» 10 и содержит два независимых реактивных центра, ответственных за связывание каждой из этих протеиназ. Определение N-концевой последовательности Секвенированием по Эдману были установлены первые 20 аминокислотных остатков белка PKCI. На рис. 4 приведено сравнение его N-концевой аминокислотной последовательности с последовательностями белков: PSPI-21-6.3, PKTI-22, PKSI, P1H5, KPI A-k1, KPi B-k2 и PI-2, выделенных из клубней картофеля сортов Истринский [Ревина и др., 2010; Valueva et al., 2000], Provita [Heibges et al., 2003], Kuras [Bauw et al., 2006] и Elkana [Pouvreau et al., 2003] соответственно. Белки PKPI принято разделять на три структурные группы: PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C [Ishikawa et al., 1994]. Белки PKPI, относящиеся к указанным трем структурным группам, имеют различное строение N- и Cконцевых участков, а также обладают различной специфичностью действия на протеиназы [Ishikawa et al., 1994]. Видно, что последовательности белков PKCI, PSPI-21-6.3, PKTI-22 P1H5, KPi B-k2 и PI-2 значительно отличались от последовательностей белков PKSI и KPI A-k1 (рис. 4), что указывает на их принадлежность к различным структурным группам ингибиторов PKPI. В работе [Ревина 2004] было показано, что белок PKSI входит в состав группы PKPI-C. Белок KPI Ak1 входит в группу PKPI-A [Bauw et al., 2006]. В тоже время первые 9 аминокислотных остатков белков PKCI, PSPI-21-6.3, PKTI-22, P1H5, KPi B-k2 и PI-2 полностью совпадали (рис. 4). Эти остатки обнаружены в последовательностях всех белков структурной группы PKPI-B и являются консервативными [Ishikawa et al., 1994]. Таким образом, белок PKCI был отнесен именно к этой структурной группе. Рис. 4. Сравнение последовательностей выделенных различных из сортов N-концевых белков клубней и PKPI, картофеля действующих как ингибиторы протеиназ 1 – PKCI, 2 – PKTI-22 [Ревина и др., 2010], 3 – PSPI-21-6.3 [Valueva et al., 2000], 4 – PKSI [Ревина и др., 2004], 5 - P1H5 [Heibges et al., 2003], 6 - KPi B-k2 [Bauw et al., 2006], 7 - PI-2 [Pouvreau et al., 2003], 8 - KPI A-k1 [Bauw et al., 2006]. Различающиеся остатки выделены серым цветом. 11 Определение pH и термостабильности белка PKCI Были исследованы рН- и термостабильность белка PKCI (рис. 5) Видно, что при инкубации белка в течение 20 ч при различных значениях pH наблюдалось определенное снижение его активности по отношению к αхимотрипсину, наиболее выраженное при pH 2,0 и 12,0 (рис. 5а), где ее потеря составила 30 и 70%, соответственно. Рис. 5. Зависимость активности белка PKCI по отношению к αхимотрипсину от рН (а) и температуры (б) 1 – инкубация при рН 6,0, 2 – инкубация при рН 2,0. В качестве субстрата использовали Suc-GGF-pNa. Измеряли степень ингибирования фермента (%) при соотношении ингибитор/фермент (моль/моль). Нагревание белка PKCI в течение 10 мин при температурах от 50 до 90°С приводило к значительному снижению активности ингибитора по отношению к α-химотрипсину, как при pH 6,0, так и при pH 2,0 (рис.5б). При температуре 9 0 °С ингибитор практически полностью терял свою активность. Таким образом, имеются все основания предполагать, что при сильно кислых и щелочных значениях pH, а также при высоких температурах среды белок PKCI теряет конформацию нативной молекулы. Изучение фунгицидной активности белка PKCI Ранее в нашей лаборатории было установлено, что некоторые белки PKPI накапливаются в тканях клубней картофеля сорта Истринский при инфицировании оомицетом P. Infestans [Валуева и др., 2003]. Было показано, что эти белки in vitro не только подавляют активность экзопротеиназ, секретируемых патогенными микроорганизмами [Гвоздева и 12 др., 2004], но и угнетают их рост и развитие [Ревина и др., 2010]. В связи с этим было исследовано действие на рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов белка PKCI, выделенного из картофеля сорта Юбилей Жукова, который обладает к ним повышенной устойчивостью. На рис. 6 представлены результаты изучения влияния белка PKCI на рост гиф и развитие макроконидий гриба F. culmorum и зооспор оомицета P. infestans. Гриб F. culmorum вызывает у растения картофеля фузариозное увядание, а оомицет P. infestans – фитофтороз. Рис. 6. Влияние белка PKCI на рост гиф и повреждение макроконидий гриба F. culmorum (а) и зооспор оомицета P. infestans (б) 1 - длина гиф; 2 – количество лизированных макроконидий или зооспор. Приведены средние значения трех независимых экспериментов со стандартной ошибкой от 2 до 10%. На рис 6а, видно, что при добавлении 400 мкг белка PKCI длина растущих гиф гриба уменьшалась на 60% по сравнению с контролем (кривая 1), при этом более чем 50% макроконидий оказывались поврежденными (кривая 2). При той же концентрации белка PKCI длина гиф оомицета уменьшалась на 50% (рис. 6б, кривая 1) и разрушению подвергались всего 30% его зооспор (рис. 6б, кривая 2). Это свидетельствует о том, что белок PKCI слабее действовал на рост и развитие оомицета чем актиномицета. На основании этого можно предположить, что данный белок наряду с другими известными факторами включен в защитную систему картофеля. 13 Характеристика генов, кодирующих ингибиторы PKPI-B в геноме картофеля сорта Юбилей Жукова. Методом обратной транскрипции, используя мРНК как матрицу, выделенную из 2-х недельных проростков картофеля сорта Юбилей Жукова, была получена полная кДНК картофеля. Затем с помощью ПЦР со специфическими праймерами, синтезированными нами, была получена кДНК, обозначенная как PKPIJ-B. Последовательность нуклеотидов в этой кДНК характеризовалась высокой степенью сходства (от 95,2 до 96,6% идентичных н.п.) с генами PKPI-B9 (AY693424), PKPI-B10 (AF536175.1) [Сперанская и др., 2005], PI-2 (AY166690) [Pouvreau et al., 2003], KPi B-k2 (DQ168333.1) [Bauw et al., 2006], P1H5 (AF492359), P4D11 (AF4955584) и S1C1 (AF492769) [Heibges et al., 2003], которые были обнаружены в картофеле сортов соответственно. Истринский, Однако Elkana, она Kuras, Provita значительно и Saturna, отличалась от последовательности gCDI-B1 (Q41484) из сорта Danshaku, содержащей только 90,7% идентичных н.п. [Ishikawa et al., 1994]. Оценка степени сходства последовательностей генов и полученной кДНК PKPIJ-B, кодирующих белки PKPI-B в картофеле семи сортов, показала, что они содержат от 89 до 99% идентичных н.п. При этом, наиболее вариабельные участки последовательностей расположены в 5’-концевой части молекул. Анализируя положения замен нуклеотидов в этих последовательностях можно сделать заключение, что они локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации. На рис. 7 приведено филогенетическое дерево, из которого видно, что сорта японской и европейской (в том числе российской) селекции находятся на разных ветвях «дерева», что соответствует гипотезе, предложенной в работе [Heibges et al., 2003], о высокой внутри- и межсортовой вариабельности белков PKPI. Действительно, замены в нуклеотидных последовательностях могут приводить к полиморфизму аллелей одного и того же генного локуса в геноме тетраплоидного картофеля 14 Рис. 7. Филогенетическое дерево генов, кодирующих белки PKPI-B в различных сортах картофеля Построено с использованием программы MEGA 4 по принципу максимального подобия. Числа в узлах ветвей (bootstraps) – индексы поддержки каждого узла, полученные при расчете 100-кратной повторности. Гетерологичная экспрессия белка PKPIJ-B Рекомбинантная плазмида для осуществления гетерологичной экспрессии белка PKPIJ-B в E. coli штамма BL-21(DE3), была создана на основе экспрессионного вектора pET23а. Продукт экспрессии, представляющий собой рекомбинантный белок PKPIJ-B, был обнаружен в основном в тельцах включения и в меньшем количестве в растворимой фракции клеточных белков E. coli штамма BL21(DE3). Молекулярная масса полученного рекомбинантного белка PKPIJ-B, определенная методом DS-Na-ПААГ-электрофореза, имела значение около 25 кДа, что совпадало с расчетной величиной. В клетках контрольных бактерий, трансформированных вектором pET23a, не содержащим вставки, белковый продукт с такой молекулярной массой не был обнаружен. Для получения рекомбинантного белка PKPIJ-B клетки E. coli разрушали ультразвуком. Нерастворимая фракция с тельцами включения E. coli была солюбилизирована в денатурирующем буфере. Наши предварительные эксперименты показали, что присутствие небелковых и белковых примесей отрицательно сказывается на процессе его ренатурации и низкому выходу целевого белка. В связи с этим денатурированные тельца включения были подвергнуты очистке от примесей на колонке (2,5х30 см) с Mono Q, уравновешенным 0,05 М Трис-HCl-буфером, pH 8,0, содержащим 7 15 М мочевину. Связанный с сорбентом материал элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере. Данная процедура позволила практически полностью отделить целевой продукт от белковых и небелковых примесей, содержащихся в клеточном лизате E. сoli. Рефолдинг солюбилизированных белков телец включения E. coli проводили путем диализа против 0,05 М Трис-HCl-буфера, pH 7,5 при 4°С в течение 24 ч. Ренатурированный белок PKPIJ-B дополнительно очищали до гомогенности методом анионообменной FPLC-хроматографии на ДЭАЭToyopearl, уравновешенном 0,05 М Трис-HCl-буфере, pH 7,5. Связавшийся с ионообменником белок элюировали линейным градиентом повышающейся концентрации NaCl от 0 до 1 М в стартовом буфере. По данным DS-Na-ПААГ-электрофореза компонент I-1, элюировавшейся при 0,15 М NaCl, содержал гомогенный белок PKPIJ-B с молекулярной массой 25 кДа (рис 8А). Можно заключить, что молекула белка состоит из одной полипептидной цепи. Следует отметить, что молекулярная масса рекомбинантного белка несколько выше, чем у PKCI, выделенного из клубней картофеля. Это связано с присутствием дополнительных аминокислотных остатков, которые был введены при создании экспрессионной плазмиды. Была исследована активность рекомбинантного белка PKPIJ-B по отношению к протеолитическим ферментам. Показано, что он эффективно подавлял активность α-химотрипсина и в меньшей степени трипсина (рис. 8Б). Зависимость степени подавлении активности α-химотрипсина от количества добавленного ингибитора сохраняла линейный характер до достижения 80%-ного ингибирования (рис. 8Б, кривая 1). Расчеты показали, что 1 моль ингибитора стехиометрически связывался с 1 молем αхимотрипсина, а также с 1 молем трипсина. Исследования при помощи ВЭЖХ, смесей, содержащих избыток рекомбинантного белка PKPIJ-B, α-химотрипсина и трипсина, элюировался только один тяжелый компонент с молекулярной массой 65 ± 1 кДа, представляющий собой вероятнее всего тройной комплекс ингибитора с ферментами, в котором с одной молекулой белка PKPIJ-B связывались одновременно одна молекула α-химотрипсина и одна молекула трипсина. Таким образом, рекомбинантный белок PKPIJ-B и выделенный нами из 16 клубней картофеля белок PKCI обладают одинаковым характером действия на протеиназы и способны образовывать тройные комплексы, в которых одна молекула ингибитора связывается одновременно две молекулы αхимотрипсина и трипсина. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что белок PKCI идентичен рекомбинантному белку PKPIJ-B. Рис. 8. А - Ds-Na-ПААГ-электрофорез рекомбинантного белка PKPIJ-B (А) и его влияние (Б) на активность α-химотрипсина (1) и трипсина (2) А: М – белки-маркеры, 1 – белок PKPIJ-B Б: Влияние рекомбинантного белка на активность α-химотрипсина (1) и трипсина (2). Для определения активностей α-химотрипсина и трипсина использовали в качестве субстратов Suc-GGF-pNa и BAPA, соответственно. 4.8. Аминокислотная последовательность белка PKCI На основании сравнения N-концевых участков белков PKCI и PKPIJ-B, их молекулярных масс, а также действия на протеиназы с возможностью образовывать тройные комплексы позволило утверждать, что белок PKCI кодируется в геноме картофеля выделенным фрагментом гена PKPIJ-B. Сравнение аминокислотных последовательностей белков группы PKPI-B, приведенных на рис. 9, показало, что они содержат от 86,5 до 98,6% идентичных остатков, часть из которых является консервативной. Прежде 17 всего, это два консервативных остатка цистина, образующих дисульфидные связи, соединяющие остатки Cys49-Cys98 и Cys147−Cys164, первая из которых формирует большую пептидную петлю в N-концевой части молекулы, а вторая – малую в ее С-концевой части. Несмотря на высокое сходство первичных структур, рассматриваемые белки различаются по специфичности действия на α-химотрипсин и трипсин. Так, белок PSPI-216.3, который кодируется геном PKPI-B9, эффективно подавлял активность эластазы из лейкоцитов человека и значительно слабее действовал на трипсин и α-химотрипсин [Valueva et al., 2000]. Такой же специфичностью действия на протеиназы характеризуется белок PSPI-21-5.2, который кодируется гибридным геном, содержащем на 3’-участке фрагмент гена PKPI-B9, а на 5’-участке - PKPI-A6 [Сперанская и др., 2005]. Белок PKTI-22, кодируемый геном PKPI-B10, является специфическим ингибитором трипсина [Ревина и др., 2010], а белки PKCI и P1H5 с одинаковой эффективностью действуют на α-химотрипсин и трипсин [Heibges et al., 2003]. Все белки, аминокислотные последовательности которых представлены на рис. 9, являются ингибиторами сериновых протеиназ и взаимодействуют с ферментами по «каноническому» субстратоподобному механизму. Молекулы ингибиторов этого типа имеют на своей поверхности специфическую структуру - «петлю связывания», в которой располагается пептидная связь Р1-Р1’, образующая реактивный центр ингибитора. Действительно, последовательностях как видно всех на рис. ингибиторов 9, в аминокислотных PKPI-B присутствует консервативный участок, окружающий остатки Arg68-Phe69, расположенные в большой пептидной петле. Показано, что они входят в состав реактивного трипсин-связывающего центра ингибиторов [Valueva et al., 2000]. Таким образом, в пространственной организации их молекул создаются условия для образования «канонической петли» связывания трипсина. Как было установлено, белок PKCI способен одновременно связать молекулы трипсина и α-химотрипсина. Кроме того, белки P1H5, Kpi B-k2, P4D11, PI-2 и S1C1, обладают способностью действовать как на трипсин, так и достаточно эффективно на α-химотрипсина [Bauw et al., 2006; Heibges et al., 2003; Pouvreau et al., 2003]. Следовательно, второй реактивный центр, связывающий α-химотрипсин, должен присутствовать в их молекулах. 18 Рис. 9. Сравнение аминокислотных последовательностей белков PKPIB из различных сортов картофеля 1 – PKPIJ-B (PKCI), 2 – PSPI-6.3 [Valueva et al., 2000], 3 - PKTI-22 [Ревина и др., 2010], 4 PSPI-21-5.2 [Valueva et al., 2000], 5 - P1H5 [Heibges et al., 2003;], 6 - gCDI-B1 [Ishikawa et al., 1994], 7 - KPi B-k2 [Bauw et al., 2006], 8 - P4D11 [Heibges et al., 2003], 9 - PI-2 [Pouvreau et al., 2003], 10 - S1C1 [Heibges et al., 2003]. Аминокислотные остатки, идентичные во всех последовательностях, не окрашены, а различающиеся обозначены серым цветом. Вариабельные участки окрашены в бирюзовый цвет. Реакционные центры указаны стрелками, дисульфидные связи (Cys49-Cys98 и Cys147-Cys164)- * и **, соответственно В работе [Heibges et al., 2003] была продемонстрирована важность остатка Met153, входящего в мотив Thr152-Met153-XX-Pro156, для проявления ингибиторами PKPI-B, действующими на трипсин, также 19 активности по отношению к α-химотрипсину. Так оказалось, что удаление остатка Met153 в результате делеции в гене P1H5 приводило к значительному снижению активности белка по отношению к α-химотрипсину, при этом активность по отношению к трипсину оставалась неизменной. Это указывало на то, что остаток Met153 может входить в состав реактивного центра, связывающего α-химотрипсин и локализованного в «канонической петле», образующейся между остатками Cys147-Cys164. В аминокислотной последовательности белка gCDI-B1 в результате делеции в нуклеотидной последовательности кодирующей его ДНК также отсутствует остаток Met153. В молекуле белка PKTI-22 этот остаток присутствует, но существуют препятствия для образования «канонической» петли связывания α-химотрипсина, поскольку между остатками Cys147Cys164 расположена еще одна дисульфидная связь Cys155-Cys158. И, действительно, белок gCDI-B1 не действует на α-химотрипсин [Ishikawa et al., 1994], а белок PKTI-22 очень слабо подавляет активность этого фермента [Ревина и др., 2010]. Только в молекулах белков PKCI, P1H5, Kpi B-k2, P4D11, PI-2 и S1C1 возможно образование «канонической» петли между остатками Cys147-Cys164, в которой локализован мотив Thr152Met153-XX-Pro156, входящий в состав химотрипсинсвязывающего реактивного центра. Таким образом, ингибитор α-химотрипсина и трипсина PKCI содержит два независимых реактивных центра связывания ферментов. В одном из них локализованы остатки Arg68-Phe69, ответственные за связывание трипсина, в другом - Met153-Ser154, химотрипсин. 20 по которым связывается α- ВЫВОДЫ: 1. Из картофеля сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок, обозначенный как PKCI, эффективно подавляющий активность α-химотрипсина и трипсина. Белок PKCI содержал два независимо действующих реактивных центра и был способен одновременно связать оба фермента. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность белка PKCI, позволившая отнести его к группе белковингибиторов PKPI-B. 2. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК, обозначенной как PKPIJ-B. Полученный рекомбинантный белок PKPIJ-B действует на протеиназы аналогично белку PKCI. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что при развитии клубней картофеля белок PKCI кодируется кДНК PKPIJ-B. 3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки семейства PKPI-B в картофеле различных сортов, показал, что наиболее вариабельные фрагменты последовательностей расположены в 5’-концевой части молекул и локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации. 4. Восстановлена полная аминокислотная последовательность белка PKCI. Показано, что остаток Met153 входит в состав реактивного центра связывания химотрипсина, который локализован в С-концевом участке между остатками Cys147 и Cys164. 5. Показано, что белок PKCI угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Bary, поражающих растение картофеля, что свидетельствует об его участии в защитной системе растения при поражении этими патогенами. 21 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах 1. Ревина Т.A., Парфенов И.A., Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Валуева Т.A. Ингибитор химотрипсина и трипсина из клубней картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 3. С. 265-272. 2. Парфенов И.А., Ревина Т.А., Пашковский П.П., Радюкина Н.Л., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 4. С. 402–407. 3. Valueva T.A., Parfenov I.A., Revina T.A., Morozkina E.V., Benevolensky S.V. Structure and properties of the potato chymotrypsin inhibitor // Plant Physiology and Biochemistry. 2012. V. 52. P. 83-90. Тезисы конференций 1. Ревина Т.A., Кладницкая Г.В., Гвоздева Е.Л., Парфенов И.A., Валуева Т.A. Специфические ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и кодирующие их гены / Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченная к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Москва. 2009. Т. 1. С. 335. 2. Парфенов И.А., Ревина Т.А. Белок-ингибитор трипсина и химотрипсина из клубней картофеля / Тез. XXII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2010. С. 48. 3. Парфенов И.А. Новый белок-ингибитор сериновых протеиназ из клубней картофеля / Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010". Москва. 2010. С. 60. 4. Парфенов И.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующий белок ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле / Всероссийская молодежная научная конференция с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации". Екатеринбург. 2010. С. 97. 5. Парфенов И.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина из клубней картофеля и кодирующий его ген / I Всероссийская виртуальная 22 интернет – конференция "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий". Казань. 2010. С. 124. 6. Парфенов И.А. Молекулярное клонирование генов, кодирующих белкиингибиторы сериновых протеиназ в картофеле / Тез. XXIII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии". Москва. 2011. С. 52. 7. Парфенов И.А., Валуева Т.А. Новый ингибитор химотрипсина из клубней картофеля. Выделение, очистка и характеристика природного и рекомбинантного белков / V Российский симпозиум "Белки и пептиды". Петрозаводск. 2011. С. 289. 8. Парфенов И.А., Валуева Т.А. Исследование свойств нового ингибитора химотрипсина из клубней картофеля Solanum tuberosum / Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова". Москва. 2011. Т. 2. С. 52. 23
