Изучение принципиальной схемы мозга

ЗДОРОВЬЕ И БЛАГОПОЛУЧИЕ
Изучение принципиальной
схемы мозга
Ц
ентр наших когнитивных способностей — мозг —
возможно, самая сложная загадка всей биологии.
Каждую секунду в человеческом мозгу миллиарды
корковых нервных клеток передают миллиарды
сообщений и выполняют сверхсложные расчеты.
Как работает мозг — как его функции следуют за его структурой — остается тайной.
Огромное количество нервных клеток мозга соединены
синапсами в цепи неимоверной сложности. В общем предполагается, что специфика этих соединений является основой нашей возможности воспринимать и классифицировать
объекты, нашего поведения, как приобретенного (например,
игра на пианино), так и врожденного (например, ходьба), и
памяти — не считая управления низкоуровневыми функциями, такими как сохранение позы и даже дыхание. На самом
высоком уровне наши эмоции, наше самоощущение, само
наше сознание полностью являются результатом действия нашей нервной системы.
На макроуровне человеческий мозг состоит из участков,
которые приблизительно можно связать с определенными
видами деятельности. Но на самом деле в выполнении одной
задачи часто используется несколько частей мозга. Эта сложность возникает в первую очередь из-за того, что большинство
действий начинается с сигнала органов чувств, после которого происходит анализ, принятие решения и, в конце концов,
само действие или моторика.
На микроскопическом уровне мозг состоит из миллиардов нейронов, каждый из которых соединен с другими нейронами несколькими тысячами синаптических связей. У нас
нет подробной принципиальной схемы мозга человека или
ДЖЕФФ В.
ЛИХТМАН (JEFF
W. LICHTMAN)
Р. КЛЕЙ РЕЙД
(R. CLAY REID)
ГАНС ПЕТЕР
ФИСТЕР (HANS
PETER PFISTER)
Гарвардский
университет (Harvard
University)
МАЙКЛ Ф. КОЭН
(MICHAEL F.
COHEN)
Microsoft Research
ЧЕТВЕРТАЯ ПАРАДИГМА
75
любого другого млекопитающего, хотя о существовании таких синаптических
цепей знали более века назад. На самом деле составить карту нервных контуров
пытались всего лишь раз, и это было двадцать лет назад с маленьким червем, который имеет всего 300 нервных клеток. Основным камнем преткновения является огромная техническая сложность, связанная с составлением подобной карты.
Но недавние технологические прорывы в визуализации, компьютерных науках
и молекулярной биологии позволяют снова заняться этой проблемой. Однако
даже при наличии принципиальной схемы нам нужно знать, какие сообщения
проходят по нейронам этой цепи — подобно тому, как прослушиваются сигналы
в компьютерном чипе. Это является вторым барьером для понимания: традиционные методы физиологии позволяют нам прослушивать только очень малую
часть нервов этой цепи.
Чтобы понять масштабы проблемы, представьте себе кору головного мозга
человека, которая содержит более 160 триллионов синаптических связей. Эти
соединения проходят от миллиардов нейронов. Каждый нейрон имеет синаптические связи с сотнями или даже тысячами различных нейронов, и каждый отправляет информацию по синапсам к аналогичному числу целевых нейронов.
Такой огромный коэффициент объединения по входу и выходу может возникать
потому, что каждый нейрон имеет сложное геометрическое строение со множеством процессов приема (дендриты) и одним очень разветвленным исходящим
процессом (аксон), который может простираться на достаточно большие расстояния.
Можно надеяться на возможность обратного проектирования цепей головного мозга. Другими словами, если мы научимся прикасаться только к отдельным нейронам и видеть их связи и прочность таких связей, мы сможем как минимум начать получать инструменты для расшифровки функций отдельной цепи.
Огромное количество и сложные формы клеток являются не единственным
аспектом этой проблемы. Цепи, соединяющие нервные клетки, имеют наномасштаб. Плотность синапсов в коре головного мозга составляет около 300 млн на
кубический миллиметр.
Функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ) предоставляет возможность краткого обзора работы мозга в макроскопическом объемном
виде. Но самое высокое разрешение фМРТ составляет около 1 мм3 на воксел — в
этом кубическом миллиметре может содержаться 300 млн синапсов. Таким образом, даже в самых подробных функциональных изображениях человеческого мозга содержится огромное количество цепей. Кроме того, размер этих синапсов слишком мал для ограниченных дифракцией разрешения стандартных
технологий оптического получения изображений.
Составление карты цепей потенциально может подвергаться анализу при
помощи цветовой кодировки нейронных процессов [1] и использования техник,
не ограниченных дифракцией [2]. В настоящее время золотым стандартом для
анализа синаптических связей является использование электронной микроскопии (ЭМ), нанометрического (нм) разрешения которой более чем достаточно
76
ЗДОРОВЬЕ И БЛАГОПОЛУЧИЕ
для выявления мельчайших деталей соединений нервных клеток. Но для составления карты цепей необходимо преодолеть технический барьер: ЭМ обычно отображает очень тонкие участки (толщиной в десятые нанометра), поэтому
для реконструкции объема требуется «последовательная реконструкция», где
информация изображения из смежных сечений одного объема реконструируется в объемный набор данных. Существует несколько методов получения таких
объемных данных (см., например, [3-5]), но все они имеют потенциал создания
очень объемных библиотек данных цифровых изображений, как описано далее.
НЕКОТОРЫЕ ЦИФРЫ
Для того, чтобы реконструировать при помощи ЭМ все синаптические цепи в
1 кубическом миллиметре мозга (объем, который мог бы поместиться на острие
иглы), потребуется набор последовательных изображений на миллиметр в глубину. Для получения всех ветвлений аксонов и дендритов потребуется секционирование на уровне, возможно, не более 30 нм. Таким образом, для глубины
в 1 мм потребуется 33 тыс. изображений. Чтобы рассмотреть все типы везикул
(источник нейротрансмиттеров) и синапсов, каждое изображение должно иметь
поперечное разрешение не менее 10 нм. Изображение одного миллиметра квадратного с разрешением 5 нм — это изображение с ~4 x1010 пикселями или 10 - 20
гигапикселями. Таким образом, данные изображения в 1 кубическом миллиметре будут находиться в пределах 1 петабайта 1 (250 ~ 1 000 000 000 000 000 байт).
Человеческий мозг содержит около 1 млн. мм3 нервной ткани.
СЕГОДНЯШНИЕ УСПЕХИ
При такой пугающей задаче хочется опустить руки и найти более простую проблему. Однако новые технологии и техники дают проблеск надежды. Мы используем их с конечной целью создания полной принципиальной схемы мозга.
Для этой цели потребуется интенсивное и масштабное сотрудничество биологов, инженеров и компьютерных ученых.
Три года назад лаборатории Рейда (Reid) и Лихтмана (Lichtman) начали
работать над методами автоматизации и ускорения крупномасштабных последовательных сечений ЭМ. Фокусируясь конкретно на крупных объемах коры
головного мозга в высоком разрешении, группа Рейда сконцентрировалась на
высокой производительности и процессах с высокой степенью автоматизации.
Пока их работа была опубликована только в абстрактной форме [3], но они уверены, что в ближайшем времени получат первые 10 терабайт объемных данных
по анатомии мозга в большом разрешении. Физиологические эксперименты теперь могут показать функцию практически каждого нейрона в кубе размером
300 мкм. Новые данные ЭМ обладают разрешением, способным показать практически каждый аксон, дендрит и синапс — физические связи, обеспечивающие
функцию нейронов.
ЧЕТВЕРТАЯ ПАРАДИГМА
77
РИСУНОК 1.
Изображения «мозговой дуги» с различными нейронами, флуоресцирующими разными цветами.
Наблюдая за нейронами в группах срезов, мы можем отслеживать сложную структуру ветвления каждого нейрона для создания древовидных структур на рисунке справа.
Разделение и отслеживание отдельных нейронов в общем объеме остается актуальной проблемой. Однако определенные успехи достигнуты при помощи экзотических средств. Лаборатория Лихтмана нашла метод выражения различных
комбинаций красного, зеленого и синего флуоресцентного протеина в созданной генной инженерией мыши. Эти случайные комбинации сейчас предоставляют около 90 цветов или их комбинаций [1]. При помощи этого метода можно отслеживать отдельные нейроны с их разветвлением к возможным синаптическим
связям с другими нейронами или конечным органам в мускулах. Маркированные различными цветами нервы (процесс «мозговой дуги» (brainbow)), показанные на рисунке 1, похожи на разноцветные провода в компьютере и служат для
той же цели: маркировка проводов, идущих на большие расстояния.
Так как эти цветные метки присутствуют в живой мыши, можно отслеживать
изменения синаптических связей, наблюдая одни и те же участки несколько раз
в течение минут, дней или даже месяцев.
Лаборатория Рейда смогла разметить нейроны зрительной коры крысы и
кошки таким образом, что они «загораются» при активации. Стимулируя кошку
линиями различной ориентации, они буквально могут видеть, какие нейроны
включаются, в зависимости от конкретных визуальных стимулов. Сравнивая организацию зрительной коры у крысы и у кошки, они обнаружили, что в то время
как нейроны крысы кажутся случайно организованными на основании визуальных стимулов, нейроны кошки имеют различимую структуру (см. рис. 2).
Для достижения максимального разрешения при помощи ЭМ требуется создание изображений очень тонких срезов нервной ткани.
Один метод начинается с блока ткани; после каждого прохода создания
изображения из блока удаляется тонкий срез, после чего процесс повторяется.
Исследователи группы Лихтмана в Гарварде разработали новое устройство —
78
ЗДОРОВЬЕ И БЛАГОПОЛУЧИЕ
РИСУНОК 2.
Нейроны зрительной коры отмечены на живом организме при помощи чувствительного к
кальцию красителя. Слева: Трехмерная реконструкция тысяч нейронов зрительной коры крысы, полученная из группы изображений (300 мкм сбоку). Нейроны имеют цветовую кодировку
в соответствии с ориентацией зрительного стимула, который их возбудил в большей степени.
Посередине: Двухмерное изображение плоскости сечения изображения слева. Нейроны, отреагировавшие на различную ориентацию стимула (разные цвета) кажутся произвольно расположенными в коре. Вставка: Цветовая кодировка ориентации стимула. Справа: Для сравнения — зрительная кора кошки крайне упорядочена. Нейроны, отреагировавшие на различные ориентации
стимула, разделены с удивительной точностью. Это изображение представляет собой полную
трехмерную функциональную карту более чем 1000 нейронов в объеме зрительной коры размером 300x300x200 мкм [6, 7].
подобие высокотехнологичного токарного станка, который они называют Автоматическим лентосборочным токарным станком-ультрамикротомом (Automatic
Tape-Collecting Lathe Ultramicrotome, ATLUM), способного обеспечивать эффективное создание изображений в наномасштабе на больших объемах ткани. (См.
рис. 3 на следующей странице).
ATLUM [3] автоматически разделяет установленный блок мозговой ткани
на тысячи сверхтонких сечений и собирает их на длинной покрытой углеродом
ленте для последующей маркировки и построения изображений в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ). Так как процесс полностью автоматизирован, объемы размером в десятки кубических миллиметров — достаточно
большие для охвата целых нейронных цепей нескольких участков — могут быть
быстро и точно сокращены до ленты со сверхтонкими сечениями. Изображения
СЭМ таких полученных на ATLUM сечений могут иметь поперечные разрешения в 5 нм и выше — что достаточно для построения изображений отдельных
синаптических везикул, а также определения и отслеживания всех связей в цепи.
ЧЕТВЕРТАЯ ПАРАДИГМА
79
Эта лента ткани собирается погруженным ленточным конвейером
Образец вращается
Нож движется
вперед
Эти синхронизированные движения дают
спиральный рез в блоке ткани,
обеспечивая постоянную ленту ткани
в водяной емкости ножа
Уровень воды ножа
регулируется этой
впускной трубкой
РИСУНОК 4.
HD View позволяет интерактивно исследовать это 2,5-гигапиксельное изображение. Слева: Срез нервной ткани. Большое серое
образование по центру — это ядро нейрона. Посередине: Приближенный капиллярный и миелинизированный аксон Справа:
Приближенные миелиновые слои, окружающие поперечное сечение
аксона. Снизу: Увеличенное изображение тонких везикул, окружающих синаптическую связь между очень мелкими структурами.
РИСУНОК 3.
Автоматический лентосборочный токарный станок-ультрамикротом (ATLUM), обеспечивающий эффективное создание изображений в наномасштабе для крупных объемов ткани.
Тонкие срезы — это изображения одного небольшого участка за один раз.
После получения серии отдельных изображений, они должны быть сшиты в
очень крупные изображения, и по возможности собраны в объеме.
В Microsoft Research продолжаются работы по сшиванию и последующему
интерактивному просмотру изображений с миллиардами пикселей1.
После организации таких гигапиксельных изображений в иерархическую
пирамиду приложение HD View может передавать запрошенные изображения
через Интернет для просмотра2. Это дает возможность исследования деталей в
большом и малом масштабах. На рис. 4 показан анализ результата.
После получения и сшивания изображений множественные срезы образца
необходимо собрать для получения согласованного объема. Возможно, самой
сложной задачей на этом этапе является извлечение отдельных ветвей нейронов.
В Гарварде ведутся работы по предоставлению интерактивных инструментов
для выделения отдельных «процессов» с последующим их отслеживанием между срезами для выявления каждого дендрического или аксонового волокна [8, 9]
(см. рис. 5). Синаптические связи находить автоматически еще сложнее; однако
80
1 http://research.microsoft.com/en-us/um/redmond/groups/ivm/ICE
2 http://research.microsoft.com/en-us/um/redmond/groups/ivm/HDView
ЗДОРОВЬЕ И БЛАГОПОЛУЧИЕ
РИСУНОК 5.
NeuroTrace позволяет неврологам интерактивно исследовать и разделять нервные процессы в
данных ЭМ с высоким разрешением.
ЧЕТВЕРТАЯ ПАРАДИГМА
81
ЗДОРОВЬЕ И БЛАГОПОЛУЧИЕ
развитие интерфейсов пользователя и компьютерного зрения дают надежду на
то, что весь процесс может стать управляемым.
Расшифровка полной принципиальной схемы человеческого мозга представляет собой одну из величайших задач 21 века. Продвижения на биологическом
и техническом уровне определенно приведут к новым успехам и открытиям и
скорее всего они помогут ответить на фундаментальные вопросы о том, как наш
мозг мечтает или думает.
ССЫЛКИ
[1] J. Livet, T. A. Weissman, H. Kang, R. W. Draft, J. Lu, R. A. Bennis, J. R. Sanes, and
J. W. Lichtman, «Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent
proteins in the nervous system» Nature, vol. 450, pp. 56–62, 2007, doi: 10.1038/
nature06293.
[2] S. Hell, «Microscopy and its focal switch» Nature Methods, vol. 6, pp. 24–32, 2009,
doi: 10.1038/ NMeth.1291.
[3] D. Bock, W. C. Lee, A. Kerlin, M. L. Andermann, E. Soucy, S. Yurgenson, and R. C.
Reid, «High- throughput serial section electron microscopy in mouse primary visual
cortex following in vivo two-photon calcium imaging» Soc. Neurosci. Abstr., vol.
769, no. 12, 2008.
[4] W. Denk and H. Horstmann, «Serial block-face scanning electron microscopy to
reconstruct three-dimensional tissue nanostructure» PLoS Biol., vol. 2, p. e329, 2004,
doi: 10.1017/ S1431927606066268.
[5] K. J. Hayworth, N. Kasthuri, R. Schalek, and J. W. Lichtman, «Automating the
Collection of Ultrathin Serial Sections for Large Volume TEM Reconstructions»
Microsc. Microanal., vol. 12, pp. 86–87, 2006.
[6] K. Ohki, S. Chung, Y. H. Ch’ng, P. Kara, and R. C. Reid, «Functional imaging with
cellular resolution reveals precise microarchitecture in visual cortex» Nature, vol.
433, pp. 597–603, 2005, doi:10.1038/nature03274.
[7] K. Ohki, S. Chung, P. Kara, M. Hübener, T. Bonhoeffer, and R. C. Reid, «Highly
ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels» Nature, vol. 442,
pp. 925–928, 2006, doi:10.1038/nature05019.
[8] W. Jeong, J. Beyer, M. Hadwiger, A. Vazquez, H. Pfister, and R. Whitaker, «Scalable
and Interactive Segmentation and Visualization of Neural Processes in EM Datasets»
IEEE Trans. Visual. Comput. Graphics, Oct. 2009.
[9] A. Vazquez, E. Miller, and H. Pfister, «Multiphase Geometric Couplings for
the Segmentation of Neural Processes» Proceedings of the IEEE Conference on
Computer Vision Pattern Recognition (CVPR), June 2009.
82
ЗДОРОВЬЕ И БЛАГОПОЛУЧИЕ
На пути к компьютерному
микроскопу
для нейробиологии
Х
ЭРИК ГОРВИЦ
(ERIC HORVITZ)
Microsoft Research
УИЛЬЯМ
КРИСТЕН
(WILLIAM
KRISTAN)
Калифорнийский
университет, Сан-Диего
(University of California,
San Diego)
отя нейробиология развивается большими шагами,
мы до сих пор не понимаем, как симфония связей
между нейронами приводит к богатому и осознанному поведению животных. Как местные взаимодействия между нейронами сливаются в поведенческую динамику нервных систем, давая животным их впечатляющие
возможности чувствовать, учиться, принимать решения и
действовать в окружающем мире? Множество подробностей
остается под покровом тайны. Новые знания появятся благодаря применению вычислительных методов, в особенности
машинного обучения и процедур логического вывода, для
создания объяснительных моделей из данных о действиях популяций нейронов.
НОВЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ ДЛЯ НЕЙРОБИОЛОГОВ
Большую часть истории электрофизиологии, нейробиологи отслеживали свойства мембран нейронов позвоночных и
беспозвоночных животных при помощи стеклянных микропипеток, заполненных проводящим раствором. Овладевая
техниками, которые могли бы впечатлить даже лучших часовщиков, нейробиологи изготовили стеклянные электроды
с наконечниками диаметром зачастую меньше микрона, и
использовали специальные машины для проведения наконечников в тело клетки отдельных нейронов — надеясь, что нейроны будут работать так же как и в более крупных группах.
Этот метод предоставил данные о напряжениях мембраны и
потенциале действий отдельной или нескольких клеток.
ЧЕТВЕРТАЯ ПАРАДИГМА
83