Раковые и здоровые клетки в поле аппарата «Камена»
advertisement
Ю.Г. Симаков, К.Г. Бунин Раковые и здоровые клетки в поле аппарата «Камена» Москва 2015 1 Введение. Аппарат «Камена» и природа его поля при дистанционном и контактном воздействии на живые клетки В настоящее время в физиотерапии применяется огромное количество аппаратов, физические поля которых используются для воздействия на живые клетки организма при различных заболеваниях. Действующим началом в таких приборах может быть постоянное магнитное или электромагнитное поле, но в большинстве случаев используются низкоинтенсивные переменные и импульсные поля с различными частотами. Помимо этого при контактном воздействии широко применяются переменные и постоянные импульсные токи с различной формой импульса и с различной частотой, а также импульсное электростатическое поле. В данном случае нами проведено исследование аппарата «Камена», который может быть использован как для контактного, так и для дистанционного воздействия, потому что в отличие от уже используемых ранее аппаратов, он имеет комплексное поле. Одна составляющая этого комплексного поля, более или менее, изучена. Это импульсное электростатическое поле, возникающее при подаче на излучатель прямоугольных электрических импульсов от источника постоянного тока с частотой 15 Гц. Новизной здесь является исследование действия на раковые и здоровые клетки именно этой частоты импульсных токов при контактном воздействии. За последнее время появилось множество работ указывающих на повышение частоты электромагнитных волн Шумана с 7,8 до 15 Гц. (Schlegel et all., 2002), в резонанс с которыми подобраны импульсы от аппарата «Камена». Вторая составляющая комплексного поля, создаваемого аппаратом «Камена», оказывает дистанционное воздействие. По физическим параметрам эта составляющая близка с постоянному, низкочастотному, импульсному электростатическому полю, которое широко применяется при 5 лечении различных заболеваний методами физиотерапии (Портнов и др., 2008). В нашем случае данный вид поля создается сжатым, при заливке в эпоксидную смолу, кристаллом горного хрусталя с электрической обмоткой, на которую подается прямоугольный импульсный ток с частотой 15 Гц. Считаются, что сходные поля образуются он рук массажистов, других биологических объектов и от кристаллов горного хрусталя. Эти поля очень благоприятно действуют на структуру крови. С другой стороны можно найти разработки, в которых показано, что залитые в смолы кристаллы горного хрусталя и металлические опилки сами по себе, даже без подачи на них электрических импульсов, создают поле, которое благоприятно действует на живые клетки. Такое поле называется «оргонным», то есть органическим или живым. До настоящего времени идут большие споры, существует ли подобное поле или это только фантазия эзотериков. Мы тоже, до тех пор, пока не будет раскрыт механизм действия этого поля, или его природа, будем его писать в кавычках. Правда, кое-что о природе такого поля можно было бы сказать. Скорее всего, если «оргонное» поле существует, то в его состав входит постоянное электростатические поле, создаваемое кристаллом горного хрусталя, сжатым затвердевшей эпоксидной смолой. Генератор «оргонного» поля, преобразующий негативную энергию идущую от техногенных устройств, в положительную, сторонники этого направления называют «оргонитом». Какие бы серьезные дискуссии не проходили о наличии или отсутствии «оргонного» поля, некоторые биофизики сделали ряд работ, и даже защитили диссертации, в которых описывается эффект воздействия указанного поля на живые объекты (Southgate, 2009; Alvarez, 2008; Hebenstreit, 2010). Электронный импульсный генератор «Камена» (в дальнейшем аппарат, генератор) настроен на физиологическую частоту 15 Гц. Это частота близка к частоте волн Шумана, распространяемым между Землей и ионосферой, и являются резонатором физиологических процессов для большинства живых организмов на Земле. Задача аппарата поддержать этот ритм, который в 6 настоящее время глушится электромагнитными волнами работающих установок и средств связи, или же нарушается при патологических изменениях в клетках организма. Аппарат «Камена» может использоваться в оздоровительных целях для гормонизации функционирования живых клеток при неинвазивном применении. Коррекция клеточных функций, создаваемая аппаратом, позволяет восстановить нормальную адгезию эритроцитов в периферической крови и активизировать клеточный иммунитет для более эффективной борьбы с болезнями, а также проявить защитные свойства по отношению к радиации и мутагенным веществам. Технические требования к аппарату «Камена» представлены в табл. 1. Таблица 1. Технические требования к аппарату «Камена» Знач Наименование ение Напряжение питания от аккумулятора постоянного тока В. 9±3 Потребляемая мощность не более (В·А) 0.1 Частота колебаний прямоугольной формы (Гц) 15±0.3 Диапазон изменения выходного тока в цепи пациента при активной нагрузке 1±0,1 кОм (мА) 0–10 Средняя наработка на отказ не менее (ч) 2000 Средний срок службы аппарата до списания не менее (лет) 3-5 Аппарат допускает непрерывную работу в течение не менее (час) 8 Габаритные размеры (мм) 90х50х24 Масса не более (гр.) около 150 7 1. Корпус – пластик (размером 90х50х24 мм); 2. Генератор импульсов 15 Гц 3. Генератор поля; 4. Излучатели поля; 5. Источник питания 9В – крона. Генератор импульсов выполнить на пластиковом DIP корпусе микросхеме таймера NE 555N доступной массовому потребителю (отечественным аналогом является микросхема К1006ВИ1). Выходной ток может достигать 200 мА, потребляемый - на 3÷6 мА больше. Напряжение питания может изменяться от 4,5 до 18 вольт. При этом точность таймера практически не зависит от изменения напряжения питания и составляет 1% от расчетного. Дрейф составляет 0,1% вольт, а температурный дрейф - 0,005% С. - Светоизлучающий диод - зеленый При воздействии электрических импульсов на генератор поля формируются волновое комплексное физическое поле (далее поле). Рис. 1. Принципиальная схема аппарата «Камена 1а». 8 Общий вид аппарата представлен на рис 2 Рис. 2. Общий вид аппарата «Камена 1а» Распределение основных узлов и положение аккумулятора дано на Рис. 3. 9 Рис. 3. Схема расположения основных узлов и аккумулятора в «Камене». Генератором поля, работающим по типу «оргонита», выступает кристалл кварца, залитый в эпоксидную смолу с алюминиевыми опилками (на рис. 3 он показан в виде прямоугольника, расположенного перед аккумулятором). Перед заливкой в эпоксидную смолу на кристалл горного хрусталя наматывается серебряная проволока, обычно делается 5 – 7 витков, и концы обмотки выводятся за пределы блока из смолы, для последующего подсоединения к сопротивлению (R 3) и крестообразному электроду (Рис.1). «Излучатель» и кристалл горного хрусталя с обмоткой, изготовленный в виде «оргонита», представлен на рис. 4. 10 а б Рис. 4. Устройство излучателя комплексного поля аппарата «Камена» для дистанционного воздействия на нормальные и раковые клетки. а. – Кристалл горного хрусталя в обмотке из серебряной проволоки; б. – Излучатель поля, изготовленный по типу «оргонита», в виде прямоугольного параллелепипеда. (Кристалл кварца залит в эпоксидную смолу с алюминиевыми опилками). После заливки горного хрусталя в эпоксидную смолу происходит механическое воздействие на кристалл за счет затвердения эпоксидной смолы и ее сжатия. По этой причине, благодаря пьезоэлектрическому эффекту, на гранях кристалла возникает электростатические поле, которое при подаче прямоугольных импульсов тока в обмотку с частотой 15 Гц образует электростатические импульсы. Обычно в аппарат «КАМЕНА 1а» устанавливается аккумулятор (никель-металлгидридный Ni-MH) и к нему прилагается зарядное устройство. Уже предварительные исследования показали, что эффективное воздействие поля включенного аппарата на живые клетки организма распространяется от аппарата на 6–7 метров. Оптимальное воздействие от аппарата составляет 4-5 метров и покрывает площадь около 15-20 кв.м. Длительность такого воздействия может составлять от 1 часа до 2-х часов в сутки. При дистанционном воздействии аппарата также улучшается 11 (ускоряется) всхожесть и созревание культурных растений. Аппарат «Камена» при дистанционном воздействии на кровь, после 20-минутной экспозиции нормализует клеточную структуру крови. Мы рекомендуем после каждого воздействия аппаратом «Камена» сделать отдых 6–8 часов и затем повторить процедуру. Однако более детальные исследования дистанционного и контактного воздействия комплексного поля аппарата на культуру раковых клеток и на нормальные клетки человека и животных будут описаны ниже. 12 Глава первая. Деление и адгезия раковых клеток под влиянием поля аппарата «Камена» 1. Действие поля аппарата «Камена» на раковые клетки человека в культурах L-41 (лейкемия), A-549 (карцинома легкого), HeLa (рак шейки матки) За последние годы количество работ посвященных борьбе со злокачественными образованиями путем химиотерапии значительно возросло и насчитывает тысячи научных статей, монографий и изобретений. Однако основной путь в лечении рака направлен на применение токсичных соединений в высоких концентрациях, способных подавлять пролиферацию злокачественных клеток. Применение высоких концентраций токсикантов и цитостатиков отрицательно сказывается на состоянии онкологических больных, которые и без того ослаблены основной болезнью, и очень плохо переносят период терапии. Данная работа направлена на поиски нетоксичных цитостатиков, которые употребляются в минимальной дозировке, и на комплексное воздействие физических и химических факторов, резко снижающих митотический индекс (МИ) злокачественных клеток. В качестве малотоксичного соединения, способного снижать пролиферацию раковых клеток, мы видим нозоды, которые с каждым днем находят широкое применение в онкологии (Skloot, 2012 Smith, 2002), а в качестве полевого воздействия на раковые клетки в культуре мы использовали электрические импульсы (15 Гц), создаваемые аппаратом «Камена» (Симаков, Бунин, 2014). Указанная частота выбрана из расчета, что она будет резонировать с полями Шумана, в которых нуждаются все клетки живых организмов (Сподобаев и др., 2000). Данную работу мы провели на трех культурах раковых клеток, которые в настоящее время широко используется в биологических и медицинских 13 исследованиях (Кудрявцев и др. 2011). Более ранними исследованиями было показано, что гетеронозоды, приготовленные из биоматериала взятого от раковых больных, дают положительный эффект при лечении рака в комплексе с другими лекарственными средствами (Рамакришнан, Куплер, 2009). Мы же для снижения высокой пролиферации злокачественных клеток будем применять совместное воздействие физического поля «Камены» и нозодов. В этом заключается отличие нашей работы от ранее проведенных исследований, и ее новизна. Целью данной части исследований является изучение действия комплексного поля, создаваемого аппаратом «Камена», и нозодов, полученных из слезы и БАТ (биологически активной точки) пациентов кафедры Восточной медицины РУДН, на митотическую активность и жизнеспособность клеток в трех указанных культурах раковых клеток. Эксперименты проведены на трех линиях клеток L-41, A-549 и HeLa, которые является самыми известными среди исследователей - биологов и медиков. Эти культуры широко используется в лабораториях для выявления факторов, подавляющих злокачественный рост, а также для испытания и тестирования различных лекарственных веществ. Показано, что после 60 минутного воздействия импульсным электрическим полем с частотой 15 Гц., создаваемым аппаратом «Камена», в культуре раковых клеток происходят морфологические структурные перестройки. Клетки сжимаются, у них уменьшается контакт с субстратом, а форма становится вытянутой и клинообразной. Помимо этого, под влиянием прямоугольных импульсных токов с частотой в 15 Гц (в форме меандра) паттерны (узоры), образованные клетками HeLa, напоминающие «цветок», разрушаются, и клетки хаотично размешаются в культуре. Клетки HeLa, после воздействия полем аппарата «Камены», становятся разными по размеру, что позволяет говорить о развитии анизоцитоза, который указывает на понижение устойчивости раковых клеток в культуре к неблагоприятным для них факторам. За этот же период времени в контроле наблюдается только перемещение клеток 14 относительно темной метки за счет горизонтальной миграции. При этом сжатия клеток и разрушение паттернов, которые первоначально отмечаются в культуре, в виде «цветка» не наблюдается. Выявленный эффект воздействия низкочастотных импульсных токов на морфологию раковых клеток и на паттерны их распределения по субстрату может оказаться важным для терапии злокачественных опухолей. Проведенный нами опыт пока не позволяет ответить на вопрос, как долго сохраняется эффект воздействия на раковые клетки человека в культуре и насколько безопасно применение указанного импульсного электростатического поля для подавления активности злокачественных клеток. В наших экспериментах, при применении только поля «Камены», наблюдалось повышение клеточной пролиферации в культуре злокачественных клеток. Все это говорит о том, что необходимы дальнейшие исследования выявленного эффекта воздействия низкоинтенсивного импульсного тока на злокачественные клетки человека в культуре. Линия клеток HeLa была получена от чернокожей женщины Генриетты Лакс в 1951 году в США от больной карциномой шейки матки, которая вскоре умерла от рака, но культура ее клеток поддерживается в лабораториях мира до сих пор. Клетки HeLa, как и все раковые клетки, бессмертны, в них синтезируется теломераза, которая способствует наращиванию теломеров, и эти клетки не подвержены феномену Хейфлика, когда здоровые клетки погибают после 52 делений (Фукуяма, 2004; Симаков. 2013). За последнее время появился ряд сообщений о том, что импульсное электромагнитное поле (от 8 до 15 Гц) подавляет прирост раковых клеток в культуре (Подчерняева и др., 2008). При использовании аппарата «Мини эксперт-ДТ» фирмы «ИМЕДИС» в течение 3 дней с интенсивностью 100 мкр Тесла, по 3 мин ежедневно, происходит снижение прироста раковых клеток в культуре на 25 %. Идентичные исследования проведены на различных культурах раковых клеток при применении других аппаратов, дающих 15 частоту 8 Гц. В данном исследовании использовалось несколько иное поле импульсное электрического поле с частотой 15 Гц, идущее от генератора «Камена 1а» (Бунин и др. 2014). Изучали распределение и миграцию клеток HeLa по субстрату (дно пластикового матраца для культивирования). Частота электрических импульсов 15 Гц, соответствует одной из гармоник полей Шумана, которые служат основным резонатором для нормальных здоровых клеток большинства организмов на Земле. Выявление отклонений в паттернах распределения клеток по субстрату и их поведение клеток при действии импульсных электрических полей может иметь большое теоретическое и практическое значение, так как эти частоты воздействуют непосредственно на процессы роста злокачественных опухолей и на образование метастазов в реальных злокачественных опухолях. 1.1. Культуры клеток и питательные среды при эксперименте Для экспериментов использовались линии раковых клеток из Коллекции культур тканей ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздрава РФ. Для культивирования клеток применяли стандартную питательную среду Игла производства Московского института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) фирмы «Пан Эко». Для изучения цитотоксического действия препаратов на культуру клеток применяли МТТ – тест (Харбиев, 2005; Chomezynski et all. 1995, Getelder et all., 1997; Lin et all., 1998, Mezentseva et all., 2013). Клетки рассевали на 96-луночную панель фирмы «Costar» (США) в концентрации 200 тыс. кл/мл в каждую лунку в объёме 100 мкл культуральной среды с 10% ЭТС и инкубировали в термостате с СО2 при 37°С. Через 24 часа после посадки клеток в лунки вносили по 100 мкл изучаемого нозода в заданных разведениях с тремя повторами на точку и дополнительно подвергали воздействию поля идущего от аппарата «Камена». После инкубации клеток с данными препаратами в течение 2, 24 и 48 часов в 16 СО2, в термостате при 37ºС, культуральную среду отсасывали из лунок, добавляли по 100 мкл среды с 20 мкл МТТ (3[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2.5дифенилтетразолия,Sigma) в исходной концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 4 часов. Затем среду с МТТ удаляли и добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Осадок клеток ресуспендировали в течение 5 мин пипетированием. Жизнеспособность клеток оценивали по интенсивности окраски раствора, измеряя оптическую плотность при длине волны 545 нм фотометра Immunochem 2100 (США). Матрасы с питательной средой и клетками HeLa, привитыми за 3 дня до постановки опыта, помещали дном непосредственно на аппарат «Камена» к контактным электродам. Исследование проводилось при частоте прямоугольных импульсов тока 15 Гц. Подаваемые импульсы на кварцевый кристалл генератора волн составляли 100 mV. Спектральная плотность колебаний составляет 0,1 мВ/м и обычно длится около 0,3 сек. Помимо лунок для культивирования использовались матрасы. Размеры матраса для культивирования клеток 4,5 Х 8,5 см. соответствовали размерам генератора «Камена». Экспозиция клеток HeLa в поле воздействия аппарата «Камена» длилась 60 минут. Состояние культуры исследовалось и фотографировалось до начала воздействия аппарата и через 60 минут (прекращение воздействия аппарата). Клетки HeLa в культуре исследовались только в живом состоянии без применения фиксаторов и красителей с помощью инвертированного микроскопа. У исследователей уже имеется опыт прижизненного изучения оптической плотности клеток линии HeLa (Симаков, Бунин, 2014). Воздействие полем идущим от аппарата осуществлялось через пластиковое дно матраца Кастора (сосуда для культивации клеток) толщиной 0.8 мм, к поверхности дна которого прикреплялись HeLa клетки. 17 Основными показателями были: измерение площади клеток, распластанных по субстрату, миграция клеток в свободные от культуры участки дна матраса и количество клеток совершивших вертикальную миграцию, которые приобрели шаровидную форму, выклинились из монослоя и приступили к митозу. При этом клетки остались прикрепленными к распластанным по субстрату клеткам. Клетки HeLa, находящиеся в процессе деления, мы выявляли по округлым очертаниям и по оконтуриванию, которое получалось за счет их поднятия над субстратом при митозе, и частичного выхода клетки из фокуса микроскопа. Для фотографирования одних и тех же зон на дне матраса с культурой клеток HeLa применяли прием естественных меток - темные образования и полосы характерной формы. Ниже приводятся снимки участков культуры, где в одном случае ориентиром выступают черный эллипсоид и черная точка, в также характерное расположение клеток вокруг одной клетки в виде «цветка», который, видимо, получается за счет множественного митоза. Прижизненная микроскопия культуры дает возможность подсчитать изменение средней площади отдельных клеток после воздействия сверхнизкими частотами импульсного поля. Помимо этого появляется возможность определить количество разрушенных паттернов в виде «цветка», образованных клетками HeLa за счет множественного деления и горизонтальной миграции. Наблюдение за состоянием клеток HeLa после воздействия полем аппарата «Камена» проводилось также через 24 и 72 часа. В общей сложности было исследовано 5 флаконов для культивации клеток HeLa, в каждом из которых изучали клетки в 3-х полях зрения микроскопа при ув. 40 х 15, площадью 0,25 мм. В качестве контроля использовали три матраса с культурой, посеянной, как и для опыта, за 3 дня до начала эксперимента. Контрольные матрасы находились в отдалении от генератора импульсных токов. Эксперименты с культурой А-549. Испытание проведено на культуре клеток рака легкого человека линии А-549 с использованием клеточного 18 анализатора в режиме реального времени iCELLigence (ACEA Biocience, США). В 8-луночный планшет клеточного анализатора ACEA (США), был произведен посев клеток рака легкого человека линии А-549 в среде. Среда для культивации клеток линии А-549 - DMEM, содержащая 10% телячьей эмбриональной сыворотки. Затем планшет устанавливали в многопараметровый биосенсорный анализатор культур клеток in vivo. На верхнюю крышку планшета помещали импульсно-волновой генератор «Камена -1а», который перекрывал шесть лунок на планшете, кроме ячеек со средой и контрольной культурой клеток (лунки А и В). Нозоды были приготовлены на кафедре Восточной медицины, университета Дружбы народов РУДН, из слезы пациентов и из эксудаьа взятого из точек БАТ (R2 и R 10), когда 0,02 мл экссудата или слезы взятой из глаза разводились физ. раствором в тысячи раз. Согласно проведенным ранее исследованиям гетеронозоды, приготовленные от раковых больных, дают положительный эффект при лечении рака в комплексе с другими лекарственными средствами (Жукова и др., 2008) Далее осуществлялось детектирование изменения электрического импеданса клеточных культур в режиме реального времени. По клеточному индексу (CI) судили о состоянии культуры в различных лунках и росте культуры А-549 в различных условиях опыта. Через сутки, после наращивания культуры клеток рака легкого в лунках планшета включали аппарат «Камена -1 а» и одновременно с этим в три ячейки (С, D, E) вносили нозоды по 400 мкл, полученные из слезы здоровых и больных испытуемых с доброкачественными и злокачественными опухолями. В ячейку С был внесен нозод полученный от пациента с липомой легкого, в ячейку D – от здоровой женщины и в ячейку Е введен нозод от больного раком мочевого пузыря. Три оставшиеся лунки (F, G, H) были заполнены культурой раковых клеток А-549, которая подвергалась только воздействию поля, создаваемого аппаратом «Камена 1а», с частотой 15 Гц. 19 Таким образом, культура раковых клеток легкого А-549 в трех ячейках (C, D, E) подвергалась двойному воздействию – полем от аппарата «Камена 1а» и влиянию нозодов, а культура клеток в лунках F, G, H только полевому воздействию, идущему от аппарата «Камена 1». Из-за невозможности исключить воздействие поля аппарата «Камена» при исследовании воздействия на общем планшете, мы обоснованно не могли поставить контроль по действию одних нозодов на культуру клеток А-549. Общая продолжительность проведения эксперимента составила 70 часов, воздействие аппарата «Камена» и нозодов составило 46 часов. Испытание было прекращено после перехода клеток культуры А-549 в большинстве лунок к выходу роста на плато. Проверялось также действие нозодов на культуру раковых клеток HeLa/ Анализ действия нозодов полученных из точек БАД, на культуру клеток HeLa делали через 3 часа после начала воздействия аппаратом «Камена 1а» и внесения нозоов в матрасы с культурой. Время экспозиции нозодов на клетки HeLa было выбрано из того расчета, что интерфаза у раковых клеток в два раза короче, чем у нормальных клеток. Состояние культуры исследовалось и фотографировалось до начала воздействия препарата и поля «Камены», и по окончании опыта 3 через часа. Клетки культуры HeLa исследовались только в живом состоянии без применения фиксаторов и красителей с помощью инвертированного микроскопа. Основным показателем увеличения митотической активности в культуре клеток HeLa было появление округлых клеток и их пар (стадия телофазы). Однако полностью адгезия у делящихся и округлившихся клеток не пропадает, и они остаются прикрепленными к распластанным по субстрату клеткам. 1.2. Воздействие аппарата «Камена» и нозодов на культуру клеток L-41 20 В таблице 1.1 даны данные по определение жизнеспособности клеток L-41 после воздействия на них нозодами полученными от женщины с лейкозом и аппаратом «Камена» (экспозиция 48 часов). Таблица 1.1. Показатели жизнеспособности в тесте МТТ (среднее по трем повторностям) для раковых клеток L-41 при действии нозодов и аппарата «Камена Разведения нозодов 1\2 1\4 1\8 1\16 10 Инь-гу 1.4 1.44 1.43 1.44 Слеза 1.3* 1.34 1.45 1.39 R 2 –Жань-гу 1.2* 1.45 1.37 1.30 Контроль 1.44±0.05 *Достоверность разницы средних (Р≤0,01) Удалось установить, что жизнеспособность раковых клеток снижается при совместном действии «Камены» и нозодов при разведении 1/2, полученных из слезы и точки жань-гу (R 2). Таким образом, принцип подавления злокачественных опухолей при комплексном воздействии аппарата «Камена» и нозодов полученных о ракового больного подтверждается тестом МТТ. Однако мы считаем эти данные первоначальными, и требуется дальнейшее исследование для набора статистических показателей. 1.3. Воздействие аппарата «Камена» на адгезию клеток HeLa Воздействие полем, полученным от генератора волн с частотой 15 Гц. приводит к изменению морфологии клеток HeLa, распластанных по поверхности дна матраса. В то время, как в контроле происходит с основном сдвиг структур относительно черной метки, представляющей собой пятно в нижней части рисунка, но паттерны клеточного распределения при этом сохраняются (Рис.5). 21 Рис. 5 Контроль. Слева - до начала эксперимента; справа - тот же участок через 60 минут без воздействия «Камены». (Внизу – черная метка). При действии импульсного низкочастотного тока распределение клеток и их конфигурация меняется настолько, что все паттерны распределения клеток на отмеченном участке становятся почти неузнаваемыми. Одновременно с этим часть клеток округляется, частично теряет адгезию с пластиковым дном матраса и приступает к делению. Об уменьшении сцепления клеток с субстратом и изменении их адгезии а можно судить по появлению контуров вокруг клеток сжавшихся под влиянием поля аппарата «Камена». Под влиянием поля аппарата «Камена» возросло количество трехполюсных митозов, что указывает на нарушения, связанные с образованием веретена деления и образование образование центриолей. Один из таких участков культуры клеток HeLа до воздействия импульсами от аппарата «Камена» и после воздействия представлен на рис.6. рис.6 22 а б Рис. 6.. Распределение клеток HeLa на отмеченном участке дна матраса под влиянием импульсного ЭМИ с частотой 15 Гц. ( метка слева). а. - до воздействия «Камены»; б – 60 мин воздействия «Камены». В качестве ориентира-метки ориентира метки выступает темное пятно с левой стороны рассматриваемого участка дна матраса с культурой клеток HeLa. На всех снимках в контроле отмечено своеобразное распределение клеток HeLa.. Имеется одна центральная клетка, а вокруг нее располагается 8 -10 10 вытянутых клеток. Все это как бы напоминает напоминает цветок. Как видно из рис.6 а, после воздействия аппарата «Камена» клетки HeLa сильно перемещаются и приобретают вытянутую тянутую клиновидную форму (Рис.6. (Рис.6. б). При воздействии импульсного генератора «Камена» пустые окна дна матраса резко сократились за счет горизонтальной миграции в них клеток HeLa. Количество оличество делящихся клеток, частично потерявших адгезию с субстратом, увеличились в два раза раза по сравнению с контролем. контролем Многие клетки, находятся на стадии поздней телофазы, которая которая определяются по 23 парам клеток, а иногда отмечены и трехполюсные и многополюсные митозы на стадии телофазы. Под воздействием поля аппарата происходит разрушение структур клеток HeLa,, похожих на «цветок». «цветок» а б паттернов «цветов» образованных на субстрате Рис. 7.. Разрушение паттернов-«цветов» клетками HeLa под влиянием поля, идущего от аппарата «Камена»: а – до воздействия; б – после воздействия (внизу черная метка). На рис. 7 а представлен также участок культуры клеток HeLa с крупной меткой внизу до воздействия импульсным генератором генератором токов. В этом случае видны структуры с центральной клеткой, напоминающие напоминающие «цветок». Клетки распластаны по субстрату и заполняют пустоты во все стороны от цен тральной клетки.. После воздействия полем аппарата с течение 60 минут то же фрагмент клеточной ой культуры представлен на Рис. 7 б. Паттерн клеток в виде «цветка» деструктирован и возрастает хаотическое распределение клеток по дну матраса. Площадь клеток сокращается, и у них проявляется контур характерный для клеток с утолщенным краем. У большинства большинств клеток 24 отмечается анизоцитоз. Налицо потеря клеточной организации, которая была в культуре раковых клеток до воздействия на них аппаратом «Камена». Далее для примера показан фрагмент газона культуры клеток Hela, где под меткой (черта под углом) расположена хорошо различимая структура в виде «цветка» (рис. 8 а), которая после воздействия импульсным полем генератора «Камена» в течение часа также подверглась разрушению (Рис. 8.б). Как и в других случаях, воздействие аппарата «Камена» приводит к сжатию клеток и к резкому возрастанию митозов (шаровидные клетки). а б Рис. 8. Разрушение отдельно взятого паттерна-«цветка» (в центре) под влиянием импульсного поля «Камены»: а – до применения «Камены»; б – после воздействия полем «Камены». Таким образом, только один морфологический анализ изменения структуры и контакта живых клеток HeLa под влиянием воздействия импульсно волнового генератора «Камена», позволяет сделать вывод, что низкочастотные и низкоинтенсивные электрические импульсы окончательно нарушают сохранившийся порядок у злокачественных клеток, вызывают их 25 сжатие, и повышают их митотическую активность. Энтропия в культуре клеток HeLa под влиянием поля аппарата «Камена» возрастает, и клеточная организация стремиться к хаосу. Для количественной электрических оценки импульсов (15 Гц.) воздействия на низкочастотных увеличение хаотического распределения клеток HeLa по субстрату при культивировании, нами были взяты - степень разрушения паттернов клеток в виде «цветка» и сокращение площади распластанных по стеклу клеток. Данные об этих показателях представлены в табл. 1.2. Таблица 1.2 Изменение структурны клеток HeLa при воздействии аппарата «Камена» (площадь клетки в мкм2, паттерны-«цветок» кол-во шт. на площади 0,25 мм2) Показатели: Наблюдение во Наблюдение время воздействия полем после воздействия поля «Камены» 30 мин. Средняя площадь 1585±187 «Камены» 60 мин. 24 часа 72 часа 1614±155 15766±205 15694±185 16 17 19 клетки (подсчет 1000 клеток, контроль) Паттерны-«цветок» 18 (контроль) 10 полей зрения микроскопа Средняя площадь 954*±126 Анизоцитоз 10126*±145 12341*±184 клетки (подсчет 1000 клеток - опыт) Паттерны-«цветки» 12 3 5 12 (опыт) в 10 полях *Достоверность разности средних площади клеток по критерию Стьюдента; Р ≤0,01. 26 Как видно из таблицы, происходит постепенное восстановление параметров нарушенных воздействием поля «Камены», но к третьим суткам еще сохраняется достоверная разница между контролем и опытом. Более длительное наблюдение за изменением площади клеток НеLa под воздействием импульсного электрического поля от аппарата «Камена2 затруднено, так как в процессе пролиферации клетки мигрируют из отмеченной исследуемой области. Анализ полученных результатов показывает, что под влиянием прямоугольных электрических импульсов низкоинтенсивного и низкочастотного генератора «Камена» раковые клетки в культуре сжимаются и происходит разрушение паттернов, сохранившихся за счет множественных митозов. вокруг основной клетки, напоминающих «цветок». В настоящее время очень трудно судить положительный или отрицательный эффект получается от этого воздействия. Необходимо проследить за отдаленным эффектом этого воздействия. Как это могло бы отразиться на реальной опухоли? Во всяком случае, можно ожидать уменьшение объема опухоли. Но непонятно, как будут вести себя злокачественные клетки, ведь проведенные активности эксперименты клеток HeLa. указывают на повышение митотической Возникший от воздействия импульсного электрического поля анизоцитоз, и деструкция паттернов распределения приводят к гибели злокачественных клеток. Выявленный эффект можно трактовать как усиление злокачественности клеток.. Прижизненная микроскопия культуры дает возможность подсчитать количество вышедших из монослоя клеток HeLa, но сохранивших связь с субстратом, на стадии телофазы по отношению к распластанным клеткам по дну матраса, и тем самым определить митотический индекс в культуре, не прибегая к окрашиванию хромосом. Совместное действие нозодов и поля аппарата «Камена 1а». Для получения средних показателей было исследовано по три участка на дне 27 флакона для культивации клеток HeLa, подвергнутых комплексному действию нозода и полевому воздействию аппарата «Камена». В каждом матрасе обсчитывались клетки в трех полях зрения микроскопа на площадях 450 Х 350 мкм, вырезанных из изображения культуры раковых клеток, распределенных по дну матраца (для оптической обработки материала использовалась компьютерная программа XV). Для подсчета митотического индекса выбиралось три произвольно выделенных поля. МИ (митотический индекс - соотношение клеток, находящихся в митозе, ко всем обсчитываемым клеткам в выделенном поле) подсчитывался в %, что вполне допустимо при высокой клеточной пролиферации в культуре клеток Hela. На кафедре «Восточной медицины» университета дружбы народов, готовили нозоды из экссудата взятого из биологически активных точек (БАТ). Исследуемые добровольцы, у которых из точек БАТ брали экссудат инсулиновой иглой, представляющий собой в основном каплю крови, были разбиты на три группы по 5 человек. В первую группу входили люди с патологией связанной с высокой пролиферативной активностью и нарушением цитодифференцировки в тканях (злокачественные и доброкачественные опухоли, лейкозы, поликистозы). Вторая группа. Больные с нарушением обмена веществ (сахарный диабет 2-го типа, токсический гепатит, мочекаменная болезнь, склеродермия, псориаз). Третья группа. Практически здоровые люди (у двух женщин климактерический синдром). Экссудат брали из точек Инь-гу (R10) и Жань-гу (R2). Контроль (рост культуры без нозодов) поставлен на З-х матрасах. Состояние культуры раковых клеток при одновременном воздействии нозодов и аппарата «Камена 1» изучалось в течение трех часовой экспозиции. 28 Показано, что наибольшее подавление митотической активности злокачественных клеток (более чем в 5 раз) отмечается при совместном воздействии аппарата «Камена 1» и нозода, полученного от донора с липомой легкого из точки Инь-гу, и более чем в три раза при применении аппарата «Камена» и нозода от больного лимфогранулематозом (ЛГМ). Наименьшей активностью обладают нозоды, изготовленные из экссудата, взятого из точки Жань-гу от здоровых людей, даже при комплексном воздействии аппарата «Камена» и нозода. Во всех случаях совместное действие нозодов, полученных из экссудата, взятого из точки R 10 и действие поля аппарата «Камена», активно подавляют митозы в культуре раковых клеток по сравнению с комплексным действием нозода, изготовленного из из точки Жань-гу и действия поля аппарата «Камена 1а» в течение 3-х часов. Таким образом, установлено, что после 60 минутного воздействия импульсным электрическим полем генерируемым аппаратом «Камена» в культуре раковых клеток происходят хорошо различимые морфологические перестройки. Во-первых, клетки HeLa сжимаются и уменьшают контакт с субстратом, их форма становится вытянутой и клинообразной. Во-вторых, под влиянием импульсного электрического поля с частотой 15 Гц паттерны (узоры), образованные клетками HeLa, напоминающие «цветок», разрушаются, и клетки хаотично размешаются в культуре. Налицо развитие энтропии. Кроме того, клетки HeLa, после воздействия полем аппарата «Камены», становятся разно размерными, что позволяет говорить о развитии анизоцитоза, характерного для большинства раковых клеток. За этот же период времени в контрольных культурах клеток HeLa происходит сдвиг относительно темной метки за счет горизонтальной миграции. Но сжатия клеток и разрушение паттернов в виде «цветка» не наблюдается. Выявленный эффект - воздействие низкочастотного электрического поля и тока с прямоугольными импульсами на морфологию раковых клеток и их распределения по субстрату, призывают настороженно относиться к 29 действию генерируемого аппаратом «Камена» поля. Проведенный нами краткосрочный опыт не позволяет пока ответить на вопрос, как долго сохраняется эффект воздействия на раковые клетки человека в культуре и насколько безопасно воздействие указанного импульсного поля на реальные опухоли у человека. Только дальнейшие эксперименты позволят ответить на эти вопросы, а пока можно только констатировать, что установлен важный эффект показывающий, что прямоугольные импульсы тока с частотой 15 Гц. влияют на адгезию раковых клеток и на их митотическую активность. 1.4. Воздействие импульсного генератора «Камена-1а» и нозодов на культуру клеток рака легкого А-549 в режиме реального времени Испытание проведено на культуре клеток рака легкого человека линии А-549 с использованием клеточного анализатора в режиме реального времени iCELLigence (ACEA Biocience, США). Методика проведения эксперимента описана ранее. Раковая клетка легкого представлена на рис.9. Рис. 9. Раковая клетка легкого, из которой формировалась пересеваемая культура раковых клеток линии А-549. 30 Далее осуществлялось детектирование изменения электрического импеданса клеточных культур в режиме реального времени. По клеточному индексу (CI) судили о состоянии культуры в различных лунках и росте культуры А-549 в различных условиях опыта. Через сутки, после наращивания культуры клеток рака легкого в лунках планшета включали аппарат «Камена -1» и одновременно с этим в три ячейки (С, D, E) вносили нозоды по 400 мкг, полученные из слезы здорового и больных испытуемых с доброкачественными и злокачественными опухолями. Нозоды были приготовлены на кафедре Восточной медицины, университета Дружбы народов РУДН, из слезы пациентов. Согласно литературным данным нозоды, полученные от раковых больных, дают положительный эффект при лечении рака в комплексе с другими лекарственными средствами (Ролик, 2000). В ячейку С был внесен нозод полученный от пациента с липомой легкого, в ячейку D – от здоровой женщины и в ячейку Е введен нозод от больного раком мочевого пузыря. Три оставшиеся лунки (F, G, H ) были заполнены культурой раковых клеток А-549, которая подвергалась только воздействию поля, создаваемого аппаратом «Камена 1», с частотой 15 Гц. Таким образом, культура раковых клеток легкого А-549 в трех ячейках (C, D, E) подвергалась двойному воздействию – полю от аппарата «Камена 1а» и влиянию нозодов, а культура клеток в лунках F, G, H только воздействию поля, идущего от аппарата «Камена 1а». Ввиду невозможности исключить воздействие поля аппарата «Камена» при исследовании с общим планшетом, мы обоснованно не поставили контроля по действию только нозода на культуру клеток А-549. Общая продолжительность проведения эксперимента составила 70 часов, воздействие аппарата «Камена» и нозодов составило 46 часов. 31 Испытание было прекращено после перехода клеток культуры А-549 в большинстве лунок к более медленному росту. На рис. 10 и 11 представлены графики изменения клеточных индексов в различных вариантах опыта, указывающие на рост культуры клеток А-549. На рис. 2 видно, каким образом первые 14 часов опыта идет активная пролиферация клеток рака легкого в лунках планшета. Через 24 часа, после замедления роста клеточного индекса, мы включили аппарат «Камена 1» и внесли нозоды в лунки С, D, E (на временной оси Х отмечено точкой). После этого наблюдается всплеск пролиферации клеток во всех лунках. Дальнейший анализ поведения раковых клеток легкого при воздействии «Камены 1» и нозодов от здоровых людей и людей с опухолями лучше рассматривать на увеличенной срединной части графика, представленной на рис. 11. Резкое повышение пролиферации клеток в культуре, скорее всего, связано с воздействием аппарата «Камена 1». Сходная картина наблюдалась при облучении других раковых клеток HeLв течение 60 минут (Симаков и др., 2014 а) в ранее проведенной нами работе. В дальнейшем идет спад прироста клеток в течение 7 часов. Причем наиболее интенсивно это явление отмечено во всех лунках, в которые внесены нозоды. Поскольку клеточный индекс в лунках с нозодами падает ниже достигнутого ранее показателя, можно говорить о частичной гибели раковых клеток под влиянием нозодов (такого падения в контроле и в культурах, с применением только аппарата «Камена» не происходит). Через 9 часов рост культуры клеток А-549 восстанавливается и идет сходно, как и в остальных лунках. Это продолжается примерно 18 часов, а затем наблюдается резкое падение роста и значительная гибель клеток культуры, в которую был внесен нозод (лунка С) больного с липомой легкого. В то же время культура раковых клеток в остальных лунках прирастает равномерно и однотипно, что указывает на отсутствие действия только одного поля аппарата «Камена» без использования нозодов полученных от больного с липомой легкого. 32 На рис 10 можно отметить, что на 60-м часу от начала опыта гибель клеток в лунке С сокращается и, возможно, при продолжении опыта она могла бы выйти на плато, хотя и не исключается полного подавления роста культуры клеток рака легкого. В лунках планшета D и E проявилось снижение роста культуры только после внесения в них нозодов. В дальнейшем даже при совместном действии поля аппарата «Камена» и нозодов разница в росте культуры между контролем и опытом не обнаружено. Рис. 10. Клеточные индексы в режиме времени в лунках планшета, содержащих культуру клеток А-549 (Клеточный анализатор ACEA) 33 Рис. 11. Клеточный индекс в 8 лунках планшета с культурой клеток рака легких при воздействии аппарата «Камена 1» и нозодов (лунки С, D, E) и только при воздействии одного поля «Камены (лунки F, G, H) (средняя часть графика представленного на рис. 11). 1.5. Обсуждение результатов Анализ полученных результатов показывает, что применение что контактного и дистанционного воздействие импульсного генератора тока «Камена 1а» способствует пролиферации в культуре клеток рака легкого А 549 в первый час после внесения. Указанная культура, используется в исследованиях, как в области онкологии, так и в области цитотоксичности (Жукова и др., 2008). Затем следует падение клеточной активности, до тех значений, которые отмечались до воздействия аппаратом «Камена 1а» и внесения нозодов в лунки с культурой клеток А 549. Однако это снижение пролиферации раковых клеток различно. В лунках (F, G, H), где на культуру 34 клеток рака легкого действует только поле аппарата «Камена 1», снижение клеточного индекса идет плавно и за 7 часов возвращается к исходным показателям (рис. 3). Совместное действие нозодов и аппарата «Камена 1» (лунки C, D, E) приводит к резкому падению клеточного индекса, и показатели падают ниже, чем они были до внесения нозодов и воздействия полем «Камены 1а». Можно отметить закономерность, что независимо от человека, из слезы которого приготовлен нозод (от здорового, с липомой легкого или с раком мочевого пузыря), отмечается примерно одинаковое падение клеточного индекса. Исключение представляет нозод от больного липомой легкого, так как культура раковых клеток приходит к прежнему показателю на час раньше. Во всех случаях, поскольку клеточный индекс падает ниже исходного положения, можно считать, что происходит гибель части клеток рака легкого под влиянием введения нозодов. Так как нозоды в нашем опыте вносились однократно, мы не можем сказать, продолжится ли гибель раковых клеток в дальнейшем, если считать, что срок действия нозодов составляет всего 7 часов. Дальнейшие испытания по многократному внесению нозодов в культуру клеток линии А 549 могло бы ответить на этот вопрос. Для этого требуются дополнительные специальные испытания с использованием клеточного анализатора в режиме реального времени iCELLigence. Через 18 часов произошло еще более заметное изменение при проведении испытания. Во временной точке 50,5 часов наблюдается резкое падение клеточного индекса в лунке С, говорящее о начале гибели раковых клеток под влиянием нозода и воздействия аппарата «Камена». Все это указывает на высокую цитотоксическую активность нозода полученного от больного липомой легкого. В нашей работе мы показали, что нозод действует не один, а в комплексе с воздействием импульсного генератора «Камена 1а». Такое комплексное воздействие нозода на раковые клетки отмечено также другими исследователями (Рамакришнан и др., 2009). Правда, они использовали 35 только химическое воздействие, и не прибегали к использованию электрических и тем более «оргонных» полей, создаваемых кристаллом горного хрусталя и металлической стружки, залитой в эпоксидную смолу, которые, возможно, образуются вокруг аппарата «Камена» своеобразное поле. Еще одной особенностью, выявленной нами в процессе проведения данной работы, является то, что активность проявил нозод, полученный от пациента с доброкачественной опухолью легких, именно он в комплексе с действием поля аппарата «Камена» оказал наиболее сильное воздействие на рост культуры клеток рака линии А 549. Мы вполне себе отдаем отчет в том, что опыт в других вариациях надо повторять многократно, чтобы окончательно убедиться, в комплексном действии нозода и аппарата «Камена», и в их способности подавлять развитие раковых клеток. 1.6. Определение жизнеспособности раковых клеток А 549, с использованием теста МТТ и митотического индекса при совместном воздействии «Камены» и нозодов Определение периода времени культивирования раковых клеток, через которое может проявиться воздействие нозодов, проведено нами на культуре А-549 с использованием теста МТТ при различных разведениях нозодов. Результаты представлены в табл. 1.3; 1.4; 1.5. Таблица 1.3 Жизнеспособность клеток A-549, определяемая МТТ, через 2 часа воздействия нозодов из слезы Разведения образца ОП 545нм Нозоды пациент. №№ №1 1\2 1\4 1\8 1\16 0.755 0.751 0.818 0.79 36 №2 0.674* 0.801 0.767 0.845 №3 0.619* 0.729 0.777 0.844 №4 0.725 0.805 0.818 0.818 №5 0.813 0.85 0.858 0.854 №6 0.791 0.828 0.854 0.817 №7 0.82 0.811 0.828 0.801 №8 0.948 0.89 0.882 0.965 №9 0.941 0.898 0.91 0.961 №10 0.909 0.993 0.947 0.957 №11 0.88 0.928 0.955 0.944 №12 0.865 0.957 0.955 0.931 №13 0.894 0.909 0.952 0.95 №14 0.933 0.952 0.972 0.977 Контроль клеток 0.887643±0.069886 *-достоверность разницы средних по критерию Стьюдента при Р≤ 0,01 Таблица 1.4 Жизнеспособность клеток A-549, определяемая МТТ, через 24 часа воздействия препаратов из слезы Разведения образца ОП 545нм Нозоды 1\1 пациентов №№ 1\2 №1 0.581 1\4 1\8 6 0.586 0.698 0.729 №2 0.598 0.753 0.714 0.788 №3 0.724 0.676 0.818 0.786 №4 0.735 0.718 0.734 0.708 №5 0.515* 0.526* 0.682 0.681 37 №6 0.693 0.627 0.642 0.726 №7 0.669 0.695 0.673 0.635 №8 0.807 0.857 0.782 0.726 №9 0.505* 0.672 0.62 0.673 №10 0.581 0.637 0.619 0.62 №11 0.579 0.628 0.643 0.734 №12 0.614 0.776 0.84 0.832 №13 0.473* 0.713 0.767 0.708 №14 0.483* 0.736 0.736 0.682 Контроль 0.761323± 0.045468 клеток *достоверность разницы средних по критерию Стьюдента при Р≤ 0,01 Таблица 1.5. Жизнеспособность клеток А-549, определяемая МТТ, через 48 часов воздействия препаратов из слезы Разведения образца ОП 545нм Нозоды 1\2 1\4 1\8 пациентов №№ 1\1 6 №1 1.395* 1.213* 1.196* 1.401* №2 1.197* 1.165* 1.195* 1.353* №3 1.177* 1.138* 1.329* 1.27* №4 0.971* 1.419* 1.424* 1.271* №5 1.195* 1.417* 1.395* 1.467 №6 1.131* 1.303* 1.347* 1.485 №7 1.038* 1.328* 1.288* 1.437 №8 1.246* 1.437 1.334* 1.458 38 №9 1.258* 1.457 1.39* 1.418 №10 1.212* 1.393* 1.404* 1.555 №11 1.212* 1.428 1.52 1.568 №12 1.362* 1.389* 1.427 1.643 №13 1.368* 1.458 1.4 1.602 №14 1.122* 1.241* 1.462 1.534 Контроль 1.641333±0.035385 клеток *достоверность разницы средних по критерию Стьюдента при Р≤ 0.01 Анализ данных, представленных в таблицах 2.2-2.4, показывает, что при двух часовом воздействии и через 24 часа нозод слезы оказывает слабое воздействие на изменение жизнеспособности клеток А-549. Активное действие препарата проявляется только через 48, когда даже при разведении нозода в 8 раз отмечается подавление жизнедеятельности большинства клеток карциномы легкого. Однако для дальнейших экспериментов по определению совместного воздействия нозода и поля аппарата «Камена» на митотическую активность клеток в культуре А-549 мы брали разведение препарата 1/2, при котором отмечалась реакция клеток на все образцы нозодов. При этом за основу длительности опыта мы взяли 48 часов, что соответствует стандартному времени проведения острого опыта для определения воздействия импульсного поля аппарата «Камена» и нозода. Микроскопическая картина культуры живых клеток карциномы легкого приведена на рис. 12, когда митозы подсчитываются по оконтуренным округлым клеткам, а клетки, находящиеся на стадии интерфазы, по выступающим светлым пятнам. При этом сдвоенные и строенные клетки мы считали как одну клетку, находящуюся на стадии поздней телофазы. Имеются данные, что митоз у раковых клеток может 39 завершиться образованием не только двух дочерних клеток, но трех и даже пяти. Рис. 12. Пример одного из участков культуры клеток (контроль) А-549, на которых определялся митотический индекс (МИ). При подсчете митозов учитывались данные электронной микроскопии, где показано, что делящиеся клетки карциномы в культуре округляются и выклиниваются из монослоя клеток расположенных на субстрате, находящихся в периоде интерфазы клеточного цикла. Все это позволяет подсчитать МИ в живой культуре без применения красителей. Для получения среднего показателя производили подсчет МИ в пяти лунках для каждого варианта опыта. В остальных лунках микроскопическая картина клеток культурыА-549 после воздействия электрических полей и нозодов была сходна с контролем, поэтому мы не приводим их изображения, так как различие было только в количестве митозов. Данные об изменении митотического индекса в различных вариантах опыта приведены в табл.2.5. Таблица 1.6. 40 Изменение МИ в культуре раковых клеток А -549 при 48 часовом воздействии аппарата «Камена» и нозодов (в %) Вид воздействия Митотический Контроль Поле Нозоды из «Камена» + «Камены» слезы нозоды 5,14±0,37 9,3*±0.24 3,9,2*±0,25 2,91*±0,31 100 181 76,3 56.7 индекс (МИ) % к контролю *Достоверность разницы средних по критерию Стьюдента при Р ≤ 0,01 Анализ полученных данных показывает, что импульсное электрическое воздействие аппарата «Камена» приводят к повышению МИ в культуре раковых клеток легкого на 81 %, а внесение в культуру раковых клеток только нозодов вызывает противоположный эффект (МИ на 23,7 % ниже контроля). В тоже время, при комплексном воздействии поля «Камены» и нозодов на клетки культуры А-594 в течение 48 часов не только снимается стимуляция клеточной пролиферации от аппарата, но и происходит дальнейшее понижение МИ по сравнению с действие только одного нозода. Можно считать, что подавление митотической активности в культуре клеток карциномы легкого при совместном воздействии импульсного электрического поля аппарата «Камена» и препарата-нозод, происходит за счет изменения проницаемости мембран раковых клеток и последующего повышенного проникновения нозодов в их цитоплазму. В пользу этого вывода говорят работы по электроперфорированию, когда с помощью сравнительно слабых электрических импульсов удалось проделывать в клеточных мембранах поры, через которые в клетку вводили чужие гены и белки. Отверстия через некоторое время затягивались, клетка возвращалась к нормальной деятельности (Пономаренко. 2011). С другой стороны, использование только одного импульсного электрического поля от аппарата «Камена» приводит сначала к повышенному появлению пор в оболочке раковых клеток, а затем к резкому повышению митотической активности, так 41 как клетки культуры А-549 от этого не гибнут и не снижают своей активности. Все это указывает на то, что применение низкоинтенсивного и низкочастотного импульсного генератора электрических полей «Камена» без нозодов, либо других лекарственных средств, даже опасно, так как появляется вероятность увеличения МИ не только в культуре раковых клеток, но и у больных в злокачественных опухолях. В противоположность этому комплексное воздействие поля «Камены» и нозодов приводит к уменьшению МИ клеток в культуре А-549 до уровня даже ниже, чем при применении только одного нозода. Можно ожидать, что сходный эффект произойдет и в реальных злокачественных опухолях. Данная работа показывает новые пути к лечению злокачественных опухолей при комплексном применении пульсирующих электрических полей и лекарственных средств с минимальными концентрациями биологически активных веществ, подавляющих жизнедеятельность раковых клеток. 1.7. Заключение по исследованию воздействия «Камены» и нозодов для культуры раковых клеток А-549 В результате проведения работы установлено, что воздействие низкоинтенсивным импульсным электрическим полем аппарата «Камена» с частотой 15 Гц. в течение 48 часов, на митотическую активность культуры клеток карциномы легкого А-549 приводит к повышению митотического индекса (МИ) почти в два раза. Применение нозодов из слезы глаза наоборот способствует понижению МИ в культуре раковых клеток примерно на 25 % по сравнению с контролем. Совершенно другая картина наблюдается при совместном действии нозодов и низкочастотного электрического поля аппарата «Камена» на раковые клетки в культуре А-549. В этом случае проявляется действие ниже аддитивного и митотический индекс (МИ) в культуре раковых клеток уменьшается почти в два раза. 42 Выявленный эффект комплексного воздействия низкочастотных пульсирующих электрических полей и нозодов, влияющий на снижение митотической активности в культуре клеток рака легкого, может найти применение в терапии злокачественных опухолей. 1.8. Изменение митотической активности у раковых клеток HeLa при воздействии аппаратом «Камена» В этой части работы ставится цель - выявить воздействие поля аппарата «Камена 1а», создаваемого низкочастотным электрическим импульсным током (15 Гц), на митотическую активность и адгезивные свойcтва клеток HeLa. Экспозиция поля, создаваемого аппаратом, на культуру клеток HeLa длилась 60 минут. Состояние культуры исследовалось до начала воздействия аппарата, через 30 минут после включения аппарата «Камена», через 60 минут (прекращение воздействия аппарата), через сутки и через 72 часа после завершения воздействием полем «Камены». Продолжительность воздействия полем, создаваемым аппаратом Камена, была выбрана из расчета, что митоз у здоровых клеток протекает в течение 60 минут, а у раковых клеток он может завершаться за более короткий промежуток времени. Клетки культуры HeLa исследовались только в живом состоянии без применения фиксаторов и красителей с помощью инвертированного микроскопа. Воздействие поля аппарата осуществлялось через пластиковое дно матраса Кастора (сосуда для культивации клеток) толщиной 0.8 мм, к поверхности дна которого прикреплялись HeLa клетки. Основным показателем увеличения митотической активности было образование округлых клеток и их пар (стадии телофазы). За снижением адгезии клеток HeLa c субстратом следили по оконтуриванию краев полигональных клеток (отставание кроев от субстрата). Однако полностью 43 адгезия даже у делящихся клеток не пропадает, и они остаются прикрепленными к распластанным распластанным по субстрату клеткам (Рис. 13). 13 Рис. 13.. Клетки HeLa,, на стадии завершения телофазы, на распластанных клетках, сохранивших адгезию с субстратом. Прижизненная микроскопия культуры дает возможность возможность подсчитать количество клеток HeLa, HeLa, находящихся в состоянии митоза, по отношению к распластанным клеткам еткам по дну матраца, и тем самым определить митотический индекс в культуре, не прибегая к окрашиванию хромосом. Было ыло исследовано дно трех флаконов для культивации клеток HeLa, в каждом варианте опыта. На дне каждого матраса обсчитывались клетки в 5 полях зрения микроскопа. В качестве контроля использовали три матраца с культурой, посеянной, как и для опыта, за 3 дня до начала эксперимента, которые находились в другой комнате. Состояние культуры клеток HeLa в контроле, который никогда не подвергался воздействию ствию поля аппарата, показано на рис 14 (а, б). 44 Рис. 14 Пример распределения митозов в контрольной культуре клеток HeLa (митозы представлены более светлыми оконтуренными клетками) Определяли митотический индекс (МИ - число митозов на 100 клеток), а также количество клеток в поле зрения микроскопа, у которых снижена адгезия. Подсчет клеток в пяти полях зрения микроскопа показал, что МИ в контроле почти одинаков в различных сосудах. Шаровидные клетки (в состоянии различных фаз митоза) занимают 7 -9 % от общего числа клеток в различных участках дна матраса (Рис. 14 , Табл. 2.7). Для примера один из участков культуры HeLa после воздействия полем аппарата «Камена» в течение 30 минут представлен на Рис. .8. Особенностью воздействия аппарата «Камена» оказалось то, что значительно возросло количество делящихся клеток. После воздействия полем аппарата «Камена» митотическая активность возрастает более чем в 1,8 раза (Табл. 2.7). 45 Рис. 15.. Округлившиеся и оконтуренные клетки (в состоянии митоза) митоза в культуре HeLa после 30 минутного воздействия полем аппарата «Камена». При воздействии низкочастотного импульсного тока и оргона в течение 60 минут количество шаровидных клеток HeLa возрастает 2.5 раза по сравнению с контролем. Таким образом, воздействие воздействи поля аппарата «Камена» в течение часа приводит к значительному возрастанию клеток вступивших в митоз и частично потерявших потерявших адгезию с субстратом. Состояние клеток культуры HeLa после часового воздействия аппарата «Камена» представлено на рис. 16. 16 46 Рис. 16.. Шаровидные (состояние митоза), оконтуренные клетки и неделящиеся клетки HeLa распластанные по субстрату в культуре, после воздействия в течение часа полем аппарата «Камена». Через сутки и через трое суток после воздействия аппарата «Камена» на клетки HeLa,, соотношение шаровидных и прикрепленных клеток ко дну сосуда для культивации постепенно уменьшалось. Следовательно, процесс увеличения численности клеток с пониженной адгезией адгезией происходил только во время работы аппарата и сразу после его воздействия. Поскольку состояние клеток HeLа HeL в культуре первых - третьих х суток становится близким к контролю, можно говорить о непосредственном влиянии поля аппарата на адгезию. Особенностью воздействия здействия поля «Камены» является то, что появляются многополюсные митозы. Количество митозов несколько снижается и на третьи сутки становится сопоставимо сопоставимо с контролем (табл. 1.7). 1.7 В контроле соотношение шаровидных и прикрепленных к субстрату клеток менялось за трое суток не более чем на 4 – 6%. Согласно современным 47 статистическим методам, применяемым в медицине и биологии (Платонов, 2001), разницу средних в этом случае можно считать недостоверной. Таблица 1.7. Воздействие поля аппарата «Камена» на митотическую активность и адгезию в культуре клеток HeLa (пониженная адгезия - количество оконтуренных клеток в поле зрения исследуемой зоны; МИ в %) Показатели Время после воздействия «Камены» с частотой 15 Гц. 30 мин. Митотический 60 мин. 24 часа 72 часа 16,6* ± 1,55 21,9* ± 2,17 12,58* ± 1,64 9,23 ±1,08 34* ±3,2 42* ±3,6 23 ± 2,5 21,2 ± 2,8 8.74 ± 1,0 9,12 ±0,87 9,2 ±0,43 9,37 ±1.1 18 ±3,8 22,1±3,2 20,7 ± 2,8 23,2 ± 3,5 индекс (опыт) Пониженная адгезия (опыт) Митотический индекс (контроль) Пониженная адгезия (контроль) *Достоверность разности средних по критерию Стьюдента; Р ≤0,05 В результате проведенных исследований по воздействию поля аппарата «Камена» в течение часа, на адгезивные свойства и пролиферацию клеток HeLa выявлено, что комплексное поле аппарата (возможно и «оргонное»), приводит к увеличению митотического индекса в 2,5 раза по сравнению с контролем. При этом появляется большое число клеток с краями, открепившимися от субстрата. Помимо этого возрастает количество клеток с многополюсными митозами. Возрастание митотической активности и некоторая потеря адгезивных свойств у клеток HeLa отмечается уже через 30 минутного воздействия импульсного электрического поля. После выключения аппарата процесс образования клеток потерявших адгезию с субстратом и подъем митотического индекса прекращается, а через 3 дня исследуемые показатели становятся близкими к контролю. 48 Проведенная работа показывает, как влияет воздействие поля, идущего от аппарата «Камена», на раковые клетки HeLa в культуре. Однако однозначно определить положительно или отрицательно воздействует поле аппарата на раковые клетки пока невозможно, так как требуются более длительные дополнительные исследования. Особенно настораживает тот факт, под влиянием поля аппарата в культуре клеток HeLa повышается митотический индекс и возрастает количество клеток с многополюсными митозами, на стадии телофазы, одна клетка дает сразу несколько дочерних клеток одновременно. У клеток уменьшается адгезия с субстратом. Возможно, при воздействии на злокачественную опухоль человека подобный процесс может способствовать отрыву клеток раковых клеток от опухоли, распространению их по сосудам и появлению дополнительных метастазов. Это необходимо проверить на других культурах клеток подобных опухолей, которых к настоящему времени насчитывается уже сотни. Можно предположить, что клетки HeLa под влиянием поля, идущего от аппарата «Камена» частично сжимаются, а это служит механизмом запуска появления дополнительных митозов, и у клеток происходит частичная потеря адгезии с субстратом. Возможен и второй вариант, под влиянием действия поля аппарата уменьшается адгезия клеток с пластиком дна матраса (поле аппарата воздействует на мембрану клеток), клетки округляются, и в них запускается митоз. Во всех случаях практическое применение аппарата для лечения злокачественных опухолей рекомендовать пока рано. 1.9. Влияние суточного воздействия поля аппарата «Камена» на рост клеток HeLa в культуре При дистанционном воздействии аппарата «Камена» на культуру клеток HeLa, полученную в лаборатории клеточных культур института Вирусологии им. Ивановского, в течение 1 часа было показано, что увеличивается количество клеток выходящих из монослоя, которые 49 находятся в состоянии митоза. Это указывает на отрицательное воздействие поля создаваемого аппаратом Камена на раковые клетки. Однако ошаривание клеток и отрыв от субстрата можно считать отрицательным явлением не только в культуре, но и при наличии злокачественной опухоли, так как увеличение митотической активности и уменьшение адгезии клеток, неблагоприятно для больного. Было решено посмотреть более длительное дистанционное воздействие аппарата, и одновременно воздействие его излучения на адгезивные свойства раковых клеток в культуре. Испытывали действие аппарата на культуру клеток HeLa в течение 24 часов, с последующим наблюдением за заполнением пустот по дне матраса в течение последующих двух суток. Методика исследований. Прижизненное наблюдения и фотографирование клеток HeLa проводили с помощью инвертированного микроскопа: до применения аппарата Камена, через 1 час после начала воздействия, через 24 часа (отключение аппарата Камена), и далее через 24 и 48 часов после завершения облучения. Основными параметрами были – измерение площадей пустых окон на дне сосуда для культивации и сокращение площади пустот по мере роста культуры клеток HeLa в монослое. Для этой цели на компьютере в программе XnWiew на изображение накладывалась сетка, и обсчитывалось соотношение площадей пустых окон к площади, покрытой клеточной культурой. Для получения каждого показателя исследовалось 4 препарата и дана средняя величина. Одновременно велось наблюдение за митотической активностью, сходно с тем как это проводилось ранее. Сравнительная картина культур клеток HeLa до облучения представлена на рис. 17. 50 а б Рис. 17.. Культура клеток HeLa до облучения. а-контроль; контроль; б –культура подготовленная к воздействию поля аппарата «Камена». (Пустоты без клеток составляют 39 %) При воздействии аппарата Камена в течение те часа количество клеток с оконтуренными краями возрастает примерно в 4 раза. Сходно с ранее проведенными опытами. Площадь Площадь пустот не занятых клетками HeLa в опыте даже аже несколько возрастает (рис. 18). 18 а б Рис. 18.. Культура клеток HeLa после воздействия твия полем аппарата Камена в течение 1 часа; а – контроль; б - опыт (Пустоты на дне матраца в контроле составляют 39 %, пустоты в опыте 43 %). 51 Через 24 часа аппарат был отключен и проведено исследование состояния культуры клеток HeLa.. В контроле отмечается резкое сокращение площадей дна матраца не занятых клетками. Одновременно отмечается возрастание в два раза пролиферационной активности клеток, которые определяются по округлению и оконтуриванию за счет выхода из монослоя. монослоя В опыте количество личество ошарившихся клеток сохранилось примерно на том же уровне, как и через час воздействия, однако рост клеток на пустые площади дна сосуда для культивации был значительно ниже, чем в контроле контро (Рис. 19). б а Рис. 19.. Клеточные культуры HeLa после 24 часов воздействия поля аппарата Камена: а – контроль; б – опыт (Пустые площади сосуда в контроле занимают 14%. В опыте площади свободные от клеток занимают 28 %) Таким образом, через сутки отмечается тся достоверное снижение адгезии у клеток HeLa в культуре при воздействии поля аппарата «Камена». Исследование состояния культуры раковых клеток через сутки после отключения аппарата «Камена» « показало, что в контрольной культуре количество лакун резко снижается, в то время как в опыте на дне матраса остаются ются еще лакуны. (рис. 20). 52 а б Рис. 20. Состояние культуры клеток HeLa через 24 часа после прекращения воздействия поля аппарата «Камена». а – контроль; б – опыт. (Площадь не занятой поверхности дна: в контроле – 11 %, в опыте 25 %). Исследование культуры клеток HeLa через 48 часов после воздействия поля аппарата Камена показывает, что замедленное распределение раковых клеток по дну матраца в опыте сохранился (Рис. 21). а б Рис. 21 Культура клеток HeLa через 48 часов после воздействия поля аппарата Камена. а- контроль; б – опыт (Пустоты: контроль 9 %, опыт –23 %). Таким образом, исследование воздействия поля аппарата «Камена» на распределение клеток HeLa в культуре по субстрату после суточного 53 облучения примерно в 2. раза ниже по сравнению с контролем, что указывает на уменьшение адгезии. В то же время клеточная культура в контроле за трое суток заполняет пустоты на 30 %, а при действии поля аппарата «Камена» распределение клеток по субстрату за трое суток подает, и они заполняют только 16 % пустот. Не смотря на повышение митотической активности в культуре клеток HeLa под влиянием поля аппарата «Камена» заполнение пустот на дне матраца происходит медленнее, что, возможно, связано с уменьшением адгезии между раковыми клетками и субстратом. После воздействия аппарата количество раковых клеток на единицу площади возрастает. 54
