Document 2364534

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Пущинский научный центр Российской академии наук
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
Пущинский государственный естественно-научный институт
Администрация города Пущино
УДК 57.08; 573.4; 574.24; 574.6; 577.1; 577.2; 577.3; 578,5; 579,6; 581.1; 591.1; 631.4
БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА: 18-я Международная Пущинская школаконференция молодых ученых (Пущино, 21 - 25 апреля 2014 г.). Сборник тезисов.
Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI
века» - научное мероприятие, проводимое для ознакомления молодых ученых с перспективами
и новейшими достижениями в различных областях биологии.
Работа школы-конференции проводится в следующих секциях:
- Биотехнология
- Биофармацевтика
- Биофизика и радиобиология
- Биохимия
- Математическая биология и биоинформатика
- Микробиология и вирусология
- Молекулярная биология
- Почвоведение и агроэкология
- Физиология животных и биомедицина
- Физиология растений и фотобиология
- Экология
В программу школы-конференции, кроме устных и стендовых докладов участников, входят
лекции ведущих российских и зарубежных ученых, круглые столы, мастер-классы, тренинги,
экскурсии по институтам Пущинского научного центра, научные и творческие конкурсы,
насыщенная культурная и спортивная программа.
ISBN 978-5-600-00210-4
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых
«БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА»
The 18th INTERNATIONAL PUSHCHINO SCHOOL CONFERENCE OF YOUNG SCIENTISTS
“BIOLOGY – THE SCIENCE OF THE XXI CENTURY”
Россия, г. Пущино, 21 – 25 апреля 2014 г.
Пущино, 2014
ПРЕДСЕДАТЕЛЬ ОРГКОМИТЕТА
Мирошников Анатолий Иванович, академик РАН, председатель ПНЦ РАН, директор ФИБХ РАН
ПРОГРАММНО-НАУЧНЫЙ КОМИТЕТ:
Боронин Александр Михайлович, член-корр. РАН, директор ИБФМ РАН
Вайнштейн Михаил Борисович, д.б.н., зам директора ИБФМ РАН, ректор ПущГЕНИ
Дагкесаманский Рустам Давудович, д.ф-м.н., директор ПРАО АКЦ ФИАН
Иваницкий Генрих Романович, член-корр. РАН, директор ИТЭБ РАН
Кудеяров Валерий Николаевич, член-корр. РАН, проф., директор ИФХБПП РАН
Лахно Виктор Дмитриевич, д.ф-м.н., директор ИМПБ РАН
Овчинников Лев Павлович, академик РАН, директор ИБ РАН
Пермяков Евгений Анатольевич, д.б.н., проф., директор ИБП РАН
Фесенко Евгений Евгеньевич, член-корр. РАН, директор ИБК РАН
Шувалов Владимир Анатольевич, академик РАН, директор ИФПБ РАН
Назарова Галина Николаевна, к.б.н., заместитель председателя ПНЦ РАН
Хаустов Сергей Анатольевич, к.б.н., заместитель председателя ПНЦ РАН
ЗАМЕСТИТЕЛИ ПРЕДСЕДАТЕЛЯ:
Шапырина Екатерина Валерьевна, н.с., ИБФМ РАН
СЕКРЕТАРИ:
Назарова Галина Николаевна, к.б.н., заместитель председателя ПНЦ РАН, учёный секретарь
оргкомитета
Леонова Мария Михайловна, к.б.н., с.н.с., ИФПБ РАН
Никонова Юлия Александровна, аспирант, ИТЭБ РАН, ПНЦ РАН
Никифорова Анна Борисовна, и.о. м.н.с., ИТЭБ РАН
Ельцова Зинаида Александровна, н.с., ИФПБ РАН
РУКОВОДИТЕЛИ СЕКЦИЙ:
Абдуллаев Серажутдин Абдуллаевич, к.б.н., н.с., ИТЭБ РАН, «Биофизика и радиобиология»
Бобылев Александр Геннадьевич, к.б.н., с.н.с., ИТЭБ РАН, «Физиология животных и биомедицина»
Вологжанникова Алиса Андреевна, н.с., ИБП РАН, «Биохимия»
Гудков Сергей Владимирович, д.б.н., с.н.с., ИТЭБ РАН, СМУ ПНЦ, «Биофизика и радиобиология»
Иващенко Кристина Викторовна, аспирант, инженер, ИФХиБПП РАН, «Почвоведение и
агроэкология»
Ивличева Наталья Александровна, к.б.н., н.с., ИБК РАН, «Физиология животных и биомедицина»
Квиткина Анна Константиновна, инженер, ИФХиБПП РАН, «Экология»
Козулева Марина Алексеевна, к.б.н., н.с., ИФПБ РАН, «Физиология растений и фотобиология»
Кондратьев Максим Сергеевич, к.ф-м.н., н.с., ИБК РАН, СМУ ПНЦ, «Математическая биология и
биоинформатика»
Москаленко Светлана Валентиновна, инженер, ИФХиБПП РАН, «Экология»
Овчинников Андрей Юрьевич, к.б.н., н.с., ИФХиБПП РАН, «Почвоведение и агроэкология»
Поливцева Валентина Николаевна, к.б.н., инженер, ИБФМ РАН, СМУ ПНЦ, «Микробиология и
вирусология»
Розова Ольга Николаевна, инженер, к.б.н., ИБФМ РАН, «Микробиология и вирусология»
Соболев Егор Васильевич, н.с., ИМПБ РАН, «Математическая биология и биоинформатика»
Согорин Евгений Анатольевич, аспирант, ИБ РАН, «Молекулярная биология»
Фадеев Роман Сергеевич, к.б.н., н.с., ИТЭБ РАН, «Биотехнология»
Фадеева Ирина Сергеевна, к.б.н., н.с., ИТЭБ РАН, «Биотехнология»
Фурсова Ксения Константиновна, к.б.н., н.с., ФИБХ РАН, «Биофармацевтика»
ТЕХНИЧЕСКИЙ КОМИТЕТ:
Бутенко Александр Вячеславович, м.н.с., аспирант ПРАО АКЦ ФИАН, информационная поддержка
Запрудина Мария Вадимовна, к.б.н., редактор сборника
Мязгова Наталия Владимировна, ЦЭПЛ РАН, дизайн
Попов Антон Леонидович, м.н.с., ИТЭБ РАН, ПНЦ РАН, координатор конкурса «Умник»
Шавкунов Константин Сергеевич, к.б.н., н.с., ИБК РАН, перевод
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
СЕКЦИЯ «Биотехнология»
EVALUATION OF ANTIMICROBIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF
ISOLATED CULTURE OF ST.-JOHN’S WORT ELONGATED
(HYPERICUM ELONGATUM LEDEB.)
Babayan A., Petrosyan M.T., Sahakyan N.Zh., Trchounian A.H.
Yerevan State University, Yerevan, Armenia
anush.babayan.90@mail.ru
The isolated culture of Hypericum elongatum Ledeb. with high biosynthetic activity was obtained.
The first signs of callus formation on explants were observed at 18-20 days of cultivation on the
medium with 1 mg/l kinetin, 0,5 mg/l NAA and 0,2 mg/l GA. But further cultivation of callus was
carried out on the MS (Murashige-Skoog) medium which was stimulating stem organogenesis (under
the light). Root formation was observed on the nutrient medium of MS-basis with 0.1 mg/ml NAA.
All of the in vitro cultures were incubated at temperature 25±1°C under the light (with the photoperiod
of 16 h (natural daylight, supplemented with artificial light of approx. 150 µmol quanta m–2 s –1
provided by white fluorescent and dark conditions). Metabolic features of this isolated culture were
studied. The agar-diffusion method was used to determine the antibacterial activity of products of the
secondary metabolism of the H. elongatum isolated culture against some gram-positive and gramnegative microorganisms. The conclusion can be done that the callus cultures of H.elongatum have the
ability to the synthesis of substances with antibiotic activity against Escherichia coli VKPM M-17,
Salmonella typhimurium TA 100, Staphylococcus aureus WDC M 5233, St. citreus WT, Bacillus
subtilis A1WT, B. mesentericus WDCM 1873. At the same time the synthesis of the substances with
antibacterial activity was under the hormonal control, and these substances selectively affect on the
test-microorganisms. In order to measure antioxidant activity of this cultures, growing under the
different conditions (composition of nutrient medium, light conditions), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
(DPPH) free radical scavenging assay was used. It was revealed that different concentrations of
extracted substances of H. elongatum tissue cultures (1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml and 50
µg/ml) growing in the dark conditions was shown higher (approximately three- fold) antioxidant
activity: 95%, 54.6%, 39.7%, 10.8%, than cultures in the same concentrations , growing under the
light. Their antioxidant activity was 28.7%, 22.7%, 2.834%, 2.421%. Thus, biotechnologically
obtained isolated culture of H. elongatum Ledeb. may be offered as a source of substances with high
antioxidant and antibacterial activity.
THE INFLUENSE OF NA AND FORMATE CONTENT ON HYDROGEN
PRODUCTIONBY HYPERTHERMOPHILIC ARCHAEA THERMOCOCCUS
ONNURINEUS NA1 UNDER ORGANO-AND MIXOTROPHIC CONDITIONS
Tekucheva D.N.
Institute of Basic Biological problems RAS, Pushchino, Russia
tekuchevadn@gmail.com
Currently, the majority of hydrogen is produced from fossil fuels, but from environmental
perspective, sustainable H2 production should be considered. Biohydrogen production has many
desirable properties, among others, environmental friendliness and renewability.
Thermococcus onnurineus NA1 is a hyperthermophilic achaea which is able to produce H2
utilizing toxic CO gas via water-gas shift reaction, and organic substances (for example formate,
disaccharides, and proteins). In the case of CO and formate utilization H2 production yield is closed to
1 mol of H2/mol of C1 substrate.
In our investigation of H2 production by batch T. onnurineus NA1 cultures different
concentrations of sodium formate were used as a sole substrate (organotrophic) or together with CO
(mixotrophic conditions). H2 production was strongly affected by formate content under both studied
conditions. The maximum H2 production under organo- and mixotrophic conditions (112.8±5.3 and
143.5±5.0 mmol H2/L broth) could be achieved at 800 mM Na-formate in the absence of NaCl (or
KCl).
3
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Both high (1000 mM) and low (450 mM) Na+ concentrations were unfavorable even if formate
content was sufficient. At sodium formate concentration of 15 mM addition of 750 mM NaCl
(standard concentration) did not improve the hydrogen production. The addition of 350 mM KCl at
750 mM formate (in absence of NaCl) produced the strong inhibitory effect as well. Obviously
inhibition is not strongly connected with particular ion; it is caused by ionic strength of medium. It
should be noted that all described effects were shown both for organo- and mixotrophic conditions.
When the Na+ concentration was fixed at 750 mM, the utilization of formate was a function of its
initial concentration (15-800 mM was tested). At formate content of 450-750 mM, its utilization by
T.onnurineus NA1 reached a maximal level 115.2±8.5 and 108.0±9.3 mM under organo- and
mixotrophic conditions, respectively. The availability of CO caused a minor inhibitory effect on
formate utilization. However, the H2 production in the presence of CO was higher as indicated above.
It suggested that CO was used for H2 production.
Together with H2 production and, respectively, formate utilization, changes in pH value occurred
and reached about 1.7. Further increase of H2 production by 20% (136.6 mmol H2/L broth) under
organotrophic conditions (but not mixotrophic) could be achieved by 60 mM PIPES-buffer addition.
Perhaps, mixotrophic culture could partly stabilize pH consuming CO together with formate.
НОВЫЕ РАСТВОРИТЕЛИ ДЛЯ ФЕРМЕНТНЫХ ВОДОРОДНЫХ
ЭЛЕКТРОДОВ
Абдуллатыпов А.В., Шастик Е.С.
ФГБУН Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Россия
azatik888@yandex.ru
Водородные электроды применяются в водородных топливных элементах и датчиках
водорода. На сегодняшний день в мире наблюдается большой интерес к использованию в
водородных электродах ферментов – гидрогеназ. Их основным преимуществом в сравнении с
традиционными катализаторами, такими, как платиновые металлы, никель и сульфиды
переходных металлов, является обратимость ингибирования сопутствующими газами
(примесями, содержащимися в водороде) и высокая селективность. В нашей лаборатории в
течение длительного времени изучается гидрогеназа из бактерии Thiocapsa roseopersicina. Она
отличается от большинства других гидрогеназ высокой термостабильностью (температурный
оптимум 75-80°С) и достаточно высокой устойчивостью к воздействию ингибиторов
(кислорода и угарного газа). На основе этой гидрогеназы были изготовлены электроды,
показавшие свою применимость в качестве сенсоров водорода и компонентов топливных
элементов. Данная гидрогеназа также показала свою устойчивость к органическим
растворителям; более того, такие растворители, как ацетон и ацетонитрил, даже повышали ее
активность.
В рамках предложенного исследования планируется применение в гидрогеназных
электродах новых растворителей – ионных жидкостей и их смесей с органическими
растворителями. Ионные жидкости – это соли, находящиеся при комнатной температуре в
жидком состоянии. Их преимущество состоит в том, что они обладают хорошей
проводимостью, широким температурным диапазоном жидкого состояния и низкой
растворимостью сопутствующих газов.
Задачи исследования: 1) Подбор растворителей для гидрогеназных электродов на основе
двух типов ионных жидкостей – смешивающихся и не смешивающихся с водой;
2) Оценка активности и стабильности гидрогеназы в данных растворителях;
3) Подбор оптимального метода изоляции камеры гидрогеназного электрода (анодной
камеры) от внешней среды – подбор мембран, иммобилизация в полимер.
Ожидается, что результаты исследования будут способствовать расширению
температурного диапазона применимости гидрогеназных электродов как сенсоров водорода и
компонентов топливных элементов.
4
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ВЫДЕЛЕНИЕ ИЗ РИЗОСФЕРЫ КАРТОФЕЛЯ ШТАММА
OCHROBACTRUM SP. IPA7.2 И ЕГО ХАРАКТЕРИСТИКА
Авдеева Е.С.1, Попова И.А.2, Серкебаева Ю.М.3, Евсеева Н.В.2,
Матора Л.Ю.2, Бурыгин Г.Л.2
1
ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского;
2
ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,
Саратов; 3ФГБУН Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН,
Москва, Россия
burygingl@gmail.com
Почвенные ростстимулирующие ризобактериии активно участвуют в жизненном цикле
растений, стимулируя их рост и развитие, а также повышая устойчивость растительного
организма к стрессовым факторам. В связи с этим, актуальным является поиск новых
природных бактерий-ассоциантов различных видов растений, в том числе, картофеля, как
одной из важнейших сельскохозяйственных культур. Целью данной работы были выделение и
характеристика бактерий из ризосферы картофеля.
Из ризосферной почвы картофеля сорта Невский на стадии начала формирования клубней
был изолирован штамм IPA7.2, способный расти на безазотистой синтетической среде.
Биохимическое исследование показало возможность культивирования данных бактерий на
малате, глюкозе, сахарозе, мальтозе, лактозе и маните в качестве источников углерода. Тесты
на активность каталазы и оксидазы дали положительный результат. Бактерии штамма IPA7.2
были подвижны в среде Пешкова, а при микроскопировании препаратов «раздавленной капли»
– способны к плаванию в жидких питательных средах. Электронная микроскопия показала, что
клетки IPA7.2 имеют форму слегка вытянутых изогнутых палочек с длиной клеток примерно
1,5 мкм и шириной – 0,7 мкм. Из клеток штамма IPA7.2 было выделена ДНК. Методом ПЦР
был наработан ген 16S рРНК, секвенирование которого показало 99,5% идентичность с
типовым штаммом Ochrobactrum lupine LUP21 и 99,3% с типовым штаммом Ochrobactrum cytisi
ESC1, являющихся, в свою очередь, симбионтами люпина белого (Lupinus albus L.) и ракитника
венечного (Cytisus scorparius (L.) Link). Таким образом, бактерии, выделенные из ризосферы
картофеля, по анализу последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК отнесёны нами к роду
Ochrobactrum. В дальнейшей работе планируется более точное видовое определение штамма
Ochrobactrum sp. IPA7.2.
Большой интерес представляется оценка способности выделенного штамма стимулировать
рост и развитие растений картофеля, что в случае положительного результата позволит
использовать данные бактерии в различных агробиотехнологиях выращивания ценной
сельскохозяйственной культуры.
ХРАНЕНИЕ И СТРАТИФИКАЦИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА IN VITRO
Азарова А.Б., Шестибратов К.А., Лебедев В.Г.
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Россия
biotech@microklon.ru
В России существует проблема посадочного материала плодовых и декоративных культур,
примерно 70% ввозится из стран ЕС. Большая часть ввозимого посадочного материала
производится с использованием методов клонального микроразмножния. Спрос на посадочный
материал в нашей стране неравномерный в течение года, существует потребность в хранение
продукции. При адаптации древесные культуры часто впадают в покой и не получается достичь
стандартного товарного вида.
В данной работе мы использовали низкие положительные температуры для сокращения
затрат при культивировании, для улучшения качества посадочного материала. Депонирование
культур in vitro при пониженной температуре обеспечивает возможность быстрого
восстановления любого сорта, утраченного вследствие возникновения сомаклональных
изменений или контаминации.
5
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Нами установлено, что значение имеет стадия, на которой растение переносится в холод.
Так, например, травянистые культуры (нивяник, эхинацея, примула) при депонировании на
стадии мультипликации некротизируют в течение месяца, а при переносе на стадии укоренения
сохраняют жизнеспособность в течение 3 и более месяцев. Большинство древесных культур
(сирень, рододендроны, боярышник) сохраняют жизнеспособность более года при
депонировании на любой стадии.
При адаптации древесных культур (сирень, алыча, береза), укорененных в условиях in vitro,
растения часто впадают в состояние покоя. Предварительная холодовая стратификация
позволяет частично решить данную проблему. Так, выдерживание микрорастений сирени сорта
Анна Шиач при +10°С в течение месяца позволяло увеличить долю растений с приростом с 70
до 90%.
Изучая стратификацию, адаптированных растений in vitro было показано, что
выдерживание растений в течение месяца при пониженных температурах, уже позволило
вывести их из покоя, и растения давали прирост. Было замечено, что длительность
стратификации повлияла на пробудимость боковых побегов, так на сорте алычи Злато Скифов
только 40% растений давали боковые побеги после месяца стратификации, а при
стратификации в течение 5 месяцев уже все растения были с боковыми побегами.
Жизнеспособность растений снижалась со временем стратификации. Для лимонника
стратификация это практически единственный способ стимулировать рост побегов. Не более
10% растений дают прирост без переноса в холодильные камеры.
Мы продемонстрировали возможность разнообразного применения стратификации на
стадиях микроклонального размножения, что может улучшить качество посадочного материала
и уменьшить влияние сезонности на производство растений in vitro.
БИОСИНТЕЗ ИЗОЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
МУТАНТНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ
ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA
Аллаяров Р.К., Моргунов И.Г.
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт;
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
ramil_allayarov@rambler.ru
В последние годы усилиями нескольких научных коллективов (ИБФМ РАН, ФМБА России
и ИТЭБ РАН) получены данные, что изолимонная кислота (ИЛК) обладает
гепатопротекторным, актопротекторным и антигипоксическим действием и может быть
использована в качестве основы лекарственных средств для спортивного питания. Узким
местом на пути внедрения этого простого и нетоксичного препарата является отсутствие не
только в России, но и в мире производства ИЛК, а также дороговизна препарата. С 1980 года,
компания Sigma-Aldrich производит небольшое количество монокалиевой соли ИЛК из сока
растения Sedum spectabile и продает по цене $ 704 за 1 г.
Целью настоящей работы явилась разработка способа микробиологического получения
ИЛК с помощью мутантных и рекомбинантных штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica.
Проведена серия работ по получению мутантных и рекомбинантных штаммов, способных
к сверхсинтезу ИЛК с минимальным содержанием побочных продуктов и стойко сохраняющих
это свойство. Получены мутанты, неспособные к росту на ацетате с измененной способностью
к кислотообразованию, среди которых селекционирован продуцент 704-UV4-A/NG50 с
эффективностью биосинтеза ИЛК на 40% выше, чем у природного штамма. Проведено
конструирование рекомбинантных штаммов – суперпродуцентов ИЛК путем суперэкспрессии
гена ACO1, контролирующего синтез ИЛК. На основе мутантных и рекомбинантных штаммов
разработаны способы получения ИЛК в ферментерах объемом 10 л; достигнуты высокие
концентрации ИЛК в среде (до 90 г/л). Разрабатываемые процессы не имеют аналогов в
Российской Федерации и в мире.
6
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России по государственному
контракту № 14.512.11.0045 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 – 2013 годы».
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЗАЦИИ СЕМЯН НА РЕДОКС-АКТИВНОСТЬ
ПЛАЗМАЛЕММЫ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ КЛЕТОК В ПРИСУТСТВИИ
ФИТОПАТОГЕНА
Апёнышева М.В.
ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный
университет, Томск, Россия
mari-08-90@mail.ru
Биологические препараты для подавления численности фитофагов и фитопатогенных
микроорганизмов являются экологически безопасной альтернативой химическим пестицидам,
так как разрабатываются на основе природных регуляторов численности вредителей и
возбудителей болезней растений.
Целью работы являлось изучение влияния бактеризации семян на редокс-активность
плазмалеммы фотосинтезирующих клеток кукурузы в присутствии фитопатогена.
Эксперименты проводили с использованием метода малых наземных экосистем. В качестве
продуцентов использована кукуруза. В эксперименте использованы следующие варианты
бактеризации: Pseudomonas fluorescens АР-33, Pseudomonas sp. В-6798, Ps. aureofaciens BS
1393. В качестве фитопатогена использован гриб Fusarium охysporum. Контролем служили
растения, выращенные без бактериальной инокуляции как в условиях фитопатогенной
нагрузки, так и без нее.
У растений в контрольном варианте в отсутствии фитопатогенной нагрузки наблюдается
меньшая red-ox активность мембран, чем в присутствии патогенна. Это может объясняться
усилением активности дыхательных ферментов. Известно, что интенсивность дыхания обычно
повышается в результате инфицирования растения патогенном. Это сопровождается
нарушением сопряжения окисления и фосфорилирования и возрастанием доли анаэробного
дыхания, что снижает запасание энергии в виде АТФ и увеличивает рассеивание в виде тепла.
Увеличение интенсивности дыхания, как правило, является защитной реакцией организма.
У бактеризованных Pseudomonas sp. В-6798 растений интенсивность дыхания в отсутствии
патогенна, находится на уровне дыхания контрольных растений в присутствии фитопатогенной
нагрузки. Можно предположить, что растениям как бы сообщается необходимость увеличения
активности ферментной системы бактериями. При бактеризации растений Ps. aureofaciens BS
1393 дыхательная активность фотосинтетической ткани растений также несколько выше
контрольных показателей, однако ниже, чем при бактеризации Pseudomonas sp. В-6798. В
варианте с бактериями Ps. fluorescens AP-33 наблюдается самая низкая интенсивность дыхания,
и именно в данном варианте наблюдается наибольшее ингибирование роста растений под
действием фузариума.
ВЛИЯНИЕ ПЛОТНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ НА УРОВЕНЬ
ТРАНЗИЕНТНОЙ ЭКСПРЕССИИ АНТИТЕЛ
Аникина А.В., Черных Ю.С.
ЗАО «Биокад», Санкт-Петербург, Россия
anikinaav@biocad.ru
TGE (transient gene expression) – широко используемый в современной биотехнологии
метод, позволяющий в сжатые сроки производить необходимые белки в культуре клеток
животных. Для TGE широко применяются протоколы трансфекции с использованием
поликатионных полимеров (полифекция), в частности, полиэтиленимина. Тенденцией
последнего времени стало проведение подобных трансфекций на культурах с высокой
клеточной плотностью (до 20*106кл/мл), что позволяет получать до 1 грамма антител в литре
7
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
культуры. Однако такой метод требует наработки большого количества клеточной массы, что
зачастую бывает затруднительно.
Мы проанализировали возможность проведения транзиентных наработок антител при
умеренно увеличенной клеточной плотности на момент полифекции – при 4*106кл/мл
(стандартный протокол предполагает проведение полифекции при клеточной плотности
2*106кл/мл).
В работе были использованы модифицированная EBNA-1 (Epstein-Barr virus Nuclear AG1)
клеточная линия CHO, и вектора для транзиентной экспрессии содержащие
последовательности OriP вируса Epstein-Barr. Полифекция проводилась с использованием
линейного полиэтиленимина 25кДа (LPEI). Клетки котрансфецировали 3-мя независимыми
векторами, содержащими последовательности LC и HC IgG человека, а также красного
флуоресцентного белка (RFP). Последний, использовали для оценки эффективности
трансфекции, методом проточной цитофлуорометрии спустя 18–20 часов после трансфекции.
Количество вносимого комплекса ДНК-LPEI было увеличено в 2 раза по сравнению со
стандартным протоколом. Через 24 часа после трансфекции культуру разводили в 2 раза свежей
питательной средой, т.о. восстанавливали исходные объем культуры и концентрацию клеток.
Клетки культивировали в бессывороточной среде, в колбах на орбитальном шейкере, при 5%
СО2. Титр антител определяли на приборе ForteBioOctetRed согласно рекомендациям
производителя.
Анализ эффективности трансфекции показал, что при проведении полифекции при
клеточной плотности 4*106 кл/мл доля RFP-позитивных клеток сопоставима с уровнем,
получаемым при проведении процедуры по стандартному протоколу (50–56% против 55–70%).
В тоже время существенно возрастала продукция антител. Увеличение продуктивности
составляло в среднем 2,1 раза (1,6–2,6 раз, в зависимости от конкретного антитела).
Т.о., при транзиентной наработке белков, концентрация клеток при трансфекции является
параметром, способным значительно влиять на продуктивность культуры. В частности,
удвоение концентрации клеток СНО (до 4*106кл/мл) при полифекции приводило к возрастанию
продукции антител в 2,1 раза, при прочих равных условиях.
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ В ГИБРИДНУЮ КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКУЮ
ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МАТРИЦУ УКСУСНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ GLUCONOBACTER
OXYDANS КАК ОСНОВА БИОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПИРТОВ
Афонина Е.Л., Каманина О.А., Рогова Т.В.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия
Still_elive@mail.ru
Иммобилизованные живые клетки микроорганизмов широко используются в различных
биотехнологических процессах, в аналитических приборах при формировании биорецепторных
элементов биосенсоров. В последнее десятилетие стремительно развивается метод
иммобилизации биоматериалов, прежде всего ферментов, в кремнийорганические золь-гель
матрицы. Благодаря своим свойствам эти матрицы могут применяться для иммобилизации
целых клеток при создании гетерогенных биокатализаторов.
Целью работы являлось создание стабильных гетерогенных биокатализаторов путем
инкапсулирования уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans ВКМ В-1280 в золь-гель
матрицы на основе тетраэтоксисилана (ТЭОС), метилтриэтоксисилана (МТЭС) и
полиэтиленгликоля. В работе исследовали влияние концентрации гидрофобной добавки МТЭС
на свойства гетерогенных биокатализаторов, которые определяются структурой и свойствами
золь-гель
матрицы,
и
физиолого-биохимическое
поведением
иммобилизованных
микроорганизмов. Для исследования свойств иммобилизованного биоматериала использована
биосенсорная установка амперометрического типа, интегрированная с персональным
компьютером. В качестве аналитического сигнала, характеризующего иммобилизованный
биокатализатор, использовали дыхательную активность уксуснокислых бактерий в
присутствии этилового спирта. Сравнительный анализ характеристик биосенсоров на основе
созданных гетерогенных биокатализаторов с разным содержанием гидрофобной добавки
показал, что увеличение доли МТЭС в составе матрицы до 50% повышает окислительную
8
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
способность бактерий, что влечет за собой увеличение коэффициента чувствительности(118±3
нА*дм3/мин*моль) и уменьшение предела обнаружения(0,003 мкмоль/дм3). Долговременная
стабильность составила от 6 до 9 суток, а относительное стандартное отклонение – 0,5%.
Работа выполнена в рамках Государственного Задания Минобрнауки РФ и гранта
Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских
ученых – кандидатов наук, заявка № МК-330.2014.4.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СОРТОВ
ALOPECURUS PRATENSIS L. (POACEAE)
Ахмедов Р.Б., Нам И.Я., Заякин В.В.
ФГБОУ ВПО Брянский государственный университет им. академика И.Г.Петровского,
Брянск, Россия
roma.akhmedov.91@mail.ru
Молекулярно-генетический анализ с использованием метода ISSR-PCR – один из наиболее
современных и информативных подходов для определения молекулярно-генетического
разнообразия и паспортизации сортов культурных растений. Основа данного метода состоит в
сравнении полиморфизма длин фрагментов ДНК, находящихся между микросателлитными
повторами. Alopecurus pratensis является высокопитательным кормовым злаком с высокой
скороспелостью, что определяет его ценность для животноводства и интерес для селекционной
работы.
Исследования проводились на образцах ДНК, полученных из отдельных зерновок 4 сортов
лисохвоста лугового: Донской 2, Обский, 1/5, 3/3. ДНК выделяли с использованием
лизирующего СТАВ-буфера, денатурирующей смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24/1) и
осаждающего агента – этанола (96%). Концентрацию ДНК определяли методом спектроскопии
в УФ-области.
После выделения ДНК проводили экспериментальный подбор ISSR-праймеров из раннее
выбранных путем анализа литературных данных: IS1, IS2, IS3, IS4, IS5, IS6, UBC810, U840,
HB12, B4. Для экспериментального подбора ISSR-праймеров проводили ПЦР по следующей
температурной схеме:
1. первичная денатурация – 94°С – 4 мин.;
2. денатурация – 94°С – 35 сек. – 37 циклов;
3. отжиг – 30 сек. – 37 циклов, (оптимальную температуру отжига для каждого праймера
определяли экспериментально);
4. элонгация – 72°С – 2 мин. – 37 циклов;
5. финальный синтез – 72°С – 4 мин.
После амплификации проводили электрофоретическое разделение продуктов реакции в 2%
агарозном геле в ТВЕ-буфере.
В ходе исследования были выбраны 4 ISSR-праймера (IS3, IS6, UBC810, B4) для
проведения молекулярно-генетического анализа. В дальнейшем данные праймеры будут
использованы для установления уровня генетического полиморфизма и паспортизации сортов
лисохвоста.
БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИСКУССТВЕННЫХ МАТРИЦ ДЛЯ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГЕПАТОЦИТОВ
Белините М.А., Ахмадеева Л.А., Фаттахова А.Н.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
labasritas@yandex.ru
Цель работы - установить эффективность культивирования гепатоцитов на матрицах из
модифицированного ионно-лучевым методом стекла.
Материалы и методы. Проводили выделение гепатоцитов мыши по известной методике.
Культивировали клетки на модифицированном стекле в течение 5 дней с разным временем
обработки. Анализировали рост клеток с помощью светового инвертированного микроскопа
9
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
при увеличении 20 и 40. Разрушали гепатоциты ультразвуком для дальнейшего изучения
белков методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Анализ концентрации
белков проводили с помощью прибора NanoDrop 2000.
Результаты. После 5 дней культивирования обнаружили, что количество клеток, выросших
на модифицированном стекле значительно выше, чем на контрольном стекле. Кроме того, на 3
сутки клетки начинают образовывать агрегаты. Следует отметить, что гепатоциты на
модифицированном стекле имели нормальную для этого типа клеток конфигурацию. Матрица
на основе модифицированного стекла экологически безопасна, не требует дорогих методов
стерилизации. Установили, что на стеклах, обработанных в течение 30 минут, клетки растут
значительно лучше, чем на стеклах, обработанных 5, 10 и 20 минут. Обнаружили, что белки с
молекулярной массой 40 кДа содержатся в большей концентрации в гепатоцитах,
культивированных на стеклах с периодом обработки 30 минут.
Заключение. Проведенное исследование позволило сделать вывод об эффективности
культивирования гепатоцитов на стекле, модифицированном ионно-лучевым методом.
Полученные результаты представляют большой интерес для разработки новых технологичных
и недорогих субстратов для культивирования клеточных культур для целей медицины и
биотехнологии.
ИЗУЧЕНИЕ АДАПТОГЕННЫХ СВОЙСТВ РАСТЕНИЙ, ПРОДУЦЕНТОВ
ЭКДИСТЕРОИДОВ, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОБНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ
Безматерных К.В.1, Володин В.В.2, Володина С.О.2, Смирнова Г.В.1,
Октябрьский О.Н.1
1
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь;
2
ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, Россия
hydrargyrum@iegm.ru
Одним из классов биологически активных веществ растительного происхождения являются
фитоэкдистероиды, которые способны оказывать положительное влияние на обменные
процессы в организме животных и человека, повышая устойчивость к различным стрессовым
воздействиям. На основе экстрактов растений, богатых экдистероидами, созданы препараты,
обладающие адаптогенными свойствами. К ним относится экдистероидсодержащая субстанция
Серпистен, разработанная коллективом лаборатории биохимии и биотехнологии ИБ Коми НЦ
УрО РАН. Серпистен представляет собой смесь 20-гидроксиэкдизона (20Е) и инокостерона
(In). В комплексе исследований воздействия экдистероидов на организм человека
представляется необходимым изучение влияния этих соединений на микробиоту человека,
имеющую важное значение для физиологии и иммунитета организма.
Адаптогенный эффект экстрактов серпухи венценосной и пажитника сенного, а также
Серпистена и 20Е на бактерии Escherichia coli изучали при действии антибиотиков разных
классов, определяя скорость наступления лизиса, способность к образованию колоний и МИК
антибиотика. Показано, что присутствие экстрактов серпухи и пажитника в среде
культивирования повышало МИК для антибиотиков стрептомицина, канамицина и
цефотаксима, но не оказывало значительного влияния на МИК для ципрофлоксацина.
Серпистен и 20Е не изменяли МИК для всех антибиотиков. В тесте на способность к
образованию колоний экстракты серпухи и пажитника не влияли на действие
ципрофлоксацина, а Серпистен и 20Е производили слабый протекторный эффект.
Устойчивость бактерий к цефотаксиму не изменялась в результате добавления Серпистена и
20Е, экстракт пажитника повышал количество колонии образующих единиц (КОЕ) в 32 раза
при дозе цефотаксима 5 мкг/мл и в 7,7 раз при дозе антибиотика 10 мкг/мл. При воздействии
канамицина экстракт серпухи увеличивал КОЕ в 1,5 раза. В наибольшей степени
модифицирующее влияние исследуемых субстанций на КОЕ проявлялось при действии
стрептомицина. Серпистен и 20Е полностью предотвращали гибель клеток после добавления
этого антибиотика. При высокой дозе стрептомицина все исследуемые субстанции значительно
(до 100 раз) снижали гибель бактерий.
Таким образом, наибольший протекторный эффект от действия различных антибиотиков в
микробных тестах демонстрировали экстракты серпухи и пажитника. Серпистен и 20Е
10
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
оказывали выраженное защитное действие только в случае стрептомицина и слабое – в случае
ципрофлоксацина.
Исследования поддержаны грантами № 12-И-4-2072, № 14-04-96031, № 14-4-НП-126.
ВЛИЯНИЕ ТРЕХМЕРНЫХ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА
ОРГАНИЗАЦИЮ СОКРАТИТЕЛЬНОГО АППАРАТА КАРДИОМИОЦИТОВ
Бильдюг Н.Б., Юдинцева Н.М.
ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
relapse@yandex.ru
Работа посвящена изучению организации сократительного аппарата кардиомиоцитов
(КМЦ) при их культивировании в трехмерных условиях. Известно, что при переводе КМЦ в
монослойную культуру происходит обратимое преобразование типичных миофибрилл в
структуры немышечного типа. Причины таких перестроек неизвестны. Ранее нами было
показано, что при культивировании КМЦ на отдельных белках внеклеточного матрикса (ВКМ),
а также на матриксе, синтезированном другими КМЦ, происходит сокращение периода
нахождения их сократительного аппарата в перестроенном состоянии. Однако непрерывного
поддержания миофибриллярной организации не наблюдается. Мы предположили, что для
сохранения сократительного аппарата КМЦ в исходном состоянии в процессе их
культивирования помимо наличия внеклеточного матрикса может быть существенна его
трехмерная организация.
Работу проводили на кардиомиоцитах, полученных из желудочков сердец новорожденных
крыс. Кардиомиоциты культивировали в течение 3 недель в трехмерных гелях на основе
коллагена I типа, который является основным компонентом ВКМ нормального сердца. С
помощью метода непрямой иммунофлуоресценции мы показали, что на всех сроках
культивирования КМЦ в гелях сохраняется миофибриллярная организация их сократительного
аппарата. Полученные данные соответствует нашим предположениям о том, что трехмерные
условия являются более подходящими для поддержания естественного состояния
кардиомиоцитов в культуре. Однако, несмотря на сохранение типичной организации
сократительного аппарата и жизнеспособность КМЦ в гелях, мы не наблюдали спонтанных
сокращений в культуре. Мы предполагаем, что важным фактором может являться конечная
концентрация коллагеновых гелей, а также отсутствие в гелях механического натяжения. Эти
предположения планируется проверить в ходе дальнейшей работы.
СОЗДАНИЕ ГИБРИДНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ VP6 И
VP8 РОТАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА ГРУППЫ А И ИЗУЧЕНИЕ ИХ
АНТИГЕННОСТИ
Богомолова Е.Г., Федорова Е.А.
ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых
биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия
bogomolovaele@inbox.ru
По данным ВОЗ практически каждый ребенок в течение первых 5 лет жизни переносит
ротавирусный гастроэнтерит, являющийся причиной около 450000 смертей детей ежегодно,
особенно в развивающихся странах. В России заболеваемость ротавирусной инфекцией
постоянно растет, что объясняется увеличением числа случаев инфицирования и
совершенствованием способов диагностики. Существующие вакцины для профилактики
заболевания основаны на живых аттенуированных штаммах ротавируса человеческого и/или
животного происхождения, размножающихся в кишечнике человека. Использование вакцин на
основе рекомбинантных белков позволяет избежать рисков, связанных с введением вируса в
организм, пусть и аттенуированного.
Целью данной работы было создание 2 белков – Rota и RotaFliC и определение их
антигенности. RotaFliC включает участки белков VP6 и VP8 ротавируса А и компоненты
флагеллина Salmonella в качестве адъюванта, соединенные гибкими мостиками. Белок Rota
11
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
содержит перечисленные элементы, кроме компонентов флагеллина. Представленные
фрагменты являются консервативными частями белков VP6, VP8, к которым в процессе
естественной инфекции образуются специфические антитела, перекрестно реагирующие с
гомологичными эпитопами различных штаммов ротавирусов А, B и C. Использование
эпитопов нескольких белков позволяет увеличить эффективность вакцины, а использование
гибких мостиков – сохранить правильную пространственную укладку белка, обеспечивающую
полноценное функционирование каждого эпитопа.
Аминокислотные последовательности смоделированных белков были переведены в
нуклеотидные и оптимизированы для экспрессии в клетках E.coli. Синтез генов rota и rota-flic
осуществляли методом ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов,
синтезированных химическим методом с помощью синтезатора ДНК ASM-800. Полученные
гены клонировали в экспрессирующий вектор pET-28a(+). Созданы штаммы на основе клеток
E.coli DH10B/R для амплификации векторов pET-28a(+)-rota и pET-28a(+)-rota-flic. Для
экспрессии гибридных рекомбинантных белков создали штаммы-продуценты на основе E.coli
BL21 (DE3). Подобран оптимальный протокол индукции экспрессии гибридных генов с
использованием 0,2% лактозы (по Штудиеру). С помощью металлоаффинной хроматографии
получены очищенные препараты белков Rota и Rota-FliC. В настоящий момент изучаются их
антигенные свойства путем иммунизации самок мышей линии BALB/с и последующей оценки
титра антител на вводимые белки. Планируется провести исследование протективности
полученных белков.
ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МАГНИТОТАКТИЧЕСКОЙ БАКТЕРИИ
MAGNETOSPIRILLUM SO1
Бурганская Е.И., Дзюба М.В.
ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, Россия
kateburganskaya@gmail.com
Магнетосомы
–
внутриклеточные
магнитные
структуры,
синтезируемые
магнитотактическими бактериями (МТБ) и представляющие собой наноразмерные кристаллы
магнетита (Fe3O4) или грейгита (Fe3S4), покрытые липопротеиновой мембраной. Наличие
однодоменного магнитного кристалла, малый разброс размеров и форм, низкая токсичность и
наличие биосовместимой поверхности – мембраны магнетосом – обуславливают высокий
биотехнологический потенциал этих бактериальных магнитных наночастиц (БМЧ). Во
множестве исследований показана перспективность применения магнетосом в медицине: в
качестве носителей для направленной доставки лекарств; контрастирующих агентов в МРТ; для
терапии опухолей методом гипертермии и т.д. Основной проблемой применения магнетосом на
практике является низкая и нестабильная продуктивность большинства штаммов и
недостаточная разработанность методов культивирования МТБ.
Целью настоящего исследования являлся подбор оптимальной среды для роста штамма
Magnetospirillum SO1 и синтеза магнетосом. Ранее нами было показано, что данный штамм
является стабильным продуцентом БМЧ. Схему эксперимента по оптимизации протокола
выращивания проводили с использованием метода анализа поверхности отклика. Было
выявлено, что наибольшее влияние на рост оказывали следующие компоненты среды: источник
углерода (карбоновые кислоты), питательные добавки (пептоны, гидролизаты, экстракты),
источник азота (аммоний/нитраты). Наиболее значимым параметром для синтеза магнетосом
являлась концентрация железа. Предложенная моделью оптимизированная среда содержала:
0.80 г/л натрия янтарнокислого, 1.00 г/л кукурузного экстракта, 0.10 г/л дрожжевого экстракта,
0.35 г/л нитрата натрия, 100 мкМ Fe3+. Далее был проведен эксперимент, в ходе которого
сравнивали выход биомассы и магнетосом при культивировании SO1: (1) на оптимизированной
среде, (2) на контрольной среде (FSM), использующейся для выращивания Magnetospirillum
gryphiswaldense (3.00 г/л лактата калия, 3.00 г/л соевого пептона, 0.35 г/л нитрата натрия, 100
мкМ Fe3+), (3) на использовавшейся нами ранее среде для SO1 (0.50 г/л натрий янтарнокислого,
0.10 г/л дрожжевого экстракта, 0.35 г/л нитрата натрия, 100 мкМ Fe3+). Оптические плотности
12
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
(OD565) культуры на 3 день выращивания составили: 0.2; 0.17; 0.1; а выход магнетосом – 4.8
мг, 1.2 мг и 2.0 мг с литра культуры для сред (1), (2) и (3), соответственно.
Таким образом, предложена оптимальная среда для культивирования штамма
Magnetospirillum SO1, обеспечивающая наибольший выход БМЧ.
ВЛИЯНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО СОСТАВА СРЕДЫ И ТИПА УГЛЕВОДА НА
ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕРСИКА
Вагапова Т.И.1,2, Сидорова Т.Н.2, Долгов С.В.1,2
1
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт; 2Филиал
ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Россия
tatya38@yandex.ru
Персик (Prunus persica) – одна из самых ценных плодовых культур. В мировом
плодоводстве персик занимает второе после яблони место по объему производимой продукции.
Однако в настоящее время существует большая угроза для культивирования косточковых
плодовых культур, обусловленная наиболее опасным среди вирусных заболеваний – вирусом
оспы сливы (Plum Pox Virus, PPV). PPV поражает все части растения, вызывает
преждевременное опадение плодов. Ввиду практического отсутствия природных доноров
устойчивости использование современных методов генной инженерии дает возможность
значительно ускорить процессы создания устойчивых высокопродуктивных сортов персика. Но
несмотря на это получение трансгенных сортов косточковых культур тормозится отсутствием
надежных методик, способных обеспечить высокую частоту регенерации побегов из
соматических тканей коммерческих сортов.
Одним из моментов, определяющих успех регенерации, является подбор минерального
состава питательной среды. Индукцию каллусообразования осуществляли на питательной
среде MS с добавлением 6-БАП и ИМК. Образовавшийся каллус помещали на среду
регенерации. В наших экспериментах оценивали эффективность регенерации побегов из
морфогенного каллуса подвоя «Bailey» на 5 средах: DKW, MS, N&N, QL, WPM. В результате
исследований выявлено существенное преимущество среды MS при адвентивном органогенезе
из морфогенного каллуса, частота регенерации составила 31,6%. Самая низкая частота
регенерации наблюдалась на среде QL – 11,1%.
Подобрав оптимальный минеральный состав, мы перешли к изучению влияния вида и
концентрации углевода на частоту регенерации из морфогенного каллуса. В экспериментах
использовали сахарозу, глюкозу, мальтозу в концентрациях 10, 20, 30, 40, 50, 60 г/л. Наиболее
интенсивно закладка меристематических очагов происходила на среде с сахарозой (30 г/л), где
эффективность регенерации составила 30,0%. На мальтозе частота регенерации была
минимальной из всех исследованных вариантов 2,8 – 7,9%.
В настоящее время продолжаются эксперименты по оптимизации гормонального состава
питательной среды. Начаты исследования по агробактериальной и биобаллистической
трансформации подвоя «Bailey» с применением выше описанной методики регенерации.
ARABIDOPSIS THALIANA С ИНТЕГРИРОВАННЫМ ГЕНОМ ФИТАЗЫ
BACILLUS GINSENGIHUMI
Валеева Л.Р., Нямсурэн Ч.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
lia2107@yandex.ru
Фосфор – один из важнейших элементов в составе вирусов, клеток про- и эукариот. В
почве фосфор в основном представлен нерастворимыми органическими соединениями –
фитатами, тогда как содержание легкодоступных неорганических фосфатов неуклонно
понижается. Многие почвенные микроорганизмы переводят органические фосфорные
соединения в неорганические, секретируя внеклеточные фосфатазы. Растения не способны
расщеплять органические соединения фосфора почв, что обусловливает проблему фосфорного
13
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
голодания, требующую поиска новых путей ее решения. Перспективным является
использование ферментов микробного происхождения – фитаз, гидролизующих фитат с
высвобождением неорганического фосфата и делающих фосфор доступным для растений.
Цель данной работы – получение модельных трансгенных растений Arabidopsis thaliana с
интегрированным геном бактериальной фитазы phyCg Bacillus ginsengihumi. Трансформацию
растений A. thaliana проводили с помощью бактерий Agrobacterium tumefaciens GV3101. В
качестве вектора использовали плазмиду pCBK05 с химерной последовательностью
ex::phyCg::His-tag, состоящей из сигнальной последовательности гена экстенсина AtExt3, гена
фитазы phyCg и His-tag последовательности, находящихся в одной рамке считывания под
контролем специфичного для корней A. thaliana индуцибельного промотора Pht1;2. Индукция
промотора происходит в условиях дефицита фосфора. Также вектор содержал ген устойчивости
к селективному гербициду BASTA. Трансформацию проводили маканием цветов в
агробактериальную суспензию. Полученные от трансформированных растений семена
высевали на полноценную питательную среду MS с добавлением BASTA и проводили
селекцию проростков. В результате анализа трех поколений трансгенных растений были
отобраны линии, гомозиготные по трансгенной вставке. Наличие трансгенной вставки в геноме
растений было подтверждено с помощью ПЦР. Для экспрессии гена фитазы трансгенные
растения выращивали на минеральной среде без добавления источника фосфора. Из общей
РНК клеток корней трансгенных растений методом обратной транскрипции получали кДНК.
Экспрессия модифицированного гена фитазы с последовательностью гена экстенисна на
транскрипционном уровне была также подтверждена секвенированием продуктов
амплификации кДНК гена фитазы.
Дальнейшее исследование трансгенных растений и активности модифицированной
микробной фитазы, синтезируемой данными растениями, позволит выяснить влияние
трансгенной вставки и фермента на морфологию и физиологию растительного организма.
СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ
ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ И ПРОТИВОРАКОВОГО БЕЛКА
ЛАКТАПТИНА
Васькова А.А., Кулигина Е.В., Рихтер В.А.
ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Новосибирск, Россия
ann.vaskova@gmail.com
Одной из причин развития злокачественных опухолей является нарушение регуляции
апоптоза, поэтому индукторы апоптоза раковых клеток рассматриваются в качестве возможных
противоопухолевых препаратов. Одним из таких индукторов является пептид лактаптин,
выделенный из молока человека. На основе лактаптина был сконструирован рекомбинантный
аналог (RL2), который вызывает апоптотическую гибель ряда линий опухолевых клеток
человека в культуре, а также подавляет рост перевиваемых опухолей мышей и человека и
развитие метастазов. В настоящее время лекарственное средство на основе RL2 – «Лактаптин»
прошло доклинические испытания.
Цель работы – повышение эффективности противоопухолевого действия Лактаптина путем
разработки адресной доставки препарата в опухоль. Адресная доставка позволит увеличить
специфичность действия Лактаптина и уменьшить терапевтическую дозу (за счет увеличения
локальной концентрации препарата в опухоли), необходимую для достижения
противоопухолевого ответа.
В качестве молекулярных адресных агентов выбраны опухолеспецифические пептиды,
которые благодаря небольшому размеру имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционно
используемыми антителами: высокие коэффициенты проникновения в опухоль и низкую
иммуногенность.
С помощью пептидной фаговой библиотеки в системе in vitro на культурах раковых клеток
мыши (гепатоаденокарциномы-1 (ГA-1) и аденокарциномы легких (АЛ)) и в системе in vivo на
мышиной модели перевиваемой опухоли ГА-1 (линия мышей A/Sn) были отобраны
опухолеспецифические пептиды, экспонированные в составе поверхностного белка pIII
14
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
нитчатого бактериофага M13. Определены последовательности отобранных экспонированных
пептидов. Среди отобранных клонов были выявлены два одинаковых (GLHTSATNLYLH и
SGVYKVAYDWQH), которые встретились как в экспериментах in vitro, так и in vivo, причем в
обоих случаях частота их встречаемости была наибольшей. Изучена возможность связывания
двух отобранных фаговых клонов с другими опухолями в системе in vivo. Показано
достоверное связывание обоих клонов с аденокарциномой легких (A/Sn), меланомой В16 (C57
Black), опухолью Кребса (C57 Black) и аденокарциномой легких Льюиса (CBA).
На основе отобранных опухолеспецифических пептидов и рекомбинантного аналога
лактаптина RL2 были сконструированы две рекомбинантные плазмиды pet15B для продукции
фьюжен-белков. Разработаны способы выделения и очистки фьюжен-белков.
Проверка цитотоксичности полученных фьюжен-белков показала, что они обладают
дозозависимых эффектом снижения жизнеспособности раковых клеток молочной железы
человека MCF-7 и MDA-MB-237.
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ КЛОНОВ РАСТЕНИЙ ОСИНЫ С
РЕКОМБИНАНТНЫМ ГЕНОМ SP-XEG
Видягина Е.О., Ковалицкая Ю.А., Шестибратов К.А.
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН; ФГБОУ ВПО Пущинский государственный
естественно-научный институт, Пущино, Россия
vidjagina@mail.ru
Ксилоглюканаза – один из ферментов, который, гидролизуя ксилоглюканы, способствует
растяжению клеточной стенки, влияя тем самым на ростовые и биохимические показатели
растения. Получено 25 линий трансгенных растений осины с конститутивной экспрессией
рекомбинантной ксилоглюканазы sp-Xeg из гриба Penicillium canescens.
Проведен анализ биометрических (высота растений, количество междоузлий,
эффективность укоренения, масса корневой системы, параметры листовой пластинки) и
биохимических показателей (содержание пентозанов, целлюлозы и лигнинов). На основе
результатов биометрии наиболее быстрорастущими генотипами являлись PtXIVXeg1a,
PtXVXeg1a и PtXVXeg1b. Максимальное отличие отмечено у растений клона PtXVXeg1b – на
первом году вегетирования они были выше на 26%, во втором году на 44%. У клонов
PtXIVXeg1a и PtXVXeg1a показано увеличение высоты на 25% у растений первого года. У
выделенных клонов также показано увеличение эффективности ризогенеза. Максимальное
значение эффективности укоренения в условиях in vitro зафиксировано у клона PtXVXeg1a – в
2,5 раза выше контроля. Масса корневой системы у растений клона PtXVXeg1a в условиях
защищенного грунта также была в 2 раза выше. Другие выделенные клоны по эффективности
укоренения и увеличению биомассы корневой системы также превышали контрольные
показатели.
Поскольку ксилоглюканаза гидролизует ксилоглюканы, воздействуя тем самым на
гемицеллюлозу, нами проведен анализ содержания пентозанов (основного компонента
гемицеллюлозы) в трансгенных линиях. Во всех линиях трансгенных растений отмечено
ожидаемое снижение удельного содержания пентозанов в древесине.
Наиболее важным показателем ценности древесины является содержание целлюлозы.
Наибольшее значение этого показателя у клона PtXIVXeg1c–426 мг/г, тогда как у контроля оно
составило 348 мг/г. У клонов PtXVXeg1b, PtXIVXeg1a и PtXVXeg1a, выбранных как наиболее
быстрорастущие, содержание целлюлозы было 360 мг/г, 341,2 мг/г и 382 мг/г
соответственно.Клон PtXIVXeg1c по биометрическим показателям также превышал
контрольные значения.
Полученные биохимические данные послужили основанием для предположения об
изменении толщины клеточной стенки в трансгенных растениях. Электронная микроскопия
показала увеличение толщины клеточной стенки выделенных клонов. Толщина ксилемы
первого года у трансгенных растений в среднем равнялась 1,69 мкм, тогда как у контрольных
растений 1,28 мкм. На основании проведенных анализов нами выделено четыре наиболее
перспективных клона: PtXIVXeg1a, PtXVXeg1a, PtXVXeg1b и PtXIVXeg1c.
15
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ СПОСОБОМ И
ИЗУЧЕНИЕ ЕЕ СВОЙСТВ
Виноградова В.Р., Болотова К.С., Чухчин Д.Г.
ФГАОУ ВПО Северный (Арктический) федеральный университет имени
М.В.Ломоносова, Архангельск, Россия
wngrdw@rambler.ru
В природе целлюлоза является самым распространенным углеводным полимером, причем
ее синтезируют не только растения, но и некоторые животные и бактерии. Бактериальная
целлюлоза является новым наноматериалом для изучения, который уже нашел применение в
медицине, производстве косметики и пищевой промышленности. Ее получают в виде гельпленки, синтезируемой бактериями вида Acetobacter xylinum.
В исследовании использовали бактериальную целлюлозу, полученную в среде на основе
глюкозы. Микроскопирование пленки, образовавшейся в пятисуточной культуре клеток,
проведенное на электронном растровом микроскопе Zeiss SIGMA VP, показало наличие
однородных нанофибрилл целлюлозы диаметром 50 нм, уложенных в беспорядочную матрицу,
включающую клетки микроорганизмов. Полученную пленку высушивали и анализировали.
Изучение летучей фракции бактериальной целлюлозы методом газовой хроматографии
показало преобладание в ее составе пропановой, миристиновой, пальмитиновой,
пентадекановой кислот и ряда других органических кислот и кетонов. Анализ целлюлозной
пленки на наличие в ее составе белковой фракции проводили методом Кьельдаля. Установлено,
что среднее содержание белка, вносимого в состав пленки клетками микроорганизмов и
ферментами, составило 6,2%.
Анализ сорбционной способности пленки бактериальной целлюлозы показал, что удельная
площадь поверхности, измеренная по показателю поглощения метиленового синего, составляет
208-261 м2/г, что практически соответствует этому показателю для микрокристаллической
целлюлозы.
Для
изучения
кристаллической
структуры
применяли
рентгенографию.
Экспериментальные данные получали на рентгеновском дифрактометре XRD-7000 на базе
Центра коллективного пользования научным оборудованием «Арктика». Показано, что
результаты, полученные для бактериальной целлюлозы, практически аналогичны показателям
сульфатной беленой хвойной целлюлозы, т.е. кристаллическая структура бактериальной
целлюлозы соответствует природной модификации целлюлоза I.
Работа выполнена при поддержке Программы развития САФУ им. М.В.Ломоносова.
МЕМБРАННАЯ ФРАКЦИЯ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS КАК
БИОКАТАЛИЗАТОР В МЕДИАТОРНОМ БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ
Возчикова С.В., Минайчева П.Р., Алферов С.В.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия
vosofya@gmail.com
Биотопливный элемент (БТЭ) – это биотехнологическое устройство, преобразующее
энергию химических связей органических веществ в электричество посредством ферментов
или целых клеток микроорганизмов. Энергетические параметры ферментных БТЭ значительно
выше, по сравнение с микробными. Использование мембранной фракции в роли
биокатализатора служит альтернативой применению ферментов. Во-первых, это экономически
более выгодно, т.к. процесс получения мембранной фракции является промежуточным этапом
выделения индивидуальных ферментов, и, поэтому менее затратен. Во-вторых, для БТЭ
является приоритетным использование широкого спектра субстратов, что можно достичь
применением мембранной фракции, содержащей различные мембранлокализованные
дегидрогеназы.
Целью данной работы являлось изучение работы макета БТЭ на основе мембранной
фракции бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius.
Ферментные препараты, содержащие мембранлокализованные дегидрогеназы бактерий G.
oxydans, получали из разрушенной ультразвуком биомассы бактерий путем последовательного
центрифугирования. Известно, что для бактерий рода Gluconobacter типичными субстратами
16
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
являются углеводы и спирты, окисляющиеся мембранолокализованными дегидрогеназами. При
сравнении полученных данных с ранее изученной субстратной специфичностью для целых
клеток бактерий G. oxydans в условиях работы медиаторного биотопливного элемента
установлено, что при использовании мембранной фракции значения напряжения при окислении
большинства субстратов заметно превосходят аналогичные значения для суспензии клеток.
Пик мощности, генерируемой БТЭ при использовании в качестве субстрата биоокисления
глюкозы, наблюдается при приложенном внешнем сопротивлении 100 кОм: Рmax=160±10 нВт.
Расчетное значение мощности отнесенное к геометрической поверхности анода составляет 0,50
мкВт/м2. Далее провели сравнительную оценку мощностных характеристик для макетов БТЭ на
основе различных биокатализаторов. Установили, что применение биокатализатора на основе
мембранной фракции позволяет практически в 2 раза увеличить генерируемый потенциал по
сравнению с суспензией клеток, при этом в 2,5 раза снизить значение внутреннего
сопротивления элемента, а удельную мощность увеличить в 3 раза. Таким образом,
использование мембранной фракции бактерий G.oxydans в качестве биокатализатора в макете
биотопливного элемента является более приоритетным по сравнению с целыми клетками
бактерий G.oxydans.
Работа выполнена в рамках гранта РФФИ соглашение № 13-03-97514/13.
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЛИСТОВЫХ ЭКСПЛАНТОВ ГИАЦИНТА И ЛИЛИИ
ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ IN VITRO
Грошева Е.В.
ФГБОУ ВПО Мичуринский государственный аграрный университет,
Мичуринск, Россия
ekaterina2687@mail.ru
Вопросы клонального микроразмножения Hyachintus L. и Lilium L. с использованием в
качестве первичных эксплантов органов, обладающих высоким морфогенетическим
потенциалом, и при их изоляции, не наносящих существенный вред растениям-донорам,
являются актуальными в современной биотехнологии. Цель настоящего исследования
заключалась в подборе эффективных стерилизующих агентов для получения жизнеспособных
листовых эксплантов гиацинта и лилии при введении в культуру in vitro. Объектами
исследования явились: 1) сорт гиацинта Fondante (Single Hyacinthus), 2) сорта лилии: Rozovaja
Dymka (Asiatic hybrids), Royal Sanset (Longiflorum x Asiatic hybrids). Культивирование
эксплантов осуществляли на питательной среде с минеральной основой и комплексом
витаминов по прописи Мурасиге и Скуга. Стерилизацию листового материала проводили 50%ным раствором «Асе» (действующее вещество гипохлорит натрия) и 0,1%-ным раствором
сулемы (HgCl2) при разных экспозициях (1; 1,5; 3; 5 мин.).
В результате исследований установлено, что высокий стерилизующий эффект (от 65 до
87%) наблюдался при обработки листового материала 0,1%-ным раствором сулемы при
экспозициях 1 и 1,5 мин. При дальнейшем культивировании на листовых эксплантах гиацинта
и лилии наблюдалась пролиферация каллуса и образование адвентивных почек. Количество
инфицированных и нежизнеспособных эксплантов не превышало 15%.
При использовании в качестве стерилизующего агента 50%-ного раствора «Асе» при
экспозициях 1 и 1,5 мин. доля жизнеспособных, но при этом инфицированных эксплантов,
была очень высока и составила 56,6% у гиацинта и 58,5% у лилии.
Обработка листового материала 50%-ным раствором «Асе» и 0,1%-ным раствором сулемы
при экспозициях 3 и 5 мин. обеспечивала очень высокую стерильность (от 93 до 100%). Однако
выход жизнеспособных эксплантов был низким, и составил у гиацинта 3,3% (при стерилизации
0,1% раствором сулемы) и 6,6% (при стерилизации 50% раствором «Асе»), у лилии – не
превышал 5% (не зависимо от стерилизующего агента). Отмечены единичные случаи, когда
0,1%-ный раствор сулемы при экспозиции более 3 мин. оказывал ингибирующее действие на
листовые экспланты, вызывая сильные некрозы и гибель эксплантов.
Таким образом, оптимальным стерилизующим агентом при введении в культуру in vitro
листовых пластин гиацинта и лилии, обеспечивающим получение стерильных и
жизнеспособных эксплантов, является 0,1% раствор сулемы при экспозициях от 1 до 1,5 мин.
17
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КЛОНОВ
POPULUS TREMULA L. ПРИ СОЗДАНИИ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ
ЛЕСОВОССТАНОВЛЕНИЯ
Дзагоева Ю.К.
ФГБОУ ВПО Костромской государственный университет им. Н.А.Некрасова,
Кострома, Россия
musika593@mail.ru
Большое значение при создании плантаций осины, имеет качество посадочного материала.
Её использование ограничивается поражением грибом Phellinus tremulae Bond. et Boris,
который вызывает разрушение древесины. Решение данной проблемы возможно при
выращивании осины с триплоидным набором хромосом (2n=38, 3n=57). Проблема при
размножении триплоидной осины в невозможности получения от неё семян. Поэтому возможно
только вегетативное размножение, что обеспечит сохранение хозяйственно ценных свойств.
Вегетативное воспроизведение лучших генотипов методом культуры ткани даёт возможность
значительно повысить интенсивность лесовосстановления.Исследования проводились в 20102013 годах на базе лаборатории биотехнологии Костромского государственного университета
им. Н.А. Некрасова. В 2010 и 2012 годах проводились экспедиции в генетический резерват
«Исполинские осины», расположенный в Шарьинском районе Костромской области, во время
которых были выделены высокопродуктивные диплоидные и триплоидные клоны Populus
tremula L., обладающие устойчивостью к поражению грибом Phellinus tremulae и значительно
превосходящие по своим морфометрическим показателям контрольные образцы.
Триплоидные клоны № 27 и 30 имеют показатели выше обычного контрольного (№ 29): по
сумме площадей сечений – соответственно на 36 и 23%, по запасу древесины – на 46 и 28%, по
средней высоте – на 4 и 3%. Средний диаметр самого высокопродуктивного клона № 27
превышает диаметр контрольного клона на 20%. Среднее изменение запаса древесины клона №
27 составляет 9,4 м3/га, клона № 30 – 8,1 м3/га, что превышает данный показатель контрольного
насаждения соответственно на 49% и 29%. Клон № 35 в возрасте 36 лет имел показатели выше
обычного (№ 37): по сумме площадей сечений – на 12%, по запасу древесины – на 15%, по
средней высоте – на 5%, среднему диаметру – на 27%. Среднее изменение запаса древесины
данного клона составлял 11,2 м3/га, что на 14% превышает показатель контрольного клона. Его
следующая (третья) корнеотпрысковая генерация в возрасте 6 лет также более
производительна: сумма площадей сечений и запасы превышают более чем в два раза, средняя
высота - на 10%, средний диаметр – на 15% аналогичные показатели контроля.
В лаборатории биотехнологии создан банк высокопродуктивных триплоидных и
диплоидных клонов осины в культуре in vitro. В настоящее время проводятся работы по
выделению новых высокопродуктивных клонов, а также исследования по снижению
себестоимости получения посадочного материала. Работа выполнена при финансовой
поддержке со стороны Минобрнауки России в рамках базовой части государственного задания.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ АМИДАЗЫ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS 4-1
Горбунова А.Н., Максимова Ю.Г.
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
anna.neustroeva.88@mail.ru
Амидазы (ациламид амидогидролазы, КФ 3.5.1.4.) – ферменты, катализирующие гидролиз
амидов до соответствующих кислот и аммиака. Амидаза имеет огромное биотехнологическое
значение, и может быть применена для биокаталитического получения различных карбоновых
кислот. Стереоселективные амидазы могут быть использованы для промышленного синтеза
стереоизомеров аминокислот и их производных.
На сегодняшний день интенсивно изучаются различные методы иммобилизации амидазы,
такие как физическая сорбция, включение в полимерные гели и др., но свойства
иммобилизованного препарата и его поведение в реакции гидролиза амидов недостаточно
изучены.
18
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
В данной работе амидаза, выделенная из клеток Rhodococcus rhodochrous 4-1, была
ковалентно иммобилизована на хитозане. Установлено, что иммобилизованный фермент
сохраняет 60% исходной активности при гидролизе акриламида и проявляет большую
термостабильность по сравнению со свободным. Показана возможность многократного
использования иммобилизованной амидазы на протяжении 5 последовательных 24-часовых
циклов трансформации акриламида. Установлено, что при иммобилизации методом
ковалентной сшивки с хитозаном амидаза не теряет своих D-стереоспецифических свойств и
катализирует гидролиз рацемического лактамида с энантиомерным избытком 31,6%.
Нами было изучено влияние адсорбционной иммобилизации на углеродсодержащих
носителях на активность и стабильность амидазы. Было установлено, что амидаза сохраняет
лишь 18% активности нативного фермента.
Были получены поперечно-сшитые агрегаты фермента при высаливании сульфатом
аммония с одновременной сшивкой бифункциональными реагентами - глутаровым альдегидом
и бензохиноном. Установлено, что при сшивании молекул амидазы бензохиноном сохраняется
около 9% исходной активности фермента, глутаровым альдегидом – около 30% активности.
Было показано, что иммобилизованные амидазы, полученные данным методом, проявляют
более высокую D-стереоселективность, чем фермент в растворе. Так, биокатализатор,
полученный сшивкой глутаровым альдегидом, катализировал гидролиз D,L-лактамида с
энантиомерным избытком D-изомера 93,8%.
Таким образом, иммобилизация амидазы различными способами позволяет получить
биокатализатор с определенными преимуществами. Так, активность по отношению к
акриламиду в большей степени сохраняется у фермента, ковалентно иммобилизованного на
хитозане, тогда как стереоселективность в реакции гидролиза рацемического лактамида выше у
поперечно-сшитых агрегатов амидазы, что позволяет использовать полученные
биокатализаторы для разных целей.
Работа поддержана грантом РФФИ р-урал-а 13-04-96050.
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК С
ПОЛИКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА
ЭЛЕКТРОАКУСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
1
Гулий О.И. , Зайцев Б.Д.2, Кузнецова И.Е.2, Шихабудинов А.М.2, Теплых А.А.2,
Матора Л.Ю.1, Караваева О.А.1, Павлий С.А.1, Игнатов О.В.1
1
ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,
2
Филиал ФГБУН Института радиотехники и электроники им. В.А.Котельникова РАН,
Саратов, Россия
guliy_olga@mail.ru
Одной из проблем современной микробиологии является изучение взаимодействия антител
с поверхностью микробной клетки с целью создания чувствительных сенсорных систем для
детектирования различных видов микроорганизмов. Особый интерес вызывают акустические
методы исследования, которые отличаются высокой чувствительностью и возможностью
проводить анализ в реальном времени. В этом плане весьма перспективными оказались
пьезоэлектрические резонаторы с поперечным возбуждающим электрическим полем, которые в
отличие от традиционных резонаторов с продольным полем более чувствительны к изменению
параметров контактирующей жидкости, поскольку реагируют на изменение как механических,
так и электрических ее свойств.
Изучено взаимодействие поликлональных антител с микробными клетками Azospirillum
brasilense Sp7 с помощью резонатора с поперечным электрическим полем. Для этого получены
специфические поликлональные кроличьи антитела на эпитопы О-антигенов штамма A.
brasilense Sp7 и показана возможность их применения для детекции микробных клеток с
помощью пьезоэлектрического резонатора с поперечным электрическим полем. Установлено,
что частотные зависимости реальной и мнимой частей электрического импеданса такого
резонатора, нагруженного суспензией клеток A. brasilense Sp7 с антителами, значительно
отличаются от зависимостей резонатора с контрольной суспензией клеток без антител.
19
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Показано, что полученные антитела взаимодействуют с клетками азоспириллы, причем
скопление маркера происходит по всей поверхности клетки. Найден предел возможного
определения микробных клеток при их взаимодействии с антителами, который составляет 104
кл/мл. Установлено, что детекция клеток A. brasilense Sp7 с помощью антител возможна в
присутствии посторонних культур.
Результаты демонстрируют возможность регистрации взаимодействия микробных клеток с
антителами и разработки биологического датчика для количественной детекции микробных
клеток.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПЕПТИДА,
ПРОДУЦИРУЕМОГО БАКТЕРИЯМИ STAPHYLOCOCCUS HAEMOLYTICUS
Жуланова А.Д.1, Коробов В.П.1,2
1
ФГБОУ ВПО Пермский национальный исследовательский политехнический
университет; 2ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,
Пермь, Россия
anya.zhulanova@gmail.com
Бактериоцины – вещества белковой природы, продуцируемые бактериями многих видов,
угнетающие развитие родственных микроорганизмов. Сегодня бактериоцины представляют
большой интерес как антибактериальные средства с меньшим, чем у классических
антибиотиков, уровнем развития к ним микробной устойчивости. Характерные особенности
таких белков – катионный заряд и липофильность, обеспечивают избирательную сорбцию на
анионных поверхностных и мембранных структурах бактериальных клеток с проникновением в
гидрофобные зоны мембран. Результатом такого взаимодействия являются необратимое
нарушение структуры и функции мембранного аппарата бактерий и их гибель.
В работе проведена идентификация штамма-продуцента, обладающего антибактериальной
активностью по отношению к индикаторной культуре Staphylococcus cohnii subsp. cohnii. Для
этого использовался набор StaphyTest 24 Lachema (Чехия). Штамм был идентифицирован как
один из представителей вида S. haemolyticus.
При проведении периодического культивирования на шейкере Sartorius Certomat
(Германия) в жидкой питательной среде, разработанной сотрудниками Лаборатории биохимии
развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН, построена кривая роста бактериальной культуры
с определением числа живых клеток и антибактериальной активности супернатантов среды
культивирования в отношении индикаторного штамма в каждый интервал времени. Показано,
что при увеличении оптической плотности продукция антибактериального соединения
возрастает и достигает максимального уровня при переходе бактериальной культуры в
стационарную фазу роста (6-й час культивирования).
Проведена очистка антибактериального фактора методом ионно-обменной хроматографии
на колонке с Toyopearl-SP 650M. Полученные препараты обессоливали диализом с
использованием мембран на 1000 Да (Spectrum Laboratories, США). После диализа пробы
содержали незначительное количество соли (13 ммоль/л) и обладали антибактериальной
активностью 128 у.е./мл. Полученный препарат высушивали на концентраторе Eppendorf 5301
(Германия). Активность после концентрирования составляла 8192 у.е./мл.
Для выяснения природы антибактериального фактора было проведено изучение степени
проявления его биологической активности после действия различных гидролаз. Обработка
препаратов антибактериального фактора РНК-азой и ДНК-азой не оказывала влияния на
антибактериальную активность, напротив, воздействие такими протеолитическими
ферментами, как трипсин и пепсин полностью инактивировало полученный препарат. Таким
образом, высокая чувствительность к протеазам обосновывает пептидную природу
антибактериального фактора.
20
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДВУХМЕДИАТОРНОЙ СИСТЕМЫ ФЕРРОЦЕН НЕЙТРАЛЬНЫЙ КРАСНЫЙ ДЛЯ СОЗДАНИЯ БПК-БИОСЕНСОРА НА
ОСНОВЕ ДРОЖЖЕВОГО ШТАММА DEBARYAMYCES HANSENII
Зайцева А.С., Арляпов В.А., Юдина Н.Ю.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия
Anyuta_Zaytseva@mail.ru
Индикатором загрязнения воды является индекс биохимического потребления кислорода
(БПК). В виду продолжительности стандартного метода определения БПК (от 5ти суток)
разрабатываются различные биосенсоры, использование которых сокращает время анализа до
10-20 минут.
Исходя из этого, в данной работе был разработан двухмедиаторный БПК-биосенсор на
основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii ВКМ Y-2482.
Электрохимические измерения проводили по двухэлектродной схеме. В качестве рабочего
электрода использовали углеродо-пастовый электрод, модифицированный медиатором
ферроценом, с иммобилизованными клетками D. hansenii. Электродом сравнения служил
насыщенный хлорсеребряный электрод. Все измерения проводились при рабочем потенциале
медиатора, в качестве которого использовали ферроцен (250 мВ). Чтобы обеспечить доступ ко
всем ферментам эукариотических клеток дрожжей в систему вводили медиатор нейтральный
красный.
Прежде чем использовать данный прибор для анализа реальных образцов были
установлены рабочие параметры эксперимента, при которых достигается максимальный
аналитический сигнал: рН=6,8; 10% ферроцен; 0,244 ммоль/дм3 нейтральный красный; 1,33 мг
D. hansenii.
Разработанный биосенсор стабильно работает в течение 48 дней, а диапазон измеряемых
концентраций БПК составляет 11,33 – 68 мг/дм3. Анализ реальных образцов сточных вод
показал высокую корреляцию к стандартному методу определения БПК.
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной
поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук, заявка № МК-330.2014.4.
БИОРЕМЕДИАЦИЯ ПОЧВЫ ПРИ УГЛЕВОДОРОДНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЯХ
Заборская О.Ю., Заборская А.Ю.
ФГБОУ ВПО Московский государственный машиностроительный университет,
Москва, Россия
O_ZA92@mail.ru
Проблема защиты окружающей среды от техногенных загрязнений и ликвидация их
последствий сегодня является наиболее актуальной в борьбе человечества за сохранение
экосистемы нашей планеты. По информации Росприроднадзора, в результате аварийных
разливов нефти на месторождениях ежегодно в окружающую среду поступает не менее 50 тыс.
тонн нефти и пластовых вод, загрязнению подвергается почвенно-растительный покров на
территории площадью до 10 тыс. га. Таким образом, становится необходимой рекультивация
обширных земельных площадей и восстановление продуктивности водоемов.
Целью работы является разработка энергосберегающей технологии восстановления
эколого-хозяйственных свойств почв, нарушенных в результате техногенных углеводородных
загрязнений.
Проведенные нами ранее эксперименты показали, что режим аэрации играет решающую
роль в процессе биоокисления углеводородов, загрязняющих почву. Нами спроектирована и
разработана лабораторная установка для изучения процесса биодеградации нефтезагрязненного
грунта в динамических условиях (в условиях механического перемешивания – аэрации).
Аппарат оснащен механическим регулируемым приводом мешалки – аэратора и измерительной
аппаратурой.
Эксперименты проводились с различными перемешивающими устройствами. Кроме
непрерывного нами исследованы прерывистые режимы перемешивания. Контрольные опыты
осуществлялись в статическом режиме (без механического перемешивания – аэрации).
21
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Наибольший интерес вызывали гребковые мешалки – аэраторы, представляющие собой наборы
неравномерно закрепленных на вращающихся траверсах вертикальных штырей. Испытания
гребковых мешалок показали их высокую эффективность.
Нами было выдвинуто предположение, что процесс аэрирования почвы можно сделать
менее энергозатратным, используя принципиально новую конструкцию мешалки,
позволяющую более полно обрабатывать объем перемешиваемого грунта при тех же скоростях
вращения вала.
Спроектирована и разработана мешалка новой конструкции сателлитного типа,
представляющая собой закрепленные на вращающихся траверсах также вращающиеся
профилированные штыри. При вращении, за один оборот траверсы, мешалка-сателлит
совершает дополнительный поворот вокруг своей оси. Таким образом, вращаясь, штыри
сателлитной мешалки оставляют в почве цилиндрические каналы сложной формы, по которым
атмосферный воздух проникает во внутренние слои грунта. Эти каналы постоянно
перекрываются новыми порциями грунта. С очередным оборотом вала, штыри сателлитной
мешалки, повернувшись, переходят на новую траекторию, аэрируя не затронутую ранее часть
грунта.
БИОПЛЕНКИ КАК ДЕСТРУКТОРЫ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ
Клишевич Н.Г.
Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
nataliklis@mail.ru
Господство биопленочной формы существования микроорганизмов было установлено во
всех природных экосистемах. Их образование наблюдают на различных поверхностях
(биотических и абиотических), в частности в организмах различных хозяев, причем
предпочтительно на инертных поверхностях. Члены такого сообщества микроорганизмов
имеют «специфические обязанности», которые, комбинируясь с другими, усиливают
жизнеспособность всего консорциума, что подтверждается экспрессией в разных клетках одной
биопленки разных генов и синтезом белков различного назначения. Сложная структура
биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток внутри
пространственно организованных систем, создает условия, благоприятствующие установлению
симбиотических взаимоотношений между бактериями разных видов и защите от воздействия
внешней среды. Биопленки пронизаны сетью водных каналов, которая обеспечивает доставку
питательных веществ членам сообщества и удаляет продукты метаболизма.
Целью исследований являлось изучение деструктивной активности консорциума,
состоящего из микроорганизмов-деструкторов углеводородов и их природных бактерийспутников, перспективных для создания микробного препарата-биоремедиатора сред,
загрязненных нефтепродуктами.
Динамику разрушения нефти ассоциациями БП1, БП2, БП3 и составляющего их ассоцианта
- представителя рода Rhodococcus, наблюдали в почве при модельном загрязнении ее нефтью
до уровня превышающего ПДК в 10 раз. Контроль убыли нефтяных углеводородов вели на
газовом хроматографе с использованием масс-спектрометрического детектора.
Три наиболее активные в деструкции нефти ассоциации БП1, БП2 и БП3 разрушают нефть
в течение трех месяце на 83, 91 и 100% соответственно, а составляющие их первичные
продуценты – на 33, 49 и 58% соответственно. Таким образом, консументы-спутники –
бактерии рода Bacillus, способствуют существенному – на 55, 42 и 42% соответственно,
ускорению процесса деструкции нефти. Ассоцианты, представленные в данных ассоциациях
микроорганизмами рода Bacillus, не способны к усвоению нефти, в качестве единственного
источника углеводорода. Проведенные исследования показали, что ассоциации обладают
большей деструктивной активностью, чем входящие в них первичные продуценты –
микроорганизмы рода Rhodococcus.
22
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИПЕПТИДА,
СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ДОМЕНУ БЕЛКА TRF2 С НЕИЗВЕСТНЫМИ
ФУНКЦИЯМИ
Ильичева Н.В.1, Воронин А.П.2
1
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный технологический институт
(технический университет); 2ФГБУН Институт цитологии РАН,
Санкт-Петербург, Россия
nad9009@yandex.ru
Теломеры – это нуклеопротеиновые структуры, расположенные на концах
эукариотических хромосом. Они состоят из повторяющихся последовательностей ДНК и
связанных с ними белков. На сегодняшний день очевидна ключевая роль теломер в клеточном
старении. Теломер-связывающий белок TRF2 имеет в своём составе домен, функции которого
неизвестны. Предполагается, что этот домен отвечает за взаимодействие TRF2 с ядерной
мембраной. Основным инструментом для изучения механизмов этого взаимодействия, а также
для изучения функций данного домена в целом, являются антитела к нему. Для получения
антител нужно получить соответствующий полипептид в достаточных количествах.
Целью данной работы было получение полипептида, соответствующего домену белка
TRF2 с неизвестными функциями, с помощью методов генной инженерии.
Фрагмент гена, кодирующий домен с неизвестными функциями, был получен с помощью
ПЦР, в которой в качестве матрицы был использован плазмидный вектор pCDNA3hTRF2Full,
содержащий полный ген белка TRF2 человека. Праймеры для ПЦР содержали сайты
рестрикции для рестриктаз FauND I и Hind III, в которых находятся старт- и стоп-кодоны,
необходимые для последующей экспрессии полипептида. Полученный с помощью ПЦР
фрагмент гена клонировали в клонирующем векторе pTZ57R/T. Полученной генетической
конструкцией трансформировали клетки E. coli штамма DH5α. Скрининг клонов проводили с
помощью ПЦР. Было проведено субклонирование фрагмента гена в вектор рЕТ32а(+) по
сайтам рестрикции FauND I и Hind III, трансформация полученной генетической конструкцией
штамма E. coli DH5α и скрининг полученных клонов с помощью ПЦР. Для проверки
пригодности генетической конструкции для экспрессии полипептида были проведены
рестрикционный анализ и секвенирование. Полученным вектором трансформировали
экспрессионный штамм E. coli RosettaBlue(DE3). Экспрессию полипептида проводили в среде
LB при температуре 37оС в течение 3,5 ч. Для индукции экспрессии в среду добавляли 0,4 мМ
IPTG. Электрофорез компонентов бактериального лизата в SDS-ПААГ показал наличие в нем
белка с кажущейся молекулярной массой 25 кДа, что примерно соответствует размерам
целевого полипептида (21 кДа). Иммуноблоттинг с антителами к TRF2 (Abcam) показал, что
экспрессируемый бактериями полипептид представляет собой домен белка TRF2. Полипептид
был выделен с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей экстракцией
из геля.
ВЛИЯНИЕ Ca2+ И CO2+ НА АНТИБАКТЕРИАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ
МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Керян А.Г., Базукян И.Л., Попов Ю.Г., Трчунян А.А.
Ереванский государственный университет, Ереван, Армения
andkeryan@yahoo.com
Молочнокислые бактерии (МКБ) синтезируют большой спектр веществ, обладающих
антибактериальной активностью (АА). Известно, что МКБ являются метаболически
ущербными: для их роста необходимы различные соедниения, такие как аминокислоты,
витамины и т.д. Энзиматическая активность МКБ компенсирует такую ауксотрофность.
Индукция ферментов МКБ может повлиять как на рост, так и на биологическую активность. К
тому же, в состав многих ферментов и витаминов входят ионы различных металлов.
Целью данной работы было изучение воздействия ионов металлов на рост и АА
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis и Lactobacillus crispatus. Штаммы лактобацилл были
23
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
изолированы из проб мацуна домашных хозяйств горных регионов Армении (Котайк и Сюник).
АА этих штаммов была изучена методом диффузии в агар.
Предварительный скрининг ионов металлов влияющих на АА МКБ показал, что Ca2+, Co2+
и Mg2+ оказывали стимулирующее действие, тогда как Mn2+, Fe3+, Fe2+ и Zn+ ингибировали АА.
Ba2+ не имел существенного влияния. В дальнейших исследованиях была выявлена
оптимальная концентрация Ca2+и Co2+ влияющая на синтез антибактериальных компонентов.
Показано, что оптимальными концентрациями были 3мМ и 1мМ для Ca2+и Co2+
соответственно. Рост изученных штаммов не подавлялся в присутствии даже 10мМ ионов
металлов. Также было выявлено, что совместное добавление ионов Ca2+ и Co2+ в оптимальных
концентрациях к среде культивирования лактобацилл не оказывало никакого влияния на АА.
Таким образом, штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis и Lactobacillus crispatus
можно использовать для получения антимикробных веществ, а для максимального их синтеза
добавлять ионы Ca2+или Co2+ в концентрациях 3 и 1мМ соответственно.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ КАРБОКСИЛЬНЫХ И АМИНОГРУПП, НЕ
СВЯЗАННЫХ ПЕПТИДНОЙ СВЯЗЬЮ В АЛЬБУМИНЕ, ЖЕЛАТИНЕ,
КАЗЕИНЕ
Клочко Е.А., Глубоченко Н.П.
ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия
Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
klochko.catia@yandex.ru
Альбумин, казеин, желатин – одни из самых распространенных природных полимеров.
Поверхностные свойства белков (адсорбция Н+ и ОН- ионов, заряд поверхности, значения
точки нулевого заряда, способность адсорбировать различные важные для живых организмов
вещества) зависят от баланса между карбоксильными и аминогруппами белка. Изменение
заряда белка в зависимости от состава водной фазы (рН, ионной силы раствора, содержания
веществ, способных повлиять на заряд) определяют пространственную структуру белков - их
конформационные превращения, способность к специфическим взаимодействиям и в конечном
счете определяет их биологическую активность. Количество свободных карбоксильных и
аминогрупп не связанных пептидной связью определяет способность белков взаимодействовать
как с неорганическими, так и с органическими электролитами, влияет на образование
внутримолекулярных связей.
Целью данной работы является определение количества свободных, не связанных
пептидной связью, карбоксильных и аминогрупп в альбумине, казеине и желатине методом
кондуктометрического титрования.
В ячейку для кондуктометрического титрования помещали 100 мл исследуемого раствора и
титровали раствором KOH (С=0,534 моль/л) для определения карбоксильных групп, для
определения аминогрупп – раствором НСl (С=0,1 моль/л). Титрант добавляли порциями по 0,1
мл. После каждой добавленной порции титранта измеряли значение электропроводности
раствора. Интервал времени между дозами титранта составлял 30-40 секунд. Исследуемый
раствор готовили следующим образом: навеску белка m=0,1 г растворяли в 100 мл
дистиллированной воды. Через сутки раствор оттитровывали. Регистрация удельной
электропроводности осуществляли на кондуктометре типа АНИОН-410 с точностью измерения
0,1 мкСм/см. Для дозирования титранта использовали микробюретку с ценой деления 0,02 мл.
Далее строили график удельной электропроводности от объема добавленного титранта.
Конечную точку титрования находили по изломам на кондуктограмме.
Установлено, что в сильно кислых и щелочных средах содержание не связанных пептидной
связью карбоксильных и аминогрупп увеличивается в связи с разрушением структуры белков.
24
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА Lac ИЗ ГРИБА TRAMETES HIRSUTE НА
ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ ОСИНЫ
Ковалицкая Ю.А.1, Филиппов М.В.1, Васина Д.В.2, Даянова Л.К.1,3,
Логинов Д.С.2, Королева О.В.2, Шестибратов К.А.1,3
1
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино; 2ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН,
Москва; 3ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт,
Пущино, Россия
kovalitskaya@inbox.ru
Лигнификация растений – сложный процесс, в регуляции которого участвует множество
генов. Считается, что в процессе полимеризации монолигнолов до образования лигнина
участвуют не только ферменты лигазы, редуктазы, дегидрогеназы, но и пероксидазы и лакказы.
Однако однозначного мнения, о том, какие из этих ферментов, важны в лигнификации
растений, пока нет.
Целью данного исследования было изучить роль лакказ в процессе лигнификации растений
на примере осины.
Нами был выбран ген грибной лакказы из гриба Trametes hirsute, с высоким окислительновосстановительным потенциалом и на основе вектора pBI была создана конструкция,
содержащая этот ген под контролем 35S промотора и нопалинсинтетазного терминатора nos. В
качестве селективного гена был использован ген устойчивости к канамицину – nptII.
Полученный плазмидный вектор pBI-Lac был перенесен в Agrobacterium tumefaciens (штамм
CBE21). Для трансформации осины (Populus tremula) использовали междоузлия растений,
полученных в условиях in vitro. Проведенный ПЦР-анализ тотальной ДНК трансформанов
подтвердил отсутствие агробактериальной контаминации и встройку целевой конструкции у 33
линий. Экспрессия целевого гена подтверждена методом ОТ-ПЦР.
Анализ активности рекомбинантной лакказы в растительном материале in vitro
трансгенных линий осины показал увеличение активности фермента в 4 клонах в 2 раза по
сравнению с контролем, в 10 клонах от 30 до 80%, в остальных клонах активность фермента
была на уровне контроля или ниже. Оценка активности лакказы в листьях тепличных растений
показала повышение общей активности фермента по сравнению с показателями in vitro, в
клонах, демонстрирующих высокие показатели активности in vitro, эти значения были выше
контрольных. В ходе биометрических исследований отмечено снижение высоты ряда клонов с
высокой активностью рекомбинантной лакказы до 50-60% по сравнению с контрольными
растениями. Химический анализ состава древесины выявил снижение содержания пентозанов,
(до 8-10%), целлюлозы (до 10%) и увеличение содержания лигнина в трнасгенных растениях.
Увеличивалось содержание лигнина Классона (на 15-40%), а количество кислоторастворимого
лигнина уменьшалось. Наблюдается корреляция увеличения активности рекомбинантного
фермента, снижения высоты растений и увеличения содержания лигнина в древесине
трансгенных растений.
Работа выполнена при поддержке гранта ФЦП № 14.B37.21.1915, стипендии президента
РФ 2013-2015, гранта РФФИ № 14-08-31667.
БПК-БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ АССОЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
ARXULA ADENINOVORANS, PICHIA ANGUSTA, DEBARYOMYCES HANSENII
Козлова Т.Н.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия
kozlovatatyana_1993@mail.ru
Особое внимание сегодня уделяется созданию микробных биосенсоров для оперативного
определения биохимического потребления кислорода (БПК). В БПК-биосенсорах в качестве
биорецепторного элемента применяют микроорганизмы, способные метаболизировать
широкий спектр органических соединений, либо искусственные ассоциации микроорганизмов,
25
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
что приводит к расширению субстратной специфичности и стабилизации функционирования
сенсора в течение длительного периода времени.
Биосенсорные измерения проводились с помощью многофункционального анализатора
Эксперт-001, используя кислородный электрод Кларка, на поверхности которого располагали
рецепторный элемент. В качестве биорецепторного элемента использовали ассоциацию
дрожжей Pichia angusta BKM Y-1397, Arxula adeninovorans Y-2677, Debaryomyces hansenii
BKM Y-2482.
Рецепторный элемент биосенсора, на основе используемой ассоциации, характеризуется
широкой субстратной специфичностью и способен окислять все основные классы органических
соединений: углеводы, спирты, карбоновые кислоты и т.д., что является перспективным с точки
зрения возможности использования данной ассоциации для оценки БПК.
Аналитические и метрологические характеристики биосенсора на основе ассоциации
дрожжей определяли с использованием глюкозо-глутаматной смеси (ГГС). Нижняя граница
определяемых концентраций БПК составила 2,41 мг/л, что сопоставимо с предельно
допустимыми концентрациями (ПДК) рыбхозяйственных водоемов. Время работы сенсора без
замены рецепторного элемента составляет 26 суток.
В работе исследован характер изменения откликов биосенсоров при концентрации NaCl от
0,5% до 20%. При увеличении солености среды до 20% ответ сенсора снижается на 72%.
Проведен анализ изменения окислительной способности ассоциации от присутствия в
растворе ионов Cu2+, Zn2+, Ni2+, Pb2+, Bi3+, Fe3+ и Cr2O72-, в диапазоне концентраций,
превышающих ПДК рыбхозяйственных водоемов от 0 до 100 раз. Наибольшее влияние на
дыхательную активность иммобилизованной ассоциации оказывает присутствие в кювете
ионов Cr2O72- и Zn2+, снижение ответов при повышении ПДК в 100 раз составило 73% и 62%
соответственно. При превышении ПДК в 10 раз для ионов Zn2+, Fe3+ и Bi3+ снижение ответов
составляет не более 20%, что может свидетельствовать о стресс-устойчивости ассоциации
Arxula adeninovorans BKM Y-2677, Pichia angusta ВКМ Y-1397, Debaryomyces hansenii BKM Y2482 к этим тяжёлым металлам.
Работа выполнена в рамках гранта РФФИ №13-05-97513.
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА
КАПСИДА ЦВС-2
Кудин К.В., Прокулевич В.А., Прокопкина Ю.О.
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
kiryl.kudin@gmail.com
Цирковирус свиней 2 типа (ЦВС-2) является экономически важным патогеном,
вызывающем целый ряд опасных заболеваний, объединяемых в англоязычной литературе под
общим названием Porcine Circovirus-Associated Diseases (PCVAD). Ранее из образца ткани
инфицированной ЦВС-2 свиньи была амплифицирована и клонирована в векторе экспрессии
pET-24b(+) открытая рамка трансляции (ОРТ), кодирующая белок капсида ЦВС-2. Несколько
вариантов экспрессионных конструкций были успешно испытаны в штамме для экспрессии
гетерологичных белков E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL.
Целью данной работы была разработка простого и эффективного метода очистки
рекомбинантного белка капсида, пригодного для дальнейшего использования в качестве
компонента иммуноферментного анализа. Для экспериментов по очистке использовался
укороченный вариант белка капсида, лишенный фрагмента N-концевого ДНК-связывающего
домена длиной 32 аминокислотных остатка, поскольку было показано, что данный фрагмент не
содержит значимых антигенных детерминант, необходимых для формирования
нейтрализующих антител к вирусу. Расчетная изоэлектрическая точка такого белка составляет
9,9, поэтому в первой серии экспериментов по очистке использовали катион-обменную
хроматографию на сорбенте Toyopearl SP (Tosoh Bioscience, Япония) в диапазоне рН 6,0-9,0 (с
шагом 0,5), для элюции использовали градиент NaCl 50-500 мМ (с шагом 50 мМ). Однако
максимальная полученная чистота целевого белка в данных экспериментах не превышала 50%
от общего белка. Поэтому в следующей серии экспериментов решили использовать металлхелатную хроматографию. Для этого была создана конструкция для экспрессии укороченного
26
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
варианта белка капсида, содержащего His-метку на С-конце. После подтверждения
способности такого белка эффективно связываться с поликлональной антисывороткой к ЦВС-2,
проводилась аналитическая хроматография на сорбенте His-Pur Ni-NTA Superflow Agarose
(TermoScientific, США). Промывка и элюция осуществлялись 20 мМ буферными растворами
фосфата натрия (рН 7,4), содержащими 300 мМ NaCl, с различной концентрацией имидазола:
для промывки использовались концентрации 30-40 мМ, для элюции использовался пошаговый
градиент 50-300 мМ (с шагом 50 мМ). Содержание рекомбинантного белка капсида в элюате
составило >90% при использовании для промывки 40 мМ имидазола, для элюции 300 мМ
имидазола.
Таким образом, для эффективной очистки рекомбинантного белка капсида ЦВС-2 была
успешно использована технология металл-хелатной хроматографии.
ВЛИЯНИЕ АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ЭМБРИОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ
Лагуновская Е.В.
ГНУ Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
E.Antonenko@igc.bas-net.by
Абсцизовая кислота (АБК) – растительный гормон, регулирующий ряд процессов
связанных с эмбриогенезом и формированием семян. Положительное влияние АБК на
индукцию эмбриогенных каллусов и соматических зародышей показано на примере многих
видов растений, а в ряде работ показано принципиальное значение введения АБК в среду для
культивирования. Предполагается, что под контролем этого фитогормона находится индукция
морфогенетических процессов в культуре in vitro, ведущих к формированию соматических
зародышей. Однако большая часть исследований, связанных с механизмами действия АБК,
проводилась на двудольных (табак, морковь, арабидопсис). О влиянии данного вещества на
процесс эмбриогенеза в культуре клеток злаков и, в частности, пшеницы, известно крайне мало.
Целью работы являлось изучение влияния различных концентраций АБК на процессы
каллусогенеза и регенерации растений в культуре зрелых зародышей пшеницы.
Для исследования отзывчивости к индукции морфогенетических процессов в культуре
соматических тканей в качестве эксплантов использовали зрелые зародыши мягкой яровой
пшеницы сорта Рассвет. Зародыши помещали в положении щитком вверх на твердую
питательную среду Мурашиге-Скуга (MS) без добавления АБК (контроль) и с добавлением
АБК в концентрациях 0,1-0,3 мг/л. Для каждого варианта среды получено 50 ± 2 каллуса.
Оценка эффективности каллусогенеза проводилась путем подсчета количества образовавшихся
каллусов и измерения площади поверхности каждого каллуса.
Были получены следующие данные. На контрольной среде MS эффективность
каллусогенеза составила 53% от посаженных эксплантов при среднем значении площади
поверхности каллуса 14 мм2. Ризо- и органогенез зафиксирован не был. Добавление в среду
АБК в концентрациях 0,1 мг/л и 0,2 мг/л привело к увеличению количества образующихся
каллусов до 99% (при средней площади 12 мм2) и 100% (при средней площади 14 мм2)
соответственно. Также при добавлении 0,2 мг/л АБК у 17% образовавшихся каллусов
наблюдался ризогенез. При добавлении АБК в концентрации 0,3 мг/л эффективность
каллусогенеза составила 100%, а средняя площадь каллуса увеличилась до 52 мм2. Вместе с тем
существенно возросла регенерационная активность: ризогенез наблюдался в 60% случаев, а
полноценная регенерация – в 27% случаев.
Таким образом, показано, что добавление в питательную среду низких концентраций АБК
стимулирует развитие каллусной массы и повышает регенерационную активность в культуре
зрелых зародышей пшеницы. Оптимальной является концентрация АБК 0,3 мг/л.
27
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
СОЗДАНИЕ БАЗЫ МАСС-СПЕКТРОВ ШТАММОВ LEPTOSPIRA SPP.
Литвинов И.К.1, Зуева Е.В.2
1
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный технологический институт
(технический университет); 2ФБУН Санкт-Петербургский научно-исследовательский
институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия
lik314@mail.ru
Грамотрицательные бактерии рода Leptospira насчитывают 20 геномовидов и
подразделяются на сапрофитные, промежуточные и патогенные группы. Патогенные виды
являются возбудителями лептоспироза, распространенного зоонозного заболевания.
Существует две системы идентификации лептоспир: по определению таксономического вида с
помощью молекулярно-генетических методов и по определению сероваров с помощью
серологических методов. Серотипирование изолятов лептоспир имеет практическое
эпидемиологическое значение для определения источника инфекции.
Идентификация
бактерий
методом
матрично-активированной
лазерной
десорбции/ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI–TOF MS) основана на
получении суммарных масс-спектров белков (MSP) исследуемого микроорганизма и сравнении
их с эталонными MSP. Однако идентификация штаммов Leptospira методом MALDI–TOF MS
затруднена из-за отсутствия эталонных MSP в международных базах данных.
Цель данного исследования – получение MSP штаммов Leptospira spp. из коллекции
лаборатории зооантропонозных инфекций НИИЭМ им. Пастера.
Экстракты клеток 9-ти патогенных штаммов Leptospira, относящихся к геномовидам L.
interrogans, L. borgpetersenii, L. kirschneri и 7-ми серогруппам, 2-х сапрофитных штамма
L.biflexa получали этанольно-муравьинокислотным методом. Образцы экстрактов наносили 6ти кратно по 1 мкл в лунки MALDI мишени. В качестве матрицы использовали раствор цианокоричной кислоты в 50% ацетонитриле и 2.5% трифторуксусной кислоте. MS были получены
на масс-спектрометре Microflex и преобразованы в MSP для каждого штамма с помощью
программы MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonik, Германия). Сравнение MSP осуществляли
визуализацией в виде построения дендрограмм. Как контроль использовали MSP спирохеты
Brachyspira murdochii из таксономической библиотеки Bruker.
Все штаммы Leptospira spp. дали специфические белковые профили, кластеризация
которых на дендрограмме чётко отличалась от MSP контроля. Группировка MSP штаммов по
таксономическим видам и по группам патогенности не была выявлена, но наблюдалась
иерархическая кластеризация MSP штаммов по серогруппам. Таким образом, данные
характеризующие созданную базу MSP коллекционных штаммов Leptospira свидетельствует о
возможном её использовании для серотипирования патогенных лептоспир.
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА
СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Логунов Е.Д., Торохин А.А., Коржавин Д.В.
ЗАО «Биокад», пос. Любучаны, Россия
logunov.ed@biocad.ru
В последние десять лет статистика показывает неуклонный рост числа гематологических
заболеваний, среди которых значительное место занимают наследственные нарушения
свертываемости крови. Гемофилия А – наиболее распространенное наследственное
заболевание, обусловленное дефицитом фактора свертывания крови VIII.
Основное лечение больных гемофилией заключается в внутривенном введении
гемопрепаратов, содержащих нативный или рекомбинантный фактор VIII. Наибольшей
эффективностью и безопасностью обладают препараты на основе рекомбинантного Фактора
VIII.
В России для клинического использования зарегистрировано несколько зарубежных
лекарственных препаратов, содержащих рекомбинантный фактор VIII. Однако, зарубежные
препараты не могут полностью удовлетворить потребности лекарственного рынка России, и, в
28
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
силу их высокой цены, недоступны широкой категории населения. В связи с этим существует
острая необходимость создания аналогичного отечественного препарата.
Для выделения и очистки рекомбинантного фактора VIII использовали ряд
последовательных хроматографий на аффинных, ионообменных и гидрофобных сорбентах.
Рекомбинантный фактор свертывания крови VIII продуцируется с использованием клеточной
линии СНО (клетки яичников китайского хомячка). Молекула состоит из тяжелой 88 кДа и
легкой 79 кДа цепи. Эти цепи связаны между собой нековалентной связью. Первоначальную
очистку проводили при помощи аффинной хроматографии. Исследованы некоторые
параметры, влияющие на эффективность выделения и чистоту рекомбинантного фактора
свертывания крови VIII. Для анализа чистоты и гомогенности полученного белка были
использованы методы SDS-электрофореза, ВЭЖХ, молекулярной ДНК-гибридизации,
иммуноферментного анализа. Для определения активности полученного белка in vitro
использовали метод хромогенного субстрата. Показано, что такие параметры, как состав
буфера, ионная сила раствора, рН значительно влияют на процесс выделения белка. Подобраны
и оптимизированы условия, обеспечивающие максимальный выход рекомбинантного белка из
культуральной жидкости.
ЭКОТЕХНОЛОГИЧЕКАЯ СИСТЕМА УТИЛИЗАЦИИ ОТХОДОВ
АГРОПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА
Лукьянов В.А.
ФГБОУ ВПО Курская государственная сельскохозяйственная академия имени
профессора И.И.Иванова, Курск, Россия
lukyanov27@mail.ru
Современное предприятие должно заботиться не только о качестве получаемой продукции,
но и стремиться к системному управлению отходами своей деятельности. Особенно важна
переработка отходов сельскохозяйственного производства, которые потребляют огромные
количества сырья, существенно превышая по массе основной продукт. Например, от одной
средней мощности птицефабрики мощностью 40 тыс. голов ежегодно поступает до 83 тыс.
тонн пометной массы с повышенной концентрацией загрязняющих компонентов. Строго
говоря, любое животноводческое или птицеводческое хозяйство, прежде всего, является
производством навоза, боинских отходов, технических стоков и т.д., а мясо, молоко, яйцо –
лишь следствие этого производства.
Результаты наших исследований свидетельствуют о способности отдельных видов
микроводорослей использовать биогенные соединения в качестве ростового субстрата, что
позволяет применять их в технологическом процессе биологической очистки сточных вод и
утилизации отходов различных сельскохозяйственных производств. В качестве ростового
субстрата могут быть использованы: все виды сточных вод, навоз, пометная масса и др.
отходы. Кроме того, имеется возможность корректировки ростового субстрата для увеличения
продуктивности микроводорослей.
Результаты проведенных в условиях Курской ГСХА исследований показали возможность
использования Spirulina platensis и Chlorella vulgaris для очистки сточных вод
птицефабрик.Скорость роста на стандартной питательной среде микроводорослей Spirulina
platensis и Chlorella vulgaris составила 0,30 и 0,33 соответственно. Количество биомассы за весь
период развития - 1,55 и 4,20 г АСВ. На сточных водах птицефабрики скорость роста резко
отличалась и составила по вариантам 0,60 и 0,63, что в 2 раза выше по сравнению с
дорогостоящей стандартной питательной средой. Что касается полученной биомассы, ее
количество увеличилось почти вдвое на варианте с Spirulina platensis (2,72 г АСВ) и в три раза
на варианте с Chlorella vulgaris (12,0 г АСВ).
Полученную биомассу скармливали телятам в дозе 50 мл на голову в течение 30 дней. За
этот период основной привес живой массы животных был на 28% выше по отношению к
контрольной группе. Результаты проведенных исследований многократно подтверждены и
имеют высокую практическую значимость для отрасли сельского хозяйства нашей страны.
29
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
РАЗРАБОТКА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ
11α-ГИДРОКСИАНДРОСТ-4-ЕН-3,17-ДИОНА ИЗ ФИТОСТЕРИНА
Малов Д.В.
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт;
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
malov.danilka@rambler.ru
11α-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дион (11α-ОН-АД), является ценным интермедиатом
синтеза фармацевтических стероидов кортикостероидной группы. Высокая физиологическая
активность гидроксилированных 3-кетостероидов обусловливает их широкое использование в
терапии многих заболеваний. Наличие гидроксильной группы в позиции 11α определяет
противовоспалительный и антиаллергенный эффект стероидов андростанового ряда. Такие
гидроксистероиды применяют при лечении в онкологии, дерматологии, ревматологии,
пульмонологии и других областях медицины.
В литературе имеется информация о возможности его (11α-ОН-АД) получения
многостадийным химическим синтезом, а также – микробиологически, путем
гидроксилирования из андростендиона в положении 11α рекомбинантным штаммом,
полученным на основе гетерологической экспрессии генов Р450 монооксигеназы в дрожжах.
Однако продуктивность штамма и степень превращения АД при этом крайне низка, что
затрудняет практическое применение метода.
Целью работы являлось изучение двустадийного микробиологического получения 11αгидроксиандрост-4-ен-3,17-диона с использованием двух активных штаммов Mycobacterium sp.
ВКМ Ас-1815Д и Aspergillus ochraceus ВКМ F-830.
Для получения АД будет использоваться культура непатогенных почвенных микобактерий
– Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815Д. После завершения ферментации содержащийся в
культуральной жидкости АД будет трансформирован в 11α-ОН-АД штаммом Aspergillus
ochraceus ВКМ F-830 в одном биореакторе.
Выделение и очистку АД в кристаллическом виде метод не предусматривает. Получение
кристаллического 11α-ОН-АД необходимой чистоты (свыше 95%) будет осуществлено
традиционными методами.
Уникальность работы заключается в эффективном введении гидроксильной группы,
которое возможно только микробиологическим способом. Экономическая эффективность
метода обусловливается использованием доступного сырьевого материала, исключением
процедуры очистки АД в кристаллическом виде и высокой производительностью штаммов.
ИСПЫТАНИЕ ОПЫТНЫХ ОБРАЗЦОВ ИЗДЕЛИЙ ИЗ УГЛЕРОДНЫХ
НАНОКОМПОЗИТОВ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ БЕЗОПАСНОСТЬ И
ТОКСИЧНОСТЬ
1
Любченко О.Д. , Соловьев В.Б.1,2, Татаринов В.Ф.2, Ястремская Я.П.1
1
ФГБОУ ВПО Пензенский государственный университет;
2
ЗАО Научно-производственное предприятие «МедИнж», Пенза, Россия
filology@inbox.ru
В настоящее время особое внимание уделяется разработкам искусственных композитных
материалов для восстановления функций органов и тканей, так как использование
ксенобиотиков и аллогенных трансплантатов показывают свою ограниченность в применении,
а использование искусственных материалов предыдущих поколений не в полной мере
удовлетворяет врачей и пациентов.
Внедрение искусственных материалов в медицине выдвинуло в число первоочередных
важнейших проблему биологической совместимости, так как материалы, применяемые в
медицине, помимо требуемых функциональных характеристик, физико-химических и
технологических свойств, должны быть полностью биосовместимыми с тканями и организмом
в целом.
30
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Таким требованиям в наибольшей степени отвечают материалы на основе углерода, так как
в большей мере реализуются биосовместимые, тромборезистентные, поверхностные,
усталостные, гальвано-электрические и другие характеристики. Однако ответом на вопрос о
возможности применения конкретного материала должно стать обязательное тестирование
готового образца на предмет соответствия требованиям, предъявляемым к материалам для
эндопротезирования и имплантации – а именно: совместимость с биологическими средами и
стабильное функционирование в месте имплантации.
Объектом нашего исследования являются инновационные углеродные нанокомпозиты для
медицины. Цель работы – оценка токсичности и биологической безопасности образцов
инновационных углеродных нанокомпозитов для медицины, разрабатываемых в рамках
государственного контракта 12411.1008799.13.053 от 14 мая 2012 с Министерством
Промышленности и Торговли РФ. Все этапы работы проходили в соответствии с ГОСТ Р ИСО
10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий».
По методу Fishbein M. et al., 1982 была проведена имплантация образцов материалов
животным с последующими лабораторными исследованиями биохимических и
гистологических показателей, характеризующих состояние организма после операции на
разных этапах приживления.
Анализ биохимических показателей крови животных после имплантации свидетельствует о
биосовместимости всех исследованных материалов. Получена гистологическая оценка
биологической безопасности, также показавшая отсутствие токсического воздействия
материалов на организм при имплантации на всех этапах исследования.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о соответствии образцов
углеродных
нанокомпозитов
требованиям,
предъявляемым
к
материалам
для
эндопротезирования в части биологической безопасности и токсичности.
ИНДУЦИРОВАНИЕ КАРОТИНОГЕНЕЗА У ДРОЖЖЕЙ PHAFFIA RHODOZYMA
ШТАММ Y2228 ПРИ ОБРАЗОВАНИИ СИНГЛЕТНОГО КИСЛОРОДА В
КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА
Мельникова Е.В., Герман Л.С.
ФГБОУ ВПО Московский государственный машиностроительный университет,
Москва, Россия
melnikovanoble@gmail.com
Дрожжи Phaffia rhodozyma штамм Y2228, являются продуцентом астаксантина, так как эти
дрожжи способны утилизировать как шестиатомные, так и пятиатомные сахара.
Астаксантин является высшим каротиноидом с самой высокой антиоксидантной
активностью. В организмах высших животных астаксантин выполняет регуляторные функции,
повышает иммунитет, повышает выживаемость особей в условиях стресса и вредных
воздействий окружающей среды.
Благодаря способности культуры утилизировать пяти- и шестиатомные сахара, возможно
получение кормового препарата, содержащего астаксантин из послеспиртовой барды.
Послеспиртовая барда для культивирования дрожжей Phaffia rhodozyma штамм Y2228
требует предварительной переработки, включающей разделение барды на фракции,
слабокислый гидролиз биомассы спиртовых дрожжей и двухступенчатый гидролиз дробины
(для получения пяти- и шестиатомных моносахаров).
Однако, в результате гидролиза цветность питательной среды не позволяет получить
нужную концентрацию синглетного кислорода при культивировании дрожжей Phaffia
rhodozyma штамм Y2228, чтобы индуцировать каротиногенез.
Получить синглетный кислород в культуральной жидкости возможно при внесении в
культуральную жидкость органических или неорганических окислителей. При выборе
окислителя следует учитывать токсичность его и продуктов разложения, так как содержание
токсинов не допустимо в кормовых продуктах. В предварительных экспериментах из трех
неорганических окислителей, показавших возможность их применения для получения такой
концентрации синглетного кислорода, которая индуцирует образование астаксантина, по
вышеназванным причинам выбран пероксид водорода.
31
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Для определения оптимальных условий культивирования и максимального выхода
астаксантина проведен эксперимент согласно многоуровневому плану латинских
прямоугольников для 4 факторов на 4 уровнях. Основными варьируемыми параметрами
выбраны: концентрация перекиси водорода, время внесения (через сколько часов после начала
культивирования будет внесен пероксид водорода), количество внесений пероксида водорода и
объем культуральной жидкости.
Анализ кривых эффектов факторов эксперимента показал, что для получения высокой
конечной концентрации астаксантина (40,3мкг/мл), концентрация пероксида водорода не
должна превышать 10млмоль/л, необходимо двукратное внесение этой концентрации
пероксида водорода в течение стадии роста культуры с максимальной удельной скоростью
роста.
ИССЛЕДОВАНИЯ МЕТАБОЛИЗАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЖИРНЫХ
КИСЛОТ И УСЛОВИЙ УВЕЛИЧЕНИЯ ДОЛИ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ В
ЛИПИДАХ ГРИБОВ MORTIERELLA ALPINA
Миронов А.А.1,2, Чистякова Т.И.1, Моргунов И.Г.1
1
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН;
2
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт,
Пущино, Россия
asolfr@rambler.ru
Арахидоновая кислота (АК) (5,8,11,14-цис-эйкозатетраеновая кислота) относится к ω-6
группе полиненасыщенных незаменимых жирных кислот, участвует в регуляции
функционирования клеточных мембран и играет важную роль в метаболических процессах в
качестве предшественника простогландинов, лейкотриенов и ряда эйкозаноидов. Благодаря
своим уникальным биологическим свойствам широко используется в медицине, сельском
хозяйстве и других областях.
Основными источниками получения АК являются печень и надпочечная железа животных,
а также яичный желток, однако, содержание АК в них настолько мало, что не может
удовлетворить растущих потребностей. Расширение сфер применения АК диктует
необходимость развития ее микробиологического производства с использованием
возобновляемых и дешевых источников углерода.
В последние годы в качестве перспективного субстрата для микробиологических
процессов рассматривается глицерин, который в настоящее время получается в больших
количествах в качестве побочного продукта при производстве биотоплива.
Выделение высокоочищенной АК из смеси полиненасыщенных жирных кислот
представляет серьезные трудности и включает использование ферментативных методов,
ионообменной или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Из этого следует, что
получение липидов с высоким содержанием АК является важной задачей микробиологического
производства.
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы было исследование возможности
повышения доли АК в липидах штаммов M. alpina LPM-301 и NRRL-A-10995, выращенных на
глицерин-содержащих средах.
Выявлено, что при инкубации отфильтрованного мицелия M. alpina происходит
увеличение доли АК в липидах за счет метаболизации других жирных кислот. При
исследовании различных режимов инкубации (температура, продолжительность процесса)
установлено, что оптимальным условием является инкубация отфильтрованной биомассы в
эксикаторе при комнатной температуре в течение 7 суток. При этом доля арахидоновой
кислоты в липидах M. alpina LPM-301 и NRRL-A-10995 увеличилась в 2.6 - 2.7 раза и достигла
60.6 и 24.9% соответственно. Содержание АК в биомассе слегка снизилось (от 4.43 до 3.94%) у
штамма LPM-301 или возросло (от 1.95 до 2.44%) у штамма NRRL-A-10995. Увеличение доли
АК в липидах обоих штаммов сопровождалось снижением содержания других жирных кислот
(как насыщенных, так и ненасыщеных).
32
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
В процессе инкубации биомассы у обоих штаммов наблюдалось развитие воздушного
мицелия. Высказано предположение, что увеличение доли арахидоновой кислоты в липидах
связано с ее интенсивным синтезом в процессе формирования воздущного мицелия.
КАТАБОЛИЗМ ТРИЭТИЛАМИНА КЛЕТКАМИ ШТАММА
RHODOCOCCUS QINGSHENGII НСТ-32
Нагорный Р.К., Самсонова А.С.
ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
samsonova@mbio.bas-net.by
Триэтиламин (ТЭА) используется в литейном производстве в качестве катализатора
реакции образования полиуретана. Для очистки воздуха литейных цехов от ТЭА используются
абсорбционно-биохимические установки, в биореакторах которых амин окисляется
иммобилизованными на носителе микроорганизмами-деструкторами. Поиск и изучение
микроорганизмов-деструкторов ТЭА является актуальной задачей. Целью данной работы
явилось изучение катаболизма ТЭА штаммом Rhodococcus qingshengii НСТ-32.
Штамм НСТ-32 является активным деструктором ТЭА. В процессе роста на среде с ТЭА в
качестве единственного источника углерода и азота клетки штамма НСТ-32 разрушают
токсикант в концентрации 100, 1000 и 10 000 мг/л за 50, 240 минут и 32 часа соответственно.
Методом жидкостной хроматографии с использованием масс-детектора в цитоплазме клеток
штамма НСТ-32 выявлены вероятные продукты окисления ТЭА: триэтиламин-N-оксид,
диэтиламин, диэтиламин-N-оксид, этиламин, этиламин-N-оксид, ацетальдегид. Метаболиты не
обнаружены в клетках, выращенных на питательной среде, не содержащей токсикант, что
свидетельствует об их образовании в процессе катаболизма ТЭА.
Проведенные исследования позволили разработать схему катаболизма ТЭА штаммом НСТ32. Предположительно, ТЭА окисляется с образованием триэтиламин-N-оксида, разложение
которого приводит к образованию диэтиламина, ацетальдегида и воды. Диэтиламин окисляется
до диэтиламин-N-оксида, с последующим образованием этиламина, ацетальдегида и воды.
Этиламин окисляется до этиламин-N-оксида, с последующим образованием ацетальдегида и
аммония. Ацетальдегид подвергается полной минерализации либо используется в
конструктивном метаболизме.
НОВАЯ ИНТЕНСИВНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА МИКОПРОТЕИНА
Неманова Е.О., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Бирюков В.В.
ФГБОУ ВПО Московский государственный машиностроительный университет,
Москва, Россия
katerinanemanova@gmail.com
Актуальной задачей современной биотехнологии является расширение пищевой базы за
счет внедрения качественно новых продуктов питания, одним из которых является
микопротеин (пищевая биомасса мицелиальных грибов, полученная методом жидкофазного
глубинного культивирования).
В СССР была разработана технология получения микопротеина с использованием гриба
Fusarium sambucinum шт. ВСБ-917. Однако используемое по этой технологии сырье
(свекловичная меласса) и технологическая схема не отвечают требованиям, предъявляемым к
современным биотехнологическим производствам.
Целью данной работы являлась разработка новой интенсивной технологии производства
микопротеина.
В результате исследований получен новый штамм Fusarium sambucinum шт. D-104 (ВКПМ
F-1161), выделенный по признаку продуктивности в процессе глубинного культивирования на
крахмалосодержащих средах штамма близкородственного ВСБ-917. Показано, что штамм F.
sambucinum шт. D-104 обладает высоким содержанием белка (истинный белок от 40 до 51%
АСМ), повышенным количеством ценных ненасыщенных жирных кислот (от 83 до 87% по
сумме жирных кислот), и пониженным содержанием нуклеиновых кислот.
33
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Выявлены источники углеродного (глюкоза, мальтоза) и азотного (NH4NO3, (NH4)2SO4)
питания, а также ростовые факторы (кукурузный экстракт). На основе выбранных источников
углеродного питания подобрано содержащее их промышленное сырье, в частности
гидролизаты крахмала.
Выявлена максимально допустимая окружная скорость перемешивающего устройства (2,02,5м·сек-1), не приводящая к механическому травмированию мицелиальной структуры
продуцента. Показано, что режим рН-статирования для накопления биомассы и биосинтеза
белковых веществ F. sambucinum шт. D-104 на крахмалосодержащих средах (4,0), существенно
отличается от оптимального значения на среде с мелассой (5,6-5,8).
Методами математического планирования эксперимента оптимизированы режимные
параметры (температура 28°С, перемешивание 700 об.мин-1 (2 м.сек-1), аэрация 1,2-1,5 л.л1
.мин-1) и состав питательной среды (критерий оптимизации - содержание истинного белка в
биомассе продуцента).
В результате исследований выход истинного белка F. sambucinum шт. D-104 по новой
технологии более чем в 1,5 раза превышает данный показатель, полученный на основе
F. sambucinum шт. ВСБ-917 по старой технологии.
Таким образом, разработана новая интенсивная технология производства микопротеина на
основе штамма Fusarium sambucinum шт. D-104 (ВКПМ F-1161), позволяющая наиболее
эффективно получить высокобелковый продукт пищевого назначения.
ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ
ЦЕЛЛЮЛАЗ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО
СЫРЬЯ НА ОСНОВЕ ГРИБНОГО ШТАММА PENICILLIUM VERRUCULOSUM
Немашкалов В.А., Кошелев А.В., Матыс В.Ю., Окунев О.Н.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
vitalianik@rambler.ru
Растительная биомасса составляет основную часть органического материала на Земле и
является возобновляемым источником сырья и энергии. Поэтому разработка эффективных
способов ее использования является одной из наиболее актуальных и приоритетных задач
современной биотехнологии. Создаваемые в настоящее время способы переработки биомассы
преимущественно основываются на ферментативной деструкции целлюлозосодержащих
материалов (ЦСМ) с образованием олиго- и моносахаридов, которые, могут быть
конвертированы в различные полезные продукты (спирты, органические кислоты, полимеры,
кормовые добавки и др.).
В связи с вышеизложенным были разработаны методы получения и анализа свойств
целлюлазных и гемицеллюазных ферментных препаратов различного компонентного сотава,
имеющих в основе карбогидразный комплекс P. verruculosum. Созданы новые рекомбинантные
штаммы P. verruculosum, способные синтезировать ферментные комплексы с увеличенной
целлюлазной активностью (за счет экспрессии эндо-β-1,4-глюканаз I и IV, целлобиогидролазы
II Trichoderma reesei), а также гемицеллюлазной активностью (за счет экспрессии эндо-β-1,4ксиланаз P. canescens и T. reesei, а также эндо-β-1,4-маннаназы T. reesei). Изучена
гидролитическая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых
рекомбинантных штаммов, по отношению к трем видам различных ЦСМ (измельченной осине,
измельченной обессмоленной сосне и измельченной багассе). Показано, что наибольшей
гидролитической способностью обладают новые ферментные препараты, в которых наряду с
рекомбинантными белками сохраняются ферменты базового целлюлазного комплекса.
Рекомбинантные ферментные препараты характеризовались высокой стабильностью.
Оптимальные значения рН и температуры для целлюлазной, ксиланазной и маннаназной
активности находились в интервале значений рН 3,5 – 5,5 и 50 - 80°С.
34
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ НА РИЗОСФЕРНЫЕ БАКТЕРИИ
Нешко А.А., Крючкова Е.В., Турковская О.В.
ФГБУН Институт биохимии, физиологии растений и микроорганизмов РАН,
Саратов, Россия
aansanura@rambler.ru
Наличие в почвах ризосферных бактерий, устойчивых к комплексным загрязнениям, а
также обладающих деструктивным потенциалом по отношению к ним, является важным
индикатором «здоровья» почвенного профиля. Зачастую почвы сельскохозяйственных угодий
содержат смешанные загрязнения, состоящие из органического компонента и катионов
тяжёлых металлов. Настоящая работа посвящена скринингу природных ризосферных бактерий,
одновременно устойчивых к высоким концентрациям Cu2+, Cd2+ и фосфорорганического
гербицида глифосата, а также первичной оценке их деструктивной активности.
Используемые в работе бактерии были выделены из ризосферы люцерны посевной
(Medicago sativa L.), выращенной в сосудах с почвой, загрязнённой смесью глифосата и солей
соответствующих металлов. Выделенные изоляты LCu2, LCu4a, LCu4b обладали устойчивым
ростом на минеральной среде, содержащей Cu2+ и Cd2+ в концентрации 1 и 5 мМ. Однако
только штамм LCu2 мог расти на глифосате в концентрации 5 мМ, добавленного в среду в
качестве единственного источника фосфора. Ростовые характеристики были сопоставимы с
контрольными, что указывает на способность данного штамма деградировать гербицид. Не
смотря на устойчивость LCu2 к каждому поллютанту по отдельности, штамм проявил
чувствительность к комплексным загрязнениям. Добавление в среду глифосата с Cu2+
ингибировало рост культуры на 50%, а глифосата с Cd2+ на 60%. Полученные результаты могут
свидетельствовать об образовании между глифосатом и катионами металлов стабильных
трудно-деградируемых комплексов. Дальнейшая работа будет посвящена выявлению
продуктов деструкции комплексных загрязнений, а также оценке способности бактериального
штамма LCu2 к сорбции или активному поглощению металлов, связанных с глифосатом.
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРОВ РЕГУЛЯЦИИ
ЭРИТРОПОЭЗА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПСЕВДОАФФИННОГО СОРБЕНТА
Плотченкова М.В., Руденко Е.Г.
ЗАО «Биокад», пос. Любучаны, Россия
plotmari@mail.ru
Анемия является одним из наиболее серьезных осложнений при различных заболеваниях:
хроническая почечная недостаточность, онкологические заболевания, трансплантация органов
и тканей, СПИД, хронические воспалительные процессы и др. Наиболее эффективным
способом лечения анемии является применение препаратов на основе рекомбинантного
человеческого эритропоетина (рчЭПО), который получают из клеточных линий
млекопитающих.
Целью данных исследований являлся подбор наиболее оптимальных условий выделения и
очистки рчЭПО. Были проанализированы различные схемы получения, выявлены взаимосвязи
условий и последовательности проведения этапов хроматографий (псевдоафинная, аффинная,
ионообменная), которые влияют на стабильность, физико-химические свойства и активность
белка. Введение в схему выделения этапа хроматографии на псевдоафинном сорбенте,
позволило получить высокоочищенный целевой белок с оптимальным соотношением
сиализированных изоформ. Для анализа чистоты и гомогенности получаемых препаратов были
использованы
методы
SDS-электрофореза,
капиллярного
зонного
электрофореза,
изоэлектрофокусирования, ВЭЖХ, молекулярной ДНК-гибридизации, ИФА. Показано, что
чистота и гомогенность полученного белка составляла более 98%. Содержание клеточных
белков и ДНК, бактериальных эндотоксинов в полученных препаратах было незначительным и
соответствовало нормам, принятым для иммунобиологических препаратов, вводимым людям,
согласно Российской и Международной нормативной документацией.
35
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ПОЛУЧЕНИЕ ГИБРИДНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ
СОБАЧЬЕГО α-IFN В КЛЕТКАХ E.COLI
Прокопкина Ю.О., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
julia.prokopkina@gmail.com
α-IFN является плейотропным цитокином, способным оказывать антивирусное,
антипролиферативное и иммунорегуляторное действие. Он может применяться в качестве
иммуномодулятора для лечения широкого спектра инфекционных заболеваний.
По данным литературных источников при лечении заболеваний собак применяется
человеческий интерферон, в то время как применение собачьего α-IFN могло бы повысить
эффективность препарата и уменьшить риск развития аллергических реакций.
Целью работы является получение гибридных рекомбинантных белков на основе собачьего
α-IFN для дальнейшего использования в ветеринарии.
Одним из подходов, позволяющих упростить и ускорить процесс получения чистых
рекомбинантных белков является включение в их состав аффинных доменов, способных
связываться с определенным сорбентом. В данной работе c этой целью был использован
целлюлозосвязывающий домен CBM9-2 Thermotoga maritima, позволяющий использовать
целлюлозу в качестве сорбента, кроме того в литературе были сведения о влиянии данного
домена на растворимость белка и процесс рефолдинга.
В ходе работы получена генетическая конструкция на основе вектора pET24b, содержащая
оптимизированную последовательность собачьего α-IFN и CBM9-2. Эксперименты по
наработке целевого белка в E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL показали довольно высокий
уровень наработки гибридного белка, однако основная его часть входила в состав телец
включения несмотря на наличие домена. Дальнейшие исследования позволили подтвердить
данные о положительном влиянии целлюлозосвязывающего домена CBM9-2 на процесс
правильного фолдинга белка.
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО
НЕКРОЗА ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНИ ЛОСОСЕВЫХ (IHNV) С
ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
Попонова М.С.1,2, Бровко Ф.А.1, Шепеляковская А.О.1, Бозиев Х.М.1,
Пыльнов В.А.3, Доронин М.И.3
1
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино; 2ФГБОУ ВПО Московский государственный
университет им. М.В.Ломоносова, Москва; 3ФГБУ Федеральный центр охраны
здоровья животных, Владимир, Россия
m.poponova@gmail.com
Инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых (IHN) – высококонтагиозное
заболевание лососевых рыб (сем. Salmonidae), вызываемое РНК-вирусом сем. Rhabdoviridae.
IHN отнесен к особо опасным и карантинным заболеваниям рыб приказом Минсельхоза РФ.
Вирус широко распространен в акваториях земного шара и внесён в список части 2.1 OIE
Aquatic Animal Health Code (9th Edition, 2013) как возбудитель опасного заболевания,
подлежащего мониторингу в соответствие с требованиями МЭБ.
IHN сопровождается характерными симптомами и в большинстве случаев приводит к
смерти. Гибель молоди составляет до 80–100%, а взрослых рыб – до 25%. Рыбы, переболевшие
IHN, являются источниками заражения здоровых особей. Заболевание приводит к некрозу
гемопоэтических тканей. Лечение IHN не разработано. Единственной мерой борьбы с
инфекцией является карантин и полное уничтожение рыбы в водоеме, с последующим
проведением ветеринарно-санитарных мероприятий. Профилактика основана на контроле
инфекционного состояния рыбы и икры, предотвращении вспышек инфекции.
Важной задачей предупреждения и распространения заболевания является доступность
эффективных средств диагностики и мониторинга возбудителя. Из разработанных и
36
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
используемых методов обнаружения вирусов особое место занимают иммунохимические.
Первым этапом разработки таких методов является получение высоко специфических и
аффинных антител к возбудителю, что и являлось целью данной работы.
Ввиду сложности получения высокоочищенных белков вируса и их лабильностью при
иммунизации использовали смесь вирусных белков с последующей идентификацией. Для этого
использовали иммуноблоттинг, позволивший установить специфичность антител. На данный
момент получено более 22 клонов продуцента моноклональных антител (Mab) к вирусным
белкам. Были отобраны наиболее активные антитела, наработаны в виде асцитной жидкости,
очищены и охарактеризованы. Были определены антитела: взаимодействующие только с одним
вирусным белком; связывающиеся с несколькими белками и взаимодействующие с
конформационными эпитопами. Подобраны пары Mab, которые позволяют определить наличие
вирусных белков в растворе.
На основе полученных Mab разрабатывается тест-система, которая позволит определить
заражение с близкой к 100% точностью. Это достигается за счет того, что антитела отбираются
к функционально важным эпитопам вирусных белков и связываются с ними, что позволяет
надеяться на точное определение. Создание тест-системы на основе Mab позволит проводить
эпизоотологический мониторинг заболевания, контролировать распространение вируса и
следить за состоянием здоровья рыб.
СОВРЕМЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ
СОЗДАНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ РАСТЕНИЕВОДСТВА
Пунина Н.В.1, Дидович С.В.2, Зотов В.С.1, Хапчаева С.А.1, Пархоменко Т.Ю.2,
Пархоменко А.Л.2
1
ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва, Россия;
2
Институт сельского хозяйства Крыма НАН Украины, Симферополь, Украина
hin-enkelte@yandex.ru
В условиях химико-техногенного влияния интенсификации земледелия на состояние
агрофитоценозов, ухудшения состояние почв и здоровья человека и животных, увеличения
затрат материальных ресурсов и энергии на единицу получаемой растениеводческой
продукции, а также возрастающей потребности в пищевых ресурсах, переход к экологически
безопасным малозатратным агробиотехнологиям является одной из наиболее перспективных
задач сельского хозяйства.
Одним из таких решений является создание и внедрение в практику высокоэффективных
растительно-микробных
консорциумов.
Ранее
подбор
промышленно
ценных
высокопродуктивных штаммов микроорганизмов (PGPPM) для создания микробного препарата
проводился на основании рутинных исследований только их фенотипических характеристик
(морфологических
свойств,
инокуляции
тест-растения,
анализа
симбиотической,
антибиотической, ферментативной активностей, анализа токсинов и др.). При этом не
учитывались физиологические особенности растения и агроклиматические условия.
Для упрощения и повышения качества процедуры поиска и подбора PGPPM, нами был
разработан подход, основанный на методах молекулярно-биологического анализа уникальных
для рода микроорганизма участков генома, отвечающих за специфическое взаимодействие с
растением. Данный подход, наряду с агроклиматическими условиями, позволяет учитывать
физиологические особенности и микроорганизма, и сельскохозяйственной культуры. Одними
из разработанных и применяемых нами методов стали: saAFLP анализ, метод сравнительного
анализа ДНК последовательностей генов «домашнего хозяйства» и hin-регион ПЦР.
ДНК-методы прошли успешную апробацию на бактериях родов (исследовано более 200
штаммов): Rhizobium, Bradyrhizobium, Rhodococcus, Dietzia, комплексных видов Bacillus subtilis
и B. thuringiensis. Полученные результаты коррелировали с данными биохимических тестов и
тестов на инокуляцию. Методы позволили не только достоверно сгруппировать все
исследуемые штаммы в соответствие с их филогенетической структурой и принадлежностью к
растению-хозяину (Rhizobium, Bradyrhizobium), но и выявить группы наиболее эффективных
промышленно ценных штаммов. Было показано, что методы могут быть успешно применены
на практике для быстрого и точного поиска и подбора PGPPM, а также последующего контроля
37
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
их качества на производстве и их паспортизации. На основании проведенных тестов были
отобраны наиболее эффективные штаммы PGPPM в качестве основы для создания одно- и
многокомпонентных полифункциональных биопрепаратов с учетом сельскохозяйственной
культуры и агроклиматических условий.
ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННЫХ ПЕРЕХОДОВ ПЕПТИДНОГО
АНТИГЕНА, МОДЕЛИРУЮЩЕГО ИММУНОДОМИНАНТНЫЙ ЭПИТОП
2-Й ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ПЕТЛИ β1-АДРЕНОРЕЦЕПТОРА
Сидорова М.В., Орлова А.В.
ФГБУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс
Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
orlova.a.mipt@gmail.com
β1-Адренорецептор экспрессируется в кардиомиоцитах и играет важную роль в регуляции
сердечной деятельности. Аутоантитела к нему вызывают особый интерес среди маркеров
аутоиммунных процессов, т.к. обладают катехоламиноподобным действием, вызывая
нарушения в работе рецептора in vitro. Антитела к β1-адренорецептору выявляют у 50%
больных идиопатическими желудочковыми аритмиями и 35% больных нарушениями
проводимости.
Ранее с помощью методов компьютерного моделирования была построена полипептидная
структура конформационного антигена, получен оригинальный бициклический полипептид,
соответствующий предложенной структуре конформационного антигена, изучена
пространственная структура синтетического конформационного антигена. При этом было
показано существование двух конформационных форм.
Целью данного исследования было определение возможности конформационного перехода
между этими формами при помощи флуоресцентного анализа полученного конформационного
антигена. В качестве основного параметра использовалось отношение интенсивности
флуоресценции образцов на длинах волн 320 и 360 нм при возбуждающей длине волны 280 нм.
В ходе исследования было показано, что антиген имеет жесткую структуру и не изменяет
своей конформации при варьировании показателей pH и окислительно-восстановительного
потенциала среды. Также было установлено, что присутствие высоких концентраций мочевины
также не способствует изменению конформации антигена.
ПОВЫШЕНИЕ НАДЕЖНОСТИ БЕСКОНТАКТНОЙ РЕГИСТРАЦИИ
ПРОЦЕССОВ СЕРДЦЕБИЕНИЯ И ДЫХАНИЯ
Путилин Е.О.
ФГБОУ ВПО Рязанский государственный радиотехнический университет,
Рязань, Россия
putilin-eo@rc-bi.com
Ранее мною были рассмотрены методы бесконтактной регистрации процессов
сердцебиения и дыхания человека посредством ультразвуковых биений. Наряду с такими
преимуществами данных методов, как высокая чувствительность и помехозащищенность,
можно выделить существенный недостаток – низкая надежность. Под надежностью в данном
случае понимается возможность регистрации сердцебиения и дыхания независимо от
взаимного расположения ультразвуковых преобразователей и грудной клетки человека. В
настоящий момент приходится долго подбирать оптимальное положение пациента, при
котором будет наблюдаться устойчивая регистрация, - эта процедура отнимает много времени
и создает ряд неудобств, как для врача, так и для пациента.
Первый вариант решения данной проблемы - повышение надежности регистрации
посредством увеличения ширины диаграммы направленности. Однако это непременно
приводит к снижению чувствительности регистрации, что критично при регистрации малых
колебаний, связанных с сердцебиением.
38
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Второй подход к увеличению надежности регистрации заключается в модернизации
конструкции
ультразвукового
приемо-передающего
преобразователя.
Предлагается
использовать не один преобразователь, а целую матричную структуру. При таком подходе
будет покрываться относительно большой участок грудной клетки пациента, но диаграммы
направленности отдельных преобразователей при этом будут достаточно узкими, чтобы
позволять регистрировать малые колебания грудной клетки. Адаптивная обработка сигналов,
поступающих с нескольких преобразователей, позволит выделить единый сигнал,
соответствующий процессам сердцебиения и дыхания человека.
При этом в один момент времени излучать ультразвук может только один преобразователь,
но принимать отраженный от грудной клетки эхо-сигнал будет вся матрица преобразователей.
Данное решение позволяет расширить приемную диаграмму всей структуры, оставляя
диаграмму направленности излучения на прежнем уровне. В результате попеременного
включения «на передачу» каждого из преобразователей будут сформированы вектора отсчетов
фазовых сдвигов для каждого канала. Корреляционный анализ данных векторов между собой
определяет значимость каждого вектора на выбранном промежутке времени. Значимость
вектора представлена весовым коэффициентом, который обратно пропорционален среднему
коэффициенту корреляции вектора фазовых отсчетов канала с векторами других каналов. В
результате такого анализа выходной сигнал, соответствующий процессам сердцебиения и
дыхания человека, будет найден как взвешенная сумма векторов фазовых отсчетов каналов
матричного ультразвукового преобразователя.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДНК-МАРКЕРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЛЕЛЬНОГО
СОСТОЯНИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ В СЕЛЕКЦИОННОМ МАТЕРИАЛЕ
КАРТОФЕЛЯ
Свиточ О.В., Воронкова Е.В., Савчук А.В., Ермишин А.П.
ГНУ Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
amusingladybird@yandex.ru
Использование ДНК-маркеров для определения аллельного состояния генов устойчивости
позволяет выявлять мультиплексные родительские линии (дуплекс, триплекс, квадруплекс).
Вовлечение таких линий в скрещивания дает возможность значительно увеличить долю в
гибридной популяции сеянцев, обладающих желаемыми признаками. Для определения
аллельного состояния гена, родительская линия скрещивается с тестером, а затем изучается
расщепление в F1. Эффективные тестеры должны быть нуллиплексами (рецессивными
гомозиготами) по максимальному числу изучаемых генов и при этом обладать высокой
мужской фертильностью, что делает возможным их использование в скрещиваниях как с
мужски фертильными, так и мужски стерильными линиями.
Целью настоящей работы было выявление тестеров, которые отвечают этим требованиям, а
также их использование для определения аллельного состояния генов устойчивости к болезням
и вредителям у ряда перспективных родительских линий картофеля.
В качестве исходного материала для выявления тестеров были использованы старые сорта
американской селекции Katahdin, Superior, Red Pontiac, Norсhip и Russet Burbank, у которых,
согласно их описанию в международных базах данных, должны отсутствовать маркеры к
большинству генов устойчивости. Кроме того, было протестировано несколько диплоидных
линий S. tuberosum, выведенных в нашей лаборатории как линии, обладающие высокой
мужской фертильностью и способностью формировать 2n пыльцу.
Сорт Red Pontiac, а также диплоидные линии IGC17-8, IGC27-11 были отобраны на
основании данных ПЦР-анализа по выявлению 12 ДНК-маркеров генов устойчивости к
золотистой цистообразующей нематоде, PVX, PVY, PLRV, раку картофеля и фитофторозу.
Помимо того, что они обладали небольшим количеством маркеров к генам устойчивости, они
также хорошо скрещивались с тетраплоидными родительскими линиями.
Нами были получены гибридные популяции F1 между тестерами и двенадцатью
перспективными родительскими линиями, предоставленными Институтом картофелеводства
НАН Беларуси. Первые результаты их исследования показали, что родительские линии
являются симплексами по большинству генов устойчивости. Тем не менее, среди линий были
39
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
выявлены несколько дуплексов и даже триплексов по гену устойчивости к нематоде H1 (маркер
TG 689) и гену устойчивости к PVY Ryadg (маркер RYSC3). Триплексное состояние генов
устойчивости у выделенных линий позволит получать на их основе гибридные популяции без
расщепления по соответствующим признакам, что облегчит отбор среди гибридов по другим
хозяйственно-важным признакам.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРАХМАЛА С ПОМОЩЬЮ БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ
ГЛЮКОАМИЛАЗЫ И ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
Скворцова Л.С.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия
lsskvortsova@gmail.com
Содержание крахмала в сырье, готовой продукции и промежуточных стадиях производства
является одним из ключевых показателей качества продуктов питания и параметров ряда
технологических процессов в пищевой промышленности.
Среди существующих в настоящее время методов определения содержания крахмала в
различных образцах биосенсорные методы являются наиболее оптимальными для
использования в промышленных, а также полевых условиях. Они превосходят стандартные
методы по таким показателям, как: экономичность, доступность, экспрессность, простота,
стабильность, требуют небольшого объема пробы (10 мкл - 1 мл).
В данной работе в основу прибора для экспресс-анализа крахмала пoлoжена биoсенсорная
устанoвка амперoметрическoгo типа. Датчиком является кислoрoдный электрод с ферментами
глюкозооксидазой и глюкоамилазой, иммобилизованными методом адсoрбции на
стеклoвoлoкoннoм фильтре и сшитые с помощью глутарового альдегида. Работа
биферментнoго биосенсора на основе кислородного электрода при определении крахмала
основана на гидролизе молекулы крахмала глюкоамилазой до глюкозы и последующем ее
окислении глюкозооксидазой, который является ферментом с абсолютной субстратной
специфичностью. Кислород потребляется на этапе окисления глюкозы и образования
глюконолактона и пероксида водорода, что позволяет соотносить изменение концентрации
кислорода с содержанием крахмала в образце.
Разработанный биосенсор позволяет определять крахмал в диапазоне 0,025-7 мг/л, период
измерения составляет 15-20 мин. Операционная стабильность сенсора – 12,4%. Долговременная
стабильность более – 89 дней (сохранение 86% активности от первоначальной).
Произведен анализ реальных образцов крахмалосодержащей продукции. Показано, что
значения концентрации крахмала, определенные с использованием разработанного биосенсора
и референтным методом совпадают с учетом доверительных интервалов (R = 0,9870).
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной
поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук, заявка № МК-330.2014.4
СКРИНИНГ СОЕДИНЕНИЙ, ВЛИЯЮЩИХ НА ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК
В ПРИРОДНЫХ И ПРОМЫШЛЕННЫХ ЭКОСИСТЕМАХ
Смирнова Л.Н.1, Смирнова Г.В.2, Октябрьский О.Н.2
1
ФГБОУ ВПО Пермский национальный исследовательский политехнический
университет; 2ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,
Пермь, Россия
akbasheva-lili@mail.ru
В природе более 99% бактериальных популяций существуют в виде биопленок, которые
представляют собой сообщество прикрепленных микроорганизмов, погруженных в
экстраклеточный матрикс, состоящий из адгезинов, экзополисахаридов, белков и ДНК.
Находящиеся в составе биопленки бактериальные клетки более устойчивы к действию
антибиотиков и других антимикробных агентов, успешно переносят все виды стрессовых
воздействий и атаку иммунной системы. Биопленки способны расти на поверхностях
медицинского имплантированного оборудования (линз, катетеров, протезов, искусственных
40
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
клапанов сердца). Они вызывают биокоррозию трубопроводов, обрастание различного
технологического оборудования, корпусов судов, нефтяных платформ. Все это создает большие
медицинские и технические проблемы и стимулирует поиск и изучение веществ, которые могут
подавлять образование биопленок и убивать бактерии внутри них.
В данной работе изучалось влияние на биопленкообразование солей кобальта и железа
(FeSO4×7H2O и CoSO4×7H2O). В качестве микробной тест-системы использовался штамм
бактерий E. coli BW25113 (wild-type). Бактерии выращивали на минеральной среде М-9 с
добавлением 0.4% глюкозы, 0.2% казаминовых кислот и 10 мкг/мл тиамина на
иммунологических планшетах при 37°С. Планшеты инкубировали без встряхивания в течение
22 часов и измеряли оптическую плотность планктонной культуры (OD600) с помощью
микропланшетного спектрофотометра xMarkTM Bio-Rad. После удаления планктона
биопленки окрашивали 0.1% раствором кристаллического фиолетового, отмывали от избытка
красителя, экстрагировали 96% спиртом и измеряли оптическую плотность при 540 нм.
Удельное биопленкообразование определяли путем деления OD540 на OD600.
В диапазоне концентраций от 1 до 10 µM сульфат кобальта не оказывал существенного
влияния на рост клеток в планктоне, в то время как сульфат железа вызывал 17%-ую
стимуляцию роста. При концентрации 10 µM обе соли снижали образование биопленок на 18 и
27%, соответственно. При этом удельное биопленкообразование в случае сульфата железа
снижалось на 37%. Таким образом, испытанные соли, особенно сульфат железа, способны
существенно ингибировать образование биопленок, растущих на минеральной среде.
Работа поддержана грантом РФФИ-Урал № 14-04-96031, а также грантом Президиума УрО
РАН для молодых ученых 14-4-НП-126.
ХИМЕРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА
ЭСКУЛЕНТИНА С НОСИТЕЛЯМИ АФИННЫХ МЕТОК
Совгир Н.В., Нагорная А.А., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
sovgirnv@inbox.ru
Выступая в качестве антибактериальных агентов, антимикробные пептиды (АМП) весьма
перспективны для получения на их основе новых лекарственных препаратов, так называемых
«антибиотиков животного происхождения». Они лишены многих недостатков, свойственных
традиционно применяемым антибиотикам. Ранее АМП получали в основном путем прямого
выделения из естественных источников или химического синтеза. В настоящее время актуальна
разработка подходов к получению АМП генно-инженерными способами с использованием
технологии слияния генов для получения фьюжн-белков. При этом в целях упрощения
хроматографической очистки химерных молекул в их состав наряду с белками-носителями
могут входить разнообразные афинные метки.
Объектом исследования в работе выступает катионный АМП эскулентин-1b (Rana
esculenta) (Esc-1b), модифицированный для гетерологичной экспрессии в бактериях путем
добавления метионина на N-конец молекулы. Серия экспериментов по клонированию
гибридных генетических последовательностей, содержащих ген эскулентина, в клетках
бактерий E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL, показала возможность его экспрессии в составе
фьюжн-белков.
В данной работе были получены гибридные конструкции гена эскулентина-1b со
следующими последовательностями: 1) углевод-связывающим модулем (carbohydrate binding
module, CBM) из Thermotoga maritima; 2) GyrA интеином из Mycobacterium xenopi; 3) малым
убиквитин-подобным модификатором (small ubiquitin-related modifier, SUMO) из Saccharomyces
cerevisiae.
Белок SUMO на N-конце молекулы снабжен шестью гистидиновыми остатками,
выступающими в качестве афинной метки (His6-SUMO-Esc-1b). Что касается GyrA интеина, то
на С-конце его молекулы афинной меткой является хитин-связывающий домен (ChiBD) из
Bacillus circulans (GyrA-ChiBD). CBM сам по себе является аффинной меткой, т.к. способен
связываться с целлюлозой, выступающей в качестве сорбента при хроматографической
очистке. Кроме того, для отделения эскулентина-1b как целевого продукта от носителей в
41
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
белках His6-SUMO-Esc-1b и CBM-Esc-1b содержатся сайты узнавания для TEV протеазы
(tobacco etch virus protease), в то время как GyrA интеин при определенных условиях вырезается
самостоятельно (Esc-1b-GyrA-ChiBD).
Все описанные конструкции клонированы в составе вектора для экспрессии pET24b(+) в
клетках бактерий E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL. На данном этапе ведутся работы по
изучению экспрессии клонированных последовательностей с целью определения оптимального
белка-носителя для получения рекомбинантного эскулентина-1b.
СИНТЕЗ СОПОЛИМЕРОВ 3-ГИДРОКСИБУТИРАТА-СО-3ГИДРОКСИГЕКСАНОАТА ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИМИ
БАКТЕРИЯМИ RALSTONIA EUTROPHA
Сырвачева Д.А.
ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет, Красноярск, Россия
SyrvachevaDA@yandex.ru
В настоящее время получение биоразрушаемых материалов, материалов нового поколения,
является одним из перспективных направлений биотехнологии. Разнообразие полимеров,
варьирование их свойствами, возможность получения композитов в разнообразных сочетаниях
с различными веществами является основой для получения новых материалов с ценными
свойствами. Среди полимеров природного происхождения особое место занимают
биоразрушаемые полигидроксиалканоаты (ПГА). Их сополимеры, содержащие в своем составе
среднецепочечные мономеры (С6-С14 атомов углерода), наиболее перспективны, так как
характеризуются более высокими физико-механическими свойствами и скоростями
биоразрушения в сравнении с гомополимером 3-гидроксибутиратом.
Цель работы – исследовать способность бактерий штамма R.eutropha В5786 синтезировать
сополимер поли(3-гидроксибутирата-со-3-гидроксигексаноата), выявить связь между
условиями биосинтеза и структурой ПГА, изучить свойства.
Проведено культивирование бактерий R. eutropha В5786, где субстратами были фруктоза и
гексановая кислота. В качестве ингибитора β-окисления жирных кислот использовали
акриловую кислоту. Подачу гексановой и акриловой кислот осуществляли дробно (4-6 раз в
течение эксперимента). Выявлено, что акриловая кислота в большей степени по сравнению с
гексановой влияет на синтез полимера и выход биомассы. Максимальные выходы ПГА (60%) и
биомассы (4,5 г/л) были получены в условиях, где суммарная концентрация гексановой
кислоты составляла 6 г/л, акриловой – 0,3 г/л, при этом включение 3ГГ достигало 43 мол.%.
Увеличение акриловой кислоты (суммарно до 1 г/л) привело к резкому снижению полимера (до
24%) и биомассы (до 2,8 г/л). Максимальное количество 3ГГ (до 67,5 мол.%) получено в
условиях суммарной концентрации гексановой и акриловой кислот, соответственно, 2,5 и 0,5
г/л.
Исследованы
физико-химические
свойства
(температурные
характеристики,
кристалличность, структура поверхности) полученных образцов.
Таким образом, установлено, что, варьируя условия культивирования и концентрацию
гексановой и акриловой кислот, возможно получать сополимеры поли(3ГБ-со-3ГГ) с
различным содержанием 3ГГ (до 67,5 мол%).
ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ФОРМИРОВАНИЯ И СТРУКТУРЫ БИМОДАЛЬНЫХ
КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКИХ ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МАТРИЦ
Соколова О.А., Каманина О.А., Рогова Т.В.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия
o.a.sokolova92@gmail.com
Золь-гель метод традиционно используется для получения высокочистых оксидных и
композиционных материалов, применяемых в электронике, в качестве сорбентов и
катализаторов. В последние десятилетия этот процесс используется также в хроматографии и
при создании гетерогенных катализаторов, применяемых в биосенсорах для анализа
42
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
загрязнений природных объектов. К достоинствам золь-гель метода относятся: возможность
получения материалов с различным размером пор, экономичность, экологическая безопасность.
В настоящей работе было получены 8 образцов золь-гель матриц на основе
тетраэтоксисилана (ТЭОС), порообразователя – полиэтиленгликоля-3000, с различным
содержанием гидрофобной добавки – метилтриэтоксисилана (МТЭС). Вводимый в систему
порообразователь обеспечивает формирование микропор, необходимых при инкапсулировании
биомассы. МТЭС способствует разрыхлению матрицы за счет наличия гидрофобной группы и
сохранению биологической активности биомассы.
Кинетика формирования золь-гель матриц была проанализирована с помощью метода ИКспектроскопии. На ИК-спектрах образцов присутствуют полосы поглощения, характерные для
их компонентов. Характеристики полученных полос поглощения хорошо согласуются с
данными, описанными в литературе.
По истечении первых 15 минут во всех золь-гель матрицах наблюдается прекращение
роста нормированных полос поглощения деформационных колебаний воды (δОН 1640 см-1),
что говорит о завершении в течение этого времени процессов гомогенной поликонденсации.
Нормирование полосы поглощения δОН 1640 см-1 осуществляли по полосе поглощения 1270
см-1, соответствующей колебаниям Si-CH3, поскольку в процессе формирования матрицы она
остается неизменной.
Это также позволяет количественно оценить содержание связей Si – O – Si, исходя из
соотношения полос поглощения диформационных колебаний ОН-группы и Si-CH3-группы
(I1640/I1270). Максимальное количество выделившейся воды, а, следовательно, и
образовавшихся связей Si – O – Si, соответствует матрице с содержанием МТЭС 50%.
Таким образом, во всех исследуемых образцах в течение первых 15 минут завершаются
процессы гомогенной поликонденсации, следовательно, время образования связей Si – O – Si
не зависит от содержания гидрофобной добавки – МТЭС. Максимальное число связей Si – O –
Si образуется в матрице, содержащей 50% МТЭС.
ВЛИЯНИЕ НАЛИЧИЯ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА НА
БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS FLUORESCENS АР-33 И
PSEUDOMONAS AUREOFACIENS BS 1393
Сухушина А.О.
ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный
университет, Томск, Россия
sao_2042@mail.ru
Быстрое развитие отрасли нанотехнологии приводит к широкому распространению
наночастиц в окружающей среде. Они попадают в организм при дыхании, с пищей, через кожу,
а также оказывают влияние на растительные организмы. Немногочисленные литературные
сведения по биотестированию опасности наночастиц (НЧ) не дают четких представлений об их
воздействии.
Проникновение НЧ в окружающую среду делает актуальной проблему оценки
соотношения риска и пользы от их применения. Одними из наиболее широко используемых
продуктов нанотехнологий в настоящее время являются НЧ диоксида титана. Они содержатся в
выхлопных газах автомобилей, используются при изготовлении бумаги, пластмасс,
солнцезащитных и косметических средств. Таким образом, появляется острая необходимость
оценки влияния НЧ TiO2 на живые объекты.
Объектом исследований были бактерии рода Pseudomonas, которые являются основной
микрофлорой прикорневой почвы, присутствуют на поверхности и в ризосфере корня,
являются наилучшими колонизаторами корней и находят свое применение в качестве
удобрений, стимуляторов роста для растений, повышая устойчивость к стрессам и болезням, и
увеличивая урожай.
В связи с широким распространением НЧ и их попаданием в почву, открытым вопросом
остается влияние НЧ на различные параметра роста и развития бактерий рода Pseudomonas,
которые играют важную роль в регуляции различных параметров роста растений.
43
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Поэтому, целью работы была оценка влияния наличия НЧ TiO2 в питательной среде на
бактерии Ps. fluorescens АР-33 и Ps. aureofaciens BS 1393 при их культивировании.
Согласно полученным данным, можно сказать, что в присутствии НЧ TiO2 происходит
увеличение удельных скоростей роста и концентраций исследуемых бактерий Ps. fluorescens
АР-33 и Ps. aureofaciens BS 1393 в 2–70 раз по отношению к контролю в зависимости от их
концентрации.
Исходя из полученных данных, можно сказать, что включение НЧ TiO2 в состав
биопрепаратов способствует увеличению ростостимулирующей активности как за счет
непосредственного присутствия НЧ, так и за счет увеличения биологической активности
бактерий. Поэтому, использование НЧ TiO2 может улучшить свойства биопрепаратов для
защиты растений от фитопатогенов.
МЕТОД УСКОРЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ГОЛЛАНДСКИХ ТЮЛЬПАНОВ В
УСЛОВИЯХ IN VITRO
Тезекбаева Б.К., Малахова Н.П., Галиева Л.Д., Калиева А.А.
РГП Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А.Айтхожина КН МОН,
Алматы, Казахстан
bota151283@mail.ru
Применение современных методов биотехнологии позволяет решить актуальную и
практически значимую для Казахстана проблему ускоренного размножения луковичных
растений, в частности, тюльпанов, для развития промышленного цветоводства.
Целью данного исследования являлся подбор оптимального метода клонального
микроразмножения перспективных сортов тюльпанов голландского происхождения для их
ускоренного тиражирования в лабораторных условиях. В качестве объектов исследования
использовали адаптированные к местным условиям голландские сорта тюльпанов группы
Triumph Verandi и группы махровых ранних тюльпанов Monsella.
В качестве исходного материала для получения эксплантов использовали луковицы
тюльпанов, прошедшие стадию покоя в течение 45-70 дней, при температуре + 4°С.
Стерилизацию проводили следующим способом: луковицы предварительно выдерживали в
слабом растворе перманганата калия - 30 минут, обрабатывали 10% гипохлоритом натрия - 20
минут, помещали в 70% этанол - 5 минут и 3-х кратно промывали бидистиллированной водой.
Микроклональное размножение голландских тюльпанов осуществляли следующим
методом: поверхность взрослой стерильной луковицы надрезали крестообразно, не повреждая
донце и помещали, ориентируя основанием на питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) с
содержанием сахарозы и регуляторов роста - α-нафтилуксусной кислоты (НУК), тидиазурона,
аминокислот с добавлением казеина. Культивирование надрезанных луковиц проводили в
термостате, при температуре 26°С, без освещения.
В результате эксперимента выявлено, что процесс образования новых микролуковиц для
сорта Verandi составляет 70-75 дней, для сорта Monsella 50-56 дней на среде без цитокининов, с
пониженным содержанием ауксина НУК. Новые микролуковицы отделяли от материнской
луковицы и помещали на среду МС, содержащую сахарозу, НУК и акпинол для стимуляции
процесса ризогенеза. Применение данного метода микроклонального размножения позволило
получить необходимое количество микролуковиц трудноразмножаемых сортов голландских
тюльпанов Verandi и Monsella в условиях in vitro за относительно короткий срок - 75-90 дней,
тогда как в природных условиях процесс размножения тюльпанов занимает около 3 лет.
В результате проведенных исследований подобран и оптимизирован метод
микроклонального размножения через крестообразное поранение материнской луковицы
голландских тюльпанов, для их ускоренного получения и тиражирования в лабораторных
условиях.
44
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
СРАВНЕНИЕ УРОВНЯ УСТОЙЧИВОСТИ К ВИРУСУ Б ХРИЗАНТЕМ,
СОДЕРЖАЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ ФРАГМЕНТЫ ГЕНА БЕЛКА ОБОЛОЧКИ
Титова С.М.1, Митюшкина Т.Ю.1,2, Фирсов А.П.1,2, Долгов С.В.1,2
1
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
биотехнологии РАСХН, Москва; 2Филиал ФГБУН Института биоорганической химии
им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Россия
f0t0nchik@mail.ru
В настоящее время метод генетической трансформации используют для повышения
устойчивости растений к вирусам. В своей работе мы использовали 3 подхода, основанных на
трансформации растений геном белка оболочки вируса в смысловой и антисмысловой
ориентации, а также на основе РНК-интерференции. Цель работы заключалась в сравнении
эффективности различных подходов модификации генома к созданию вирусоустойчивых
сортов хризантем. В данной работе были исследованы растения хризантем сорта White
Snowdon, трансформированные следующими конструкциями: с полной последовательностью
гена белка оболочки вируса хризантем Б (CP-CVB) в смысловой ориентации (pBSS), с двойной
смысловой последовательностью гена CP-CVB (pBDS), с антисмысловой последовательностью
гена CP-CVB (pBAS) и РНК-интерференционной конструкцией на основе фрагмента гена CPCVB размером 273 пн (pRNAiVB). Эти последовательности находились под контролем 35S
промотора вируса мозаики цветной капусты и терминатора гена nos A. tumefaciens.
Искусственное заражение вирусом Б трансгенных растений хризантем и нетрансгенной
неинфицированной линии, которая использовалась в качестве контроля, проводили методом
прививки. Для этого черенки с инфицированных вирусом Б растений хризантем прививали в
расщеп к стеблю растений-реципиентов, средняя приживаемость прививок составляла более
90%. Детекция вируса после заражения осуществлялась методом иммуноферментного анализа
(ИФА). ИФА выполнялась с использованием антител к белку оболочки вируса Б хризантем
производства компании «Loewe», Германия.
В результате, было показано, что прививка инфицированных черенков на контрольные
растения привела к заражению вирусом всех привитых растений. Было изучено 17 трансгенных
линий хризантем с четырьмя различными конструкциями: 4 линии pBAS, 6 линии pBDS, 3
линии pBSS. 4 линии pRNAiVB. Линии трансгенных хризантем показали различную степень
устойчивости. Было выделено несколько линий с высокой резистентностью к вирусу Б.
Данные ИФА дополнительно подтверждали методом Вестерн-блот анализа. В устойчивых
к вирусу Б линиях полоса, соответствующая белку оболочки вируса Б не детектировалась. В то
же время в контрольных инфицированных растениях и в трансгенных растениях неустойчивых
линий использованные антитела специфически узнавали белок оболочки вируса Б
молекулярной массой около 37 кДа.
ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIII
ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНИОНООБМЕННОГО СОРБЕНТА
Торохин А.А., Логунов Е.Д., Коржавин Д.В.
ЗАО «Биокад», пос. Любучаны, Россия
andrejjtrkhin@rambler.ru
Гемофилия А – генетическое заболевание, вызванное врожденным дефицитом белка
свертывания крови VIII (FVIII). При этом заболевании возникают кровоизлияния в суставы,
мышцы и внутренние органы, как спонтанные, так и в результате травмы или хирургического
вмешательства. При гемофилии резко возрастает опасность гибели пациента от кровоизлияния
даже при незначительной травме.
В настоящее время основным методом лечения гемофилии А является заместительная
терапия препаратами, содержащими FVIII человека, которые могут быть получены из плазмы
доноров или с помощью рекомбинантной ДНК технологии (rFVIII).
До недавнего времени на российском рынке для лечения больных гемофилией были
доступны исключительно препараты, выпускаемые зарубежными фармацевтическими
компаниями, что обусловило необходимость создания отечественного rFVIII.
45
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
В данной работе были проведены исследования очистки фактора свертывания крови VIII
на анионообменном сорбенте.
Исследованы параметры (ионная сила раствора и рН), влияющие на чистоту и активность
получаемого рекомбинантного фактора свертывания крови VIII. Определены оптимальные
условия, обеспечивающие максимальный выход активного белка с чистотой 95%. Исследованы
физико-химические свойства очищенного белка. Изучена стабильность полученного rFVIII при
разных значениях pH.
ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ ПРОЯВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ГРИБНОЙ
ЛАККАЗЫ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ОСИНЫ
Тугбаева А.С.1, Ковалицкая Ю.А.2, Шестибратов К.А.2
1
ФГАОУ ВПО Уральский федеральный университет им. первого Президента России
Б.Н.Ельцина, Институт естественных наук, Екатеринбург; 2Филиал ФГБУН Института
биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,
Пущино, Россия
anastasia.tugbaeva@gmail.com
Лигнин – один из основных компонентов древесины, однако механизмы регуляции его
биосинтеза и полимеризации до настоящего времени мало изучены. Долгое время полагали, что
в полимеризации лигнина задействованы Н2О2-зависимые пероксидазы, исследования
последних десятилетий показывают связь между работой лакказ, пероксидаз и полимеризацией
лигнина. Исследование роли лакказ в растениях позволит понять конечные этапы синтеза
лигнина. Цель работы – исследовать фенотипическое проявление экспрессии гена грибной
лакказы в трансгенных растениях осины.
В группе лесной биотехнологии ФИБХ РАН была проведена агробактериальная
трансформация триплоидного генотипа осины 47 бинарным вектором pBI содержащим ген
лакказы 072 из гриба Trametes hirsute с высоким Red/Ox потенциалом активного центра под
контролем 35S промотора. В качестве селективного гена был использован ген nptII. Было
получено 29 линий трансформантов. Из всех линий выделена ДНК и с помощью метода ПЦР
проанализирована на наличие гена vir B, целевого гена Lac и селективного гена nptII. Было
показано, что в 17 линиях произошла встройка целевого гена Lac, ген nptII присутствует во
всех линиях, агробактериальная контаминация отсутствует.
Нами был проведен анализ 18 линий осины: оценена активность рекомбинантной лакказы в
растениях, выращенных в условиях in vitro и адаптированных к условиям защищенного грунта;
проведены биометрические исследования 4-х месячных растений; оценено укоренение
апикальных эксплантов в условиях in vitro. Активность рекомбинантной лакказы в растениях,
выращенных в условиях in vitro выше, чем в контроле у 12 линий, максимальное значение
отмечено у генотипа 47XVIIILac22 и составляет 76,6 МЕ, что выше контроля в 2,2 раза.
Активность фермента у 4-х месячных растений в тепличных условиях выше, чем в контроле у
11 линий на 11-50%. По результатам биометрического анализа установлено, что высота
трансгенных растений у 5 генотипов выше, чем в контроле до 26,5%, 4 генотипа ниже
контрольных растений на 5-10% и 5 генотипов на 35-40%. Результаты изучения эффективности
укоренения трансгенных клонов осины показали, что большинство генотипов (9 линий
трансформантов) демонстрировали 80-100% укоренение на 9-12 день эксперимента, средняя
длина корней и количество корней на 1 растение совпадали с контрольными показателями.
Генотипы, высота которых была ниже контрольных растений, демонстрировали низкие
значения всех проанализированных параметров. Таким образом, экспрессия гена грибной
лакказы в осине может влиять на высоту растений, активность фермента и эффективность
укоренения эксплантов.
46
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ САКСАУЛА ЧЕРНОГО
(HALOXYLON APHYLLUM)
Хасейн А., Малахова Н.П., Ахметжанова А.Б., Жумагельдинов Б.К.
РГП Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А.Айтхожина КН МОН,
Алматы, Казахстан
leogold24@mail.ru
Опустынивание земель на территории Казахстана относится к наиболее острым
экологическим и социально-экономическим проблемам. Для нашей страны, большая часть
территории которой расположена в зоне недостаточного увлажнения, эта проблема является
крайне актуальной. Одним из решений проблемы опустынивания в Республике Казахстан
является культивирование на засушливых территориях растений саксаула (Haloxylon aphyllum и
Haloxylon persicum), который является доминантной древесно-кустарниковой породой в
умеренных пустынях Центральной Азии. Применение современных методов клеточной
биологии и биотехнологии, позволяет решать вопросы размножения саксауловых насаждений в
пустынных зонах нашей страны с помощью ускоренного размножения и тиражирования из
небольшого числа растительного материала трудноразмножаемых в природных условиях
растений саксаула. Такой подход является наиболее результативным способом разрешения
критической проблемы по восстановлению и по сохранению биологического разнообразия
пустынных экосистем в Казахстане.
Цель данного исследования состояла в подборе состава питательных сред и условий
культивирования пробирочных растений саксаула черного. Объектом исследования служили
семена и проростки саксаула черного (Haloxylon aphyllum).
Стерилизованные семена саксаула черного помещали на питательную среду МС с
содержанием сахарозы и 1% регулятором роста – α-акпинола. Образование проростков из
семян саксаула черного наблюдалось через 2 дня после начала эксперимента. Полученные
проростки пересаживали на питательную среду МС с различными концентрациями регуляторов
роста - индолилмаслянной кислоты (ИМК), 6-бензиламинопурин (6-БАП) и добавлением 2%ного NaCl. Всего было использовано 8 вариантов сред с различным сочетанием NaCl и
регуляторов роста. 2%-ный NaCl был использован для создания условий роста растений
саксаула, приближенных к естественным. На основе полученных данных установлено: на среде
с добавлением 6-БАП и NaCl через 14 дней после начала эксперимента у пробирочных
растений отмечался активный рост и образование корней, тогда как в контрольном варианте
активация роста пробирочных растений саксаула отмечалась на 3 - 4 недели позже.
Корнеобразования в контрольных растениях отмечено не было.
По результатам исследования подобран и оптимизирован состав питательных сред,
обеспечивающий получение и размножение растений саксаула черного (Haloxylon aphyllum) с
хорошо развитой корневой системой в условиях in vitro из семян и проростков.
АНАЛИЗ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МЕТАБОЛИТОВ В ТРАНСГЕННЫХ
РАСТЕНИЯХ ОСИНЫ С ГЕНОМ SP-XEG
Улько Д.О., Видягина Е.О., Шестибратов К.А.
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН; ФГБОУ ВПО Пущинский государственный
естественно-научный институт, Пущино, Россия
gannicus91@mail.ru
Метаболиты являются конечными продуктами экспрессии генов, поэтому любые
изменения на генетическом уровне, несомненно, влияют на состав метаболома. В этой связи
существуют необходимость тщательного анализа метаболитов генномодифицированных
организмов. Используя агробактериальный перенос, в нашей лаборатории были созданы
трансгенные растения осины с конститутивной экспрессией рекомбинантной ксилоглюканазы
sp-Xeg из гриба Penicillium canescens. Поскольку рекомбинантный ген может оказывать
плейотропные эффекты, изучение метаболома полученных трансгенных растений поможет
объяснить суть отмеченных биохимических и фенотипических изменений.
47
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Для одревесневших растений генотипов Pt, PtXIVXeg1a, PtXVXeg1c, PtXVXeg5a с
помощью газовой хроматографии был проведён анализ содержания метаболитов в стеблях
растений осины. Статистически значимые отличия обнаружены для 340 веществ. Наибольшие
различия отмечены для туранозы, раффинозы и мальтотриозы.
Поскольку тураноза влияет на транспорт ауксинов в корневую систему, способствуя
образованию придаточных корней, её повышенное содержание в исследуемых генотипах
(PtXIVXeg1a в 82,5 раза, PtXVXeg1c в 156,5 раза, PtXVXeg5a в 112,6 раза выше контроля),
возможно, может послужить объяснением отмеченного увеличения количества придаточных
корней. В среднем количество придаточных корней у соответствующих клонов по сравнению с
контролем увеличилось в 1,9 раз для клона PtXIVXeg1a и в 1,6 раз для клонов PtXVXeg1c и
PtXVXeg5a.
Отмечено увеличение содержания раффинозы в трансгенных клонах осины по сравнению с
контрольными в 13,1 для PtXIVXeg1a, в 29,3 раза для PtXVXeg1c и в 9,1 раза для PtXVXeg5a.
Возможно, это впоследствии скажется на увеличении выживаемости трансгенных растений,
поскольку известно, что раффиноза защищает растительные клетки от окислительного
повреждения.
Существуют данные, показывающие, что распад мальтотриозы может стимулировать
синтез амилозы, тем самым влиять на увеличение клеточной стенки. Содержание мальтотриозы
в генотипе PtXIVXeg1a было меньше в 260,1 раза, PtXVXeg1c в 242,1 раза, PtXVXeg5a в 9,8
раза). Указанные изменения коррелируют с увеличением толщины ксилемы первого года у
трансгенных растений, которая в среднем равнялась 1,69 мкм, тогда как у контрольных
растений 1,28 мкм.
Мы планируем продолжить дальнейшее изучение метаболома в указанных трансгенных
растениях.
ТЕХНОЛОГИИ ПРЕДИМПЛАНТАЦИОННОЙ ПОДГОТОВКИ АЛЛО- И
КСЕНОГЕННЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ
НЕКАЛЬЦИФИЦИРУЮЩИХСЯ БИОПРОТЕЗОВ КЛАПАНОВ СЕРДЦА И
СОСУДОВ
1,2
1,2
Фадеева И.С. , Фесенко Н.И. , Фадеев Р.С.1,2, Сачков А.С.3, Вежнина Н.О.1,
Шаталин Ю.В.1, Акатов В.С.1,2
1
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН; 2ФГБОУ ВПО
Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино;
3
ФГБУ Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН,
Москва, Россия
aurin.fad@gmail.com
Восстановление функции дегенеративно измененных клапанов сердца и сосудов,
необходимое при лечении врожденных и приобретенных пороков сердца и сосудов, является
важнейшей задачей современной сердечно-сосудистой хирургии. При этом разработка
способов предимплантационной подготовки как алло- так и ксеногенных биоматериалов,
необходимых для изготовления функциональных и долговечных заменителей клапана сердца
или сосуда является одной из важнейших задач тканевой инженерии и биотехнологии.
Известно, что большинство биоматериалов, используемых для изготовления биопротезов,
кондуитов или сосудистых заплат (модифицированные и/или обработанные кросссшивающими агентами донорские сосуды, клапаны, перикард, глиссонова капсула печени,
фасции, подслизистый слой кишечника и т.д.) при имплантации в системный кровоток
реципиента подвергаются интенсивной кальцификации, что в ранние или отдаленные сроки (в
зависимости от возраста пациента) требует проведения сложных повторных операций.
Для подавления процессов асептического кальциноза в организме реципиента на
сегодняшний
день
используют
2
основных
подхода
–
технологии
девитализации/децеллуларизации ткани до имплантации (1) и технологии вакантного
замещения аффинных к осаждению кальцификатов мест в структуре внеклеточного матрикса
биоматериала (2). Однако, несмотря на обилие предлагаемых методик, способов,
обеспечивающих полное подавление кальцификации указанных биоматериалов до сих пор нет.
48
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Нашей группой было обнаружено, что кальцификация соединительнотканных
биоматериалов осуществляется по зависимым и независимым от клеток реципиента
механизмам. Обнаружено, что инициирующую роль при развитии асептического кальциноза с
участием клеток реципиента играют липидные компоненты матрикса (преобладающий
механизм).
Обнаружено,
что
удаление
липидных
компонентов
из
матрикса
соединительнотканного имплантата с помощью липофильного детергента дезоксихолата
натрия подавляет развитие их кальцификации в организме реципиента. Обнаружено, что в
зависимости от условий обработки (pH, буферная система, t°С, ионная сила и т.д.)
использование дезоксихолата натрия может как полностью подавлять кальциноз, так и
провоцировать токсическое действие имплантированной ткани.
На основе полученных результатов разработана технология обработки биоматериалов с
помощью липофильного детергента дезоксихолата натрия, обеспечивающая не только полное
подавление кальцификации и отсутствие токсического эффекта, но и снижение
иммуногенности и повышение биосовместимости алло- и ксеноматериалов в организме
реципиента (Фадеева И.С. и соавт., патент РФ №2499611, 2013 г.). Показано, что структурные
нарушения
внеклеточного
матрикса
биоматериалов
вследствие
проведения
девитализации/децеллуларизации ткани вызывают развитие асептического кальциноза даже в
условиях полного удаления липидных компонентов матрикса (независимый от клеток
реципиента пассивный механизм кальцификации, эластокальциноз). Обнаружено, что
обработка нативных биоматериалов в соответствии с разработанной нами технологией не
вызывает повреждение структурных компонентов их внеклеточного матрикса и, следовательно,
препятствует образованию аффинных к осаждению кальцификатов центров инициации
кальциноза. Все экспериментальные результаты достоверны (p<0.05) и получены в моделях
гетеротопической (подкожной) и ортотопической (в системный кровоток) имплантации
лабораторных животных.
Работа выполнена при поддержке стипендиального гранта Президента РФ №СП6867.2013.4, гранта РФФИ №14-04-32191, а также в рамках проекта Государственного Задания
Минобрнауки РФ.
ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИВНОГО ПСИХРОТРОФНОГО ШТАММАНЕФТЕДЕСТРУКТОРА RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS ДН1
Хасенова Э.Ж., Шарипова Г.Ж., Молдагулова Н.Б.
РГП Национальный центр биотехнологии КН МОН РК, Астана, Казахстан
elmira_alta@mail.ru
Микробиологические методы являются неотъемлемым компонентом современных
способов очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Основными препятствиями
для эффективной очистки окружающей среды являются низкая температура, повышенная
концентрация соли, низкое содержание питательных веществ, отсутствие или низкая
деградативная активность природных микробных популяций. В связи с этим необходим
постоянный поиск и пополнение перспективными штаммами микроорганизмов нефтедеструкторов.
В процессе отбора психротрофных нефтеокисляющих штаммов был выделен активный
углеводороокисляющий штамм, характеризующийся высокой нефтеокисляющей активностью
при низких положительных температурных условиях для очистки нефтезагрязненных почв.
Штамм был выделен из нефтезагрязненной почвы Мангыстауской области. При изучении
культуральных признаков наблюдалось, что при росте на СПА (сухой питательный агар) при
температуре 10°С через 48-72 часа инкубации образуются колонии округлой формы, размером
1-3 мм, бежево-розового цвета, выпуклые, блестящие, поверхность гладкая, консистенция
пастообразная с ровными краями. По морфологическим признакам представляет собой
подвижные грамположительные палочки, размером 2-3 мкм с округленными концами,
расположенные одиночно и в скоплениях. Штамм не токсичен и не патогенен.
Нами были изучены физиолого-биохимические признаки культуры. Было установлено, что
культура не разжижает желатин, крахмал гидролизует слабо, обладает способностью к
49
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
выделению сероводорода, не образует индол, ацетилметилкарбонил и газы из KNO3. Каталаза
положительная, оксидаза отрицательная. Не дезаминирует фенилаланин.
Выявлено, что штамм обладает эмульгирующей способностью от 10–15% на различных
субстратах (бензин, дизельное топливо, вазелиновое, репейное, подсолнечное масла).
Нефтеокисляющую активность определяли по остаточному содержанию нефтяных
углеводородов методом гравиметрии, что составила 89%.
Согласно фенотипической и генетической идентификации по 16 S rRNA штамм был
идентифицирован как Rhodococcus erythropolis ДН1.
Также на базе Национальной научной лаборатории коллективного пользования (РГП
«Национальный центр биотехнологии») было проведено полное секвенирование штамма
Rhodococcus
erythropolis
ДН1.
Полный геном
представлен в
базе
данных
atDDBJ/EMBL/GenBank под номером № AUZK00000000.
ИЗМЕРЕНИЕ ЗАМЕДЛЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА И
КИНЕТИКИ ЕЕ ЗАТУХАНИЯ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА РАСТЕНИЯ
СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ
1,2
Худякова А.Ю. , Сивашева Т.Н.2, Креславский В.Д.3, Ланкин А.В.4
1
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт; 2ФГБУН
Институт биологического приборостроения РАН; 3ФГБУН Институт фундаментальных
проблем биологии РАН, Пущино; 4ФГБУН Институт физиологии растений им.
К.А.Тимирязева РАН, Москва, Россия
s_t_i_m_a_@mail.ru
Измерение замедленной флуоресценции (ЗФл) хлорофилла а и анализ ее параметров
представляют собой неинвазивный и эффективный инструмент изучения воздействия на
фотосинтетический аппарат (ФА) растений стрессовых факторов различной природы.
При измерении индукционных кривых ЗФл наблюдаются несколько различных компонент,
различающихся по времени, быстрая компонента отражает изменения редокс-потенциала
акцепторной стороны фотосистемы 2 (ФС2), а медленная - фотоиндуцированное увеличение
электрохимического градиента протонов на тилакоидных мембранах.
Кинетики затухания ЗФл позволяют получить первичные оценки функционального
состояния различных компонент ФС2, которые изменяются в результате действия стрессовых
факторов на ФА. Начальная интенсивность и количество компонент кривых затухания
определяются скоростями процессов рекомбинации разделенных зарядов в реакционном
центре ФС2 и переноса электронов, например, между Z+ и QA-, Z+ и QB- и т.д.
С
целью
обеспечения
режима
измерения
кинетики
затухания
ЗФл
в
компьютеризированную установку были включены следующие аппаратно-программные
средства:
- светодиодный источник освещения исследуемых объектов;
- драйвер для управления светодиодом;
- программные модули, обеспечивающие обработку данных и соответствующие режимы
работы установки.
Результаты экспериментов, проведенных на модернизированной установке, показали, что
введение светодиодного источника привело к более четкому выявлению трех различных
компонент на индукционных кривых ЗФл - двух быстрых и одной (двух) медленной фаз ЗФл.
При исследовании влияния нафталина, одного из распространенных полициклических
ароматических углеводородов, на активность ФА обнаружено, что нафталин повреждает,
прежде всего, акцепторную сторону ФС2, по-видимому, через увеличение относительной доли
фотохимически неактивных QB - невосстанавливающих реакционных центров ФС2.
При сравнении кинетик затухания ЗФл, в физиологических условиях и после воздействия
теплового стресса (43° С, 20 мин), было показано практически полное исчезновение более
медленных компонент кинетик ЗФл (сотни миллисекунд) под действием стресса.
Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-31812 мол_а.
50
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ТОКСИЧНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГЛУТАРОВОГО АЛЬДЕГИДА НА
ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
GLUCONOBACTER OXYDANS
Чарыева С., Каманин С.С.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия
ms.sulgun@mail.ru
Благодаря уникальной организации метаболической системы бактерии Gluconobacter
oxydans широко используются в биотехнологии. Перспективным является применение
бактерий G. oxydans в качестве основы медиаторных биосенсоров для определения содержания
легкоутилизируемых углеводов и спиртов. Целью данной работы было изучение влияния
глутарового альдегида (ГА) на субстратную специфичность бактерий G. oxydans.
G. oxydans способны окислять глюкозу и этанол. ГА оказывает токсическое действие на
бактериальные клетки, что особенно сильно сказывается на способности клеток окислять
этанол. Для того, чтобы оценить влияние ГА на каталитическую активность бактерий по
отношению к более широкому спектру субстратов, сформировали печатные электроды на
основе бактерий, не подвергавшихся действию ГА и бактерий, выдержанных в растворе ГА в
течение 60 мин. Определена субстратная специфичность бактерий, не подвергавшихся
действию ГА и выдержанных в растворе ГА. В результате действия глутарового альдегида
происходит падение ответов биосенсора на этанол и изобутанол по отношению к глюкозе. В то
же время наблюдается повышение относительного ответа на галактозу.
Получены градуировочные зависимости ответа сенсора от концентрации глюкозы и
этанола для модифицированных печатных электродов на основе неингибированных и
ингибированных ГА клеток G. oxydans. В результате действия глутарового альдегида при
использовании этанола в качестве субстрата снижается максимальная скорость реакции,
эффективная константа Михаэлиса остается постоянной, а при использовании глюкозы после
выдерживания в растворе глутарового альдегида снижается эффективная константа Михаэлиса,
а максимальная скорость остается постоянной.
Для определения токсичности ГА по отношению к клеткам определяли количество
жизнеспособных клеток G. oxydans до прибавления раствора ГА и после выдерживания их в
растворе ГА в течение 60 минут. Определение проводили по методу Коха. Показано, что даже
после выдерживания бактерий в растворе ГА в течение 60 минут в биомассе количество клеток,
способных к воспроизводству, составляет 47% от первоначального содержания.
В результате выполнения работы было доказано, что при добавлении ГА к суспензии
клеток G. oxydans наблюдается неодинаковое снижение окислительной активности бактерий по
отношению к различным субстратам.
Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной
поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук, заявка № МК-330.2014.4.
БИОАКТИВНОСТЬ МАТРИКСОВ ИЗ ПРИРОДНЫХ ПОЛИЭФИРОВ ДЛЯ
ИНЖЕНЕРИИ КОСТНОЙ ТКАНИ
Чернобровкина Д.А.
ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет, Красноярск, Россия
namtuda@ya.ru
Перспективной стратегией восстановления костной ткани при достижении критического
размера дефекта является трансплантация клеток в составе тканеинженерных конструкций.
Полигидроксиалканоаты (ПГА) - биосовместимые и биодеградируемые полиэфиры
микробиологического происхождения – могут найти широкое применение в реконструкции
костной ткани.
Биологическая активность матриксов – способность осаждать гидроксиапатит на
поверхности – является ключевым фактором остеоинтеграции. Её оценивали in vitro в ходе
экспонирования в растворе, имитирующем солевой состав межтканевой жидкости (SBF).
Анализ образованного покрытия проводили с использованием метода энергодисперсионной
спектрометрии. Топографию поверхности исследовали с применением растровой электронной
51
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
микроскопии. Для исследований было получено семейство полимерных и композитных
матриксов из гомополимера 3-гидроксимасляной кислоты, двухкомпонентного сополимера 3гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата и гидроксиапатита (ГАП).
Результаты электронной микроскопии показали редкие точечные отложения фосфатов
кальция на матриксах: плёнки из гомополимера и сополимера, ультратонкие волокна. На
отдельных участках происходило осаждение фосфатов кальция на объёмных матриксах.
Сплошное покрытие на поверхности полимера было образовано на двух типах матриксов:
ориентированное ультратонкое волокно с включением ГАП 230 мг/г и 375 мг/г. Через 14 дней
инкубации волокна с меньшим включением ГАП были покрыты фосфатами с небольшими
промежутками, волокна с большим включением были покрыты сплошным слоем. Волокнистая
структура матрикса прослеживалась отчётливо. Через 28 суток волокна с включением ГАП 375
мг/г были покрыты толстым минеральным слоем, закрывшим большинство пор и не
позволявшим различать структуру волокон.
Проанализирован элементный состав образованного покрытия. В нём присутствовали
кальций, фосфор и магний, что соответствует составу неорганической части костной ткани,
которая состоит из кристаллов гидроксиапатита Ca10(PO4)6(OH)2 и округлых гранул аморфного
фосфата кальция и может содержать соли Mg2+, K+, Na+. Соотношение кальция и фосфора во
всех случаях было близко к 2,4:1.
Таким образом, включение частиц гидроксиапатита в структуру матриксов позволило
значительно повысить их биологическую активность благодаря появлению центров
кристаллизации на гладкой и гидрофобной полимерной поверхности. Полученные матриксы
были близки к структуре нативной костной ткани, где кристаллы основного минерала ткани
формируются на коллагеновых волокнах. Можно прогнозировать высокую остеоинтеграцию
данных композитных материалов in vivo.
ПРЕПАРАТ АНТОЙЛ ДЛЯ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД
ОТ ЖИРОВЫХ ВЕЩЕСТВ
Чирикова М.С., Шакун Т.П., Самсонова А.С.
ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
margarita.chirikova@mail.ru
Проблема очистки хозяйственно-бытовых и промышленных сточных вод сохраняет свою
актуальность. В Республике Беларусь общий объем стоков, содержащих жировые вещества,
достигает 10-12 млн. тонн в год. Нерегулируемый сброс таких неочищенных сточных вод
вызывает сложности в работе биологических очистных сооружений, ведущих очистку с
помощью активного ила. Для решения этой проблемы в последнее время все активнее
используются биоремедиационные методы очистки, основанные на использовании
микроорганизмов-деструкторов жировых веществ.
Целью данной работы явилось исследование влияния микробного препарата на очистку
сточных вод от жировых веществ.
В работе использован препарат Антойл, технология производства которого разработана в
ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси». Препарат составляют активные штаммы
микроорганизмов-деструкторов жировых веществ: Rhodococcus sp. Р1-3ФН, Rhodococcus ruber
2B, Bacillus subtilis 6/2-АПФ1, Pseudomonas putida 10АП. Микробный препарат предназначен
для интенсификации очистки сточных вод от жировых веществ. Изучение деструкции
молочного и свиного жиров проводили в колбах Эрленмейера объемом 0,5 л, содержащих 100
мл минеральной среды Е8 и источник питания в количестве 1000 мг/л. Производственные
испытания проводили на очистных сооружениях ОАО «Копыльский маслосырзавод» и
биологических очистных сооружениях КУП «Копыльское ЖКХ». Норма расхода препарата
составляла 0,5 л на 1 м3 очищаемого стока. Периодичность внесения – 2-х кратная с интервалом
2 недели.
Установлено, что культуры Rhodococcus sp. Р1-3ФН, Rhodococcus ruber 2B, Bacillus subtilis
6/2-АПФ1, Pseudomonas putida 10АП осуществляют деструкцию свиного жира за 7 суток на
90,2%, 84,3%, 92,55%, 91,9% соответственно. Молочный жир они разрушают за 7 суток на
89,0%, 85,6%, 92,9%, 85,9% соответственно.
52
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
При внесении микробного препарата в сточные воды маслосырзавода наблюдается
снижение уровня загрязнения по ХПК на 50,2% через восемь часов под влиянием микробного
препарата. Содержание жировых веществ в очищаемом стоке снизилось на 90,4%.
Испытание микробного препарата на биологических очистных сооружениях УП
«Копыльское ЖКХ», принимающих стоки маслосырзавода, показало, что при внесении
препарата эффективность очистки сточных вод по ХПК составила 87,6%. Исходное содержание
жировых веществ (48,8 мг/л) в сточной воде в результате обработки препаратом было снижено
до следовых количеств. Эффективность очистки стока от жировых веществ составила 99,9%.
ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ РОСТА НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ
РОДА RHODOCOCCUS
Шарипова Г.Ж., Аюпова А.Ж., Молдагулова Н.Б.
РГП Национальный центр биотехнологии КН МОН РК, Астана, Казахстан
solnce30-04@mail.ru
Уникальная способность бактерий рода Rhodococcus утилизировать различные вещества,
обусловленная в основном наличием плазмид, несущих гены, которые кодируют ферменты
способные разлагать большой спектр ксенобиотиков и природных органических соединений
вызывает огромный интерес со стороны ученых. Бактерии рода Rhodococcus отличаются не
только высокой метаболической активностью, но и медленной реакцией на меняющиеся
условия окружающей среды. Это дает им возможность легко приспосабливаться и выживать в
неблагоприятных условиях среды. На сегодняшний день известны десятки биопрепаратов, для
очистки нефтезагрязненных территорий, в основу которых входят бактерии рода Rhodococcus.
Знание кинетических особенностей роста культур бактерий, входящих в состав препаратов,
позволит решить задачу по оптимизации технологических режимов наработки биопрепаратов.
Целью работы явилось изучение количественных закономерностей роста перспективных
штаммов-нефтедеструкторов в реальных условиях культивирования.
Объектами изучения являлись штаммы нефтеокисляющих бактерий Rhodococcus
erythropolis B12 и Rhodococcus sp. B13, выделенных из нефтезагрязненных почв Западного
Казахстана. Для изучения динамики накопления биомассы, бактерии культивировали 72 часа
на качалках при 150 об/мин. и температуре 25°С. Культуры вносили с концентрацией клеток
109 КОЕ/мл в 100 мл питательной среды. Отбор проб для определения численности
бактериальных клеток осуществляли через каждые шесть часов от начала культивирования.
Полученные результаты показали, что лаг-фаза началась после посева и продолжалась до
12 часов у обеих исследуемых культур. Титр клеток составил 107 КОЕ/мл. Эта фаза
характеризуется высокой скоростью биосинтеза ферментов и активного транспорта.
Экспоненциальная фаза была отмечена от 12 до 36 часов у В12 и В13. Титр клеток составлял
108 КОЕ/мл. Наступление стационарной фазы происходило с 36 часов до 62 часов у
исследуемых штаммов. Максимальная концентрация клеток наблюдалась на 62 час с титром
109 КОЕ/мл. Эта фаза характеризуется равновесием между клеточным ростом, делением и
процессом отмирания клеток.
Далее наступала фаза отмирания, характеризующаяся уменьшением численности
популяции клеток.
Анализ кинетического роста исследуемых объектов позволяет сделать вывод о том, что
оптимальными сроками культивирования штаммов являются 48-62 часа. Именно в этот период
времени компоненты питательной среды активно потреблялись бактериями или практически
полностью утилизировались к 72 часам, что подтвердил титр исследуемых штаммов
Rhodococcus еrythropolis B12 и Rhodococcus sp. B13.
53
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ВЗАИМОВЛИЯНИЕ ФЕРМЕНТНОГО ВОДОРОДНОГО ЭЛЕКТРОДА И
ВОДОРОДВЫДЕЛЯЮЩЕГО МИКРОБНОГО КОНСОРЦИУМА ПРИ
ПРОТОЧНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
Шастик Е.С., Зорин Н.А., Цыганков А.А.
ФГБУН Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Россия
shastikevgeny@gmail.com
К наиболее важным проблемам, стоящим перед современным миром, можно отнести
дефицит энергоносителей и утилизацию техногенных отходов, загрязняющих окружающую
среду. Эти проблемы являются взаимосвязанными, так как большая часть энергетики
использует традиционные источники энергии: нефть, газ, каменный уголь. Очистка
органических отходов, в свою очередь, требует больших затрат электроэнергии, хотя окисление
этих же отходов могло бы давать энергию. Таким образом, использование отходов как
вторичных ресурсов для получения энергии - перспективный путь решения указанных проблем
энергосбережения и утилизации отходов. Особенно интересен биосинтез водорода из
крахмалсодержащих сточных вод с одновременным его окислением в топливной ячейке для
генерации электричества, как один из путей получения возобновляемой энергии из вторичных
ресурсов.
Целью данной работы является изучение влияния гидрогеназного электрода (ГЭ),
совмещенного с микробным клостридиальным крахмалразлагающим консорциумом на его
метаболизм при проточном культивировании.
Было показано, что при длительном непрерывном культивировании в биореакторах
микробного консорциума с ГЭ и без ГЭ происходило изменение выхода продуктов брожения
(орг. кислот). В биореакторе без ГЭ наблюдалось увеличение образования лактата,
прекращение выделения водорода и снижение концентрации ацетата и бутирата. Это
свидетельствует об изменении видового состава консорциума и преобладании молочнокислого
брожения. В биореакторе, оснащенном ГЭ, также наблюдалось изменение спектра продуктов
брожения. Однако смещение спектра продуктов происходило в сторону образования ацетата,
бутирата и изобутирата, без существенного изменения количества выделенного Н2. Имеющиеся
данные не позволяют сделать однозначный вывод о причинах такого смещения. Возможно, это
связано с пониженным содержанием водорода вследствие его поглощения ГЭ. Не исключено,
что в приэлектродном пространстве развивались синтрофные бактерии, способные к
образованию ацетата и водорода из С 3-4 органических кислот. Хотя концентрация ацетата к
концу эксперимента возрастала, не было обнаружено значительного увеличения выделяемого
Н2, поэтому необходимы дальнейшие специальные исследования для выяснения этого вопроса.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОМАГНИТНОЙ СЕПАРАЦИИ ПРИ
ОПРЕДЕЛЕНИИ LISTERIA MONOCYTOGENES
Шевяков А.Г., Ветчинин С.С., Полосенко О.В., Бикетов С.Ф.
ФГБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и
биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека, Оболенск, Россия
senior.anton.sh@gmail.com
Присутствие патогенной для человека бактерии L. monocytogenes в продуктах питания
представляет большую опасность для некоторых групп населения. К ним относятся пожилые
люди, беременные женщины, новорожденные, люди с ослабленным иммунитетом (в том числе
ВИЧ-инфицированные). Для выявления L. monocytogenes можно использовать широкий набор
методов (PCR, MALDI-TOF, ДНК-типирование и др.), однако большинство из них являются
сложными, дорогостоящими и требующими временных затрат и высококвалифицированного
персонала. В связи с этим актуальной является проблема разработки быстрых, простых в
применении, недорогих методов, которые бы обеспечивали приемлемую чувствительность.
В качестве такого метода мы использовали иммуно-ферментный анализ (ИФА), в котором
твердой фазой является поверхность магнитной частицы (МЧ). В работе были использованы
МЧ, функционализированные карбоксильными или цианомочевинными группами, а также с
54
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
ковалентно фиксированными белок G или кроличьими (анти-IgG мыши) антителами. На все
типы МЧ сорбировали моноклональные антитела (МкАт) к антигену L. monocytogenes —
ассоциированному с инвазией белку p60 (кодируется геном iap). Использованные антитела
обладают высокой афинностью и специфичностью к антигену и позволяют достоверно
определять L. monocytogenes без перекрестных реакций с другими представителями рода
Listeria.
С помощью полученных МЧ определяли антиген p60 в среде ПБЛ после 24 часового
культивирования чистой культуры различных представителей рода Listeria. Для этого к 100 мкл
образца среды культивирования каждого вида добавляли по 25 мкл МЧ с концентрацией частиц
1 мг/мл. Инкубировали при постоянном перемешивании 1 час при 37°С. При этом экзогенно
продуцируемый только клетками L. monocytogenes белковый антиген p60 связывался с МкАт и
выделялся из среды при магнитной сепарации. После МЧ помещали в планшет для ИФА и
проводили анализ с использованием кроличьих поликлональных IgG к антигену p60 и козьего
анти-IgG кролика конъюгата с пероксидазой.
Чувствительность такого определения белка p60 составила 150 пг/мл в среде
культивирования L. monocytogenes. Данный метод сепарации обладает высокой
специфичностью и позволяет уменьшить время анализа на 2 часа по сравнению с
традиционным методом «сэндвич»-ИФА, без учета времени сенсибилизации планшета МкАт.
Кроме того, было показано, что использование МЧ покрытых белком G или кроличьими
анти-мышиными антителами обеспечивают максимальную возможность связывания антигена.
Возможно, это связано с оптимальной ориентацией сорбированных антител на поверхности
МЧ.
ВЛИЯНИЕ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОЙ КОНСТРУКЦИИ СОДЕРЖАЩЕЙ
ИНВЕРТИРОВАННЫЕ ПОВТОРЫ ГЕНА 4-КУМАРАТ-КОЭНЗИМ А-ЛИГАЗЫ
НА ВЫСОТУ И СОСТАВ ДРЕВЕСИНЫ РАСТЕНИЙ ОСИНЫ
Шестибратов К.А., Ковалицкая Ю.А., Даянова Л.К.
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН; ФГБОУ ВПО Пущинский государственный
естественно-научный институт, Пущино, Россия
l.daianowa@yandex.ru
Процесс формирования клеточной стенки растений до настоящего времени остается
актуальным исследованием, поскольку знание основ его регуляции даёт возможность
управления им с помощью методов генной инженерии. 4-кумарат-коэнзим а-лигаза - один из
ферментов, участвующих в биосинтезе монолигнолов, которые впоследствии полимеризуются
до лигнина. Согласно данным зарубежных коллег изменение активности этого фермента поразному может влиять на высоту и состав древесины трансгенных растений. Целью нашей
работы было изучить влияние экспрессии рнк-интерференционной конструкции содержащей
инвертированные повторы гена 4-кумарат-коэнзим А-лигазы на высоту и состав древесины
растений.
В группе лесной биотехнологии были получены клоны осины, экспрессирующие РНКинтерференционную конструкцию, содержащую инвертированные повторы гена 4-кумараткоэнзим А-лигазы (4CL). Предложенный подход был использован впервые. Для 14 генотипов
подтвержден трансгенный статус и отсутствие агробактериальной контаминации с помощью
ПЦР-нализа тотальной ДНК растений. Методом ОТ-ПЦР в этих растениях отмечено снижение
экспрессии ключевого фермента биосинтеза лигнинов – 4CL. Полученные растения были
адаптированы к условиям защищенного грунта и использованы для биометрических
исследований и анализа химического состава древесины.
В ходе изучения химического состава древесины для генотипов PtXIII4CL2c и PtXIII4CL4а
выявлено наименьшее содержание лигнинов на 23% и на 11% соответственно и одновременно
самые высокие значения показателя целлюлоза/лигнин. В остальных клонах снижение
содержания лигнина было незначительным.
Изучение биометрических показателей трансгенных растений в возрасте 5 месяцев,
адаптированных к условиям защищенного грунта показало, что растения генотипов
55
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
PtXIII4CL2c, PtXIII4CL3а и PtXIII4CL4а на 10-30% ниже контрольных значений. Показатели
длин средних жилок и черешка не снижены по сравнению с контролем. Анализ эффективности
укоренения исследуемых растений продемонстрировал замедление элонгации корней in vitro,
что приводило к ухудшению укоренения трансгенных растений. Исследование эффективности
укоренения ex vitro не показало значимых отличий по отношению к контролю.
Таким образом, экспрессия РНК- интерференционной конструкции 4CL приводит к
снижению содержания лигнинов, изменению количества целлюлозы и пентозанов, изменению
высоты растений и замедлению элонгации корней in vitro.
ИЗУЧЕНИЕ АГРЕГАТИВНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЛАТЕКСОВ ПОЛИСТИРОЛА
С АММИНИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТЬЮ МЕТОДОМ ФОТОМЕТРИИ
Шпилина И.Д.1, Терещенко М.С.1, Широкова И.Ю.1, Беляев А.П.1, Кучук В.И.1,
Шевченко Н.Н.2
1
ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая
академия Министерства здравоохранения РФ, 2ФГБУН Институт высокомолекулярных
соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия
irina.shirokova@pharminnotech.com
Вопросы агрегативной устойчивости коллоидных систем имеют большое значение в
различных областях технологии, в том числе, биотехнологии. Так поиски новых носителей
биолигандов для проведения иммунного анализа, привели к необходимости исследования
устойчивости монодисперсных латексов полистирола с амминированной поверхностью. В
большой мере устойчивость определяет фактор электростатического отталкивания, который
обусловлен наличием двойного электрического слоя (ДЭС) с развитой диффузной частью. В
случае, когда дисперсная фаза представлена, а степень диссоциации зависит от состава
дисперсионной среды, что влияет на структуру ДЭС. Согласно современным представлениям
размер частиц так же может существенно влиять на энергию парного взаимодействия, таким
образом, изменение состояния среды и размер частиц дисперсной фазы следует учитывать при
оценке устойчивость системы.
Целью данной работы является исследование агрегативной устойчивости положительно
заряженных латексов полистирола методом фотометрии в зависимости от состава
дисперсионной среды.
В качестве объектов были выбраны монодисперсные (отклонение от среднего не
превышало 5%) гидрофобные полимерные сферическими частицы с диаметром 0,19 мкм. Заряд
микросфер связан с поверхностными амминогруппами. Изучение системы проводилось в
присутствии индифферентного электролита (NaCl) с концентрацией 0,001 моль/л, 0,01 моль/л,
0,15 моль/л в диапазоне pH (3-6).
Использование метода фотометрии для исследования кинетики коагуляции дисперсных
систем основано на законе Бугера-Ламберта-Бера, согласно которому оптическая плотность
системы зависит от концентрации частиц дисперсной фазы. По изменению оптической
плотности из уравнения Рэлея найдены размер и концентрацию агрегатов в данный момент
времени. Исходя из полученных данных, можно сделать выводы об условия устойчивости
выбранной коллоидной системы. Кроме того, было установлено, что метод применим в
диапазоне диаметров от 0.19 до 0.62 мкм, что позволило исследовать системы, в которых
агрегаты достигают данного размера.
Было показано, что при добавлении индифферентного электролита дисперсная система
теряет устойчивость, число частиц уменьшается в несколько раз, аналогичное поведение
наблюдается при увеличении рН системы от 3 до 6.
Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ № 13-03-00741 и Гранта СП-968.2012.5.
56
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
К ВОПРОСУ БИОСИНТЕЗА МОНОТЕРПЕНОВЫХ И АРОМАТИЧЕСКИХ
СПИРТОВ МИКРОМИЦЕТОМ EREMOTHECIUM
Шпичка А.И., Семенова Е.Ф.
ФГБОУ ВПО Пензенский государственный университет, Пенза, Россия
ana-shpichka@yandex.ru
Эфирные масла представляют собой смесь душистых летучих соединений различного
химического строения. В частности гераниол, цитронеллол, нерол, β-фенилэтанол и др.,
относящиеся к монотерпеновым и ароматическим спиртам, являются главными компонентами
розового масла, которое чрезвычайно востребовано на мировом рынке и не имеет
альтернативных источников получения с применением биотехнологических подходов.
В результате проведенного анализа 11 штаммов видов Eremothecium аshbyi Guilliermond
1935 и Eremothecium gossypii Kurtzman 1995, было показано, что указанные микроорганизмы
способны синтезировать ароматические продукты, близкие по компонентному составу маслу из
лепестков розы, причем соотношение этих веществ может варьировать под действием
различных внутренних и внешних факторов. Так зависимость биосинтетической активности от
компонентов питательных сред неодинакова у изучаемых видов: уровень накопления
ароматообразующих соединений для E. аshbyi достигал на соево-сахарозной 202,3-280,0 мг/л,
для E. gossypii– глюкозо-пептонной 209,5-247,5 мг/л. Ферментативная активность E. gossypii в
отношении метаболизма фенилаланина и глюкозы с образованием фенилпирувата –
предшественников ФЭС (Watanabe S. et al., 2002) – значительно выше, чем E. аshbyi
Guilliermond 1935. E. аshbyi синтезирует смесь летучих душистых веществ с преобладающим
содержанием ценных терпеновых спиртов (гераниола, нерола, цитронеллола, линалоола,
фарнезола). Максимум накопления компонента – гераниола – наступал в период между 36 и 48
часами культивирования и составил 32,1±0,3 мг/г сухой биомассы.
На основе проведенного контент-анализа литературных данных и исследования летучих
душистых веществ, синтезируемых представителями рода Eremothecium, нами предложена
гипотетическая метаболическая модель путей биосинтеза основных ароматообразующих
соединений в сравнении с розой эфирномасличной.
МОДЕЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИЙ-ДЕСТРУКТОРОВ ГЛИФОСАТА В
ЗАГРЯЗНЕННЫХ СРЕДАХ
Эпиктетов Д.О.1,2, Свиридов А.В.1, Леонтьевский А.А.1,2
1
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К.Скрябина РАН;
2
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт,
Пущино, Россия
hunter_dimok@mail.ru
Одним из важнейших аспектов современного сельского хозяйства является широкое
применение гербицидов, среди которых наиболее распространены препараты на основе Nфосфонометилглицина или глифосата (ГФ). ГФ способен накапливаться в почвах, приводя к
снижению урожайности, а также перемещаться с поверхностными стоками и попадать в
водоемы. Кроме того ГФ оказывает токсическое и тератогенное действие как на
беспозвоночных, так и на позвоночных.
Ранее в нашей лаборатории из почв, загрязненных органофосфонатами, было выделено 40
бактериальных штаммов, способных расщеплять простейшее соединение среди фосфонатов –
метилфосфоновую кислоту. Штамм Ochrobactrum anthropi GPK3 проявил себя как лучший
деструктор ГФ в жидких средах по сравнению с известными из литературы аналогами и
обладал ранее не описанным путем метаболизма ГФ, обеспечивавшим полную утилизацию
гербицида внутри бактериальной клетки. В цитоплазме штамма GPK3 мы обнаружили
глиоксилат и аминометилфосфоновую кислоту (АМФК), которые являются продуктами
фермента глифосат-оксидоредуктазы, впервые изученного в нашей лаборатории. В ростовых
условиях АМФК метаболизировалась с разрывом С-Р связи, за счет чего клетки снабжали себя
ортофосфатом.
57
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОТЕХНОЛОГИЯ»
В ходе дальнейшей работы был выделен и изучен штамм Achromobacter sp. Kg16,
обеспечивавший более эффективную деструкцию ГФ в условиях почв по сравнению с O.
anthropi GPK3. Данный феномен оказался связан с ранее не описанной в литературе
способностью Achromobacter sp. Kg16 декарбоксилировать ГФ, быстро превращая его в
физиологически нейтральную N-метилАМФК. Achromobacter sp. Kg16 не мог использовать
данное соединение в качестве источника фосфора, чем объясняются его худшие ростовые
характеристики в жидких минимальных средах по сравнению с почвами. Однако N-метил
АМФК мог метаболизироваться большинством из имеющихся в нашей коллекции
деструкторов фосфонатов, в том числе O. anthropi GPK3 с образованием ортофосфата (Pi).
Таким образом, обнаруженные нами различия в поведении штаммов-деструкторов
глифосата позволили нам предложить схему их взаимодействия в микробном сообществе в
загрязненной глифосатом почве. Активные штаммы (O. anthropi GPK3 и ряд других) в таком
консорциуме может осуществлять деструкцию глифосата посредством глифосатоксидоредуктазы, а продукты деструкции – АМФК и ортофосфат, могут поддерживать рост
Achromobacter sp. Kg16. В свою очередь, функция Kg16 может заключаться в быстром
превращении глифосата в нетоксичную для бактерий форму, доступную для расщепления
большинством деструкторов ГФ, что, в свою очередь, косвенно снабжает Kg16 ортофосфатом.
58
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
СЕКЦИЯ «Биофармацевтика»
A NEW HIGHLY SELECTIVE FACTOR XIIA INHIBITOR BASED ON INFESTIN-4
Kolyadko V.N.1, Vuimo T.A.2, Surov S.S.2, Ovsepyan R.A.2, Korneeva V.A.1,
Minakhin l.3, Kuznedelov K.3, Severinov K.3, Vorobiev I.I.4, Orlova N.A.4,
Ataullakhanov F.I.1,2,5, Panteleev M.A.1,2,5
1
Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology RAS; 2Federal Research
and Clinical Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia;
3
Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, The State University of NJ, New Jersey, USA;
4
Centre «Bioengineering» RAS; 5HemaCore LLC, Moscow, Russia
vladimir-kolyadko@yandex.ru
Background: Inhibition of activated coagulation factor XIIa (FXIIa) is important both for antithrombotic therapy and global coagulation assays. Promising inhibitors include infestin-4 (Ki of 0.1
nM to FXIIa), corn trypsin inhibitor (CTI; Ki 1 nM), and trypsin inhibitors from Luffa cylindrica
(LCTI-III; Ki 15 nM) and Cucurbita maxima (CMTI-III; Ki 25 nM), which are insufficiently selective
against other coagulation proteases (Ki in range between 1 – 30 µM) that alter the dynamics of
thrombin generation and fibrin formation.
Objective: To develop a more-selective FXIIa inhibitor exhibiting minimal FXII-independent
activity.
Methods: Recombinant infestin-4 and variants of infestin-4 mutated at the P2, P1’, and P2’
positions of the reactive site (PDB: 2ERW); CMTI-III; corn-extracted CTI; and synthesized LCTI-III
were characterized by aPTT elongation and Ki values which were determined with chromogenic
assays. Selectivity was estimated in FXII-depleted plasma by examining spatial clot formation
initiated by surface-immobilized tissue factor (TF) in the thrombodynamics assay.
Results: One infestin-4 mutant, Inf4-MutB (P2-P4’ sequence TRNFVA), efficiently inhibited
FXIIa (Ki of 0.9 nM) and did not alter the dynamics of TF-triggered coagulation in FXII-depleted
plasma, despite its minor non-specific activity (Ki of 0.9 µM for thrombin). Moreover, 20 µM Inf4MutB increased aPTT 3-fold, blocked contact-activated clotting in the thrombodynamics assay, and
prolonged the whole blood clotting time. Other infestin-4 mutants inhibited FXIIa 5-10-fold less
efficiently and inhibited factor IXa when fused with thioredoxin (Ki ≤1 µM). CTI, LCTI-III, and
CMTI-III were less effective (Ki in range between 0.5 – 30 nM to FXIIa) and inhibited factors XIa
and Xa (Ki between 1 – 30 µM). Moreover, these inhibitors downregulated TF-triggered coagulation
in FXII-depleted plasma.
Conclusion: Inf4-MutB, a selective FXIIa inhibitor, may be used in vitro in the global coagulation
assays with TF-initiation and for blood anticoagulation ex vivo.
PROTEIN ENCAPSULATION VIA CACO3 MICROSPHERES
Lopez de Guerenu А.V.
Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
alopes1@mail.ru
Nowadays the number of therapeutic proteins used in clinical practice is constantly increasing.
Thus, formulation of proteins into particulate form is gaining considerable attention. A perspective
strategy of obtaining stable micrometer-sized protein particles with certain parameters such as size and
shape is the entrapment of macromolecules into organic or inorganic matrices. One of the least studied
inorganic templates are porous vaterite microspheres. Their main advantages include defined shape,
size and internal structure, high surface area, biodecomposability and low price. Proteins can be
included into CaCO3 microspheres by either physical adsorption or by co-precipitation it the process
of formation of the microspheres. After the entrapment of protein they can be easily dissolved at mild
conditions to form pure protein microbeads or covered with polyelectrolytes using Layer-by-Layer
technique to obtain protein-containing capsules.
59
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
The aim of this study is to investigate the process of physical adsorption of four model proteins
with different physicо-chemical properties (insulin, aprotinin, protamine and catalase) on vaterite
microspheres.
Vaterite microspheres with a diameter of 3-5 µm were obtained as described in [1]. The
adsorption process was studied at pH from 8 to 10, the concentration of microspheres varied from 5 to
80 µg µL-1 and the concentration of proteins varied from 0,05 to 2,0 µg µL-1.
As a result, the effect of pH on the adsorption of proteins on CaCO3 microspheres was
determined; the concentration of proteins and CaCO3 microspheres and the incubation time were
optimized. Adsorption isotherms for 4 proteins were studied; adsorption equilibrium constants were
determined and analyzed. The effect of protein concentration on the efficiency of protein incorporating
during the co-precepitation was studied.
Polyelectrolyte capsules (dextrane-sulfate and protamine were used as anionic and cationic
polyelectrolytes, respectively) were obtained on protein-containing CaCO3 matrices using the Layerby-Layer technique.
The obtained results show that protein entrapment in CaCO3 microspheres is a perspective
approach for obtaining protein-containing polyelectrolyte microcapsules, and can further be used for
drug development.
[1] Volodkin D.V., Larionova N.I., Sukhorukov G.B. Protein encapsulation via porous CaCO3
microparticles templating // Biomacromolecules 2004, № 5, p. 1962-1972.
THE HTRA PROTEASE FROM B.SUBTILIS 168 AS POTENTIAL VULNERARY
Sharafutdinov I.S., Nureeva A.A., Kayumov A.R.
Kazan (Volga region) federal university, Kazan, Russia
irwad@yandex.ru
HtrA proteases are widely distributed in all organisms from bacteria to human, and are required
for folding and degradation of aberrant proteins as well as for processing and maturation of native
proteins. HtrA proteinase has a weaker activity in compare with trypsin which is preferably used in
medical practice. One of the side effects of trypsin is its toxicity related to high level of proteolytic
activity for both native and damaged proteins. The advantage of replacement of trypsin by HtrA could
be the selectivity of its proteolytic activity for damaged proteins.
The gene of htrA with strep-tag on the C-terminus was amplified by PCR from genomic DNA of
B.subtilis 168 using appropriate primers and cloned into pDG148 expression shuttle-vector under
control of SPAC promoter and lac-operator. The recombinant plasmid was transformed into E. coli
XL-10. The direction and sequence of the htrA gene was checked by PCR with appropriate primers
and sequencing. The plasmid pDG148-HtrA was transformed into E. coli BL-21 and overproduction
of HtrA was performed. Protein overproduction was induced by 0,5 mM isopropylthiogalactoside
(IPTG) using cell culture with OD590=0,7. After four hours after induction the cells were harvested
and lysed by sonication in the StrepWash buffer (150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 100 мМ трис-НCl, pH
8.0). Crude cell lysate was mixed with Strep-Tactin and loaded into 2-ml column. HtrA-ST was eluted
by desthiobiotin containing buffer (150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 2.5 мМ desthiobiotin, 100 мМ трисНCl, pH 8.0). The protein purification quality was checked by the SDS-PAGE.
Physicochemical properties of HtrA were studied using hydrolysis of chromogenic substrate
azocasein by HtrA protease under different temperature and pH. The reaction mixture (600 µl) that
contained the purified enzyme and 1% azocasein in 50 mM Tris HCl / phosphate buffer was incubated
for 2 hours under different conditions. Then non-hydrolyzed azocasein was precipitated by 5%
trichloracetic acid. Remaining hydrolysed azocasein was neutralized by 4N NaOH and the absorbance
at 410 nm was measured. Maximal activity was observed at 32°C and pH 7,0 (Tris HCl – buffer
conditions).
Acquired data of HtrA activity are lower in compare with trypsin that is widely used nowadays as
vulnerary medication. Taking into account that pH of obtained proteinase is close to pH of skin and
blood of human it is possible to expect minimal changes of its properties in therapeutic use.
This research was supported by RFBR grant 14-04-31635.
60
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
ОБ АДАПТОГЕННЫХ СВОЙСТВАХ ЭКСТРАКТОВ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ
ТЕРМОФИЛЬНЫХ ГИДРОБИОНТОВ
Акшинцев А.А.
ФГБУН Институт водных проблем РАН, Москва, Россия
okaikado@mail.ru
Экстремофильные организмы (обитающие при повышенных или пониженных
температурах, крайних значениях рН и пр.) являются перспективным источником сырья для
получения новых биологически активных веществ (БАВ), представляющих интерес для
медицины, фармакологии и других разделов науки и практики, связанных с регуляцией
состояния живых организмов. В данной работе "стартовыми" объектами для скрининга новых
БАВ в массиве экстремофилов стали термофильные сине-зеленые водоросли (ТСЗВ). Выбор
обусловлен рядом причин: они одна из наиболее часто встречаемых групп экстремофилов в
силу широкой распространенности горячих источников в природе; устойчивость к тепловому
воздействию является одной из наиболее общих форм устойчивости; способность жить при
высоких температурах связана со способностью жить при низких концентрациях кислорода в
силу его низкой растворимости в воде при высоких температурах. Синезелёные водоросли
сочетают в себе рекордную приспособляемость, свойственную простейшим организмам, и
относительную, по сравнению с бактериями, сложность, роднящую их с многообразием
многоклеточных форм жизни
На начальном этапе было выяснено, что экстракты из ТСЗВ увеличивают устойчивость
изолированных клеток и тканей к различным повреждающим факторам (гипертермии,
гипоксии, гипер- и гипотоническим растворам солей). В последующих лабораторных
экспериментах были обнаружены следующие виды биологической активности веществ,
выделенных из ТСЗВ: антигипоксическая активность (для мышей, для развивающихся
эмбрионов вьюна, для нейронов в срезе мозжечка крысы); антистрессовая активность (для
животных); антитоксическая активность - способность снижать токсическое действие
некоторых лекарственных препаратов (на животных); иммуностимулирующее действие,
выражающееся в активации нормальных киллеров в опытах in vitro и в стимуляции синтеза
гамма-интерферона; высокая стимулирующая активность по отношению к мембранотропным
ферментам, таким как кальций-магниевая АТФаза и моноаминооксидаза; стимулирующее
действие на импульсную активность нейронов мозга животных.
В дальнейшем намечено три основных направления обращения к ТСЗВ: изучение
генетических, молекулярных, биохимических и физиологических принципов механизмов
адаптации; использование их как более эффективных продуцентов веществ (ускорение
технологических процессов роста массы за счет повышения температуры); использование как
источника новых БАВ, важных для направлений практической деятельности человека,
связанных с задачами химической регуляции нормальной и патологической деятельности
живых организмов.
КОМПЛЕКС ДЕСТАБИЛАЗЫ-ЛИЗОЦИМА С ЛИПОСОМАМИ КАК
ПЕРСПЕКТИВНАЯ ФАРМСУБСТАНЦИЯ
Антипова Н.В., Кузнецова Н.Р.
ФГБУН Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН, Москва, Россия
nadine.antipova@gmail.com
Включение биомакромолекул в липосомы защищает активный компонент от
преждевременной деградации под действием ферментов организма. В то же время в случае
гидрофобных молекул липосомы могут быть использованы как средство для получения
стабильной формы препарата, пригодной для исследований in vivo.
Объектом наших исследований стал рекомбинантный белок детабилаза – лизоцим
гидрофобный полифункциональный фермент проявляющий изопептидазную, лизоцимную и
антимикробную функции. Его изопептидазная функция реализуется в способности к
высокоспецифическому расщеплению фибрина, который стабилизирован при участии фактора
61
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
XIIIa, то есть содержит ковалентные ε-лизил-γ-глутамил-изопептидные связи, которые и
расщепляются ферментом, в то время как нестабилизированный фибрин не является его
субстратом. В отличие от стандартных тромболитических препаратов дестабилаза способствует
постепенному медленному тромболизису без угрозы образования крупных фрагментов
кровяного сгустка и поэтому интересно его исследование в качестве перспективного
тромболитического препарата.
В нашей работе мы изучили активность комплекса рекомбинантного белка дестабилазылизоцима с флуоресцентномечеными липосомами состава яичный фосфатидилхолин –
BODIPY-C7-PC, 99.9: 0.01, среднего размера ~100 нм, приготовленные стандартным методом
экструзии. Очищенный и рефолдировнанный белок Ds2 добавляли на стадии гидратирования
липидной пленки. Суспензию разделяли с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-75.
Элюированные фракции анализировали по флуоресценции BODIPY-C7-PC (λex 480 нм, λem
max 506 нм). Количество дестабилазы-лизоцима во фракциях определяли по методу Лоури.
Показано, что исследуемый белок количественно встраивается в липидный бислой
липосом. Далее определяли лизоцимную активность комплекса дестабилазы-лизоцима с
липосомами по просветлению суспензии клеточных стенок бактерии M. lysodeikticus.
Изопептидазную функцию оценивали по способности комплекса дестабилазы-лизоцима с
липидами гидролизовать Д-димер до Д-мономера.
Лизоцимная и изопептидазная активности рекомбинантного белка дестабилазы-лизоцима в
составе липосом увеличиваются на порядок по сравнению с исходной. Комплекс сохраняет
повышенную активность в течение времени. В результате проделанной работы предлагается
использовать фермент дестабилаза-лизоцим в составе липосом как самостоятельную
фармсубстанцию.
ОЦЕНКА МУТАГЕННЫХ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ХИТОЗАНЕ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ
В КАЧЕСТВЕ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ
Байдамшина Д.Р.1, Холявка М.Г.2, Каюмов А.Р.1
1
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань;
2
ФГБОУ ВПО Воронежский государственный университет, Воронеж, Россия
prosto-di@mail.ru
Одним из современных направлений биотехнологии является создание перевязочных
средств с иммобилизованными на нерастворимых носителях ферментами для лучшего
ранозаживления. При закреплении ферментов на нерастворимых носителях получаются
гетерогенные биокатализаторы, которые обладают рядом преимуществ: значительно
повышается не только стабильность, но и эффективность полученного препарата за счет
возможности управления процессом протекания реакции. Перспективными носителями
являются хитозаны. Молекулы хитозана содержат гидроксильные и аминогруппы, его
полимерная матрица позволяет иммобилизовать ферменты, как внутри сетки, так и на ее
поверхности. Целью работы был анализ степени токсичности ферментов и различных
хитозанов для клеток про- и эукариот. Концентрация ферментов составляла 1 (планируемая
фармацевтическая концентрация) и 10 мкг/мл, что соответствует превышению планируемой
фармацевтической концентрации в 10 раз. Установлено, что сам трипсин и все варианты
хитозана не продемонстрировали мутагенного действия в тесте Эймса. Напротив, РНКаза и
ДНКаза показали мутагенный эффект, и, следовательно, не могут быть рекомендованы к
использованию.
Цитотоксичность соединений исследовали на линии MCF7 клеток рака молочной железы
человека с помощью метаболического MTS – теста. Ни одно из исследуемых соединений не
приводило к снижению активности митохондриальной дегидрогеназы по окислению MTS.
Следовательно, все соединения не являются токсичными и могут быть использованы в качестве
ранозаживляющих препаратов. Кроме MTS теста, также исследовали морфологию клеток,
пролиферирующих в присутствии ферментов и хитозанов. Результаты микроскопии показали,
что ни одно из исследуемых соединений не вызывало изменений в морфологии клеток и не
оказывало цитостатического эффекта, в отличие от положительного контроля – азида натрия.
62
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
Надо отметить, что присутствие трипсина значительно усиливало пролиферацию клеток,
следовательно, можно ожидать высокого заживляющего эффекта этого фермента. Присутствие
всех видов хитозана кроме сукцината хитозана также не нарушало морфологии клеток.
Нерастворимые примеси в сукцинате хитозана значительно обрастали клетками измененной
формы, в меньшей степени такая картина наблюдалась в случае высокомолекулярного
хитозана. Этот факт также требует более глубокого исследования, поскольку данный эффект
может негативно сказаться при использовании данных видов хитозанов при клиническом
использовании с иммобилизованными ферментами.
ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ
ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА
1
Богданов В.В. , Березин Б.Б.1, Ильина А.П.1, Ямскова В.П.2, Ямсков И.А.1
1
ФГБУН Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН;
2
ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва, Россия
vse-bogd@yandex.ru
Ранее в тканях животных и растений нами были обнаружены вещества, названные
мембранотропными гомеостатическими тканеспецифическими биорегуляторами (МГТБ). Они
действуют как факторы межклеточной адгезии и влияют на процессы клеточной
дифференцировки, миграции и пролиферации. Их действие демонстрирует тканевую
специфичность при отсутствии видовой специфичности, что было показано при исследовании
МГТБ млекопитающих на моделях низших позвоночных животных. Следует особо отметить
действие МГТБ на вышеуказанные процессы в сверхмалых концентрациях (10-8 - 10-15 мг/мл).
В данной работе была впервые предпринята попытка выделения и изучения пептидных
фракций, по свойствам сходных с МГТБ, в тканях беспозвоночных животных. В качестве
объекта был выбран гепатопанкреас краба - секреторный орган, совмещающий свойства печени
и поджелудочной железы. Ткань подвергалась экстрагированию и выделению по методике,
ранее разработанной для МГТБ с последующим изучением физико-химическими методами.
Методом кругового дихроизма было показано наличие в растворе пептидсодержащей фракции
элементов вторичной белковой структуры с преимущественным (до 60%) содержанием αспиралей, а методом динамического светорассеяния - присутствие растворе крупных (до 300
нм) наноразмерных частиц. Данное поведение пептидов в растворе было ранее показано для
ряда МГТБ. Контроль пептидной фракции на проявление специфической для МГТБ
биологической активности вели специальным адгезиометрическим методом. Им было
продемонстрировано присутствие в исследуемых фракции специфической адгезивной
активности в широком диапазоне концентраций. Тканеспецифическая активность
исследовалась на модели роллерного культивирования ткани печени тритона. Исследовалось
влияние МГТБ на состояние ткани печени и количество меланомакрофагов. Действие
исследуемой фракции изучалось в сравнении с МГТБ печени крысы, а также с коммерческим
препаратом Эссенциале форте. Было показано, что исследованные фракции влияют на
увеличение количества пигментированных клеток в ткани культивируемой печени тритона.
Зафиксировано увеличение количества пигментированных клеток на 15-23% по сравнению с
контрольным образцом, что говорит об активизации деятельности макрофагов в печени.
Таким образом, в работе продемонстрировано сходство в физико-химических свойствах
пептидной фракции, полученной из гепатопанкреаса краба, с МГТБ печени крысы и
коммерческим гепатопротектором, а также тканевая специфичность действия, причем
последняя впервые продемонстрирована для МГТБ из беспозвоночных на модели животного,
принадлежащего к более высокоорганизованному виду.
63
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
МОДЕЛИРОВАНИЕ ФАГОВОЙ ТЕРАПИИ В КИШЕЧНИКЕ МЫШИ
Васильева Е.Л.1, Скобликов Н.Э.2, Дьяченко И.А.3, МурашевА.Н.3
1
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино; 2ГНУ Северо-кавказский научно-исследовательский институт
животноводства РАСХН, Краснодар; 3Филиал ФГБУН Института биоорганической
химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино, Россия
apollo66@rambler.ru
Существенным препятствием к широкому применению фаговых препаратов является
недостаток знаний об отношениях фаг-хозяйская клетка, особенно в организме животного. Для
создания экспериментальной модели для исследования трансдукции в кишечнике животного в
данной работе были взяты лабораторные штаммы, отличающиеся по физиологическим и
генетическим характеристикам. На начальном этапе работы была проведена проверка
жизнеспособности выбранных штаммов в кишечнике экспериментального животного.
Было показано, что клетки ни одного из штаммов не колонизируют кишечник и
элиминируются примерно через сутки после введения. Этот факт можно объяснить
существованием резидентной микрофлоры и связанной с ней колонизационной
резистентностью желудочно-кишечного тракта животного. Для продолжения исследования был
выбран штамм E. coli CR204, так как он обладал наибольшей длительностью сохранения в
толстой кишке мыши с наиболее высоким тиром и наличием маркера устойчивости к
антибиотику – канамицину, хромосомной локализации. Данный штамм E. coli заражали в
кишечнике мыши различными бактериофагами, входящими в состав антибактериального
фагового препарата, предназначенного для борьбы с колибактериозом поросят, и следили за
изменением титра CR204 и бактериофага в кишечнике мыши. Таким образом, была
сконструирована модельная система фаговой терапии в кишечнике мыши.
Работа была частично поддержана грантом РФФИ №13-04-00991.
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИСТРЕПТОКОККОВОГО
БЕЛКА CHAP-B30
Голенченко С.Г., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
golenchenko@inbox.ru
Streptococcus agalactiae является распространённым патогеном человека и животных,
вызывая целый ряд опасных и экономически значимых заболеваний. Цель данной работы –
получить антибактериальный белок, активный в отношении штаммов S. agalactiae,
ассоциированных с маститом у крупного рогатого скота.
В качестве антибактериального агента нами был выбран CHAP-домен лизирующего
фермента стрептококкового бактериофага В30 (CHAР-В30). Нуклеотидная последовательность
была получена обратной трансляцией аминокислотной последовательности (GenBank
AY149214.3) с оптимизацией кодонов. Фрагмент в 470 п.н. был синтезирован ПЦР и
клонирован в составе экспрессионного вектора pET24b(+) в бактерии E. coli BL21CodonPlus(DE3)-RIPL. После индукции 1М ИПТГ в бактериях накапливался растворимый
белок соответствующей массы (18 КДа). Лизат клеток после индукции был подвергнут
анионообменной хроматографии на колонке с Toyopearl-Q, в результате чего был получен
препарат целевого белка чистотой не менее 95%.
Для определения активности полученного препарата, из молока коров с клинической
картиной мастита, с использованием модифицированной среды Эдвардса, были выделены 3
изолята S. agalactiae. Видовая принадлежность изолятов была подтверждена ПЦР к
специфическим участкам 16S РНК. Полученный на предыдущей стадии белок проявлял
антибактериальную активность ко всем исследованным изолятам в равной степени. Активность
CHAР-В30 составила 18 ЕА/мг. Предполагается, что данный белок может стать основой для
антимаститного препарата.
64
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА TB10.4 MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS В КЛЕТКАХ ESHERICHIA COLI
Добровольская О.А., Федорова Е.А., Черняева Е.Н.
ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых
биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия
dobrovolskay-oly@yandex.ru
Туберкулез является инфекционным заболеванием, вызывающим наибольшее количество
случаев с летальным исходом. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ),
туберкулезом ежегодно заболевает около 8 млн. человек, и около 3 млн. заболевших погибает.
На сегодняшний день единственной зарегистрированной и используемой вакциной
является BCG (БЦЖ). Сомнительная эффективность вакцинации BCG и побочные эффекты
заставляет научное сообщество разрабатывать эффективные средства вакцинации против
Mycobacterium tuberculosis. Существует несколько направлений разработки новых
противотуберкулезных вакцин, одним из которых является создание субъединичных вакцин на
основе рекомбинантных белков. Идентифицирован ряд антигенов Mycobacterium tuberculosis,
перспективных для использования в качестве компонентов новых вакцин. К ним относятся, в
частности, иммунодоминантные секретируемые антигены, присутствующие в культуральном
фильтрате Mycobacterium tuberculosis, среди которых наиболее изучены антигены ESAT-6
(Early Secret Antigen Target-6), CFP-10 или TB10.4.
По уровню синтеза γ-интерферона мононуклеарными клетками периферийной крови
доноров в ответ на их контакт с соответствующими антигенами низкомолекулярный белок
TB10.4 демонстрирует наибольшую иммуногенность. Белок распознается на ранней стадии
туберкулезной инфекции и способствует пролиферации лимфоцитов, ответственных за
продукцию интерферона γ (ИФН-γ), – основного фактора протективного иммунитета.
Учитывая эти свойства, рекомбинантный белок TB10.4 может быть использован для создания
новых кандидатных вакцин против туберкулеза.
Цель работы заключается в получении рекомбинантного белка TB10.4 в клетках E. coli.
Нами была получена оптимизированная для высокой экспрессии в клетках E. coli
нуклеотидная последовательность, кодирующая белок TB10.4. Создан вектор pET-28a(+)tb10.4.
Был создан штамм E. coli DH10B/R pET-28a(+)tb10.4, для амплификации плазмидной ДНК.
Также был создан высокопродуктивный штамм E. coli BL21 (DE3) pET-28a(+)tb10.4 продуцент
рекомбинантного белка TB10.4. Подобран оптимальный протокол индукции экспрессии гена,
кодирующего белок TB10.4, обеспечивающий высокий выход белка при наименьших затратах
индукция 0,2% лактозой по Штудиеру.
В настоящий момент ведется работа по получению рекомбинантного белка TB10.4 в
чистом виде с использованием металлоаффинной хроматографии.
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛИПЕПТИДНОГО АНАЛЬГЕТИКА
(РТ1), СЕЛЕКТИВНО ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩЕГО С
ПУРИНЕРГИЧЕСКИМИ РЕЦЕПТОРАМИ
1,2
Дьяченко И.А. , Жармухомедова Т.Ю.1,2, Дьяченко Е.В.2, Мурашев А.Н.1,2
1
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН; 2Пущинский естественно-научный институт, Пущино, Россия
dyachenko@bibch.ru
Болевые ощущения испытывают все люди на земле, однако помимо сигнализации о
грозящей опасности для организма, боль может возникать при различных нейропатических
заболеваниях, которые приносят страдания и не выполняют защитной функции. Одним из
перспективных подходов признается использование высокоселективных веществ, способных
специфично блокировать рецепторы, которые непосредственно воспринимают болевые
стимулы и/или медиаторы воспаления (болевые рецепторы). Важнейшим классом таких
рецепторов являются ионотропные пуринергические рецепторы P2X. Преимуществами
65
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
анальгетиков нового типа являются: высокая эффективность, специфичность действия, малые
эффективные дозы, отсутствие или минимальное побочное действие, отсутствие привыкания.
Исследование специфической активности проводили на мышах самцах CD-1 при
внутривенном введении исследуемого вещества. Источник животных - НПП «Питомник
лабораторных животных» ФИБХ РАН. Животные содержались в условиях вивария при
постоянной температуре (22±4°C) со стандартным свето-темновым циклом (12 ч свет/12 ч
темнота), с 10-ти кратной сменной объема воздуха в комнате в час. Относительная влажность в
комнате содержания животных составляла 30-70%. Корм и воду давали ad libitum. Все
процедуры с животными в исследовании были рассмотрены и утверждены институтской
комиссией по уходу и использованию животных (IACUC). Исследование специфической
активности проводили в тестах: адекватной хемогенной модели острой воспалительной
реакции, которой является «Формалиновый тест» (модель неспецифического воспаления).
Модель висцеральной боли (уксусные корчи), тест направлен на исследовании острой
висцеральной и соматически глубокой боли. Гиперчувствительность, спровоцированная CFA
(модель воспаления вызванного инфекцией). Воспалительный процесс может формировать
хронически боли соматически глубокого происхождения (повреждение подушечки лапы).
Оценивается острая боль в тестировании и переносимость хронической боли. Полипептид РТ1
исследовался в дозе 0,01 мг/кг. Показано, что исследуемый пептид РТ1 при однократном
внутривенном введении достоверно изменяет показатели в тестах: формалиновый тест,
висцеральная боль, тепловая гиперчувствительность проявляя выраженную обезболивающую
активность. Дальнейшее исследования максимальной толерантной дозы (МТД) показало,
высокую переносимость исследуемого препарата при внутривенном введении мышам CD-1,
которая равнялась 1400 мг/кг.
Таким образом, провели первые этапы доклинического исследования пептидного
обезболивающего вещества РТ1 при внутривенном введении у мышей CD-1.
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ТОКСИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА
ВЫЗВАННОГО ВВЕДЕНИЕМ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ
РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПАКЛИТАКСЕЛА И ЭТОПОЗИДА С
ПОМОЩЬЮ СРЕДСТВ С АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Ермолаева Л.А., Федорова Е.П., Неупокоева Л.А., Фомина Т.И.
ФГБУ Научно-исследовательский институт фармакологии им. Е.Д.Гольдберга
СО РАМН, Томск, Россия
ermolaeva_la@mail.ru
Задачи исследования: 1. изучить гепатотоксичность противоопухолевых препаратов
паклитаксела и этопозида; 2. изучить возможность коррекции выявленных эффектов с
помощью средств с антиоксидантной активностью тиофана и эплира.
Материалы и методы: эксперименты проведены на 100 аутбредных крысах-самках.
Цитостатики вводили однократно внутривенно в максимально переносимой дозе (МПД)
паклитаксел – 5 мг/кг, этопозид - 30 мг/кг. Наблюдения проводили на 5-е, 10-е, 15-е, 30-е сутки.
Исследования печени крыс проводили с помощью морфологических и биохимических методов.
Результаты обрабатывали с использованием критерия Манна-Уитни.
Результаты: морфологическое исследование токсического влияния паклитаксела и
этопозида на печень экспериментальных крыс показало, что в ранние сроки после их
однократного внутривенного введения в печени животных развивались гемодинамические
нарушения, мелкокапельная жировая дистрофия и моноцеллюлярные некрозы гепатоцитов,
лимфомакрофагальная инфильтрация паренхимы и портальных трактов, снижение количества
двуядерных гепатоцитов. Вследствие отека и расширения синусоидов наблюдалась
дискомплексация печеночных балок. Биохимическое исследование показало увеличение
активности ферментов АлТ, АсТ, щелочной фосфатазы, γ-глутамилтранспептидазы и маркера
ПОЛ – МДА, в сыворотке крови. Наиболее выраженные нарушения отмечались на 10, 15 сутки
после инъекции цитостатиков. Использование корректоров с антиоксидантной активностью
тиофана и эплира оказывало противовоспалительное действие, стимулировало регенерацию в
поврежденной печени, способствовало восстановлению обменных процессов, что проявлялось
66
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
нормализацией синтеза ДНК, гликогена и снижением выраженности жировой дистрофии
гепатоцитов. Тиофан проявлял более выраженное гепатопротекторное действие, по сравнению
с эплиром.
Выводы: при однократном внутривенном введении паклитаксела и этопозида в
максимально-переносимой дозе в печени крыс развивался острый токсический гепатит;
применение в качестве фармакологических корректоров тиофана и эплира способствовало
улучшению метаболизма и регенерации печени крыс.
РАЗРАБОТКА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИОННО-СПРАВОЧНОЙ
ИНТЕРНЕТ-СИСТЕМЫ
Журавель М.А., Спичак И.В., Вареных Г.В.
ФГАОУ ВПО Белгородский государственный национальный
исследовательский университет, Белгород, Россия
zhuravel@bsu.edu.ru
В настоящее время наблюдается динамичное развитие информационных технологий и их
внедрение во все сферы жизни общества, в том числе и в фармацевтическую деятельность.
Целью исследования явилась разработка специализированного фармацевтического сайта
средства массовой коммуникации, способствующего развитию фармацевтической
информационно-технологической среды (ФИТС).
Для реализации цели разработана концепция, включающая 7 этапов: 1) определение
целевой аудитории; 2) социологическое исследование потребителей фармацевтической
информации (ФИ); 3) разработка структуры сайта; 4) сбор информации для разделов, её
систематизация; 5) программирование; 6) разработка информационных материалов для
пользователей; 7) формирование рекламных подходов к продвижению сайта.
На первом этапе исследования выбраны категории целевой аудитории, на которую
ориентирована информация, представленная на сайте: население, врачи, фармацевтические
работники, студенты медицинских и фармацевтических учебных заведений.
Далее проведен социологический опрос выявленных потребителей ФИ. На основании их
потребностей определены потенциальные предложения сайта, реализованные в контенте.
На третьем этапе разработана структура ФИТС, включающая 9 блоков: «Главная»,
«Врачу», «Родителям», «Всё о лекарственных средствах», «Словарь медицинских терминов»,
«Лекарственные растения», «Советы фармацевтического специалиста», «Государственное
регулирование лекарственного обращения», «Полезные ссылки и горячая линия».
На следующем этапе для каждого раздела осуществлен сбор и систематизация
информации, формирующей контент. Основными источниками для его формирования
служили: федеральные руководства, научные статьи, справочники официальной информации о
лекарственных средствах и заболеваниях и др.
Далее реализовано программирование сайта с привлечением специалистов факультета
информационных технологий и прикладной математики НИУ «БелГУ».
На шестом этапе для облегчения работы пользователей сформированы информационные
материалы: инструкция по работе с сайтом и сценарии пользователей.
На заключительном этапе разработаны рекламные листовки для продвижения
фармацевтической информационно-справочной системы.
Таким образом, в результате разработан сайт, позволяющий оптимизировать
взаимодействие в системе «врач-провизор-пациент», обеспечить понимание и принятие
пациентами процесса лечения, устранить информационный дефицит в области медикофармацевтической помощи.
67
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ АНАЛОГОВ ЭСТРОГЕНОВ
НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ФЕОХРОМОЦИТОМЫ (PC12)
Зорина И.И.1, Власова Ю.А.2, Аврова Н.Ф.2
1
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет;
2
ФГБУН Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН,
Санкт-Петербург, Россия
carry111@yandex.ru
Женские гормоны эстрогены (Е) проявляют множество эффектов и задействованы в работе
сердечно-сосудистой, опорной, репродуктивной и нервной систем. Многочисленными
исследованиями отмечается защитная роль эстрогенов. Показано, что Е влияют на когнитивные
функции, снижают риск развития нейродегенеративных заболеваний. Многочисленные
эксперименты, проведенные in vitro на различных культурах клеток показали, что Е, их
производные и аналоги способны защищать нейроны от окислительного стресса в широком
диапазоне концентраций: 0,1 нМ – 50 мкМ. Культура клеток феохромоцитомы PC12 проявляет
нейрональные свойства и является удобной моделью для изучения процессов, происходящих в
клетках нервной системы, как на клеточном, так и на молекулярном уровнях.
Целью данной работы стало изучение возможных цитопротекторных свойств следующих
аналогов E: 17β-этинилэстрадиол (ЕЕ); соединение №1: 3-гидрокси-7α-метил-6-окса-8α-эстра1,3,5(10)-триен-17-он; соединение №2: 3,17β-дигдрокси-7α-метил-6-окса-8α -эстра-1,3,5(10)триен. Опыты проводили на культуре нейрональной клеточной линии РС12. Клетки были
преинкубированы с данными соединениями в концентрации 10 мкМ в течение 1 часа, а затем
проводилась 2-х часовая коинкубация клеток с 0,3 мМ H2O2 для индукции окислительного
стресса. Оценка цитотоксичности проводилась по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в
супернатанте разрушенных клеток и вычислялась в %. В ходе работы было показано, что все
исследуемые соединения обладают цитопротекторными свойствами. Так, добавление в среду
ЕЕ и соединения №1 достоверно снижало (в 2 раза) выход фермента из клеток: активность ЛДГ
соответственно составила 9,77±0,06% и 9,15±1,58% по сравнению с клетками,
инкубированными только в присутствии H2O2 (20,67±1,26%). Соединение №2 также проявляло
защитные свойства, но менее выражено: активность ЛДГ составила 15,08±4,13%. Проявленные
цитопротекторные свойства возможно определяются антиоксидантной активностью данных
соединений, которая была обнаружена нами ранее. Выявленные в ходе работы защитные
свойства аналогов эстрогенов представляют особый интерес для поиска терапевтических
подходов для лечения различных нейродегенеративных заболеваний, что открывает
дальнейшие перспективы для их исследования.
КОМПЬЮТЕРНЫЙ ПРОГНОЗ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ТЕТРАГИДРОПИРИДИНА
Иванова Е.В., Блохнова Ю.М., Никишина М.Б., Стемпинь Н.Д.,
Шахкельдян И.В., Атрощенко Ю.М.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный педагогический университет
им. Л.Н.Толстого, Тула, Россия
omela005@gmail.com
Известно, что пиперидиновое кольцо является структурным фрагментом многих
алкалоидов, а также многочисленных предшественников лекарств. Исследования в химии
пиперидина и интерес к синтезу новых молекул обусловлены их высоким биологическим
значением. В последнее десятилетие несколько тысяч производных пиперидина были
использованы
в
клинических
и
доклинических
исследованиях.
Производные
тетрагидропиридинов также входят в состав природных алкалоидов и синтетических
биологически активных веществ.
Нами синтезирован ряд новых производных 6-R-3,5-динитро-1,2,3,4-тетрагидропиридинов
посредством действия тетрагидридобората натрия на соответствующие 2-R-3,5-
68
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
динитропиридины с последующей обработкой образующихся гидридных аддуктов
разбавленной ортофосфорной кислотой.
Для первоначальной оценки их биологической активности было проведено компьютерное
моделирование с помощью системы PASS. Как показали результаты прогноза биологической
активности, выполненного в программе Pharma Expert, исследуемые соединения проявляют
широкий спектр биологической активности. Показатель вероятности проявления большинства
активностей превышает 60. Аминопроизводные тетрагидропиридинов с наибольшей
вероятностью
проявляют
такие
виды
биологической
активности,
как
Acrocylindropepsininhibitor, Chymosininhibitor, Saccharopepsininhibitor, Ubiquinol-cytochromecreductaseinhibitor,
Phobicdisorderstreatment,
Fusarinine-Cornithinesteraseinhibitor.
Среди
побочных эффектов прогнозируются Postural (orthostatic) hypotension, Neutrophilic dermatosis,
Ototoxicity, Hyperglycemic Спектр потенциальной биологической активности для 3,5-динитро6-(o-толилтио)-1,2,3,4-тетрагидропиридина
несколько
отличается.
Так,
помимо
вышеперечисленных видов активности, 3,5-динитро-6-(o-толилтио)-1,2,3,4-тетрагидропиридин
демонстрирует снижение вероятности проявления большинства видов активности, за
исключением Ubiquinol-cytochrome-creductase inhibitor, Polyporopepsin inhibitor, Platelet derived
growth factor receptor kinase inhibitor, а также снижение токсичности.
Таким образом, проведенное исследование позволяет не только сделать вывод, что
полученная серия тетрагидропиридинов проявляет разнообразную биологическую активность,
но и прогнозировать их дальнейшее прикладное значение.
МОДЕЛИРОВАНИЕ АНЕМИИ НА КРЫСАХ МЕТОДОМ ЧАСТИЧНОЙ
НЕФРЭКТОМИИ ДЛЯ ИСПЫТАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Исмаилова А.М., Панченко Н.А.
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино; 2Московский государственный университет
им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
ptichka77791@mail.ru
На данный момент, около четверти населения нашей страны в большей или меньшей
степени подвержено анемии. Основными причинами заболевания являются нарушения
образования эритроцитов и синтеза гемоглобина.
Для испытания лекарственных препаратов нормализующих состав крови необходима
адекватная и как можно менее затратная лабораторная модель заболевания. Существует
несколько способов моделирования анемии in vivo, но все они имеют определенные недостатки.
Добиться понижения уровня эритроцитов в крови можно угнетением процесса
пролиферации их клеток предшественников – ретикулоцитов. Эритропоэтин – гормон
активирующий митоз и созревание эритроцитов из ретикулоцитов, который синтезируется
почками.
Метод частичной нефрэктомии заключается в удалении 5/6 всей массы почек
хирургическим путём в два этапа: первый – удаление 2/3 правой почки, второй – удаление
левой почки полностью через две недели после первой операции.
Это приводит к значительному снижению уровня эритропоэтина в крови. В результате
формируется эритропоэтиндефицитная анемия (ЭДА).
В дальнейшем, на этой модели могут тестироваться препараты стимулирующие
эритропоэз. Прооперированным крысам вводятся действующие вещества, и через различные
промежутки времени проводится забор крови, отслеживаются изменения в ее составе.
Активность изучаемого препарата, а так же её зависимость от вводимой дозы можно будет
выявить после проведения эксперимента, на основе сопоставления результатов с показателями
препарата сравнения.
Было выявлено, что метод частичной нефрэктомии достаточно достоверен и наиболее
доступен для изучения противоанемических препаратов.
69
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕДЕНИЯ АПОЕ-ДЕФИЦИТНЫХ МЫШЕЙ В
ПОСТНАТАЛЬНОМ ОТНТОГЕНЕЗЕ
Кардаш Е.В.1,2, Лобанов А.В.2,3
1
ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет Министерства
здравоохранения РФ, Волгоград; 2Филиал ФГБУН Института биоорганической химии
им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН; 3ФГБОУ ВПО Пущинский
государственный естественно-научный институт, Пущино, Россия
ramashkofff@yandex.ru
Во время пренатального и постнатального периодов развития происходит формирование
головного мозга млекопитающих. В результате воздействия внутренних и внешних факторов в
определённые периоды пренатального развития животных наблюдаются структурнофункциональные изменения в развитии мозга. Отсутствие белка Аполипопротеина Е у мышей
вызывает нарушения формирования поведения в постнатальном периоде.
Цель - изучение формирования структуры головного мозга и поведения у AпoEдефицитных мышей в постнатальном периоде развития.
Материалы и методы. В экспериментах использовались мыши линии AпoЕ-/-, полученные
из питомника лабораторных животных Эдинбургского университета. В качестве контроля была
использованы мыши линии C57BL/6. Животные содержались в стандартных условиях
(температура 21±3°C, влажность 30-70% при 12 часовом периоде освещения, корм и вода - ad
libitum). В исследовании были сформированы две группы животных: AпoЕ-дефицитные и
контрольные животные. Все манипуляции с животными осуществлялись в соответствии с
требованиями комиссии по контролю над содержанием и использованием лабораторных
животных. Для тестирования потомства был применен комплекс тестов для оценки
развивающегося поведенческого фенотипа мышей, которая была разработана в Институте
нормальной физиологии им. П.К. Анохина, и представляет собой расширенную модификацию
сенсомоторных тестов. Тестирование длилось 60 минут при одновременном обследовании 2-х
пометов одним экспериментатором.
В результате исследования выявили ряд нарушений в соматическом и сенсомоторном
развитии с 1 по 21 день постнатального периода у АпоЕ-дефицитных мышей. Со стороны
соматического развития наблюдались изменения у АпоЕ-дефицитных мышей в виде отставания
массы тела, прозревание происходило на более поздних сроках по сравнении с контрольными
животными. Отличительной чертой сенсомоторного развития у АпоЕ-дефицитных мышей
явилось отставание в формировании различных навыков: рутинг, реакция переворачивания,
способность избегать наклонную плоскость, способность удерживаться на горизонтальном
канате передними конечностями, вибриссный плейсинг, отсутствие формирования зрительного
плейсинга.
Выводы: 1. У АпоЕ-дефицитных мышей было выявлено отставание в физическом
созревании и в формировании поведенческого фенотипа. 2. Отсутствие белка АпоЕ вызывает
изменения в формировании рабочей пространственной памяти и пространственной ориентации
в постнатальный период.
РАЗРАБОТКА МИКРОЧИПА ДЛЯ ПЦР-ДИАГНОСТИКИ МИКОПЛАЗМОЗА
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Липин С.А.1,2, Катанугина А.С.1, Сляднев М.Н.1
1
ЗАО «Люмэкс-Маркетинг»; 2ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный
политехнический университет, Санкт-Петербург, Россия
stenfostas@gmail.com
Микоплазмоз крупного рогатого скота является одной из наиболее острых проблем в
современном сельском хозяйстве. Инфекция преимущественно поражает легкие, суставы и
слизистые животного, вызывая артриты, конъюктивиты либо самопроизвольные аборты.
Верификация микоплазм в патологическом материале позволила бы установить этиологию
70
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
процесса и предпринять соответствующие меры, однако культуральный и микроскопический
анализы в этом вопросе бессильны.
Актуальной задачей диагностики микоплазмоза является достижение высокой скорости,
производительности и чувствительности анализа при минимизации себестоимости
исследования одного образца биоматериала. Наиболее перспективным методом, способным
удовлетворить данным условиям, является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в
формате микрочипа. Отличительной особенностью данного формата является возможность
предподготовки компонентов реакционной смеси, что позволяет упростить процедуру
постановки реакции и избежать контаминационных ошибок.
Разработанный микрочип позволяет проводить диагностику проб на наличие двух штаммов
рода Mycoplasma: Mycoplasma bovis и Mycoplasma mycoides в концентрации от 103 копий/мкл.
Анализ проводится методом ПЦР в режиме «реального времени» с помощью ампликатора
нуклеиновых кислот «АриаДНА». В качестве проб ДНК используется патоморфологический
материал животных (слизь, выделения, абортивный материал). Один микрочип позволяет
провести единовременную диагностику 3 проб. В процессе производства микрочипы
заполняются необходимыми реагентами (праймеры, полимераза, dNTP), а затем проходят
процедуру лиофилизации. Высушенные микрочипы могут храниться продолжительное время
(до полугода). Перед проведением анализа в микрочип добавляется только выделенная из
пробы ДНК в соответствующем буферном растворе, что существенно облегчает процесс
проведения анализа.
Микрочиповая ПЦР характеризуется высокой скоростью. Продолжительность анализа (без
учета доставки материала в лабораторию и выделения ДНК) составляет 30 минут, а вместе с
пробоподготовкой 90 минут.
Микрочип для диагностики микоплазмоза планируется использовать в ветеринарных
лабораториях Санкт-Петербурга и Ленинградской области, в том числе в СББЖ (станциях по
борьбе с болезнями животных) для скрининговых исследований.
МЕДИКО-СОЦИАЛЬНЫЙ ПОРТРЕТ БЕРЕМЕННОЙ ЖЕНЩИНЫ С ОСТРОЙ
РЕСПИРАТОРНО-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
Мурашко Ю.И., Спичак И.В.
ФГАОУ ВПО Белгородский государственный национальный
исследовательский университет, Белгород, Россия
murashko_yu@bsu.edu.ru
На сегодняшний день, острые респираторно-вирусные инфекции (ОРВИ), по своей
социальной значимости, занимают лидирующую позицию среди всех болезней человека.
Данная группа инфекций имеет тяжелое течение и дает большое количество осложнений в
период беременности. Неоспорим тот факт, что беременная женщина принимая то или иное
лекарственное средство должна быть уверена в его безопасности и эффективности как в
отношении себя, так и в отношении будущего ребенка. Следовательно, она нуждается в
фармацевтической информационной поддержке, в т.ч. и на этапе профилактики.
Целью исследования явилось определение портрета беременной женщины с острым
респираторно-вирусным заболеванием, как главного потребителя фармацевтической помощи.
Методы
исследования:
контент-анализ,
графико-аналитический,
ранжирования,
группировки, сравнения.
Источники данных: 500 индивидуальных карт беременных женщин с ОРВИ, находящихся
на учете с 2012 по 2013 гг. в МБУЗ «Городская поликлиника №7» и МБУЗ «Городская
поликлиника №2» г. Белгорода в возрасте от 16 до 45 лет.
Для реализации поставленной цели на основе индивидуальных карт беременных женщин
собран информационный массив, анализ которого показал, что большая часть беременных – это
женщины замужем (83%) в возрасте от 21 до 30 лет (72,2%), имеющие первую беременность
(46,6%) и не имеющие детей (60%). В процессе анализа информации о наличии сделанных
абортов, установлено, большинство исследуемых женщин не прибегали к аборту (64,8%) или
перенесли его один раз (24,2%), в результате третьей беременности (29,8%). На следующем
этапе осуществлен анализ заболеваемости беременных женщин ОРВИ. Так, выявлено, 44%
71
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
обращались к специалисту с данным диагнозом один раз и перенесли ОРВИ с осложнениями
(26,2%), в общей структуре которых преобладают ларинго-трахеиты – 46%.
Данный фрагмент является частью исследования по оптимизации лекарственной помощи
беременным женщинам, перенесшим ОРВИ.
МУТАГЕН-МОДИФИЦИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКТРАКТА
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИ ВЫРАЩЕННЫХ КОРНЕЙ
ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО
Неупокоева О.В., Воронова О.Л., Ермолаева Л.А., Федорова Е.П.
ФГБУ Научно-исследовательский институт фармакологии им. Е.Д.Гольдберга
СО РАМН, Томск, Россия
repaov@mail.ru
Обоснование: учитывая избирательность действия антимутагенов на мутагенный фактор
целесообразно использовать модели генотоксичности с различными механизмами становления
мутаций. Для профилактики мутагенных эффектов использовать соединения с широким
диапазоном биологических эффектов, низкой токсичностью и возможностью длительного
применения.
Задачи исследования. 1. Индуцировать мутагенез цисплатином и циклофосфаном (ЦФ) в
клетках костного мозга мышей (ККМ). 2. Изучить возможность защиты генома клетки от
повреждающего действия цитостатиков с помощью экстракта корней шлемника байкальского
(ЭШБ), выращенных in vitro.
Материалы и методы. Эксперименты проведены на 160 мышах-самцах и самках линии
СВА/СаLac. Цитостатики вводили однократно внутрибрюшинно: цисплатин в дозе – 6 мг/кг,
ЦФ - 20 мг/кг. Наблюдения проводили через 24, 48 ч, и 90 сутки. ЭШБ вводился однократно
внутрижелудочно, в дозе 200 мг/кг и 5-дневным курсом per os 40 мг/кг. В ККМ учитывали
долю поврежденных метафаз, клетки с увеличенным набором хромосом и с множественными
нарушениями. Отмечали одиночные, парные фрагменты и обменные аберрации. Результаты
обрабатывали с использованием критерия Манна-Уитни.
Результаты. Использование цисплатина в качестве прямого мутагена и ЦФ в качестве
промутагена выявило однотипные повреждения хромосом ККМ у мышей линии СВА/СаLac.
Анализ перестроек хромосом в метафазах на сроке наблюдения 3 месяца при однократном
воздействии цисплатина и ЦФ показал характерную картину продленного мутагенеза.
Выявлена большая чувствительности мышей-самцов к мутагенному действию цисплатина и
ЦФ. ЭШБ подавлял мутагенное действие цитостатиков при однократном и при курсовом
применении, снижая количество структурных аберраций хромосом в 2-2,5 раза. Отмечено
полное исчезновение мультиаберрантных клеток в ККМ мышей. Однократное и курсовое
использование ЭШБ было сопоставимо по степени выраженности защитного эффекта при
повреждениях, вызываемых цисплатином. При использовании модельного мутагена ЦФ,
курсовое введение ЭШБ обладало более выраженным генопротекторным эффектом, чем
однократное. Введение ЭШБ способствовало нормализации цитогенетических показателей у
мышей на отдаленных сроках наблюдения
Выводы. Однократное и курсовое применение ЭШБ модифицирует действие прямого
мутагена цисплатина и промутагена ЦФ и защищает геном клетки.
КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ОВЕЧЬЕГО
α2- и γ-ИНТЕРФЕРОНОВ В КЛЕТКАХ E. COLI
Острикова К.В., Потапович М.И., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
mpatapovich@mail.ru
В овцеводстве особенно остро стоит проблема инфекционных заболеваний, которые
приводят к значительным экономическим потерям. Для лечения заболеваний бактериальной
этиологии выпускается огромное количество антибиотиков, однако антивирусных лечебных
72
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
ветеринарных препаратов практически не существует. В этом плане большие надежды
связывают с препаратами интерферонов (ИФН).
Интерфероны являются многофункциональными компонентами защиты против вирусных
и паразитарных инфекций и некоторых опухолей. Они представляют собой класс
гликопротеинов, обладающих антивирусной, антипролиферативной и иммунорегуляторной
активностью.
Выявлены три основных типа ИФН характерные для человека и различных видов
животных. К типу I относят большую группу белков, куда входят ИФН-α (альфа), -β (бета), - δ
(дельта), - κ (каппа), - ω (омега) и др. К типу II принадлежит ИФН-γ (гамма), или иммунный
интерферон. Третью группу составляют интерфероны лямбда ИФН-λ1, -λ2 и -λ3.
Инфекционные заболевания овец вирусной этиологии широко распространены и наносят
большой экономический ущерб, поскольку эффективные средства борьбы с ними отсутствуют.
К числу наиболее серьезных вирусных заболеваний овец можно отнести вирусную пневмонию,
болезнь Найроби, энцефалит, ящур и др.
При разработке и создании противовирусных лечебно-профилактических препаратов для
овец на основе рекомбинантных ИФН наиболее эффективным представляется использование
сочетания рекомбинантного овечьего ИФН-α, обладающего высокой антивирусной
активностью, и рекомбинантного овечьего ИФН-γ, являющегося высокоэффективным
иммуностимулятором, благотворно воздействующим на функционирование систем клеточного
и гуморального иммунитета животного.
В ходе работы синтезированы структурные части генов овечьих ИФН-α2 и ИФН-γ с
последовательностями, оптимизированными для экспрессии в бактериях E. coli.
Синтезированные последовательности клонировали в составе вектора экспрессии pET24b(+) в
клетках E. coli BL21 (DE3). В результате получены высокоэффективные штаммы-продуценты
овечьих α2- и γ-ИФН, накапливающие более 50% целевых продуктов от общего количества
белка клетки, что создает основу для биотехнологического производства видоспецифических
высокоэффективных антивирусных иммуностимулирующих ветеринарных препаратов для
овцеводства.
ИЗУЧЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ И ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ
ЭКСТРАКТОВ ПОЛЫНИ ЯКУТСКОЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ И СЕВЕРОВОСТОЧНОЙ ЯКУТИИ
Сивцева С.В.
ФГАОУ ВПО Северо-Восточный федеральный университет им. М.К.Аммосова,
Якутск, Россия
Lilya_Sivtseva@mail.ru
Разработка лекарственных средств профилактики, контроля и лечения бактериальных и
грибковых инфекций на основе растительного сырья является одной из важнейших задач
современной фармацевтической науки. Большую ценность в качестве основы для создания
новых высокоэффективных препаратов представляют растительные экстракты.
Целью данной работы было исследование различных экстрактов полыни якутской на
антибактериальную и фунгицидную активность. В задачи работы входили получение водных,
водно-спиртовых и спиртовых экстрактов из фитомассы объекта исследования, оценка
антибактериальной и фунгистической активности полученных экстрактов по степени
воздействия на рост и развитие тест-культур – микроорганизмов методом Кирби-Бауэра с
модификациями. В качестве тест-культур были использованы бактерии, грибы и дрожжи.
Скрининг активности экстрактов показал следующие результаты. Спиртовые экстракты
обладают высокой ингибирующей активностью (73-75%) в отношении с использованными
видами микроорганизмов, но в различной степени (с зоной подавления роста в 0,1-3 см).
Водно-спиртовые экстракты (40%) проявили низкую антибактериальную активность (зона
торможения роста всех использованных микроорганизмов (бактерий и грибов) равна 0,1-0,3
мм). Водные экстракты полыни якутской проявили низкую антибактериальную активность
(зона торможения роста всех использованных микроорганизмов (бактерий и грибов) равна 0,10,2 мм).
73
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
Полученные данные могут составить основу для разработки альтернативных средств
профилактики определенных заболеваний человека на основе спиртовых экстрактов,
полученных из Artemisia jacutica центрально-якутской популяции.
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ФАРМАКОКИНЕТИКИ КАПСУЛ С
НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫМ ЯДРОМ, НАГРУЖЕННЫМ
ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРАМИ
Смирнова О.Д., Букреева Т.В., Марченко И.В., Калашникова И.В.,
Ванцян М.А., Кочетков А.А.
ФГБУ Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»,
Москва, Россия
smirnova0ksana@ya.ru
Мы синтезировали наноструктурированные частицы ватерита СаСО3, на которые были
адсорбированы различные фотосенсибилизаторы: Фотосенс, фотодитазин и родамин. Затем на
эти частицы послойно были нанесены биорезорбируемыми полиэлектролиты – хитозан и
декстран сульфат. Размер полученных капсул был от 1 до 5 мкм. Предварительно был
поставлен эксперимент in vitro по иcследованию десорбции красителей в воде. Было
обнаружено, что возрастание ионной силы раствора ведёт к усилению десорбции. Десорбция
родамина происходила в результате перекристаллизации частиц СаСО3 в кальцит. Хитозандекстрансульфатные капсулы были стабильны в водных растворах при рН от 4 до 8.
Фармакокинетика полученных препаратов была исследована на мышах линии HSK
возраста 4-6 месяцев. Для этого приготовлялась суспензия микрокапсул в физрастворе и
вводилась через шприц в мышцы задней лапы мышей в количестве 0,3 мл на мышь (около 1011
частиц, содержащих 0,02 г СаСО3 и 0,004 г полимеров).
Не было обнаружено никаких острых токсических эффектов и нарушений в поведении
испытуемых животных.
Визуализация фармакокинетки производилась неинвазивно и прижизненно по сигналу
флюоресценции, который измерялся при помощи лазерного диагностического комплекса
ЛАКК-М в МОНИКИ им. МФ Владимирского. Были предварительно получены калибровочные
графики зависимости сигналов флюоресценции от концентрации препаратов для различных
органов и тканей. На основании этих данных проведён сравнительный анализ
фармакокинетики
свободных
форм
препаратов
и
иммобилизированных
в
наноструктурированные капсулы. Получен эффект продления сохраняемого уровня
концентраций препаратов при введении в капсулах с наноструктурированными ядрами. Так,
для капсулированного Фотосенса сигнал наблюдался на протяжении 2-3 месяцев, - в
сопоставлении с 1 месяцем для раствора свободного фотосенса. Сигнал для капсулированного
фотодитазина наблюдался 7-10 дней, - в сопоставлении с 3-4 днями для свободного
фотодитазина. Для капсул с родамином сигнал наблюдался на протяжении 6-7 недель – в
сравнении с 2-3 неделями для раствора свободного родамина.
Работа выполнена при поддержке РФФИ, Проект № 13-03-00913.
АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ПОМОЩИ ДЕТЯМ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
СУСТАВОВ В УСЛОВИЯХ ПОЛИКЛИНИКИ
Спичак И.В., Дереглазова Ю.С.
ФГАОУ ВПО Белгородский национальный исследовательский университет,
медицинский институт, Белгород, Россия
yuliya.dereglazova@mail.ru
Ювенильные артриты (ЮА) являются актуальной проблемой современной педиатрии.
Фармакотерапия нозологии предусматривает использование значительного количества
лекарственных средств (ЛС), длительное амбулаторное и стационарное лечение.
74
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
На сегодняшний день существуют проблемы в оказании амбулаторно- поликлинической
помощи детям, страдающим заболеваниями суставов, так в частности, назначение
фармакотерапии без учета предпочтений пациента в выборе ЛС и экономических
возможностей семьи при их приобретении. Актуальным является разработка ассортиментных
портфелей ЛС для лечения детей с ЮА в амбулаторных условиях с учетом потребительских
предпочтений.
В ходе контент-анализа более 100 амбулаторных карт детей, страдающих ЮА,
сформирован информационный массив назначений. Осуществлен анализ структуры
ассортимента и потребления назначаемых препаратов. В ходе детального внутригруппового
анализа отмечена тенденция полипрагмазии фармакотерапии, не всегда соответствующей
тяжести течения заболевания. В рамках сегментационного анализа ЛС для лечения ЮА
определены препараты с высокой, средней и низкой частотой потребления. Осуществлен АВСанализ ЛС по затратам с целью определения ценовой приверженности врачей назначаемым ЛС.
В ходе выполнения VEN- анализа проведена экспертиза ЛС с учетом оптимизации следующих
критериев: фармакотерапевтическая эффективность (ФЭ), цена, целесообразность
использования для лечения детей с ЮА в амбулаторных условиях. В экспертизе приняли
участие высококвалифицированные врачи – специалисты. Для каждого ЛС определены
средневзвешенные оценки, на основании которых осуществлено сегментирование
ассортимента по группам «V»- обязательные к применению, «Е»- препараты замены и «N»средства наименее целесообразные в терапии ЮА. На следующем этапе проведен
многоаспектный матричный анализ ассортимента ЛС (проф. Спичак И.В., Панкратова О.Г.),
позволяющий осуществить комплексную оценку препаратов одновременно по 5 приоритетным
потребительским характеристикам: ФЭ, возрастные ограничения, цена, удобная лекарственная
форма, безопасность. Сформировано 3 ассортиментных портфеля (АП) ЛС для лечения детей
от 3-х лет с юношеским поли - / олигоартикулярным артритом в амбулаторно-поликлинических
условиях в трех ценовых диапазонах на курс лечения: низкозатратном (до 1000руб.),
среднезатратном (до 1700 руб.), высокозатратном (до 4500 руб). Разработанные АП позволяют
родителям на приеме у врача осуществить выбор комплекса ЛС, исходя из экономических
возможностей семьи.
МИЕЛОТОКСИЧНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ
РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ
КОРРЕКЦИЯ ЭКСТРАКТОМ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО
Федорова Е.П., Ермолаева Л.А., Неупокоева О.В., Чурин А.А.
ФГБУ Научно-исследовательский институт фармакологии им. Е.Д.Гольдберга
СО РАМН, Томск, Россия
fedorova-elen@mail.ru
Задачи исследования: 1. оценить характер повреждающего действия противоопухолевых
препаратов паклитаксела и этопозида на систему крови и влияние экстракта шлемника
байкальского в качестве фармакологического корректора на фоне их применения; 2. сравнить
эффекты, вызванные применением противоопухолевых препаратов на систему крови; 3.
сравнить реакцию системы крови, после применения экстракта шлемника байкальского на фоне
действия противоопухолевых препаратов.
Методы исследования: определение показателей периферической крови (концентрация
гемоглобина, содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, гематокритное число)
проводили, используя автоматический гематологический анализатор Abacus (Diatron, Austria) и
дифференциальный подсчет лейкоцитарной формулы в периферической крови, миелограмм в
костном мозге, цитограмм тимуса и селезенки производили стандартными гематологическими
методами.
Результаты. Анализ проведенных исследований показал, что введение цитостатиков в МПД
вызывает угнетение всех ростков кроветворения. В периферической крови наблюдалось
развитие панцитопении. При анализе цитограмм тимуса и селезенки отмечено снижение
количества лимфоцитов всех степеней зрелости. Введение паклитаксела, в отличие от
этопозида вызывало наибольшее угнетение лимфоидного ростка кроветворения. На
75
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФАРМАЦЕВТИКА»
миелоидный и эритроидный ростки кроветворения противоопухолевые препараты оказывали
равное воздействие. Введение экстракта шлемника байкальского способствовало снижению
токсических эффектов цитостатиков и выражалось в нормализации всех параметров системы
крови. На фоне применения паклитаксела введение экстракта шлемника байкальского
оказывало наибольший гемостимулирующий эффект на эритроидный и миелоидный ростки
кроветворения. На фоне действия этопозида применение экстракта шлемника байкальского в
большей степени влияло на миелоидный росток кроветворения.
Выводы. Таким образом введение экстракта шлемника байкальского в условиях
цитостатической миелосупрессии оказывает стимулирующее влияние на миело-, эритро- и
лимфопоэз в костном мозге, следствием чего является восстановление числа зрелых клеток в
периферической крови, лимфоидных органах начиная с ранних сроков наблюдения.
СОЗДАНИЕ МЫШИНОЙ МОДЕЛИ ТОКСИЧНОСТИ
СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА А
Фурсова К.К.1, Щанникова М.П.1,2, Семушина С.Г.1, Бровко Ф.А.1,2
1
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН; 2ФГБОУ ВПО Пущинский государственный
естественно-научный институт, Пущино, Россия
mshannikova@mail.ru
Бактерии рода Staphylococcus вырабатывают различные факторы вирулентности,
являющиеся причинами их патогенности. Среди таких факторов патогенности особое место
занимают энтеротоксины - суперантигены. SEA (стафилококковый энтеротоксин А), имеющий
два участка взаимодействия с MHC-II, способен образовывать кластеры на плазматических
мембранах лимфоцитов. приводит к синтезу и продукции воспалительных цитокинов, при этом
клетки, активированные суперантигенами, как правило, погибают.
Нами проводилась оценка токсичности SEA на мышах линии С57ВL/6 и Balb/C при
однократном внутрибрюшинном введении. В качестве премирующих агентов сравнивались
галактозамин и LPS (липополисахаридом) E. coli. Проводился контроль токсичности LPS, SEA
и растворителя. Для мышей линии Balb/C LD50 составила 20 мкг/мышь, при премировании
галактозамином в дозе 20 мг/мышь за 8 часов до инъекции SEA. Для мышей линии С57ВL/6
LD50 составила 0,5 мкг/мышь, при премировании LPS в дозе 150 мкг/мышь через 3 часа после
инъекции SEA. При введении только LPS в дозе 150 мкг/мышь, наблюдалась 100%
выживаемость животных.
Таким образом, определена LD50 SEA для линии мышей С57ВL/6. Это позволит
использовать полученную модель токсичности для дальнейшего поиска способов
нейтрализации эффектов SEA. Кроме того, показано, что липополисахарид E. coli оказался
более эффективным премирующим агентом, чем галактозамин. В комплексе с SEA LPS
проявлял способность активировать иммунную систему, вызывая септический шок животных,
и при этом, сам не обладал летальной токсичностью.
76
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
СЕКЦИЯ «Биофизика и радиобиология»
STRUCTURAL PROPERTIES OF LIPID RAFTS IN BIOMEMBRANES: A
MOLECULAR DYNAMICS SIMULATION STUDY
Bozdaganyan M., Shaitan K.
Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia
m.bozdaganyan@gmail.com
A number of experimental studies show the existence of highly ordered lateral domains in
biomembranes rich in sphingomyelin (SM) and cholesterol. These domains, called functional lipid
rafts, take part in a variety of processes such as membrane trafficking, signal transduction, and
regulation of the activity of membrane proteins.
In this work we have created three independent systems - all of them consist of water, SM,
cholesterol and POPC lipids in ratio 1:1:2. The first system is mixed lipids randomly inserted in the
water box, the second is bilayer without formed raft and the last with SM and cholesterol raft in the
center of biomembrane. The aim of the research is to understand how raft can be formed and its
evolution during the time.
The MD simulations were carried out using the program Gromacs, version 4.5. Such properties of
the membrane were measured: lateral diffusion of the lipids, area per lipid, order parameter, thickness
and density profiles. We showed that raft always have the higher thickness than POPC bilayer, SM
lipids have crystal phase and cholesterol plays crucial role in formation of the raft. Also we found out
that two monolayers of the raft are asymmetric with respect to each other.
THE SIGNAL TRANSDUCTION IN THE ARCHEAL PHOTOSENSORIC
COMPLEX NpSRII:NpHtrII AS STUDIED BY MOLECULAR DYNAMICS
SIMULATIONS
1
2
Orekhov P.S. , Klose D. , Klare J.P.2, Mulkidjanian A.Y.2,3, Shaitan K.V.1,
Steinhoff H.-J.2
1
Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia; 2Fachbereich Physik, Universität
Osnabrück, Osnabrück, Germany; 3A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology,
Moscow State University, Moscow, Russia
ps.orekhov@gmail.com
Bacterial and archeal signaling systems share similar two-component architecture and are highly
homologous. The central role in these systems belongs to the histidine kinase CheA, which is bound
along with the CheW protein to the tips of thetransmembrane receptors. Transmembrane receptors
organized in trimers-of-dimers recieve various signals and convey them to thekinases: a single
conformational disturbance arising in the receptor upon its activation appears to be transduced along
the receptor molecule of 20-30 nm in length to the tip region, where it alters kinase activity of the
bound CheA and eventually changes cell mobility.
Adjusting of the TCSs to the current level of input signal is furnished by a reversible methylation
process of specific Gluresidues in the cytoplasmic domain of the receptors. Constitutively active CheR
methylates these residues, while CheB catalyzes the competing process of demethylation and is active
only whenphosphorylated. Since only the activated form of CheA phosphorylates CheB this scheme
grounds a robust feedback mechanism called adaptation.
We performed multi-scale MD simulations of the trimer ofNpHtrII:NpSRII in methylated and
demethylated states to reveal molecular mechanisms of signal trunsduction and kinase
activationmaking use of strong analogy between activation and adaptation processes.
Upon the methylation/activation of the complex the interacting with CheA tip region does not
undergo any significant structural rearrangement but rather its dymanics changes. We suggest a
universal model of signaling in bacterial and archeal receptors:different conformational input signals
cause distinct pattern of dynamical changes along the trimer modulating CheA activity via dynamical
allostery.
77
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ЯДРЫШЕК ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ,
ПОДВЕРГАЮЩИХСЯ ДЛИТЕЛЬНОМУ ВЛИЯНИЮ
ПОВЫШЕННЫХ ДОЗ ИЗЛУЧЕНИЯ РАДОНА
Ааль А.А.
ФГБОУ ВПО Кемеровский государственный университет, Кемерово, Россия
alex.aal@yandex.ru
В последние годы существенно возрос интерес к экогенетическим и биомедицинским
проблемам, связанным с воздействием на население радона и дочерних продуктов его распада.
Биологические, в том числе и генетические последствия от длительного воздействия альфа излучения изучены недостаточно, в связи с чем представляется актуальным подбор методов и
критериев, позволяющих оценить радиационные риски различных групп населения,
подвергающихся сверхнормативным дозам облучения от радона. Известно, что из всех клеток
крови лимфоциты наиболее чувствительны к воздействию ионизирующей радиации.
Целью настоящей работы является изучение влияния длительного воздействия
повышенных доз облучения радоном на морфометрические и количественные показатели
ядрышек лимфоцитов детей и подростков.
Группа, экспонированная радоном, состояла из 25 учащихся школы-интерната г. Таштагол
Кемеровской области, подвергающихся в условиях проживания и обучения сверхнормативному
облучению от радона. Группа контроля включала 15 детей и подростков, проживающих в селе
Зарубино Кемеровской области в условиях отсутствия выраженного загрязнения окружающей
среды по радиационным и химическим показателям. Материалом для исследования послужили
мазки периферической крови.
Площадь ядрышек измерялась в микрометрах, для чего ПП «ImageJ» калибровали с
помощью объектмикрометра ОМО (ГОСТ 7513-56). Статистическую обработку производили с
помощью пакета программ STATISTICA 6.0 (лицензионное соглашение 74017-640-00010657177). Достоверность отличий между группами обследования оценивали с использованием
U – критерия Манна – Уитни. Различия считали достоверно значимыми при p<0,05.
Статистически достоверные отличия по показателю средней площади ядрышек выявлены
только для больших лимфоцитов, в группе экспонированной радоном данный показатель
составил 2,03 ± 0,44 мкм, а в контрольной-1,78 ± 0,23 мкм (p = 0,0316).
Показано влияние повышенного радиационного фона на количество ядрышек в ядрах
лимфоцитов периферической крови. В экспонированной радоном группе средние значения
частоты выявления лимфоцитов с одним ядрышком составили 73,79 ± 14,14%, с двумя
ядрышками- 19,15 ± 9,95%, с тремя ядрышками-4,36 ± 4,42%, для контрольной группы
соответствующие значения составили 87,14 ± 6,37%, 12,14 ± 6,03% , 0,56 ± 1,53%, отличия всех
средних значений являются достоверными. Аналогичные результаты были получены для
группы ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС.
ВЛИЯНИЕ ПРОЛОНГИРОВАННОЙ ГИПОТЕРМИИ НА АКТИВНОСТЬ И
КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МОНОАМИНООКСИДАЗЫ МОЗГА КРЫС
Абдуллаев Р.А.1, Абдуллаев В.Р.2
1
НОУ ВПО Институт «ЮЖДАГ»; 2ФГБОУ ВПО Дагестанский государственный
университет, Махачкала, Россия
vagab@mail.ru
Для изучения кинетических свойств митохондриальной МАО головного мозга интактных и
охлажденных животных, и характеристики различий между ними мы измеряли зависимость
начальной скорости реакции от концентрации серотонина – специфического субстрата МАО
типа А.
Кривая зависимости начальной скорости [V] серотонин-дезаминазной активности МАО
митохондрий мозга интактных крыс от начальной концентрации [S] серотонина имеет
гиперболический характер. При этом, построенный по методу двойных обратных величин
Лайнуивера-Берка график подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментена и имеет линейный
78
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
характер. Вычисленные из графика величины кажущихся Км и Vmax для митохондриальной
МАО мозга интактных крыс составили 0,50 ± 0,03мМ И 8,33 ± 0,47нМ NН3 на 1 мг белка за 1
мин. При изученных концентрациях серотонина коэффициент кооперативности Хилла близок к
1.0, что свидетельствует об отсутствии кооперативных взаимодействий между центрами
связывания серотонина у МАО мозга крыс в состоянии нормотермии.
У животных после кратковременной глубокой гипотермии кинетические параметры
окислительного дезаминирования серотонина в митохондриальной фракции головного мозга,
по сравнению с аналогичными показателями у интактных животных существенно не
отличаются.
Активность МОА у животных, подвергнутых пролонгированной глубокой гипотермии,
измеренной при низких концентрациях серотонина, оказалась существенно выше, чем у
интактных крыс. При этом параллельно со снижением превращения фермент-субстратного
комплекса (Vmax – 1.25±0.08нМ NН3/мг белка), снижается и сродство фермента к субстрату
(0.83±0.04 мМ).
Показатели энергии активации окислительного дезаминирования серотонина в
митохондриях мозга кратковременно охлажденных крыс, оставались в пределах тех же
величин, которые были найдены у интактных животных. У животных после двухчасовой
пролонгированной гипотермии при минимальных концентрациях субстрата (0.031 и 0.062 мМ)
эффективность окислительного дезаминирования серотонина митохондриальной МАО мозга
повышается по сравнению с таковой у интактных крыс в среднем на 40%.
Снижение величин Еа свидетельствует об изменении температурной чувствительности
МАО при ее инкубации с субстратом в области физиологических концентраций.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ИНТЕГРАЦИИ
МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК В ЯДЕРНОМ ГЕНОМЕ, ИНДУЦИРОВАННОЙ
ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИЕЙ
Абдуллаев С.А.
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
Пущино, Россия
abdullaev.iteb@rambler.ru
Перенос новых фрагментов митохондриальной ДНК (мтДНК) в ядерный геном принято
рассматривать как постоянный и динамичный процесс, формирующий numt-псевдогены. В
настоящее время локализация numt-псевдогенов в ядерном геноме показана у многих эукариот.
Их можно рассматривать не только как нейтральный полиморфизм; они могут быть сопряжены
с онкогенезом, со старением и с генетическими заболеваниями. Экспериментальное выявление
numt-вставок, возникающих de novo, ограничивается из-за наличия многочисленных гомологий
мтДНК, конститутивно существующих в ядерных геномах эукариот. Возникновение de novo
numt-вставок в ядерную ДНК (яДНК) выявляли у эмбрионов кур (Gallus gallus), изъятых из яиц,
облученных рентгеновскими лучами. Образцы яДНК печени эмбрионов были очищены от
свободной мтДНК двукратным гель-электрофорезом. Для выявления numt-вставок в яДНК
контрольных и выживших эмбрионов (из облученных яиц) были проведены ПЦР анализы с
использованием 11 пар праймеров мтДНК.
ПЦР с яДНК контрольной группы не выявило наличие в них гомологий мтДНК,
амплифицируемые с подобранными праймерами. ПЦР с яДНК восьми эмбрионов из
облученных яиц показали, что в яДНК двух эмбрионов появились амплифицируемые сайты
мтДНК. Стабильно выявляются ПЦР-амплификации 3-х локусов мтДНК в яДНК от одного
эмбриона и 4-х локусов в яДНК от другого эмбриона. Полученные данные указывают, что из
восьми выживших эмбрионов из облученных яиц только у двух произошла интеграция
крупных фрагментов мтДНК в ядерный геном. Нуклеотидный анализ секвенирования ПЦРампликонов синтезированных на матрицах этих яДНК показал, что их последовательности
идентичны мтДНК и точно охватывают сайты указанных генов и участок D-loop. Анализ
нуклеотидной последовательности ПЦР-ампликонов, интегрированных в яДНК печени
эмбрионов, показал также, что они, по сравнению с исходными последовательностями
указанных сайтов мтДНК, содержат повреждения в виде одиночных нуклеотидных
79
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
полиморфизмов. В основном они обусловлены двумя-тремя заменами одиночных оснований
или делеций на анализируемом локусе мтДНК.
Таким образом, полученные экспериментальные данные указывают, что ионизирующая
радиация, которая вызывает деструкцию мтДНК и двунитевые разрывы яДНК и активацию
систем их репарации, может рассматриваться как важнейший агент способный индуцировать
формирование de novo numt-псевдогенов.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 08-04-00163.
ВЛИЯНИЕ САХАРОЗЫ НА ЭЭГ КРЫС ПРИ ГИПОТЕРМИИ
Исаева Э.И., Маллаева Л.М., Абдурахманов Р.Г.
ФГБОУ ВПО Дагестанский государственный университет, Махачкала, Россия
radik72@mail.ru
Работа головного мозга основана на ритмах различной частоты, генерируемых набором
пейсмекерных систем. Пейсмекеры расположены как в новой коре, так и в подкорке. Их
частоты перекрывают диапазон от долей герца до сотен герц. Эволюционно подкорка является
более древней структурой. Поэтому пейсмекеры подкорки должны генерировать более
медленные ритмы. Эти ритмы должны обеспечивать протекание самых первых процессов
жизнедеятельности. Кора мозга более молодая структура. Температурные зависимости ритмов
коры и подкорки могут быть различными, так как структуры, порождающие эти ритмы
эволюционно разновозрастные. Состояние гомойотермного животного, при которых
температура тела ниже нормальной, называются гипотермическими. Ранее нами было показано,
что введение мочевины и ее аналогов при гипотермии снижает критическую температуру для
ЭЭГ. Одна из рабочих гипотез состоит в том, что ЭЭГ становится плоской из-за того, что в
мозге развивается отек нейронов, сокращение экстраклеточного пространства и, как следствие,
прекращение генерации биопотенциалов. Добавление в кровь осмотически активных веществ,
может снять или предотвратить отек и тем самым снизить критическую температуру. Сахароза
используется в качестве осмотически активного вещества при различных экспериментальных
вмешательствах у животных.
Введение сахарозы в дозе 3мМ/100г веса тела амплитуда колебаний сначала увеличивается
при гипотермии, а потом снижается и, наконец при температуре тела ниже 20°С становится
плоской. При согревании тела после достижения критической температуры электрическая
активность мозга постепенно восстанавливается. Распределение потенциалов и спектр
мощности также закономерно изменяются в цикле охлаждение-согревание. Таким образом,
введение сахарозы не привело к снижению критической температуры. Однако при температуре
тела 19-20°С амплитуда и частота ЭЭГ все еще довольно высоки. В отличие от мочевины,
сахароза не проникает через гематоэнцефалический барьер. Однако она является более
эффективным осмотиком, и поэтому должна эффективно извлекать воду из тканей в т.ч. из
мозга. Поэтому можно было ожидать, что введение сахарозы снизит критическую температуру.
Восстановление электрической активности при согревании на фоне введения сахарозы
происходит при более низких температурах тела. Возможно, этот эффект также обусловлен
осмотическими свойствами сахарозы.
ПРОЛОНГИРОВАНИЕ УМЕРЕННОЙ ГИПОТЕРМИИ СНИЖАЕТ
ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
В КРОВИ КРЫС
Аль Рабии М.А.М., Астаева М.Д., Кличханов Н.К.
ФГБОУ ВПО Дагестанский государственный университет, Махачкала, Россия
klich-khan@mail.ru
Гипотермия в терапевтических целях используют в нейро- и кардиохирургии, а также для
защиты тканей от ишемических повреждений. Случайная, или непреднамеренная гипотермия
развивается у гомойотермов, в том числе и у человека, под влиянием неблагоприятных
внешних условий (метеорологических или при погружении в холодную воду), достаточных по
80
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
интенсивности для снижения внутренней температуры тела. У ненаркотизированных
организмов начальные этапы гипотермии характеризуются развитием холодового стресса, что в
свою очередь приводит к активации свободнорадикальных процессов (СРП) в тканях,
имеющих важные физиологические последствия. В то же время неизвестно как зависит
интенсивность СРП от длительности гипотермии.
Для оценки прооксидантно-антиоксидантного состояния плазмы крови и эритроцитов крыс
нами исследовано содержание продуктов окислительной деструкции липидов (малоновый
диальдегид, МДА) и белков (карбонильные группы) мембран, а также активность
антиокислительной системы клеток при умеренной гипотермии разной длительности. Общую
гипотермию вызывали наружным охлаждением. За 30 мин температуру тела снижали до 30°С
(кратковременная умеренная гипотермия), а затем эту температуру тела поддерживали в
течение 90 и180 мин (пролонгированная гипотермия). При кратковременной гипотермии
незначительно возрастает уровень МДА в плазме крови, но по мере пролонгирования
гипотермии его содержание достоверно снижается. В эритроцитах содержание МДА при
кратковременной гипотермии незначительно снижается, а с удлинением времени гипотермии
возрастает до уровня контроля. Количество карбонильных групп в белках плазмы и мембран
эритроцитов при кратковременной гипотермии возрастает на 110% и 88%, соответственно.
Степень карбонилирования плазменных белков при прологировании гипотермии снижается и
через 3 ч составляет 64,7% от уровня контроля. В белках мембран эритроцитов это снижение
составляет 48% относительно контроля. Содержание восстановленного глутатиона в
эритроцитах через 90 мин гипотермии снижается на 11%, но через 3 ч гипотермии его уровень
повышается до контрольных значений.
Таким образом, при пролонгировании умеренной гипотермии существенно снижается
интенсивность СРП в крови. Механизм такой перестройки СРП в крови предстоит выяснить.
ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДОВ НЕЛИНЕЙНЫХ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНЫХ
СИСТЕМ В ОЦЕНКЕ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ СИГНАЛОВ ПРИ АПНОЭ
Андреева А.
ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет
Министерства здравоохранения РФ, Екатеринбург, Россия
anastasiia.andreeva@gmail.com
Апноэ – временная остановка дыхания во сне, которая может происходить во время сна
многократно и длится более десяти секунд. В таких случаях из-за отсутствия необходимого
количества кислорода может наблюдаться гипоксия. Диагностируют данное заболевание с
помощью полисомнографического исследования – метода длительной регистрации различных
функций организма во время сна. Регистрация параметров исследования осуществляется в
течение всего сна (6 – 8 часов).
В связи с отсутствием прямых клинических и электроэнцефалографических признаков, по
которым можно было бы предсказать остановку дыхания, возникла необходимость в
исследовании биоэлектрических сигналов с помощью математического аппарата нелинейной
динамики, теории динамического хаоса и нейронных сетей. Можно предположить, что
состояние, предшествующее апноэ, формируется под влиянием совокупности различных
факторов внешней среды и внутренних процессов нервной системы.
Теоретическая часть работы базируется на результатах системного анализа
электрофизиологической информации методами нелинейной динамики для установления
закономерностей в работе нелинейных живых систем. Практическая составляющая работы
сопряжена с поиском диагностических маркеров заболеваний на основе использования подхода
искусственного интеллекта, а также разработке соответствующих программных продуктов для
его реализации. Предметом исследования служили данные полисомнографического
исследования лиц, обследованных на базе АНО «Клинический институт мозга».
Исходные данные проанализированы в рамках методов описания сложных нелинейных
динамических систем: псевдофазовые и фазовые портреты, временная задержка и размерность
пространства вложения, показатель Ляпунова, время забывания начальных условий, эволюция
81
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
фазового объема, аттракторы фазовых траекторий, энтропия Колмогорова, показатель Херста,
спектральный анализ.
В частности, установлено, что сложность аттрактора зависит от степени функционального
состояния соответствующей физиологической системы человека. Анализ хаотических
процессов позволил идентифицировать поведение динамической системы, прогнозировать ее
временные характеристики и реконструировать аттрактор. Исследования различных типов
сигналов показали, что чем сложнее аттрактор системы, тем в более спокойном и здоровом
состоянии находится «система», а при апноэ степень хаотичности снижается. Отличительной
особенностью данного исследования является синтез методов нелинейного анализа с
нейронными сетями, основное внимание уделено поиску решений, на основе которых можно
строить предположения о времени начала приступа.
ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ ФИТОГОРМОНАЛЬНОГО СТАТУСА В
ДИНАМИКЕ ПРОРАСТАНИЯ СЕМЯН ЯЧМЕНЯ, ОБЛУЧЁННЫХ В
СТИМУЛИРУЮЩИХ ДОЗАХ
Битаришвили С.В.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
радиологии и агроэкологии РАСХН, Обнинск, Россия
2pilotdrinkins@mail.ru
Применение ионизирующих излучений в сельском хозяйстве основано на их
биологическом действии на живые организмы, в частности, на культурные растения. В основе
повышения продуктивности сельскохозяйственных растений с помощью радиационных
технологий лежит явление радиационного гормезиса, когда при воздействии ионизирующих
излучений проявляется стимулирующий эффект малых доз облучения.
Положительный эффект в растениеводстве дает предпосевное облучение семян. В этом
случае ионизирующее излучение стимулирует прорастание и увеличение процента всхожести
семян. Основной механизм стимулирующего действия малых доз ионизирующих излучений на
растения заключается в усилении синтеза рибосомальных РНК и ДНК, структурных белков,
ферментов, липидов. Ключевую роль в этих процессах играют фитогормоны, являющиеся не
только основными регуляторами ростовых и морфогенетических процессов, но и адаптивных
реакций.
В исследованиях механизмов гормональной регуляции растений за последние годы был
достигнут существенный прогресс. В частности интенсивно изучаются: рецепторы
фитогормонов и системы трансдукции гормональных сигналов.
Основной проблемой использования предпосевного облучения семян в сельском хозяйстве
является невоспроизводимость эффекта стимуляции в полевых условиях. Так как
регистрируемые морфологические эффекты не позволяют сделать однозначный вывод о
механизмах радиационного гормезиса, необходимо проведение комплексных исследований, с
уделением особого внимания биохимическим изменениям в облучённых растениях.
Адаптирована методика оценки концентраций фитогормонов в облучённых проростках
ячменя посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии. Получены данные о
морфометрических особенностях проростков облучённых в низких дозах семян ячменя и их
ферментном статусе. Ведётся работа по определению изменения концентраций фитогормонов в
динамике прорастания облученных малыми дозами семян, а так же исследования по
выяснению механизмов активации синтеза фитогормонов и особенностей их взаимодействия,
обуславливающих эффект стимуляции при воздействии γ-облучения на ранних этапах
онтогенеза.
82
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МОДИФИКАТОРОВ ПОВЕРХНОСТНОГО
МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА НА ПАЛЬМИТАТ/Сa(2+)ИНДУЦИРОВАННОЕ ПОВЫШЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ОДНОСЛОЙНЫХ
ЛИПОСОМ И ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ
Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В.
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
Пущино, Россия
bekonik@rambler.ru
Физическое состояние липидных мембран зависит от электростатических эффектов на
поверхности мембраны. Как правило, температура фазового перехода понижается в мембранах
с высоким поверхностным зарядом. В настоящей работе изучено влияние катионных и
анионных мембранотропных агентов и ионного состава среды, которые модулируют
поверхностные свойства мембран, на пальмитат/Са(2+)-индуцированное изменение
проницаемости липосомальных и митохондриальных мембран. Предполагается, что
повышение проницаемости мембран, вызванное добавлением длинноцепочечных насыщенных
жирных кислот (преимущественно, пальмитиновой) и ионов кальция, происходит по
механизму хемотропного фазового перехода и сопровождается образованием короткоживущей
липидной поры в бислое. Установлено, что катионный детергент CTAB ингибирует
образование липидной поры в липосомальной мембране и митохондриях, в то время как
анионный детергент SDS облегчает ее образование. Включение в состав липосом
отрицательнозаряженного фосфолипида кардиолипина приводит к облегчению образования
липидной пальмитат/Са(2+)-индуцированной поры. Изменение состава инкубационного буфера
митохондрий и липосом путем замены сахарозы на KCl при сохранении постоянной
осмолярности раствора приводило к снижению пальмитат/Са(2+)-индуцированной
проницаемости мембран. Полученные данные можно объяснить влиянием ионов калия и
мембранотропных агентов на поверхностный потенциал мембраны. Экранируя отрицательный
заряд мембраны, KCl будет препятствовать связыванию анионов жирной кислоты с кальцием в
мембране и тем самым препятствовать открытию поры. В то же время SDS, несущий
отрицательный заряд, увеличивает поверхностный потенциал бислоя и, вероятно, за счет этого
активирует образование липидной поры.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ №12-04-00430-а и стипендии
Президента РФ (СП-2697.2013.4).
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ Са(2+)-ЗАВИСИМОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 В
ИНДУКЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ
МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ И МЕХАНИЗМЕ ВЫХОДА
ПРОАПОПТОТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ ИЗ МИТОХОНДРИЙ
Белослудцева Н.В.
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
Пущино, Россия
natago_imagination@rambler.ru
В настоящей работе индукция неспецифической проницаемости внутренней
митохондриальной мембраны проницаемости и активация фосфолипазы А2 осуществлялась
путем нагрузки митохондрий ионами Sr(2+), чтобы устранить возможность открытия
«классической» MPT поры (mitochondrial permeability transition pore). Показано, что после
аккумуляции 1.2-1.4 мМ Sr(2+) наблюдается необратимое повреждение митохондрий,
приводящее к массированному выбросу ионов Sr(2+) и К(+) из органелл, падению мембранного
потенциала, высокоамлитудному набуханию митохондрий. С помощью Вестерн-блот анализа
установлено, что после накопления Sr2+ в митохондриях и их последующем осаждении, в
инкубационной среде присутствует вышедший из межмембранного пространства органелл
цитохром с. Это свидетельствует о том, что параллельно с процессом Sr(2+)-индуцированного
нарушения функционирования митохондрий происходит открытие неселективной поры во
83
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
внутренней мембране органелл и выброс из них проапоптотического белка. Эти процессы не
ингибируются известным блокатором MPT поры – циклоспорином А. Методом газовой
хроматографии было показано, что эти изменения сопровождаются увеличением уровня
свободных жирных кислот в митохондриях (содержание пальмитиновой кислоты
увеличивалось с 3.19 ± 0.01 до 3.54 ± 0.26, стеариновой кислоты - с 2.39 ± 0.39 до 3.14 ± 0.47
мкг/мг белка). Все эти данные свидетельствуют о том, что при загрузке митохондрий ионами
Sr(2+) происходит активация фосфолипазы А2, накопление свободных жирных кислот (в
частности, пальмитиновой и стеариновой – которые связывают Са2+(Sr2+) с высоким
сродством) и индукция неспецифической поры. Таким образом, выброс из митохондрий
цитохрома с и других проапоптотических белков может происходить не только при добавлении
экзогенной жирной кислоты (как это было показано ранее), но и при их эндогенном накоплении
вследствие активации фосфолипазы А2. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта
РФФИ №12-04-00430-а и стипендии Президента РФ (СП-2697.2013.4).
ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ПОЛЯ МЕТРОВОГО ДИАПАЗОНА НА
ДИНАМИКУ УРОВНЯ КАТАБОЛИТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ
ЛИПИДОВ У КРЫС
1
2
Богачева Е.В. , Перов С.Ю. , Хотулева А.Г.3, Ненашева Р.А.3, Помыканова Ю.С.3
1
ГБОУ ВПО Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н.Бурденко
Министерства здравоохранения РФ, Воронеж; 2ФГБОУ ВПО Московский
государственный университет им. М.В.Ломоносова; 3ФГБУ Научно-исследовательский
институт медицины труда РАМН, Москва, Россия
elenav567@gmail.com
В условиях постоянно увеличивающегося уровня облучения человека техногенными
электромагнитными полями (ЭМП) изучение их биологического действия является актуальной
задачей. Для ЭМП метрового диапазона оценка биологических эффектов вызывает
значительные затруднения, поскольку существуют особенности их взаимодействия с
биологическими объектами в ближней зоне источника. Описание ответных биологических
реакций на воздействие ЭМП метрового диапазона с биологическими объектами, в том числе и
с лабораторными животными в ближней зоне источника на основании биологических
экспериментов в имеющихся зарубежных и отечественных публикациях практически
отсутствует, не смотря на наиболее строгие предельно допустимые уровни в этом диапазоне
длин волн. Среди негативных факторов первостепенное значение в патогенезе развития
заболеваний имеет процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ). Влияние экспозиции ЭМП
на эти процессы в литературе отражены недостаточно.
Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления при действии ЭМП было
определено количественное содержание продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты, кетодиены и
карбонилы). Определение продуктов ПОЛ проводили в сыворотке крови, взятой у
лабораторных беспородных белых крысах-самцах, массой 400 г. Перед забором крови
осуществлялось облучение животных в ближней зоне источника излучения на частоте 171 МГц
при напряженности 160 В/м. В первой серии эксперимента экспозиция животных
осуществлялась однократно в течение 9 минут, с перерывами в 30 секунд каждые 3 минуты. Во
второй серии условия облучения были идентичны, однако облучение животных проводили в
течение 5-ти дней по 30 минут. В каждой из серий облучения были контрольные группы с
мнимым
воздействием.
Определение
концентрации
катаболитов
проводили
спектрофотометрически в гексановом экстракте на спектрофотометре «Cary-50» (Agilent
Technologies Inc., США) по их коэффициентам экстинкции (εM, М-1* см-1) в максимумах
поглощения против холостой пробы. Статистическая обработка результатов проводилась с
применением однофакторного дисперсионного анализа (t-критерий Стьюдента).
При проведении анализа уровня катаболитов ПОЛ в зависимости от времени экспозиции
было выявлено достоверное (р<0,05) снижение концентрации карбонилов (100,1±17,2
мкмоль/л) во второй серии экспериментов у опытной группы, по сравнению с группой
контроля (138,1±16,3 мкмоль/л).
84
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МАТРИЦЫ МЕТОДАМИ
ОПТИЧЕСКОЙ И СКАНИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Бурмистрова Т.В.1, Каманина О.А.1, Мачулин А.В.2
1
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула; 2ФГБУН Институт
биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино, Россия
tatyana.burmistrova.94@mail.ru
На сегодняшний день существует множество методов и подходов иммобилизации клеток
микроорганизмов. Среди них можно выделить метод бимодальной кремнийорганической зольгель матрицы, который обеспечивает сохранение биологической активности биоматериала и
эффективную защиту от механического, теплового и биологического воздействия. Данный
метод является экологически чистым. А процесс приготовления матрицы не требует дорогого и
энергоемкого оборудования.
В данной работе проведено исследование формирования золь-гель матрицы на основе
тетраэтоксисилана (ТЭОС), метилтриэтоксисалана (МТЭС) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) в
присутствии палочковидных дрожжевых клеток Cryptococcus curvatus ВКМ Y-3288 методами
оптической и сканирующей электронной микроскопии.
Было обнаружено, что при соотношении силановых прекурсоров 85% об. МТЭС и 15% об.
ТЭОС происходит рост вокруг каждой клетки плотной капсулы, которая состоит из шариков
различного диаметра (менее 1 мкм). С помощью оптической фазово-контрастной микроскопии
была исследована динамика процесса формирования капсул. Капсулы полностью формируются
в течение 5 часов и достигают толщины ~ 1мкм.
Работа выполнена в рамках Государственного Задания Минобрнауки РФ и гранта
Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских
ученых – кандидатов наук, заявка № МК-330.2014.4.
ОСОБЕННОСТИ ИНДУКЦИИ СА2+-ЗАВИСИМОЙ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ
ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ
ЦЕСАРОК NUMIDA MELEAGRIS L.
Ведерников А.А., Дубинин М.В., Адакеева С.И., Самарцев В.Н.
ФГБОУ ВПО Марийский государственный университет, Йошкар-Ола, Россия
aa.vedernikov90@gmail.com
Митохондрии животных не только обеспечивают клетку АТР и теплом, но и участвуют в
гибели клеток путем апоптоза и некроза. Одним из связанных с митохондриями звеньев гибели
клеток является индукция Ca2+-зависимой неспецифической проницаемости внутренней
мембраны (открытие поры). Механизмы и пути регуляции открытия поры изучены главным
образом на митохондриях печени и сердца лабораторных крыс, которые характеризуются
относительно короткой продолжительностью жизни. В то время как аналогичные механизмы
индукции неспецифической проницаемости митохондрий жизненно важных органов птиц,
которые характеризуются большей продолжительностью жизни, остаются не изученными.
В работе были использованы птицы – самцы цесарки Numida Meleagris L. «дикой» серокрапчатой популяции, разводимой в племенных хозяйствах в качестве резервного генофонда. В
качестве контрольных животных – белые лабораторные крысы-самцы. Митохондрии из печени
цесарок и крыс выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования с
последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью БСА. Кальциевую
емкость митохондрий, т.е. способность митохондрий в присутствии неорганического фосфата и
других проникающих анионов захватывать и удерживать в матриксе ионы кальция, определяли
с помощью Ca2+-селективного электрода. Индукцию Ca2+-зависимой поры оценивали по
набуханию митохондрий в сахарозной среде инкубации путем регистрации изменения
оптической плотности суспензии митохондрий при длине волны 540 нм.
Установлено, что в присутствии 1 мМ неорганического фосфата кальциевая емкость
митохондрий печени цесарок составляет 1,4 мМ в отсутствии и 2 мМ в присутствии 1 мкМ
циклоспорина А (ЦсА). В то время как кальциевая емкость митохондрий печени крыс в
отсутствии ЦсА не превышает и 100 мкМ. При указанных концентрациях кальция митохондрии
85
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
печени цесарок и крыс интенсивно набухают в сахарозной среде инкубации, что
свидетельствует об открытии неспецифической поры. В опытах на митохондриях печени крыс
установлено, что 20 мкМ гексадекандиоловая кислота в присутствии 200 мкМ Ca2+ способна
индуцировать неспецифическую проницаемость органелл по нечувствительному к ЦсА
механизму. Аналогичные данные получены и на митохондриях печени цесарок. Однако
интенсивность набухания митохондрий печени цесарок существенно менее выражена, чем
митохондрий печени крыс. Механизмы, лежащие в основе описанных выше явлений,
предполагается изучить в ходе последующих исследований.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (в рамках
государственного задания № 1365) и гранта РФФИ (№ 14-04-00688-а).
ОТДАЛЁННЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ В
ПОПУЛЯЦИЯХ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА
РАДИОАКТИВНО ЗАГРЯЗНЁННЫХ ТЕРРИТОРИЯХ
Волкова П.Ю., Гераськин С.А., Удалова А.А., Дикарева Н.С., Макаренко Е.С.,
Васильев Д.В., Кузьменков А.Г.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
радиологии и агроэкологии РАСХН, Обнинск, Россия
volkova.obninsk@gmail.com
Даже спустя 20 лет после аварии на Чернобыльской АЭС в России, главным образом в
Брянской области, сохранились участки, радиоактивное загрязнение которых значительно
превышает фоновый уровень. В то время как биологические эффекты острого радиационного
воздействия изучены относительно хорошо, механизмы влияния хронического низкодозового
облучения на биологические процессы на настоящий момент до конца не ясны. Тем не менее,
известно, что хроническое радиационное воздействие способно существенным образом
изменять значения параметров, влияющих на судьбу популяции.
Были проведено многолетнее (2003-2013) комплексное исследование популяций сосны
обыкновенной, включающее в себя анализ цитогенетических характеристик, изоферментного
полиморфизма, ферментной активности, морфологических и репродуктивных параметров,
радиоадаптации.
Показано, что частота аберраций хромосом в корневой меристеме проростков семян сосны
возрастает с уровнем радиоактивного загрязнения экспериментальных участков, причём эта
зависимость сохраняется на протяжении всех лет исследования. Показано увеличение темпов
мутагенеза в основных ферментных локусах и увеличение числа полиморфных локусов при
росте поглощённой генеративными органами растений дозы. При этом хроническое
низкодозовое воздействие не влияет на репродуктивные характеристики облучаемых сосен и
ферментативную активность в их семенах. Таким образом, многолетнее хроническое
воздействие в дозах до 130 мГр/год ведёт к увеличению частоты мутаций в изоферментных
локусах в клетках сосны обыкновенной и к возрастанию уровня аберраций хромосом, но не
оказывает воздействия на более высокие уровни биологической организации.
Помимо этого, проведён анализ генетической структуры исследуемых популяций.
Обнаружено незначительное превышение гетерозиготных генотипов в экспериментальных
популяциях, оценен вклад каждого изученного локуса во внутрипопуляционную изменчивость.
Рассчитаны генетические расстояния между популяциями, показано, что популяции,
характеризующиеся наибольшими и наименьшими значениями радиоактивного загрязнения
объединены в два различных кластера.
86
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
РАЗЛИЧИЕ ЗАВИСИМОСТЕЙ ДОЗА-ЭКСПРЕССИЯ МЕЖДУ ГЕНАМИ
СТРЕСС-ОТВЕТА ПРИ ВОЗДЕЙСТИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ В
МАЛЫХ ДОЗАХ НА НОРМАЛЬНЫЕ ФИБРОБЛАСТЫ ЧЕЛОВЕКА
Велегжанинов И.О.1, Шадрин Д.М.1, Пылина Я.И.1, Пыстина А.В.1, Шосталь О.А.1,
Белых Е.С.1, Канева А.В.1, Ермакова О.В.1, Клоков Д.Ю.2
1
ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, Россия; 2Radiological
Protection Research and Instrumentation Branch, Chalk River Laboratories, Atomic Energy
of Canada Limited, Чолк ривер, Онтарио, Канада
vellio@yandex.ru
Понимание механизмов таких специфических биологических эффектов ионизирующих
излучений в малых дозах как радиационный гормезис, адаптивный ответ и
гиперрадиочувствительность является одной из основных задач современной радиобиологии.
Несмотря на то что, экспериментальные данные свидетельствуют об участии множества
молекулярных систем стресс-ответа в реализации упомянутых эффектов, детали конкретных
механизмов остаются невыясненными. Препятствием к их выяснению является стохастический
характер проявления перечисленных эффектов даже в схожих экспериментальных условиях.
Мы предположили, что в основе специфических эффектов малых доз и стохастического
характера их проявления лежат качественные отличия зависимостей доза-реакция систем и
элементов клеточной защиты между собой. В настоящем исследовании с помощью ОТ-ПЦР
был проанализирован уровень экспрессии 22 генов, вовлечённых в клеточный стресс-ответ, в
нормальных фибробластах человека, облучённых в десяти дозах от 1 сГр до 2 Гр. Для
увеличения разрешения метода эксперименты были проведены в 7 независимых биологических
повторностях.
С использованием щелочной версии метода ДНК-комет был также проанализирован
уровень повреждений ДНК в зависимости от накопленной дозы и времени после облучения.
Обнаружена нелинейная зависимость доза-ответ по параметру репарации повреждений ДНК, а
также по экспрессии большинства проанализированных генов. Кроме того различные гены
характеризовались различными паттернами зависимости доза-экспрессия. Таким образом
сложный дискретный характер реакции элементов клеточного стресс-ответа на облучение в
малых дозах может быть причиной нелинейности и нерегулярности эффектов, проявляющихся
на более высоких уровнях организации.
ИЗУЧЕНИЕ КОЖНОЙ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ
САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ И ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ МЕТОДОМ
ЛАЗЕРНОЙ ДОППЛЕРОВСКОЙ ФЛОУМЕТРИИ
1,2
Глазков А.А. , Куликов Д.А.2,3, Атаманчук А.А.2, Рогаткин Д.А.2, Древаль А.В.1,2
1
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова; 2ГБУЗ
Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический
институт им. М.Ф.Владимирского», Москва; 3ФГБУН Институт теоретической и
экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия
aaglazkov@bk.ru
Как для сахарного диабета (СД), так и для гипертонической болезни (ГБ) характерно
развитие системных нарушений микроциркуляции крови, которые играют важную роль в
патогенезе развития осложнений данных заболеваний и, в последствии, приводят к ранней
инвалидизации и смерти больных. Развитию осложнений предшествуют субклинические
изменения микроциркуляции. Их раннее выявление может быть использовано для
своевременной профилактики осложнений. Проводить неинвазивную оценку кожной
микроциркуляции крови позволяет метод лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Ранее
нами была разработана оригинальная методика выявления микроциркуляторных нарушений у
больных СД. В данном исследовании мы провели оценку ее специфичности и возможности
использования для обследования больных с ГБ.
87
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Целью исследования являлось изучение кожной микроциркуляции крови у больных СД и
ГБ методом ЛДФ. Кожная микроциркуляция крови измерялась при помощи анализатора
ЛАКК-02 (НПП «Лазма»). В исследование были включены 10 пациентов с гипертонической
болезнью и 13 пациентов с сахарным диабетом (1 и 2 типа).
Изменения микроциркуляции у больных ГБ, выявленные с помощью разработанной
методики при оценке созданным ранее способом, значимо не отличаются от
микроциркуляторных нарушений у больных СД. Однако в ходе анализа графиков зависимости
микроциркуляции от времени было замечено, что при выполнении постурально-тепловой
пробы на ногах в момент функционального воздействия у пациентов с ГБ изменение кровотока
носит возрастающий характер, а у пациентов с СД – постоянный. Реакция на нагрев у
пациентов с ГБ также была выражена сильнее. При пробе на руках различия были менее
четкими. Данные наблюдения показывают, что оценка дополнительных параметров может быть
использована для увеличения точности и специфичности метода.
Разработанный способ в перспективе может быть использован для раннего выявления
микроциркуляторных нарушений у больных СД и ГБ, что позволит проводить своевременную
профилактику развития осложнений. Помимо этого, он может быть применен для
инструментальной оценки эффективности лечения и степени компенсации углеводного обмена,
артериального давления. Профилактика развития осложнений и качественный контроль
эффективности лечения позволит значительно снизить частоту инвалидизации и смертности
больных, улучшить их качество жизни.
ВЛИЯНИЕ ФРАКЦИЙ ЭКСТРАКТОВ ПЛАЦЕНТЫ НА
ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫХ БЕЛКОВ ЭРИТРОЦИТОВ
Говорова Ю.С., Зинченко А.В., Боброва Е.Н.
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина
ju-st7@yandex.ua
Экстракты плаценты содержат в себе широкий спектр биологически активных веществ,
благодаря чему широко применяются в биологии и медицине. В последнее время возрастает
интерес к исследованию влияния экстрактов плаценты и фракций из нее на различные
биологические структуры, в частности, эритроциты. Однако инкубирование эритроцитов с
фракциями экстрактов плаценты может вызывать определенные изменения в пространственной
организации мембраносвязанных белков, что отражается на их термоденатурации. Одним из
прямых экспериментальных подходов в исследовании термоденатурации белков является
дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК), которая позволяет оценить
термодинамические и кинетические параметры плавления макромолекул. Целью данной
работы было исследование влияния фракций экстрактов плаценты различных молекулярных
масс на термостабильность мембраносвязанных белков на примере теней эритроцитов
донорской крови с помощью метода ДСК.
Водно-солевые фракции экстрактов плаценты человека получали методом гельхроматографии. В работе исследовались фракции экстрактов плаценты следующих
молекулярных масс: до 5 кДа, 65 кДа и 250 кДа. Тени эритроцитов человека получали по
методу Доджа с некоторыми модификациями. Термограммы регистрировали на
дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (Пущино, Россия). Область
сканирования – от 20 до 100°С, скорость нагрева – 1 град/мин. Концентрация
мембраносвязанных белков эритроцитов контролировалась спектрофотометрически и
составляла около 1 мг/мл.
На термограмме денатурации суспензии теней эритроцитов в 5 мМоль натрий-фосфатном
буфере (pH 7,8) без фракций экстрактов плаценты наблюдается 4 перехода мембраносвязанных
белков эрироцитов: первый переход при температуре около 50°С, второй – 64°С, третий – 70°С,
четвертый – 81°С. Согласно общепринятой классификации данные переходы соответствуют
термоденатурации спектрина, белка полосы 3, гемоглобина и тропомиозина, соответственно.
Добавление к мембраносвязанным белкам эритроцитов фракций экстрактов плаценты
различных молекулярных масс не приводит к значительному изменению их температур
денатурации. Наиболее существенное влияние на конформационные переходы исследованных
88
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
белков оказывает фракция 65 кДа. Добавление данной фракции к мембраносвязанным белкам
эритроцитов приводит к появлению дополнительного пика денатурации при 57°С, а также
повышению интенсивности всех остальных пиков плавления белков, в среднем, на 30%.
ВЛИЯНИЕ ХЛОРИДА И СУЛЬФАТА НИКЕЛЯ НА ЛИМФОЦИТЫ
КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Грехова А.К.
ФГБУН Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва, Россия
Annagrekhova1@gmail.com
Никель является необходимым микроэлементом в организме человека, участвующим в
окислительно-восстановительных процессах и влияющим на кроветворение и углеводный
обмен. Также известно, что в количествах, превышающих физиологический уровень, никель
является генотоксичным и канцерогенным агентом.
Целью данного исследования являлось определение временных параметров и
выраженности цитотоксического действия солей никеля. Были исследованы две
водорастворимые соли никеля - сульфат и хлорид. Объектами исследования служили
лимфоциты здоровых молодых женщин, выделенные из крови путем центрифугирования в
градиенте плотности фикол-верографина (Histopaque, «Sigma»).
Суспензию лимфоцитов инкубировали при 37°С в течение 48 часов с солями никеля в
концентрациях от 50 мкмоль/л до 3000 мкмоль/л.
Методом ДНК-комет установлено, что после 1-часовой инкубации индуцировались
двунитевые разрывы ДНК, увеличивающиеся с возрастанием концентраций солей никеля от 50
мкмоль/л до 500 мкмоль/л. Доля ДНК в хвосте «ДНК-комет» при воздействии сульфата или
хлорида никеля возрастала соответственно в 2,2 и 2,6 раза, по сравнению с контролем.
Методом детергентного осаждения выявлена индукция сшивок ДНК-белок. В зависимости
от концентрации солей никеля они имели двухфазную зависимость. При концентрациях до 100
мкмоль/л определялось линейное увеличение доли ДНК, сшитой с белком. При более высоких
концентрациях солей никеля, количество сшивок ДНК-белок выходило на «плато».
48-часовая инкубация лимфоцитов с солями никеля в концентрациях от 50 мкмоль/л до 500
мкмоль/л вызывала гибель не более 8% клеток. Повышение концентрации солей приводило к
их тотальной гибели.
Проведенные исследования позволили установить дозово- и временнозависимый характер
цитотоксического действия двух солей никеля, из которых у хлорида повреждающий эффект
оказался выраженнее, чем у сульфата. Возможно, данные исследования окажутся полезными
для металлотоксикологии и при создании новых металлосодержащих цитостатиков.
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ 11-ДЕЗОКСИАНАЛОГОВ ПРОСТАГЛАНДИНА Е1 НА МОДЕЛИ ОСТРОГО ПОРАЖЕНИЯ
ПЕЧЕНИ IN VITRO И IN VIVO
Губич О.И., Шалимо А.П., Корзун В.И., Русов А.В.
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
Hubich_Oksana
Хлороформ – один из первых препаратов, широко применявшихся с середины 19 века до
1985 года в анастезиологической практике, обладающий однако высокой токсичностью и
способностью вызывать нарушение сердечного ритма, дистрофические изменения в миокарде,
цирроз и атрофию печени.
Простагландины (ПГ) – биологически активные производные полиненасыщенных жирных
кислот, способные оказывать цитопротекторное действие на клетки печени на различных
моделях токсического, ишемического и инфекционного повреждения печени.
Целью нашей работы явилось изучение гепатопротекторных свойств новой коллекции
синтетических простаноидов группы Е, синтезированных в Институте биоорганической химии
НАН Беларуси.
89
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Установлено, что обработка гепатоцитов синтетическими ПГ в присутствии 0,5% CНCl3
вызывает развитие достоверного дозозависимого защитного эффекта. Максимально
эффективной оказалась концентрация, равная 1•10-8 моль/л. По силе действия исследуемые
соединения образовали следующий ряд эффективности: ТЯ-239 (-66,7%) = ТЯ-263 (-66,6%)
>ПГ I2 (-60,5%) >ТЯ-30 (-60,9%) > 11-дезокси-ПГЕ1(-51,54%) > ЯК-109 (-18,7%) >ЯК-122 (12,19%) >>ЯК-32= ТЯ-240= 0.
Максимальный защитный эффект наблюдался в присутствии аналога ТЯ-239, обладающего
С15-фенильным кольцом в ω-цепи, расположенном в непосредственном окружении С15-оксо и
С13-аминогрупп. Наблюдаемый защитный эффект коррелировал со способностью данного
соединения на 42,7% снижать в гепатоцитах интенсивность перекисного окисления липидов,
индуцированного свободно-радикальными продуктами биотрансформации CHCl3.
Примечательно, что однократное внутрибрюшинное введение препарата ТЯ-239 крысам в
дозе 50 мкг/кг спустя 5 минут после внутрижелудочного введения масляного раствора CHCl3 в
дозе 0,5 мл/кг массы тела животного достоверно снижало развитие гепатотоксического
эффекта. Так, наблюдалось снижение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови
крыс на 312,6% к чистому эффекту CHCl3, аспартатаминотрансферазы – на 96%, щелочной
фосфатазы – на 80,1%, связанного билирубина – на 60,2%, свободного билирубина – на 58,9%.
Наблюдалась нормализации уровня общего белка и альбумина. Эти результаты коррелировали
со снижением интенсивности перекисного окисления липидов в печени. Так, активность
супероксиддисмутазы гомогената печени снижалась в этих условиях в 2,1 раза, концентрация
диеновых конъюгатов - в 6,3 раза.
Таким образом, в ходе работы выявлен простаноид, проявляющий достоверное
гепатопротекторное действие in vitro и in vivo и перспективный для дальнейших клиникобиохимических испытаний.
ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ АНИОНОВ НА ГЕНЕРАЦИЮ
АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПОД ДЕЙСТВИЕМ HE-NE ЛАЗЕРА
Гудков С.В., Иванов В.Е., Брусков В.И.
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
Пущино, Россия
S_makariy@rambler.ru
Исследовано влияние биологически значимых анионов в концентрации 1 мМ на процесс
образования перекиси водорода в воде под действием лазерного излучение с длинной волны
632,8 (0,7 мВт/мм2, 5 мин). Показано, что при выбранных условиях воздействия образуется
около 5,5 нМ перекиси водорода. Установлено, что такие органические анионы, как сукцинат-,
ацетат-, цитрат- и нитрит приводят к уменьшению образования перекиси водорода под
действием лазерного излучение с длинной волны соответствующей максимуму поглощения
одной из линий молекулярного кислорода примерно на 25-40%. Хлорид анион в концентрации
1 мМ фактически не влияет на образование перекиси водорода. Нитрат-анионы одно- и
двузамещенные фосфат-анионы, нитрат-анион увеличивают продукцию перекиси водорода под
действием лазерного излучения примерно вполовину. Бикарбонат-анион увеличивает
образование перекиси водорода, примерно в два раза. Изучено влияние биологически значимых
анионов в концентрации 1 мМ на процесс генерации гидроксильных радикалов в воде под
действием лазерного излучение с длинной волны 632,8 (0,7 мВт/мм2, 5 мин). Установлено, что
сукцинат-, ацетат-, цитрат-анионы приводят к уменьшению генерации гидроксильных
радикалов, хлорид- и нитрат-анионы существенно не влияют на генерации гидроксильных
радикалов, одно и двузамещенные фосфат-и нитрит-анионы увеличивают продукцию
гидроксильных радикалов.
90
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ИНДУКЦИЯ Са2+-ЗАВИСИМОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЛИПОСОМ
α,ω-ГЕКСАДЕКАНДИОЛОВОЙ КИСЛОТОЙ
Дубинин М.В.1, Самарцев В.Н.1, Асташев М.Е.2,3, Казаков А.С.4, Белослудцев К.Н.3
1
ФГБОУ ВПО Марийский государственный университет, Йошкар-Ола;
2
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН; 3ФГБУН Институт теоретической и
экспериментальной биофизики РАН; 4ФГБУН Институт биологического
приборостроения РАН, Пущино, Россия
Dubinin1989@gmail.com
Ранее нами установлено, что α,ω-диоловые кислоты (среди них наиболее эффективно α,ωгексадекандиоловая кислота (ГДК)) в митохондриях печени, нагруженных Ca2+ или Sr2+,
способны индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны по
нечувствительному к циклоспорину А (ЦсА) механизму. Было предположено, что в основе
такой проницаемости лежит формирование поры в мембране органелл, имеющей липидную
природу. В настоящей работе с целью выяснения молекулярного механизма этого процесса
нами исследовано действие ГДК на Сa2+-зависимую проницаемость модельных мембран
(липосом) для флуоресцентного зонда сульфородамина Б (СрБ). Показано, что ГДК, подобно
пальмитиновой кислоте (ПК), способна индуцировать проницаемость липосом для СрБ в
присутствии Ca2+. Однако кинетика выхода СрБ при индукции Сa2+-зависимой
проницаемости мембраны липосом ГДК и ПК отлична. Кроме того, установлено, что ГДК
уступает ПК в способности индуцировать проницаемость мембраны липосом для СрБ. С
помощью метода ультразвуковой интерферометрии показано, что ГДК, в отличие от ПК, не
способна индуцировать хемотропный фазовый переход в липидном бислое мембраны в
присутствии Ca2+, который, как было показано ранее, лежит в основе индукции ПК/Сa2+индуцированной проницаемости липидных мембран. Таким образом, можно предположить, что
Сa2+-зависимая проницаемость липосом, индуцированная ГДК и ПК происходит по двум
разным механизмам. Методом динамического светорассеяния выявлено, что добавление Ca2+ к
липосомам, модифицированным ГДК, индуцирует слияние липосом. Мы полагаем, что процесс
слияния липосом может сопровождаться частичным выходом СрБ из везикул вследствие
образования пор слияния.
На основе полученных результатов нами предположено, что процесс слияния мембран,
сопровождающийся формированием пор слияния, может лежать и в основе описанной ранее
ГДК/Са2+-индуцированной неспецифической проницаемости внутренней мембраны
митохондрий печени.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (в рамках
государственного задания № 1365) и грантов РФФИ (№ 14-04-00688-а, 12-04-00430-а).
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ С
ИОНИЗИРУЮЩИМ ИЗЛУЧЕНИЕМ И ГИПЕРТЕРМИЕЙ
Евстратова Е.С., Омельченко А.О.
ФГБУ Медицинский радиологический научный центр
Министерства здравоохранения РФ, Обнинск, Россия
ekevs7240@mail.ru
Известно, что ионизирующие излучения в комбинации с некоторыми химическими
агентами часто используются в медицинской радиологии для понижения радиорезистентности
опухолевых клеток. В данной работе изучено влияние одновременного комбинированного
действия химических радиосенсибилизаторов с ионизирующим излучением и гипертермией на
радиочувствительность и восстановление диплоидных дрожжевых клеток Saccharomyces
сerevisiae, штамм XS800. Исследовали влияние следующих препаратов, применяемых в
клинике: цисплатин, доксорубицин и эндоксан. В экспериментах дрожжевые клетки облучали
различными дозами g-квантов 60Со в присутствии и отсутствии исследуемых соединений, а
также подвергали воздействию гипертермии. Основным тестом, использованным в данной
работе, является выживаемость, т.е. способность облученных клеток к бесконечному
91
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
размножению, определяемая по их способности образовывать видимые невооруженным глазом
макроколонии.
С увеличением концентрации цисплатина уменьшалась способность клеток
восстанавливаться от радиационных повреждений. Однако препарат влиял на
радиочувствительность клеток во время облучения в меньшей степени, чем доксорубицин, при
котором радиочувствительность клеток повышалась в 3,7 раза. Полученные данные указывают
на то, что ингибирование восстановления происходит не за счет нарушения самого процесса
восстановления, а благодаря формированию в условиях комбинированных воздействий
необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.
Показано, что синергическое взаимодействие гипертермии с химическими агентами
регистрируется лишь в определенном диапазоне действующих температур, причем внутри
этого диапазона имеется оптимальная температура, приводящая к максимальному
синергичекому взаимодействию. Повышение концентрации препаратов приводило к смещению
максимального синергизма в область более высоких температур. Механизм синергического
взаимодействия обусловлен взаимодействием субповреждений, индуцируемых каждым
агентом и которые не являются эффективными при их раздельном применении. Повышение
действующей температуры приводит к повышению числа термических субповреждений, что
обусловливает возрастание коэффициента синергизма. Дальнейшее повышение температуры
приводит к снижению синергизма за счет сокращения продолжительности комбинированного
воздействия и уменьшению числа субповреждений от химического агента.
ИЗУЧЕНИЕ МЕМБРАННОГО МЕХАНИЗМА ПРОТИВОВИРУСНОГО
ДЕЙСТВИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ (ПЭ) ПОЛИСТИРОСУЛЬФОНАТА СО
СТЕПЕНЬЮ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ 8 И ПОЛИАЛЛИЛАМИНА С
МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 6 КДА С ПОМОЩЬЮ
ФОСФОЛИПИДНЫХ МОНОСЛОЕВ
Ермакова А.А., Контаров Н.С., Юминова Н.В., Зверев В.В.
ФГБУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток
им. И.И.Мечникова РАМН, Москва, Россия
anna-andreevna@mail.ru
Известно, что полиэлектролиты обладают повреждающим действием на вторичную
структуру белков и ферментов. Также известно, что некоторые ПЭ обладают выраженным
иммуностимулирующим действием в отношении Т- и В-лимфоцитов. Однако, на данный
момент практически ничего не известно о влиянии используемых в работе ПЭ на вирусные
белки и вирусную оболочку. В связи с чем, подробное изучение механизмов противовирусного
действия различных полиэлектролитов позволит создать научно-практическую базу для
создания противовирусных химиопрепаратов на полиэлектролитной основе.
В данных исследованиях впервые изучен мембранный механизм противовирусного
действия полиэлектролитов полистиролсульфоната (ПСС) со степенью полимеризации 8 и
полиаллиламина (ПАА) с молекулярной массой 6 кДа с помощью фосфолипидных монослоев.
Впервые для оценки воздействия ПЭ на структурно-функциональные состояния вирусной
мембраны были использованы мономолекулярные монослои, являющиеся моделями клеточных
мембран.
В ходе проделанной работы было изучено взаимодействие ПЭ с фосфолипидными
монослоями, были получены зависимости относительной площади, приходящейся на одну
молекулу фосфолипида от концентрации ПЭ. Из полученных зависимостей можно сделать
вывод об увеличение степени конденсации монослоя при увеличении концентрации ПЭ.
Данный процесс сопровождается увеличением вязкости монослоя, что в свою очередь, может
приводить к изменению структурно-функционального состояния монослоев. Проецируя
полученные результаты на мембрану вируса гриппа полученные изменения, можно
предположить невозможность процесса слияния вируса с клетками, не смотря на наличие
рецепторных взаимодействий. Так как проникновение вируса в клетку может произойти только
после слияния их мембран.
92
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ КОМПЛЕКС «МАГНИТОЦИТОМЕТР» ДЛЯ
ИССЛЕДОВАНИЯ ДИНАМИКИ МАГНИТНЫХ СВОЙСТВ КЛЕТОК
РАЗВИВАЮЩЕЙСЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ
Жолудь А.М.1, Петрова Е.А.2
1
Институт тепло- и массообмена им. А.В.Лыкова НАН Беларуси; 2Институт
физиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
zholud.anton@gmail.com
Характеризация клеточных суспензий является одной из наиболее важных задач в
современных биологических и медицинских исследованиях, для ее решения используются
различия клеток по физическим и биохимическим параметрам. Наибольшее распространение в
настоящее время получил метод проточной цитометрии, позволяющий получить ответ на
широкий спектр вопросов. Тем не менее, данный метод не может решить все задачи, и в
единичных случаях сталкивается с трудностями.
В последнее десятилетие значительно возрос интерес к методам измерения магнитных
свойств клеток. Однако, до сих пор информация о магнитных свойствах клеток остается весьма
скудной. В данных тезисах представлено исследование магнитных свойств клеток асцитной
карциномы Эрлиха при ее развитии в организме мышей. Для этих целей использовался
измерительный комплекс «Магнитоцитометр».
Метод, реализованный в измерительном комплексе, основан на видеорегистрации
протяженных траекторий двумерного движения большого числа клеток, движущихся в плоском
щелевом канале под действием скрещенных гравитационной и магнитной сил. Специально
разработанный комплекс программ позволяет определить параметры траекторий и вычислить
по ним ряд характеристик клеток. Относительная удельная магнитная восприимчивость
определяется соотношением κ = (χ–χ fl) / (ρ–ρfl).
Здесь χ, χfl – магнитные восприимчивость клетки и жидкой среды (в которой находиться
клетка) соответственно, ρ, ρfl – плотности клетки и среды соответственно.
Магнитофоретическая подвижность m, которая устанавливает связь между скоростью
движения в магнитном поле vm с характеристиками поля:
vm = m ∇(H2/2),
здесь H – вектор напряженности магнитного поля.
Измерения магнитных свойств клеток асцитной карциномы Эрлиха показало, что
относительная магнитная восприимчивость изменяется от (–1.7±0.1)·10-7 см3/г на 6 день до (–
1.2±0.1)·10-7 см3/г на 17 день роста опухоли; магнитофоретическая подвижность изменяется от
(–6.4±0,6)· 10-14 с/г на 6 день до (–4.8±0.6)· 10-14 с/г на 17 день. «Магнитоцитометр» также
позволяет регистрировать скорость оседания, которая не изменялась в данной серии
экспериментов и составила 3.6±0.2 мкм/с. Таким образом, приведенные здесь результаты
говорят о том, что магнитные свойства клеток опухоли по мере ее роста становятся более
диамагнитными.
ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА НА
ЛИМФОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА
Жорник Е.В., Баранова Л.А., Волотовский И.Д.
Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
r344@ibp.org.by
В настоящее время всё возрастающее внимание во всем мире уделяется развитию
технологий направленного получения и использования материалов в диапазоне размеров до 100
нм. Биологическая безопасность наноматериалов является важнейшим фактором,
регламентирующим их промышленное производство и внедрение нанопродуктов в
здравоохранение.
Наночастицы TiO2 являются распространенным нанопродуктом, широко используемым в
различных областях. В микроразмерном состоянии диоксид титана считается биологически
инертным. Однако степень его биологической инертности в наноразмерном состоянии мало
изучена.
93
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
В связи с этим целью работы является изучение взаимодействия наночастиц диоксида
титана с клетками лимфоцитов человека и последствий этого взаимодействия с целью оценки
биосовместимости наноматериала.
В работе было изучено влияние различных концентраций наночастиц TiO2 на
жизнеспособность лимфоцитов человека, индукцию образования АФК в культуре клеток и
структуру ДНК.
Методом окраски клеток красителем нейтральным красным показано снижение
жизнеспособности лимфоцитов человека под воздействием наночастиц диоксида титана,
количество жизнеспособных клеток при этом зависит от времени воздействия и концентрации
наночастиц.
С помощью флуоресцентных зондов DCFH-DA (дихлорфлуоресцин-диацетат) и DHE
(дигидроэтидиум) установлено, что обработка лимфоцитов наночастицами TiO2 приводит к
дозозависимому увеличению интенсивности флуоресценции зондов, что является показателем
генерации активных форм кислорода.
Методом фрагментации ДНК показано, что наночастицы TiO2 в концентрации 50 и 100
мкг/мл способны индуцировать повреждение структуры ДНК, характеризующееся появлением
на гель-электрофореграмме ее более мелких фрагментов, что свидетельствует о запуске
процессов апоптоза в клетке. Используя флуоресцентные красители аннексин V-FITC и
пропидиум йодид, было обнаружено, что наночастицы TiO2 вызывают гибель клеток путем как
апоптоза, так и некроза. Глубина повреждающего действия наночастиц увеличивалась с
увеличением времени инкубации с наночастицами.
Оценивая результаты исследований, можно говорить о потенциальном токсическом
действии наночастиц диоксида титана. Обнаруженное снижение жизнеспособности
лимфоцитов может быть результатом апоптотической гибели клеток, либо результатом
развития в клетке окислительного стресса, активации процессов перекисного окисления
липидов, и как следствие - некротической гибели, обусловленной нарушением барьерных
свойств и целостности плазматической мембраны.
СОЗДАНИЕ МАГНИТНО-ЛЮМИНИСЦЕНТНЫХ НАНОМАРКЕРОВ НА
ОСНОВЕ АПКОНВЕРТИРУЮЩИХ НАНОФОСФОРОВ И НАНОЧАСТИЦ
ОКСИДА ЖЕЛЕЗА
Зелепукин И.В.1, Никитин М.П.2,3, Деев С.М.2
1
ФГАОУ ВПО Московский физико-технический институт (государственный
университет), Долгопрудный; 2ФГБУН Институт биоорганической химии им. акад.
М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН; 3ФГБУН Институт общей физики
им. А.М.Прохорова РАН, Москва, Россия
ivan.zelepukin@gmail.com
В настоящее время различные наночастицы находят широкое применение в медицине и
биологии, в частности для визуализации опухолей и создания различных диагностических
систем.
В данной работе был произведен синтез наночастиц магнетита (МНЧ) и кристаллов
апконвертирующих нанофосфоров (НАФ), легированных трехвалентными редкоземельными
ионами Yb3+,Tm3+,Er3+ и на их основе был получен ряд магнитно-люминисцентных
наномаркеров. Магнитная составляющая в данных конструкциях может быть детектирована
методом регистрации суперпарамагнитных материалов. Данный метод позволяет в реальном
времени получить количественную информацию об интегральном накоплении частиц в
образцах. Оптический имиджинг НАФ, в свою очередь, позволяют видеть реальную картину
распределения частиц в биоткани, так как регистрация сигнала в более высокоэнергетической
части спектра в сравнении с волной возбуждения, позволяет избежать вклад от
автолюминисценции биологичексих объектов.
Предварительно синтезированные магнитные наночастицы и апконвертирующие
нанофосфоры были соединены в одну конструкцию с использованием различных покрытий:
олеиновой кислоты и сополимера молочной и гликолидных кислот (PLGA), оксида кремния,
различными гидрофильных полимеров. Наибольшую стабильность в экспериментах in vivo
94
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
продемонстрировали наноконструкции, полученные на основе PLGA. Данные агенты были
изучены методами динамического светорассеяния, электронной микроскопии, оптическими
методами регистрации фотолюминисценции. Было определено, что наноагенты имели
характерный размер 200±60 нм с включениями нескольких ядер магнетита размером 8-10 нм и
нанофосфоров с характерным размером 20 нм.
Также были изучены in vivo фармакокинетические параметры наночастиц, а именно: время
полувыведения частиц из кровотока и их биораспределение, - как на здоровых мышах, так и на
мышах с аденокарциномой молочной железы. Было получено, что время полувыведения
наночастиц из кровотока мышей с опухолью было статистически меньше, чем у здоровых
мышей. Биораспределение частиц в обоих моделях совпадало. Методами регистрации
суперпарамагнетиков и оптического имиджинга наночастицы были детектированы в опухоли.
Таким образом, в данной работе были получены эффективные магнитно-люминисцентные
наномаркеры и показана возможность их применения in vivo.
ОБРАЗОВАНИЕ ДОЛГОЖИВУЩИХ АКТИВНЫХ ФОРМ БЕЛКОВ ПОД
ДЕЙСТВИЕМ ТЕПЛА
Иванов В.Е., Карп О.Э., Гудков С.В., Брусков В.И.
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
Пущино, Россия
iwe88@rambler.ru
Активные формы кислорода (АФК) в организме возникают как при нормальном клеточном
метаболизме, так и при воздействии разных физико-химических факторов. При достижении
АФК уровня, превышающего возможности их нейтрализации антиоксидантной системой
клетки, они вызывают окислительный стресс и оказывают повреждающее действие на
биомолекулы. Значительная часть повреждений в клетке, индуцированных ионизирующей
радиацией, образуются за счет короткоживущих АФК, обусловленных радиолизом воды. После
воды основной мишенью воздействия АФК являются белки из-за их высокого относительного
содержания и чувствительности к окислению.
Известно, что под действием рентгеновского излучения образуются долгоживущие
активные формы белков (ДАФБ). Установлено, что ДАФБ являются источником вторичных
свободных радикалов, вызывающих дальнейшее окисление белков и других биомолекул,
включая ДНК.
Ранее было установлено, что тепло вызывает образование АФК в водных растворах и что в
растворах бычьего сывороточного альбумина (БСА), гамма-глобулина (ГГ) при умеренной
гипертермии образуются ДАФБ, которые генерируют АФК.
В данной работе впервые исследована зависимость образования H2O2 от времени после
воздействия тепла (45°С, 2 ч) в растворах БСА, ГГ. Образование Н2О2, индуцированное ДАФБ
в растворах БСА и ГГ под влиянием тепла, измеряли методом усиленной хемилюминесценции
в системе люминол – пара-йодофенол – пероксидаза.
При концентрациях ГГ – 2 мкМ и БСА – 10 мкМ наблюдался максимальный эффект.
Данные концентрации были использованы в дальнейшем для измерения содержания H2O2 в
течение 6 ч после теплового воздействия. В контрольном растворе без белка концентрация
H2O2 составляла около 4-5 нМ и уменьшалась к 6 ч до 1 нМ. В растворе БСА наблюдалось
плавное увеличение концентрации H2O2 в течение 4 ч, а затем быстрое ее уменьшение к 6 ч. В
случае ГГ происходил рост ее концентрации до 1 ч с последующим уменьшением к 6 ч. Можно
полагать, что в течение времени полужизни ДАФБ (около 4 ч) происходит интенсивная
генерация H2O2, приводящая к росту ее концентрации для БСА в течение 4 ч и 1ч в случае ГГ с
последующим распадом.
Кинетика продукции H2O2 при тепловом образовании ДАФБ для БСА существенно иная,
чем при рентгеновском облучении. В случае ДАФБ, индуцированных рентгеновским
облучением, через 30 мин после облучения происходит близкое к экспоненциальному
уменьшение концентрации H2O2. Это различие может быть обусловлено разным соотношением
отдельных видов АФК, генерируемых при радиолизе воды и при тепловом воздействии.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 13-04-00730-а.
95
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ОСОБЕННОСТИ РОСТА КЛЕВЕРА ПОСЛЕ ПРЕДПОСЕВНОГО ОБЛУЧЕНИЯ
НА РАДИОАКТИВНО ЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЕ И В КОНТРОЛЕ
Казакова Е.А.1,2, Горшкова Т.А.2
1
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
радиологии и агроэкологии РАСХН; 2Обнинский институт атомной энергетики филиал ФГАОУ ВПО «Национальный исследовательский ядерный университет
«МИФИ», Обнинск, Россия
alvaly@mail.ru
Как известно, определить влияние радиации на растения можно различными методами
биоиндикации и биотестирования, в т. ч. по морфофизиологическим параметрам растительного
организма на ранних этапах онтогенеза.
Было проведено исследование, направленное на обнаружение закономерностей реакций
проростков Trifolium repens L., претерпевших предпосевное облучение, выращенных методом
рулонной культуры и на универсальном грунте. В результате эксперимента определен диапазон
доз, стимулирующих ростовые процессы у проростков, а также дозы, при которых происходит
ингибирование роста клевера.
Исходя из сравнения высоты ростков, длины корней, количества листьев и выявленной
всхожести показано, что стимулирующая доза для развития растений находится в диапазоне
10–100 Гр, а облучение семян клевера в дозе 1000 Гр вызывает явное замедление роста
проростков.
Кроме того, установлено, как развивались растения клевера, семена которых подверглись
облучению в выявленных стимулирующих и ингибирующих дозах, на радиоактивно
загрязненной почве и на контрольном почвенном субстрате.
Исследование роста клевера в условиях дополнительной радиоактивной нагрузки показало,
что на загрязнённой радионуклидами почве ростовые процессы идут медленнее. Необходимо
отметить, что была обнаружена схожая динамика роста клевера без предпосевного облучения и
после облучения, а также выявлены характерные морфологические изменения проростков
клевера ползучего, определены количество сложных листьев и развитых листочков сложного
листа, балл их состояния, время заложения каждого нового листа, всхожесть семян и общая
длина корней проростков.
Таким образом, облучение семян Trifolium repens L. перед посевом в малых дозах вызывает
эффект радиационной стимуляции их ростовых процессов, т. е. радиационный гормезис. Но
перед высеванием семян на сельскохозяйственные угодья в зонах, подвергшихся
радиоактивному загрязнению, необходимо оценивать уровень активности изотопов в почве.
РЕГУЛЯЦИЯ ЭНДОГЕННЫХ ДЕПО-УПРАВЛЯЕМЫХ КАНАЛОВ
КАЛЬЦИЕВЫМИ СЕНСОРАМИ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА
БЕЛКАМИ STIM1 И STIM2
Камалетдинова В.О.1,2, Зимина О.А.2, Можаева Г.Н.2, Шалыгин А.В.2
1
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет; 2ФГБУН Институт
цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
elifein@mail.ru
Ионы кальция (Ca2+) - важнейший вторичный посредник, регулирующий широкий спектр
внутриклеточных процессов. В регуляции кальциевого гомеостаза и генерации кальциевых
сигналов важнейшую роль играют депо-управляемые кальциевые каналы плазматической
мембраны, активирующиеся после опустошения внутриклеточных кальциевых депо. Сигнал от
опустошенного депо к каналам плазматической мембраны передают кальциевые сенсоры белки
STIM1 и STIM2. В клетках линии HEK293 были охарактеризованы депо-управляемые
кальциевые каналы с разными электрофизиологическими свойствами: Imin, Imax, INS. Цель
этой работы выяснить отличается ли регуляция разных депо-управляемых каналов белками
STIM1 и STIM2.
96
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Методом patch-clamp в конфигурации cell-attached было показано, что в клетках линии
HEK293 в ответ на опустошение депо с помощью приложения 1 мкМ тапсигаргина (Tg) к
внешней поверхности клеточной мембраны активируются каналы Imax и INS. Последующее
добавление УТФ вызывало активацию каналов Imin, Imax и INS. При оверэкспрессии белка
STIM1 добавление 1 мкМ Tg также не вызывало активацию каналов Imin, в то время как
регистрировались каналы Imax и INS. Последующее приложение 100 мкМ УТФ вызывало
активацию каналов Imin, Imax и INS. При нокдауне кальциевого сенсора STIM1 каналы Imin
становились депо-управляемыми и активировались в ответ на добавление 1 мкМ Tg. Можно
предположить, что каналы Imin регулируются другим кальциевым сенсором, а именно STIM2.
Следующей задачей было отделить активацию STIM2 от STIM1. Белки STIM2 более
чувствительны к изменению концентрации Ca2+, чем белки STIM1, и активируются уже при
частичном опустошении депо. Методом измерения внутриклеточной концентрации Ca2+ c
помощью флуоресцентного зонда Fura-2АМ было показано, что 10 нМ Tg вызывает частичное
опустошение депо. Методом patch-clamp в конфигурации cell-attached было выявлено, что
добавление 10 нМ Tg активирует каналы Imin. При частичном опустошении депо с помощью
10 нМ Tg в клетках, оверэкспрессирующих ген STIM2 каналы Imin регистрировались
значительно чаще. В клетках с нокдауном гена STIM2 1 мкМ Tg не вызывает активацию
каналов Imin. Добавление УТФ в том же эксперименте активирует каналы Imin.
Таким образом, каналы INS регулируются только белком STIM1. Каналы Imin дозозависимо регулируются белком STIM2. По-видимому, чувствительность каналов Imin к
состоянию депо зависит от соотношения активированных белков STIM1 и STIM2. Каналы Imax
могут регулироваться как STIM1, так и STIM2.
Работа поддержана грантом РФФИ.
ОЦЕНКА УРОВНЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В КЛЕТКАХ APORRECTODEA
CALIGINOSA ИЗ ПОПУЛЯЦИЙ, ДЛИТЕЛЬНОЕ ВРЕМЯ ОБИТАЮЩИХ НА
ТЕРРИТОРИИ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ РАДИОНУКЛИДОВ И
ТЯЖЁЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ПОЧВЕ
Канева А.В., Белых Е.С., Майстренко Т.А., Шадрин Д.М., Пылина Я.И.,
Велегжанинов И.О.
ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, Россия
canewa.anuta@yandex.ru
Проблеме изучения влияния на биологические объекты малых доз как ионизирующих
излучений, так и химических токсических агентов посвящено большое число научных
исследований. В то же время механизмы формирования таких специфических эффектов
низкодозового воздействия, как гормезис, адаптивный ответ или гиперчувствительность на
всех уровнях структурно-функциональной организации окончательно не выяснены. Ещё
меньше экспериментальных данных о реакции биоты на хроническое действие
генотоксических факторов и молекулярно-клеточных механизмах, определяющих устойчивое
существование природных популяций растений и животных в условиях сильнейшего
антропогенного давления на окружающую среду.
Целью нашего исследования являлась оценка уровня генотоксических эффектов у
дождевых червей Aporrectodea caliginosa из популяций, в течение многих поколений
населяющих территории с техногенно повышенным содержанием в почвах тяжёлых
естественных радионуклидов и тяжёлых металлов.
Установлено, что детектируемая с помощью щелочной и нейтральной версии метода ДНКкомет степень повреждения ДНК беспозвоночных, длительное время обитающих на
загрязнённых территориях, не отличается от спонтанного уровня таких нарушений у животных
из контрольной популяции. В то же время скорость репарации повреждений ДНК,
индуцированных в клетках особей с загрязнённой территории дополнительным острым
облучением, была значительно выше, чем для червей с контрольных участков. Активность
эффекторной протеазы апоптоза каспазы-3 у червей с контрольного и содержащего в почве
повышенные концентрации радионуклидов и тяжёлых металлов участков достоверно не
97
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
отличались. При этом дополнительное провокационное облучение привело к увеличению
данного показателя в 2.7–2.8 раза у червей из обеих природных популяций.
Таким образом, нами выявлено увеличение эффективности функционирования систем
репарации ДНК у особей дождевых червей из популяций, обитающих в течение множества
поколений на загрязнённой радионуклидами и тяжёлыми металлами территории.
Выполнение работы поддержано грантом РБУ_а № 13-04-90351 РФФИ.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТИОФОСФАМИДА НА ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ ИОНОВ
ТЯЖЁЛЫХ МЕТАЛЛОВ МЕТОДОМ ДНК-КОМЕТ
Кожина Е.А., Стукалов С.В.
ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, Россия
e_kozhina@mail.ru
При загрязнении окружающей среды веществами, проявляющими генотоксические
свойства, следует уделять внимание не только самим этим веществам и их воздействию на
геном человека, но и их взаимодействию с лекарственными препаратами, которые используют
в медицинской практике. В рамках данного исследования было изучено совместное действие
препарата ТиоТЭФ (тиофосфамид), который применяется в противоопухолевой терапии, и
ионов ртути и свинца - широко распространённых в среде в виде солей этих тяжёлых металлов.
В качестве материала для исследования были взяты лимфоциты крови здорового человека.
После обработки лимфоцитов веществами, степень поврежденности ДНК оценивали методом
щелочного электрофореза одиночных клеток (метод ДНК-комет). Метод позволяет оценить
относительное количество двунитевых разрывов ДНК по вышедшим в гель во время
электрофореза фрагментам ДНК. В качестве основных показателей учитывали «момент хвоста»
кометы (т.е. произведение доли ДНК в хвосте на его длину) и долю ДНК, вышедшей в «хвост».
Показано, что с увеличением концентрации тиофосфамида от 5 до 25 мкг/мл, наблюдается
линейный рост показателя «момент хвоста»: Y=1568 + 127,6×С (R²=0,905, где С – конц. в-ва).
При воздействии на клетки тиофосфамидом (до 10 мкг/мл) в присутствии нитрата свинца (250
мкг/мл) также наблюдали линейный рост показателя: Y=1602 + 40,83×C (R²=0,903).
При обработке только солью свинца в той же концентрации наблюдали более выраженный
генотоксический эффект. Это может быть связано с возможным усилением тиофосфамидом
цитотоксичности ионов свинца, т.к. в этом случае некротические клетки выпадают из анализа
использованным методом. Та же закономерность проявляется и при совместном действии
ацетила ртути (100 мкг/мл) с тиофосфамидом.
Таким образом, нами выявлено как усиление цитотоксических, так и (вероятно)
генотоксических свойств солей тяжёлых металлов в присутствии «модельного»
алкилирующего
генотоксиканта
тиофосфамида,
используемого
в
химиотерапии
злокачественных опухолей. В дальнейших экспериментах планируется изучить влияние этих
веществ на активность репаративных процессов в клетках и, как следствие, их взаимное
модифицирующее влияние на проявление генотоксической активности.
ИНГИБИТОР ЭПОКСИГЕНАЗ ПОДАВЛЯЕТ ЭФФЕКТ ГЛУТОКСИМА НА
ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОНЦЕНТРАЦИЮ Са2+ В МАКРОФАГАХ
Курилова Л.С., Крутецкая З.И., Наумова А.А., Бутов С.Н., Крутецкая Н.И.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
cozzy@mail.ru
Фармакологический аналог окисленного глутатиона (GSSG) препарат глутоксим
(динатриевая соль GSSG с цисплатиной в наноконцентрации, «ФАРМА-ВАМ», Москва)
используется как иммуномодулятор и гемостимулятор в комплексной терапии бактериальных и
вирусных заболеваний, псориаза, лучевой и химиотерапии в онкологии. Однако механизмы
клеточного и молекулярного действия этого препарата далеки от полного понимания.
98
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Ранее нами было впервые обнаружено, что глутоксим увеличивает внутриклеточную
концентрацию Са2+, [Ca2+]i, вызывая мобилизацию Са2+ из тапсигаргин-чувствительных
Са2+-депо и последующий вход Са2+ в перитонеальные макрофаги крысы.
Полиненасыщенная арахидоновая кислота (АК) и продукты ее окисления являются одной
из важнейших сигнальных систем в клетках. Ферменты метаболизма АК имеют высокую
редокс-чувствительность и являются мишенью для окисляющих и восстанавливающих агентов.
C использованием ингибиторов циклооксигеназ и липоксигеназ нами ранее было впервые
показано участие циклооксигеназного и липоксигеназного путей окисления АК в действии
глутоксима на [Ca2+]i в макрофагах. В связи с этим представлялось также целесообразным
исследовать возможную роль эпоксигеназного пути окисления АК в действии глутоксима на
[Ca2+]i в перитонеальных макрофагах крысы. Для этого был использован ингибитор
эпоксигеназ антимикотический агент проадифен (SKF-525A).
С использованием флуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM впервые показано, что
преинкубация макрофагов с 100 мкМ проадифена в течение 5 мин до введения 200 мкг/мл
глутоксима вызывает значительное (на 50-60%) подавление обеих фаз Са2+-ответа,
вызываемого глутоксимом, в макрофагах. Полученные результаты свидетельствуют об участии
эпоксигеназ и/или продуктов эпоксигеназного пути окисления АК в действии глутоксима на
[Ca2+]i в макрофагах.
ВЛИЯНИЕ МЕТЕОРОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ИОНИЗИРУЮЩЕГО
ИЗЛУЧЕНИЯ НА КАЧЕСТВО И РЕПРОДУКТИВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
СЕМЯН СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ
Кузьменков А.Г., Васильев Д.В.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
радиологии и агроэкологии РАСХН, Обнинск, Россия
hakkep@mail.ru
Исследованы шесть популяций сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающих
в наиболее загрязненных радионуклидами районах Брянской области: Новозыбковском,
Клинцовском и Красногорском. Исследования проводятся с 2003 по настоящее время.
Сосна обыкновенная обладает высокой чувствительностью к воздействию ионизирующего
излучения, особенно чувствительны к повреждающим воздействиям её репродуктивные органы
отличающиеся сложностью организации и длительным генеративным циклом (более двух лет).
В нашей лаборатории изучается широкий спектр показателей: изоферментный
полиморфизм популяций сосны и ферментативная активность; выход цитогенетических
нарушений в корневой меристеме проростков семян; репродуктивные характеристики семян и
пыльцы.
Проведен анализ зависимости репродуктивной способности сосны обыкновенной от
поглощенных генеративными органами доз ионизирующих излучений и метеорологических
условий в период формирования семян.
На экспериментальных участках пробы (шишки) отбирались в конце ноября – начале
декабря. На каждом участке шишки собирали с 15–29 деревьев в пределах гомогенного
древостоя, по 30–50 шишек с каждого дерева, с высоты 1,5-2,0 метра. Шишки выдерживали до
раскрытия и высыпания семян.
Показано отсутствие достоверной зависимости изучаемых параметров: всхожесть; энергия
прорастания; среднее количество семян; процент нормальных, невыполненных и сухих семян
от поглощенных генеративными органами доз ионизирующего излучения. При этом
обнаружены достоверные корреляции: процент нормальных семян от суммы нормированных
средних температур, средней эффективной температуры, суммы осадков и гидротермического
коэффициента (ГТК) в период опыления (май); процент сухих семян от средней влажности и
процент пустых от ГТК и суммы осадков в период опыления (май); процент недоразвитых
семян от суммы нормированных средних температур и средней эффективной температуры за
период развития семян (2 года); процент сухих семян от ГТК и от средней влажности за 2 года;
всхожести от средней влажности за период развития семян; энергии прорастания от средней
влажности и от средней эффективной температуры за 2 года.
99
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Полученные данные свидетельствуют о меньшем влиянии поглощенных генеративными
органами доз ионизирующих излучений на качество и репродуктивные характеристики семян
по сравнению с метеорологическими условиями.
АССИМИЛЯЦИЯ УГЛЕВОДОВ ПРИ СВИНЦОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
РАСТУЩИХ КРЫС
Кучкарова Л.С., Кудешова Г.Т.
Национальный университет Узбекистана, Ташкент, Узбекистан
k_gulchi@mail.ru
Превышение содержания свинца в окружающей среде во многих индустриальных
регионах, приводит к тому, что ионы свинца попадают с пищей и водой в желудочнокишечный тракт.
Цель работы – исследовать влияние ионов свинца на ассимиляцию углеводов в тонкой
кишке.
Опыты проводились на крысах линии Вистар. У крыс, массой 90-100 г питьевую воду
заменяли раствором 0,01% хлорида свинца. Контрольные крысы употребляли питьевую воду.
Забой крыс проводили через неделю после обработки с последующим определением
активности панкреатической α-амилазы (Уголев, 1969), и энтеральных мальтазы, сахаразы и
лактазы (Dahlquist, 1984), содержания гликогена в печени (Данченко, Чиркин, 2010), глюкозы и
молочной кислоты в крови при помощи стандартных наборов.
Оказалось, что свинцовая интоксикация приводила к увеличению активностей
панкреатической α-амилазы (127,9±10,2 г/мин/г белка в опыте против 77,2±4,5 г/мин/г белка в
контроле), а также энтеральных мальтазы, сахаразы и лактазы (486,3±32,3; 37,2±2,4 и 3,4±0,4
мкмоль/мин/г белка в опыте против 323,7±41,2; 46,8±3,3; 6,7±0,3 мкмоль/мин/г белка в
контроле соответственно), что говорит о том, что поступление глюкозы из полости тонкой
кишки в кровоток возрастало. Содержание глюкозы крови увеличивалось, составляя 7,2±0,3
моль/л в опыте против 4,8±0,2 моль/л в контроле. Концентрация молочной кислоты также
возрастало ( 2,9±0,1 ммоль/ в опыте против 1,4±0,1 ммоль/л в контроле), а содержание
гликогена, напротив, уменьшалось (33,2±2,7 мг/г в опыте против 40,0±3,1мг/г в контроле).
Эти данные свидетельствуют о том, что свинцовая интоксикация приводит к
гипергликемии из-за увеличения активности ферментов начальной (панкреатическая α-амилаза)
и заключительной (энтеральные мальтаза, сахараза и лактаза) стадий ассимиляции углеводов в
тонкой кишке, а также уменьшения уровня депонирования глюкозы в гликоген. Повышение
содержания молочной кислоты свидетельствует о более высокой востребованности организмом
глюкозы в качестве энергетического субстрата при свинцовой интоксикации.
МЕМБРАНОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ ПЕПТИДА ДЕЛЬТА-СНА ПРИ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ СТАРЕНИИ ОРГАНИЗМА
Кутилин Д.С.1, Харченко Е.Ю.1, Бондаренко Т.И.1, Михалева И.И.2
1
ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону; 2ФГБУН Институт
биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,
Москва, Россия
jenya.xarchenko@yandex.ru
Поиск средств, замедляющих преждевременное старение и улучшающих качество жизни,
относится к приоритетным научным направлениям современной биомедицины. В этом плане
особый интерес представляет дельта-сон индуцирующий пептид – ДСИП, проявляющий
геропротекторное (Попович И.Г. и др., 2003) и антиоксидантное (Бондаренко Т.И. и др., 2012),
действие на организм, молекулярные механизмы реализации которого окончательно не
известны. Старение характеризуется «тетрадой» признаков: поражением мембран,
инактивацией ферментов, нарушением клеточного деления и накоплением балластных
полимеров, включая нуклеиновые кислоты, липиды и белки (Анисимов В.Н., 2008). Ферменты
100
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
лизосом в процессе аутофагии обновляют клеточные структуры, ликвидируя поврежденные
молекулы и органеллы.
В связи с этим целью нашей работы явилось изучение влияния ДСИП на состояние
лизосомальных мембран, которое оценивали, определяя активность кислых пептидгидролаз
(pH 4,5) (КПГ) во фракции, обогащенной лизосомами, и растворимой фракции, и по приросту
их активности в последней судили о структурно-функциональном состоянии лизосомальной
мембраны. Эксперимент выполнен на 158 белых беспородных крысах - самцах в возрасте 2-24
месяцев. Экзогенный ДСИП вводили подкожно крысам в возрасте от 2 до 24 месяцев
постнатального развития в дозе 100 мкг/кг массы тела животного курсами по 5
последовательных дней (ежемесячно).
Нами обнаружено, что активность КПГ в растворимой фракции мозга крыс увеличивается
в 6-20 и 24-мес., в сердечной мышце в 4 и 8-24 мес., а в печени в 8-24 мес. возрасте по
сравнению с 2 месячными животными, что свидетельствует о дестабилизации структуры
лизосомальной мембраны с возрастом. При введении ДСИП в течение жизни наблюдается
снижение активности КПГ в растворимой фракции мозга у 6, 12-24-мес., сердечной мышцы у 4,
6, 12, 18-24-мес., печени у 6-22-мес. возрасте по сравнению с 2 месячными животными, что
характеризует стабилизацию структуры мембран лизосом.
Таким образом, проведенное исследование показало, что ДСИП при старении обладает
мембранопротекторным действием, которое вероятно связано с его антиоксидантным
эффектом, а также влиянием на состояние биомембран путем изменения их физико-химических
параметров: ассиметрии, микровязкости, степени погружения белков в мембрану, степени их
ассоциации, снижения полярности в гидрофобной зоне бислоя, отрицательного поверхностного
заряда мембран, состава и подвижности белков и липидов.
ИЗУЧЕНИЕ ОТДАЛЁННЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АВАРИИ
НА ПОПУЛЯЦИЯХ СОСНЫ ПО МОРФОЛОГИЧЕСКИМ
ПАРАМЕТРАМ ХВОИ
Макаренко Е.С.1, Удалова А.А.1,2
1
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
радиологии и агроэкологии РАСХН; 2Обнинский институт атомной энергетики филиал ФГАОУ ВПО «Национальный исследовательский ядерный университет
«МИФИ», Обнинск, Россия
makarenko_ek_obninsk@mail.ru
После аварии на Чернобыльской АЭС было проведено много исследований человека и
биоты, подвергшихся действию высоких доз облучения. Особый интерес представляют
биологические эффекты в растительных и животных популяциях, населяющих территории с
менее выраженными уровнями воздействия. Сосна входит в список референтных видов МКРЗ в
качестве одного из самых радиочувствительных видов растений.
Целью данной работы являлась оценка биологических эффектов при хроническом
радиационном воздействии на сосну с использованием морфологических параметров хвои.
Экспериментальные участки располагаются в Брянской области, загрязненной после аварии на
Чернобыльской АЭС. Изучаемые популяции сосны растут на радиоактивно загрязненных
территориях более 25 лет. В 2011 и 2013 гг. образцы двухлетней хвои были собраны с 6
пробных площадок. По расчетам предполагаемая годовая доза для сосновых крон находится в
диапазоне 7-130 мГр. У хвоинок были определены длина, масса и степень повреждения
некрозом. На основе полученных данных рассчитывали индекс флуктуирующей асимметрии
(ФА), который отражает результат неспособности организма следовать его программе
развития.
Длина хвоинок сосны обыкновенной колебалась от 64,8 до 80,2 мм. Масса хвоинок
колебалась от 18,2 до 30,5 мг, и в 2013 г. была значимо выше на всех радиоактивно
загрязненных участках в сравнении с контрольными популяциями. Корреляционный анализ
морфометрических параметров и дозовой нагрузки выявил отсутствие статистически значимой
зависимости. Здоровые хвоинки встречались с частотой 18-81%, частично поражённые
некрозом - 17-59%, с сильным повреждением некрозом - 0.2-29%. Частота здоровых хвоинок
101
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
значимо снижается с ростом радиоактивного загрязнения в 2011 г. (r=-0,86, р<0,05). Индекс ФА
по массе изменяется от 0,040 и 0,054, значимого влияния радиационного воздействия на
данный параметр не выявлено. Колебания асимметрии длины хвоинок находятся между 0005 и
0012. Индекс ФА по длине на самых загрязненных участках значительно превышает (р<0,01)
контрольный уровень, а также увеличивается с ростом годовой дозы в 2011 г. (r=0,97, р<0,01) и
2013 г. (r= 0,75, р=0,08).
В некоторых работах, хроническое действие облучения при мощности дозы 100 мГр/год
предлагается в качестве безопасного уровня хронического воздействия для биоты на
популяционном уровне. Мы обнаружили, что морфометрические параметры сосновой хвои
нечувствительны к такому воздействию, в то время как нестабильность развития и
некротические процессы могут быть зарегистрированы в дозах около 90-130 мГр/год.
ОЦЕНКА ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ IN VITRO НА
ОПУХОЛЕВЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ
Макаренко С.А., Замулаева И.А.
ФГБУ Медицинский радиологический научный центр Министерства
здравоохранения РФ, Обнинск, Россия
makarenko7sa@gmail.com
Одной из наиболее важных проблем при лечении злокачественных опухолей является их
множественная устойчивость к целому ряду терапевтических воздействий. Предполагают, что
это явление может быть связано с наличием опухолевых стволовых клеток (ОСК), способных
сохраняться после лечения и приводить к развитию рецидивов заболевания. Известна
устойчивость ОСК к редкоионизирующему излучению и целому ряду химиопрепаратов, однако
к фотодинамическому воздействию еще мало изучена.
Целью
данной
работы
являлось
выяснение
закономерностей
накопления
фотосенсибилизатора хлоринового ряда «Фотолон» в опухолевых стволовых и не стволовых
клетках in vitro; сравнительное исследование гибели этих клеток после фотодинамического
воздействия в двух линиях клеток (меланома B-16 и рак молочной железы MCF-7).
Установлены различия в накоплении фотосенсибилизатора (ФС) в ОСК, которые
идентифицировали с помощью проточной цитофлуориметрии по формированию т.н. боковой
популяции (side population-SP), и в остальных опухолевых клетках (не-SP). В исследованном
диапазоне концентраций ФС (0,75-15,0 мкг/мл) наблюдалась прямая линейная зависимость
внутриклеточного содержания препарата от его концентрации в среде как для SP, так и не-SP
клеток изученных линий (r>0,93; р<0,01). Однако SP накапливали препарат значительно слабее,
чем остальные клетки (в 1,8 раз для B-16 и в 1,5 для MCF-7, p<0,05). Процесс накопления ФС
во времени носил нелинейный характер и различался в ОСК и основной популяции. Анализ
временных и концентрационных зависимостей показывает, что внутриклеточное содержание
ФС в ОСК (SP) обеих изученных линий статистически значимо ниже, чем в не-SP, уже через 1
ч. инкубации с препаратом, что свидетельствует о способности ОСК активно исключать это
соединение.
Несмотря на различия в накоплении ФС, было показано, что уровень гибели клеток SP и
не-SP обеих линий после облучения лазером с длиной волны 661нм и мощностью 0,06Вт
статистически значимо не различается (p<0,05) во всех использованных экспериментальных
условиях (при разной концентрации ФС (0,375-1,5 мкг/мл) и разной продолжительности
лазерного воздействия (30-60 с).
Полученные
результаты
впервые
экспериментально
обосновывают
высокую
эффективность ФДТ с точки зрения элиминации ОСК – наиболее резистентной части опухоли.
Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта РФФИ №13-04-01721.
102
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ТЕПЛОВАЯ ДЕНАТУРАЦИЯ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИКРОНОЖНОЙ
МЫШЦЫ КРЫС ПРИ ГИПОТЕРМИИ
Магомедова М.М., Загирбекова А.А., Джафарова А.М., Халилов Р.А.
ФГБОУ ВПО Дагестанский государственный университет, Махачкала, Россия
albina19764@mail.ru
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – это ключевой фермент гликолитического пути окисления
глюкозы. Исследование механизмов температурных адаптаций ЛДГ является важным шагом в
изучении патологических и адаптивных изменений в тканях животного при гипотермии.
Выяснение связи между функциональной активностью фермента и стабильностью его
структуры может прояснить механизм функционирования фермента и регуляции его
активности.
В настоящей работе нами предпринято исследование термостабильности ЛДГ мышц
гомойотермных животных при умеренной (30°С) и глубокой (20°С) гипотермии. Исследование
проведено на белых беспородных крысах. Активность ЛДГ в мышечном экстракте определяли
по убыли содержания НАДН2 в реакционной смеси в результате энзиматического
восстановления пирувата в лактат. Кинетика термоденатурации ЛДГ была исследована при
температуре 50° С.
Исследование показало, что ЛДГ мышц крыс очень чувствительна к довольно
незначительному нагреванию. За 30 мин термоинактивации скорость восстановления пирувата
в контроле снижается на 75%, при гипотермии 20°С на 56%, а при гипотермии 30°С - на 36,2%.
Таким образом, термостабильность ЛДГ контрольных животных ниже таковой
гипотермированных. Кинетика тепловой денатурации фермента при 50°С имеет две
экспоненциальные стадии: быструю и медленную, что может быть обусловлено наличием двух
денатурированных состояний фермента. По тангенсу угла наклона кинетических прямых в
координатах ln(А0/Аt) – t были вычислены константы скорости денатурации (Ктд для быстрой
и медленной фазы). Ктд быстрой фазы ЛДГ при умеренной и глубокой гипотермии на 25% и
48,8% ниже таковой контрольных животных. При этом Ктд медленной фазы при умеренной и
глубокой гипотермии, напротив, увеличиваются на 81% и 46% относительно контроля. Это
указывает на то, что при гипотермии вклад медленной фазы в термоденатурацию
увеличивается. Таким образом, гипотермия привела к температурной стабилизации
лактатдегидрогеназы и изменению вклада разных стадий в кинетику денатурации. Такая
стабилизация фермента, скорее всего, это связана с его химической модификацией при низких
температурах тела.
КОНФОРМАЦИОННЫЕ ОСОБЕННОСТИ НАТИВНОГО БЕЛКА Dps,
ЕГО АПО-ФОРМЫ И НАСЫЩЕННОГО ИОНАМИ ЖЕЛЕЗА
Мелехов В.В.1,2, Швырева У.С.2,3, Тимченко А.А.4, Озолинь О.Н.2,3,
Антипов С.С.2,3,5
1
ФГБУН Институт биологического приборостроения РАН; 2ФГБОУ ВПО Пущинский
государственный естественно-научный институт; 3ФГБУН Институт биофизики клетки
РАН; 4ФГБУН Институт белка РАН, Пущино; 5ФГБОУ ВПО Воронежский
государственный университет, Воронеж, Россия
maintain@inbox.ru
Белок Dps является ДНК-связывающим белок, а так же выполняет регуляторную и
защитную функции в клетках в различных условиях роста. Помимо этого он относится к
большому семейству белков-ферритинов. По сравнению с другими представителями этого
семейства Dps обладает рядом уникальных качеств – меньшим размером и способностью
взаимодействовать ДНК. Защитная функция белка Dps заключается в утилизации возникающих
в ходе реакции Фентона гидроксильных радикалов, посредством перевода растворимого железа
Fe2+ в насыщенное ферригидритное ядро во внутренней полости белка. Таким образом,
первичной биологической задачей Dps является не столько запасание железа, сколько защита
макромолекул от опасного сочетания ионов Fe2+ и H2O2.
103
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Целью данной работы было изучение конформационных особенностей белка Dps, что
позволит подойти к более детальному изучению его функциональной роли в клетке и расширит
понимание механизмов, лежащих в основе его антиоксидантной функции.
Для данной работы нативный Dps выделяли в соответствии с разработанной нами ранее
методикой, после чего получали его апо-форму методом ступенчатого кислотного гидролиза,
которую затем заново насыщали ионами железа в различных условиях. На каждом этапе
проведения эксперимента конформационные изменения оценивали методом АСМ по
стандартному протоколу. Насыщение ионами железа проводили при комнатной температуре на
холоде, а избыток железа удаляли хроматографически.
В ходе исследования было установлено что форма и геометрические параметры нативного
белка не отличаются от его апо-формы, но насыщение белка ионами железа, как при комнатной
температуре, так и на холоде, приводит к некоторым изменениям его конформационного
состояния. Это выражается в присоединение к сферическому додекамеру Dps частиц, по форме
и размерам, соответствующим более мелким олигомерам белка (возможно ди- или тримерам),
присутствие которых наблюдалось в растворах нативного и апо-белка. Соответствующее этому
увеличение размеров было зарегистрировано методом ультрацентрифугирования и ВЭЖХ.
Такая гетерогенность конформаций свидетельствует о зависимости процесса олигомеризации
Dps от присутствия железа и может указывать на существование альтернативных путей его
сборки. Не исключено, что минорные структуры мультифункционального белка Dps
формируются не только в искусственных условиях и от их относительного содержания зависит
его способность выполнять две разные биологические функции.
Работа выполнена в рамках госзадания Минобрнауки России № 2014/281.
ИНГИБИТОР ФОСФОЛИПАЗЫ А2 4-БРОМФЕНАЦИЛБРОМИД ПОДАВЛЯЕТ
ТРАНСПОРТ Na+ В КОЖЕ ЛЯГУШКИ
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Бутов С.Н., Крутецкая Н.И., Антонов В.Г.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
avm242@hotbox.ru
Кожа амфибий и другие изолированные эпителиальные системы являются классическими
модельными объектами для исследования механизмов транспорта ионов через биологические
мембраны. Транспорт Na+ в осморегулирующих эпителиях представляет собой сложную,
многокомпонентную систему, в работе которой принимают участие Na+-транспортирующие
белки и сигнальные каскады, локализованные в различных мембранах клетки.
Арахидоновая кислота (АК) и ее метаболиты выступают в качестве сигнальных молекул,
участвующих в процессах внутри- и внеклеточной сигнализации, и обладающих широким
спектром физиологических и патологических эффектов. В частности, многие ионные каналы
являются мишенями как для самой АК, так и для ее метаболитов. В коже лягушки
простагландины стимулируют трансэпителиальный транспорт Na+, усиливают секрецию ионов
К+ и увеличивают проницаемость апикальной мембраны для воды. В культуре кортикальных
собирательных трубочек почки мыши ингибиторы циклооксигеназ диклофенак и ибупрофен
подавляют транспорт Na+.
Одним из основных механизмов образования свободной АК является гидролиз
мембранных фосфолипидов под действием фосфолипазы А2 (ФЛА2). В связи с этим,
представлялось целесообразным исследовать возможную роль ФЛА2 в регуляции глутоксимом
транспорта Na+ в коже лягушки Rana temporaria. В экспериментах использовали ковалентный
ингибитор ФЛФ2 4-бромфенацилбромид.
Для регистрации вольт-амперных характеристик (ВАХ) кожи лягушки использовали
автоматизированную установку фиксации потенциала. В интервалах между измерениями ВАХ
трансэпителиальный потенциал (VT) кожи поддерживали при потенциале открытой цепи VOC
(VOC = VT при трансэпителиальном токе IT = 0). Из ВАХ определяли электрические
параметры кожи: ток короткого замыкания ISC (ISC = IT при VT = 0), VOC и
трансэпителиальную проводимость gT. Транспорт Na+ оценивали как амилорид-
104
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
чувствительный ISC. Статистический анализ проводили с применением t-критерия Стьюдента.
Данные представлены в виде x ± sx.
Показано, что 4-бромфенацилбромид подавляет транспорт Na+ в коже лягушки. Так,
обработка кожи 20 мкМ 4-бромфенацилбромида (по данным 10 экспериментов) снижает ISC на
39.43 ± 5.18 или 30.49 ± 3.34%, VOC – на 6.88 ± 1.32 или 28.94 ± 5.13%, а gT – на 35.16 ± 8.23
или 10.14 ± 2.08%, для приложения 4-бромфенацилбромида к апикальной или базолатеральной
поверхности кожи, соответственно. Полученные данные свидетельствуют об участии ФЛА2 и
каскада метаболизма АК в регуляции транспорта Na+ в коже лягушки.
ИЗМЕНЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ГЛЮКОЗЫ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ
ВЛИЯНИИ РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
Минасян А.Д.
Арцахский государственный университет, Степанакерт, Армения
as_minasyan@mail.ru
Известно, что воздействие рентгеновского излучения находит свое отражение в
изменениях системы крови, которая включает в себя как кроветворные органы, так и
периферическую кровь.
Было проведено исследование влияния рентгеновского излучения на некоторые
биохимические показатели периферической крови in vitro у трех возрастных групп мужчин и
женщин (18–40, 41–60, 61–80 лет). В частности, было показано изменение количества глюкозы
при воздействии вышеуказанного физического фактора, доза которого в эксперименте
составила 250 микрозиверт. Как выяснилось в ходе эксперимента, в сыворотке крови как
мужчин, так и женщин всех трех возрастных групп количество глюкозы повышалось. Так
например, у мужчин трех возрастных групп изменения выглядели следующим образом: у 18–
40-летних повышение составило 13%, 41–60-летних – 4.5%, 61–80-летних – 6.8%. Изменение
количества глюкозы периферической крови женщин были следующего характера: у 18–40летних – 22%, 41–60-летних – 16.7%, 61–80-летних – 8.1%. Как видно из исследований, с
увеличением возраста уменьшается вероятность негативного воздействия рентгеновского
излучения на кровь, а значит и на организм в целом, поскольку кровь является отражением
состояния всего организма. Предполагается, что повышение количества глюкозы в
периферической крови при воздействии рентгеновского излучения имеет место по причине
повреждения мембранных структур клеток крови (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты),
содержащие гликолипиды и олигосахариды, которые при разрушении частично превращаются
в моносахариды, например глюкозу.
ПОВЫШЕНИЕ УРОВНЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В МОЧЕ У КРЫС,
ПОДВЕРГНУТЫХ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ
Минкабирова Г.М., Абдуллаев С.А.
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
Пущино, Россия
gulchachak.mink@gmail.com
В последнее десятилетие значительно возрос интерес к исследованиям внеклеточных
нуклеиновых кислот в биологических жидкостях при изучении механизмов развития
различных патологий. Методом ПЦР в режиме реального времени было исследовано изменение
общего количества копий трансренальной (преодолевшей почечный барьер) внеклеточной
митохондриальной ДНК (вк-мтДНК) наряду с ядерной ДНК (вк-яДНК) в моче крыс, после их
рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр, и в зависимости от пострадиационного времени (от
6 часов до 30 дней). У этих же животных в моче анализировали уровень мутантных копий вкмтДНК. Мутации определяли по расщеплению CEL-I эндонуклеазой (фермент, расщепляющий
неспаренные основания) гетеродуплексов, получаемых путем гибридизации ПЦР-ампликонов
вк-мтДНК (Cyt-B - регион) облученных и контрольных образцов.
105
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Результаты показали, что уровень общего количества мтДНК и яДНК в моче облученных
крыс зависит как от пострадиационного времени, так и от дозы облучения. Так, максимальное
количество копий мтДНК и яДНК регистрировалось на 12-24-е часы после их облучения.
Количество продуктов ПЦР-амплификации вк-мтДНК в 2-3 раза выше, по сравнению таковым
вк-яДНК.
Анализ уровня мутантных копий вк-мтДНК показал, что гетеродуплексы, полученные
гибридизацией продуктов ПЦР мтДНК до облучения (контроль) и в разные сроки после
облучения, расщепляются CEL I эндонуклеазой в большей степени, чем гетеродуплексы,
полученные путем смешивания продуктов ПЦР мтДНК контрольного образца. Это указывает
на наличие радиационно-индуцированных мутаций в участках вк-мтДНК. Показано, что
мутагенез мтДНК имеет линейную зависимость от дозы рентгеновского излучения.
Максимальный уровень мутантных копий мтДНК (гена Cyt-B) приходится на 3-е сутки после
облучения.
Полученная динамика изменений количества копий общей мтДНК и мутантных копий
мтДНК в моче указывает на то, что из тканей облученных животных в пострадиационный
период в мочу элиминируются мутантные копии мтДНК. Наблюдаемая элиминация может
рассматриваться как результат избирательной деградации митохондрий, несущих мутантные
копии ДНК, так и продолжающейся клеточной гибели в тканях облученных животных.
Повышенное содержание внеклеточной мтДНК с мутациями в моче можно рассматривать как
потенциальный, чувствительный биомаркер для оценки результативности радиотерапии
опухолей, уровня генотоксического груза при радиационном поражении организма и
воздействия других генотоксических агентов.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта
№ 12-04-31070.
ИНФОРМАЦИОННО-БИБЛИОГРАФИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ НАУКИ
Митрошин И.А.1, Петров А.Б.2
1
ФГБУН Библиотека по естественным наукам РАН, Москва; 2ФГБУН Институт
теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия
imitros@yandex.ru
В процессе проведения исследований ученым требуется постоянный доступ к различным
научным изданиям, статьям, патентам. Научные библиотеки, находящиеся при
исследовательских организациях, дают возможность ссвоевременно получать всю
необходимую информацию о состоянии науки в отдельных областях и в целом. По данным,
получаемым библиотеками, проводятся исследования и изучаются перспективные направления
развития в той или иной области. На базе Пущинского Научного Центра этим занимается
Библиотека по естественным наукам РАН. На основании патентных исследований и
информационно-библиографического поиска происходит анализ состояния научной
деятельности.
Так в 2012-2013 годах выбраны основные векторы развития препаратов повышающих
работоспособность организма при физических нагрузках, средств для лечения мужского
гипогонадизма, лечение сахарного диабета II типа, криоконсервации клеток. По завершении
исследований, сотрудниками ИТЭБ РАН поданы несколько заявок на патенты.
В данный момент, для институтов научного центра, ведется постоянная работа по
следующим направлениям:
- воздействие электромагнитного излучения на биологические объекты,
- разработки, связанные с нанотехнологиями в Московской области,
- перфторуглеродные соединения,
- криоконсервация,
- лечение диабета,
- биологически активные добавки и т.д.
Работы, выполняемые по поиску информации в конкретных областях науки, выполняются,
в основном по запросам руководителей подразделений. В последнее время чаще и чаще
окончательное направление разработки определяется после анализа современного состояния на
106
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
рынке и выбора перспективного направления. Так, например, в тесном сотрудничестве с
библиотекой работает Лаборатория энергетики биологических систем под руководством д.м.н.
Е.И.Маевского.
В заключении отметим, что такое привлечение библиотек к научной деятельности может
быть рациональным по причине имеющегося доступа к большому количеству патентной и
непатентой информации. Проведенные исследования на ее основании могут стать отправной
точкой к разработке новых продуктов, выводящих научные организации на самоокупаемость,
что в свете последних государственных преобразований становится крайне необходимым
условием их существования.
ОЦЕНКА ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ
ПАЦИЕНТОВ НА ПРОВОДИМЫЕ КУРСЫ РАДИАЦИОННОЙ ТЕРАПИИ
Митрошина И.Ю.1, Митрошин И.А.1,2
1
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино;
2
ФГБУН Библиотека по естественным наукам РАН, Москва, Россия
xf2@rambler.ru
Ионизирующая радиация является неотъемлемым компонентом окружающей среды,
однако при увеличении интенсивности превращается в негативный фактор воздействия на
здоровье и благополучие человека. Неповторимость каждого человека и его генома
обусловливает возможность формирования индивидуального ответа организма, подверженного
воздействию генотоксических факторов, в частности ионизирующего излучения.
Целью работы является определение индивидуальной чувствительности организма
онкологических пациентов на проводимые лечебные курсы радиационной терапии с помощью
молекулярно-генетических маркеров. В качестве таких маркеров были использованы
микросателлитные последовательности типа тринуклеотидов (CTG)n, расположенные в 3’ –
UTR – нетранслируемой области гена миотонической протеинкиназы человека. Известно, что
данная область богата CTG-повторами, которые в норме образуют регионы в 40 - 50
триплетных повторов. Полагают, что под воздействием внешних и внутренних факторов
происходит увеличение числа повторов до нескольких сотен и тысяч пар оснований. Это
является проявлением их генетической нестабильности, которая может быть использована в
качестве чувствительного маркера оценки генотоксического действия ионизирующих
излучений, используемых при радиотерапии.
Был использован метод локус-специфической ПЦР для богатой (CTG)n - повторами 3'UTR гена миотонической протеинкиназы человека на препаратах ДНК периферической крови.
Далее применялась технология электрофореза в 6% полиакриламидном геле и окраска
азотнокислым серебром.
В ходе эксперимента обнаружены высокие уровни тринуклеотидных повторов до
проведения радиотерапии у 4 из 7 пациентов. Выявляемое повышение количества
тринуклеотидных повторов по сравнению с показателями контрольной группы может быть
обусловлено нарушением систем репарации и репликации ДНК, ассоциированным с
возникновением и последующим развитием онкологического процесса. Увеличение количества
тринуклеотидных повторов после проведения 1 курса радиотерапии выявлено у 4 из 7
пациентов. Повышенные количества тринуклеотидных повторов после проведения
радиационной терапии в 3 из 4 случаев ассоциированы с летальным исходом от рака легких.
Т.о. выявлена микросателлитная нестабильность тринуклеотидных (CTG)n повторов, как
до проведения лечения, так и после его окончания. Предполагается, что динамика данного
маркера может служить основой оценки индивидуальной реакции организма пациента,
страдающего онкологическим заболеванием, на проводимое лечение.
107
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
СВЕТОВЫЕ РЕЖИМЫ РЕГУЛИРУЮТ АКТИВНОСТЬ
ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ АМИЛАЗЫ У КРЫС
Морозов А.В.1, Свечкина Е.Б.1, Хижкин Е.А.1, Илюха В.А.1,2, Матвеева Ю.П.2,
Виноградова И.А.2
1
ФГБУН Институт биологии КарНЦ РАН; 2ФГБОУ ВПО Петрозаводский
государственный университет, Петрозаводск, Россия
artem.morozow@yandex.ru
Свет является экологическим фактором, влияющим на физиологические функции
млекопитающих, через секрецию основного гормона пинеальной железы – мелатонин. До
функционального созревания эпифиза у крыс (21 дня постнатального онтогенеза) циклические
колебания мелатонина в крови определяются эпифизом матери. В желудочно-кишечном тракте
(ЖКТ) секретируется даже больше мелатонина, чем в эпифизе, но эта секреция не регулируется
светом. Нарушение суточной цикличности синтеза мелатонина способно влиять на
деятельность ЖКТ. Целью данного исследования было изучение активности панкреатической
амилазы в поджелудочной железе 3,6 и 12-ти месячных крыс, находившихся при различных
режимах освещения с периода внутриутробного развития и с момента рождения.
Эксперименты были проведены на самках лабораторных крыс линии ЛИО, разделенных на три
группы, каждая из которых в период беременности находилась при естественном (NL),
стандартном регулярно чередующемся (LD) и постоянном (LL) освещении, соответственно.
Полученное от них потомство с момента рождения находилось, либо при том же режиме
освещения, что и матери (NL, LD, LL), либо было перенесено из регулярно чередующегося в
постоянное освещение (группа LD/LL). Отбор образцов тканей поджелудочной железы
производился у 5 животных из каждой группы в возрасте 3, 6 и 12 месяцев после декапитации.
В результате проведенного исследования нами установлено, что максимальное влияние
световых режимов на панкреатическую амилазу поджелудочной железы отмечается у 3-х и 12ти месячных крыс. При стандартном освещении у животных отмечалось постепенное
возрастное увеличение активности амилазы. Режимы LD/LL, LL/LL, а также NL/NL в период
удлиняющегося фотопериода приводили к существенному угнетению активности фермента.
Полученные нами результаты свидетельствуют, что постоянное освещение, приводящее к
торможению мелатонин - секретирующей функции эпифиза, значительно снижает и активность
панкреатической амилазы, и может приводить к развитию различных патологических
процессов и нарушений работы ЖКТ. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта
Президента НШ-1410.2014.4, РФФИ (№ 12-04-31368), программы «УМНИК-2013» и
программы стратегического развития ПетрГУ с использованием оборудования Центра
коллективного пользования ИБ КарНЦ РАН.
ПОИСК ПОДХОДОВ К ОЦЕНКЕ ВКЛАДА МЕДИЦИНСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ В
КАНЦЕРОГЕННЫЙ РИСК У РАБОТНИКОВ ПО «МАЯК»
Осипов М.В.
ФГУП Южно-Уральский институт биофизики ФМБА, Озерск, Россия
ferrum76@mail.ru
Медицинское ионизирующее излучение наряду с безусловной диагностической
информативностью также может являться фактором риска возникновения заболеваний, в
первую очередь онкологических, в особенности при проведении рентгеновских процедур без
достаточной клинической обоснованности. Трудности оценки влияния малых доз
медицинского излучения состоят в необходимости длительного наблюдения стохастических
эффектов, и в отсутствии специальных регистров, фиксирующих информацию о накопленной
индивидуальной дозе от медицинского излучения.
Целью настоящего исследования является поиск возможности сравнительной оценки
вклада медицинских диагностических рентгеновских процедур (РП) у персонала радиационноопасных предприятий, подвергающегося хроническому воздействию производственного
внешнего гамма и внутреннего альфа излучения, в канцерогенный риск.
108
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Когортное исследование персонала производственного объединения «Маяк» на основе
информации медико-дозиметрического регистра, созданного в лаборатории эпидемиологии
ЮУрИБФ, представляет возможность ретроспективной оценки вклада РП в риск
возникновения отдалённых эффектов на здоровье персонала, наряду с оценкой риска от
производственных факторов.
Канцерогенный риск воздействия медицинского излучения достоверно повышен у
работников, получавших РП. В группе работников, умерших от нераковых причин, не было
получено достоверного превышения риска. Поскольку РП являются стандартом в диагностике
многих злокачественных новообразований, то такой диагноз может являться условием
проведения рентгеновского исследования, и, как следствие, приводить к увеличению
накопленной дозы от РП.
Доза от медицинских диагностических РП достоверно коррелирует с показателями
смертности от злокачественных новообразований в исследуемой когорте. Однако, наряду с
прямым влиянием дозы от РП на канцерогенный риск, существует обратный механизм, при
котором наличие злокачественного новообразования приводит к возрастанию накопленной
дозы медицинского излучения, что затрудняет количественную оценку риска, поэтому наличие
корреляционной связи нельзя расценивать как причинно-следственную связь. Таким образом,
вклад медицинского излучения в канцерогенный риск может быть оценен с позиции пользавред. Количественная оценка вклада медицинского излучения в канцерогенный риск может
быть реализована в исследовании случай-контроль.
УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ПОТОМСТВА ПЕРВОГО
ПОКОЛЕНИЯ САМЦОВ КРЫС, ПОДВЕРГШИХСЯ ОСТРОМУ
ГАММА ОБЛУЧЕНИЮ В ДОЗЕ 1 ГР
Панфилова В.В., Колганова О.И.
ФГБУ Медицинский радиологический научный центр Министерства
здравоохранения РФ, Обнинск, Россия
whiskas04@yandex.ru
В данной работе исследовано влияние облучения самцов-крыс линии Вистар на
психофизиологическое развитие их потомства первого поколения. Половозрелых самцов крыс
облучали на гамма-установке «Луч» (60Co, доза 1 Гр, мощность дозы 0,003 Гр/с). Затем их
спаривали с интактными самками через разные интервалы времени после облучения, чтобы в
оплодотворении участвовали сперматозоиды, облученные на разных стадиях сперматогенеза.
Когнитивные (памятные) функции мозга оценивали по способности к выработке и
воспроизведению условного рефлекса избегания (УРИ). В экспериментах использовали
стандартную методику обучения крыс в челночной камере Шаттл-бокс. Данный метод
позволяет судить о таких элементах высшей нервной деятельности, как закрепление условных
связей и воспроизведение выработанного навыка, эмоциональное поведение и развитие стресса.
У самцов крыс первого поколения во всех подопытных группах зарегистрировано
значительно большее количество отказов от перебежек, чем в контрольной группе. С гораздо
более низкой скоростью нарастало количество условных рефлексов во время обучения у групп
«сперматозоиды» и «сперматиды», то есть для достижения равного с контролем уровня
обученности этим подопытным группам требовалось значительно больше сочетаний условного
и безусловного стимулов. Во втором тестировании расхождение с контролем в этих
подопытных группах еще более усугубилось. У самцов этих групп выработалось значительно
меньше условных рефлексов, чем в контроле, выявились нарушения, как в краткосрочной, так и
в долгосрочной памяти – эти животные начали второе тестирование с более низких позиций,
чем закончили первое.
У самок первого поколения при первом тестировании только в группе «сперматозоиды»
были отмечены значительные отклонения от контроля в худшую сторону (меньшая скорость
обучения). При повторной сессии обучения были обнаружены нарушения в долгосрочной
памяти в группах «сперматозоиды» и «сперматогонии». Крысы из этих подопытных групп
плохо запомнили урок предыдущего тестирования. По показателям скорости обучения
заметное отставание от контроля наблюдалось у крыс из группы «сперматогонии». У крыс
109
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
подопытных групп отмечалось развитие состояния эмоционального стресса, выражавшееся в
частых межсигнальных перебежках.
Таким образом, в результате наших исследований было выявлено негативное влияние
облучения родителей в дозе 1 Гр на высшую нервную деятельность их потомков.
ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ МЕХАНИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ
ОКИСЛЕННЫХ МЕМБРАН С ПОМОЩЬЮ ЛИПИДНЫХ НАНОТРУБОК
Парьева Е.С.1, Башкиров П.В.1, Синцов М.Ю.1, Антоненко Ю.Н.2,
Чекашкина К.В.1, Фролов В.А.3, Кузьмин П.И.1
1
ФГБУН Институт физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН; 2НИИ
физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного
университета им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия; 3University of the Basque Country
elena.paryeva@gmail.com
Клеточная мембрана постоянно испытывает воздействие различных биологически
активных веществ, которые могут приводить к значительным модификациям ее свойств, в том
числе и ее упругих характеристик (натяжение, изгибная жесткость). В данной работе мы
исследовали изменения упругих свойств бислойной липидной мембраны при ее окислении
синглетным кислородом. Для этого мы использовали мембранные нанотрубки (НТ), вытянутые
в растворе электролита из плоских бислойных липидных мембран с помощью пэтч-кламп
методики. Изгибную жесткость мембраны и ее латеральное натяжение находили из анализа
изменения формы НТ под воздействием электрического поля. Окисление мембраны
происходило в результате фотодинамической реакции фотосенсибилизатора AlPcS3,
адсорбированного на мембране. Было показано, что адсорбция AlPcS3 имеет обратимый
характер и не приводит к изменению модуля изгиба мембраны. В результате возбуждения
фотосенсибилизатора светом (длина волны 650 нм) происходило постепенное уменьшение
изгибной жесткости мембраны. Причем величина эффекта зависела от длительности
освещения. Проводимость мембраны при этом оставалась неизменной. Однако через некоторое
время после активации AlPcS3 в мембране возникали гидрофильные поры, и мембрана
разрушалась. Мы считаем, что регистрируемое уменьшение изгибной жесткости мембраны, за
которым следует образование гидрофильных пор и в итоге дестабилизация БЛМ, связано с
накоплением в ней окисленных липидов, которые обладают положительной спонтанной
кривизной.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ИЗЛУЧЕНИЙ НА
ГЛЮКОКОРТИКОИДНУЮ ФУНКЦИЮ НАДПОЧЕЧНИКОВ КРЫС
Перов С.Ю.
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова,
Москва, Россия
elenav567@gmail.com
В связи с отсутствием биологических специфических реакций организма на действие
электромагнитных излучений (ЭМИ) радиочастотного диапазона низких интенсивностей,
обычно, рассматриваются отдельные биологические эффекты, в том числе, реакция
нейроэндокринных механизмов общего адаптационного синдрома, где ведущая роль отводится
надпочечникам. Функциональная активность коры надпочечников находится под контролем
адренокортикотропного гормона гипофиза. Нейроэндокринные механизмы составляют
фундамент регуляции всех функций организма. Механизм стрессорной функция на действие
внешнего фактора, такого как ЭМИ, увеличивает продукцию катехоламинов и
глюкокортикоидных гормонов. Это приводит к повышению их содержания в крови и
увеличению экскреции с мочой.
Учитывая, что характер эндокринной реакции организма на стресс может меняться,
состояния напряжения можно оценивать не по абсолютному содержанию глюкокортикоидов в
110
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
крови, а по динамике их концентрации в процессе действия исследуемого фактора. Используя
указанные критерии стресса можно оценить степень влияния ЭМИ на биологические объекты.
Подобный подход был использован в исследованиях оценки действия ЭМИ частотой 170
МГц для трех уровней экспозиции (15, 25 и 35 В/м) в течении 15 дней на лабораторных крыссамцов массой 200 г. Для этих целей использовалась ТЕМ-камера, где размещались в клетках
12 особей в ЕНК ориентации, для каждого уровня экспозиции существовал свой контроль,
состоящий их такого же числа крыс. Перед началом облучения все крысы обеих групп для
каждого уровня экспозиции в течении 10 суток содержались в ТЕМ-камере с целью адаптации
к экспериментальным условиям. Для сбора мочи в клетки индивидуального содержания
помещали вкладыши. Забор мочи осуществлялся каждый день после облучения в одно и тоже
время. Кортикостерон в суточной моче крыс определяли иммуноферментным методом с
помощью тестов для количественного определения кортикостерона в моче (Corticosterone EIA
Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Германия). Полученные данные показывают
статистически значимое увеличение концентрации кортикостерона в моче уже на 8 сутки в
условиях экспозиции 25 В/м, а при уровнях 35 В/м изменение концентрации кортикостерона
регистрировалось на 4 сутки облучения. Однако к 15 суткам экспозиции концентрация
кортикостерона не отличалось от контрольных значений для всех трех уровней ЭМИ. На
основании полученных данных, экспозиция ЭМИ при напряженности 25 В/м и выше может
оказывать влияние на функцию надпочечников, причем в условиях облучения до 35 В/м на 15
сутки наблюдается устойчивая адаптация к воздействующему фактору.
РОЛЬ КАТИОНОВ КАЛЬЦИЯ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА SDH2-3
СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ЛИСТЬЯХ КУКУРУЗЫ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ
КРАСНЫМ И ДАЛЬНИМ КРАСНЫМ СВЕТОМ
Покусина Т.А., Курабутова Л.А., Шабалина В.С., Сапата Асеведо Х.Ф.,
Федорин Д.Н., Епринцев А.Т.
ФГБОУ ВПО Воронежский государственный университет, Воронеж, Россия
rybolov@mail.ru
В растительной клетке набор фоторецепторов обеспечивает сложную систему регуляции
биохимических и физиологических реакции, регулирующих различные процессы клетки.
Механизм передачи и реализации сигналов сложен и до настоящего времени не до конца
изучен.
Ранее было показано, что при облучении проростков светом разной длины волны, меняется
экспрессия гена sdh1-2, кодирующего субъединицу А сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Кроме
того, также показано, что катионы кальция влияют на экспрессию генов ряда ферментов, в том
числе и сукцинатдегидрогеназы, осуществляя трансдукцию фитохромный сигнал в ядро,
выступая в качестве вторичного мессенжера.
В связи с этим, целью нашей работы было исследовать зависимость экспрессии генов,
кодирующих субъединицу В сукцинатдегидрогеназы, от функционального состояния
фитохромной системы и роль кальция в передаче фоторецепторного сигнала.
В качестве объекта исследования использовали листья кукурузы кукурузы (Zea mays L.).
Для облучения растений красным и дальним красным светом использовали светодиоды с
соответствующей областью испускания. Пробы для анализа отбирали через 3 часа с момента
облучения. Измерение свободного кальция осуществляли спектрофотометрическим методом.
Экспрессию гена sdh2-3 определяли методом количественной ПЦР в реальном времени.
Изучение действия света разного спектрального состава на экспрессию гена sdh2-3,
кодирующего субъединицу В СДГ, показало зависимость его транскрипции от состояния
фитохромной системы. Активная форма фитохрома ингибирует эекпрессию гена sdh2-3.
Использование блокатора кальциевых каналов (рутения красного) и комплексона (ЭГТА)
позволило установить, что содержание мРНК гена sdh2-3 зависит от концентрации катионов
кальция в ядерной фракции, обусловленное действием фитохромной системы растительной
клетки.
Полученные данные свидетельствуют о том, что перераспределение кальция между ядром
и цитоплазмой можно рассматривать как механизм регуляции экспрессии гена sdh2-3 красным
111
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
светом посредством фитохромной системы. Механизм трансдукции фитохромного сигнала в
ядре, вероятно, связан с активацией факторов транскрипции, в частности PIF, обеспечивающих
контроль уровня экспрессию гена sdh2-3 СДГ.
РАДИОЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ НАНОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ЦЕРИЯ IN VITRO
Попов А.Л.1,2, Попова Н.Р.1, Селезнева И.И.1,2, Иванов В.К.3
1
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН; 2ФГБОУ ВПО
Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино; 3ФГБУН
Институт общей и неорганической химии им. Н.С.Курнакова, Москва, Россия
toshka_bf@mail.ru
Нанокристаллический диоксид церия (НДЦ) является перспективным материалом для
биомедицинских целей. Ранее показано его способность инактивировать различные формы
свободных радикалов, такие как супероксид-анион радикал, перекись водорода, нитроксильный
радикал, гидроксил радикал. Более того, показано, что НДЦ способен миметировать активность
ряда антиоксидантных ферментов клетки, таких как супероксиддисмутаза и каталаза, при этом
его активность в том или ином направлении зависит от условий окружения и кислородной
нестехиометрии поверхности наночастиц. Кроме того, НДЦ способен защитить мышиные
клетки эпителия кишечника от радиационно-индуцированных повреждений и предотвратить
дегенерацию сетчатки, вызванную ультрафиолетовым (УФ) излучение. Существует ряд работ
подтверждающих многофакторное действие НДЦ, в том числе на метаболизм и на сигнальные
пути клетки. Однако, конкретный механизм защитного действия клетки с использованием
НДЦ, в том числе при воздействии ионизирующего излучения, недостаточно изучен. Ранее
нами предложен метод синтеза НДЦ для биомедицинских целей и показано его высокая
биосовместимость. Целью данной работы было изучение радиозащитного действия НДЦ в
условиях in vitro.
Нами показано, что предварительная обработка культуры первичных фибробластов мыши
НДЦ в концентрациях 10-5-10-9 М, предотвращает развитие апоптоза в клетках облученных
рентгеновским излучением в дозе 15 Гр, сохраняя их жизнеспособность на высоком уровне (9095% от контроля), при этом концентрация 10-5 М проявляет максимальный защитный эффект.
Анализ препаратов, окрашенных Hoechst 33358, подтверждает радиозащитный эффект НДЦ,
снижая количество микроядер в культурах клеток, подвергнутых воздействию ионизирующего
излучения. Таким образом, использование наночастиц диоксида церия в качестве
радиозащитного вещества может снижать негативные последствия влияния ионизирующего
излучения на клетку и организм человека в целом.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №
14-04-32199 мол_а.
АНАЛИЗ ЭФФЕКТОВ ХРОНИЧЕСКОГО РАДИАЦИОННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
НА ФЕРМЕНТЫ АНТИОКСИДАННОЙ СИСТЕМЫ В ПОПУЛЯЦИЯХ
СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ
Помелова Д.О., Волкова П.Ю.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
радиологии и агроэкологии РАСХН, Обнинск, Россия
danusikp@mail.ru
В результате крупной радиационной аварии в Чернобыле радиоактивному загрязнению
подверглись значительные территории лесных массивов. Лесные экосистемы играют
важнейшую роль в поглощении и перераспределении радионуклидов, но в тоже время
отличаются высокой радиочувствительностью.
При воздействии радиации на живые ткани, в них образуются активные формы кислорода
(АФК). Радиационное воздействие провоцирует сверхпродукцию АФК в клетке, тем самым
приводя ее в состояние, получившее название окислительного стресса. В ликвидации АФК
112
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
участвуют ферменты-антиоксиданты, важнейшими из которых являются супероксиддисмутаза,
каталаза, пероксидаза, аскорбатпероксидаза и ферменты, включённые в аскорбатглутатионовый цикл.
Был проведен анализ изоферментов супероксиддисмутаза (SOD), глутатионредуктаза (GR),
глутатионпероксидаза (GPX), так как они играют важную роль в сопротивлении организма
растений радиационно-индуцированному оксидативному стрессу. Частота мутаций
изоферментных локусов в природных популяциях является чувствительным и информативным
критерием при оценке генетических последствий хронического облучения в малых дозах.
Экспериментально показано увеличение темпов мутагенеза в основных ферментных локусах и
увеличение числа полиморфных локусов при росте поглощённой генеративными органами
растений дозы. Исследованный полиморфизм ферментов антиоксидантной системы
увеличивается вместе с уровнем радиоактивного загрязнения изучаемых территорий. В
условиях хронического радиационного воздействия роль аллозимов SOD, GR и GPX как
ферментов, элиминирующих супероксидный радикал и перекись водорода, существенно
возрастает. Следовательно, наблюдаемый нами полиморфизм в генетических локусах,
кодирующих данные ферменты, может быть связан с ключевой ролью этой ферментной
системы в ликвидации активных форм кислорода. Анализ активности антиоксидантных
ферментов показал, что хроническое радиационное воздействие не оказывает влияния на
активность ферментых систем, несмотря на повышенный уровень мутагенеза в изоферментных
локусах.
Для обобщения полученных данных, в настоящее время проводится анализ изофермента
глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (G6PG), так как именно этот фермент отвечает за образование
в клетке НАДФН, чье содержание обеспечивает успешную антиоксидантную защиту. На
настоящий момент проанализированы 4 экспериментальных участка из шести.
Предварительная оценка показывает, что с увеличением поглощенной в репродуктивных
органах сосны дозы увеличивается частота мутаций, регистрируемых в локусах G6PG-1 и
G6PG-2.
ПРОЕКТИРОВАНИЕ КОМПЛЕКСА, ФОРМИРУЮЩЕГО Y-ОБРАЗНУЮ
СТРУКТУРУ ИЗ ТРЁХ ЧАСТИЧНО КОМПЛЕМЕНТАРНЫХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
1
Преображенская Е.В. , Мелехов В.В.2,3, Озолинь О.Н.3,4, Антипов С.С.1,3,4
1
ФГБОУ ВПО Воронежский государственный университет, Воронеж; 2ФГБУН
Институт биологического приборостроения РАН; 3ФГБОУ ВПО Пущинский
государственный естественно-научный институт; 4ФГБУН Институт
биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
Elena.VL.Preobrazhenskaya@gmail.com
Биологические макромолекулы уже давно используются для решения целого ряда
прикладных задач, но создание трёхмерных конструкций на основе самособирающихся
молекул ДНК (ДНК-оригами) является относительно новым направлением. Интерес к таким
конструкциям обусловлен не только их миниатюрностью, но и возможностью создания нового
материала со стандартными характеристиками.
Данная работа посвящена разработке стратегии создания элементарных ДНК-ячеек для
мономолекулярного связывания белка Dps, а конкретная задача заключалась в получении Yобразной структуры из трёх частично комплементарных олигонуклеотидов. Для обеспечения
полноценного контакта с белком, длина каждого из лучей Y-структуры, должна быть не менее
10 нм. На их концы должны быть вставлены сайты лигирования, а в центральной части
олигонуклеотидов должно располагаться максимальное количество А/Т-пар для обеспечения
посадки белка в эту область. Последовательность должна быть продумана таким образом,
чтобы обеспечить единственную возможность комплементарного спаривания каждого
олигонуклеотида с двумя другими. В качестве основы для создания Y-образной структуры
были взяты последовательности регуляторной области гена dps и 3’-нетранслируемой области
гена uxuT, являющиеся очень хорошими мишенями для взаимодействия с белком Dps. Было
установлено, что для обеспечения полноценного комплементарного спаривания
113
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
олигонуклеотидов в водном растворе, необходимо расплавить случайно сформировавшиеся в
них вторичные структуры, обеспечить условия комплементарного спаривания и формирования
стабильной трёхмерной структуры. Однако конкретная реализация этого подхода требовала
некоторой оптимизации. Наиболее эффективная схема включала следующие шаги. На первом
этапе осуществляли плавление каждого отдельно сегмента ДНК при 98°С в течении 5 минут,
после чего их смешивали в пробирке предварительно прогретой до 98°С и оставляли еще на 5
минут. Далее смесь переносили на 10 минут в 70°С. После этого термостат остужали до
комнатной температуры без принудительного охлаждения. Размер образовавшихся ДНКструктур и гетерогенность полученного препарата оценивали электрофоретически, а
формирование стабильных Y-образных структур регистрировали с помощью атомно-силового
микроскопа. В результате проделанной работы нам удалось подобрать условия для самосборки
минимального блока нуклеотидной ячейки и выработать стратегию для создания более
сложной конструкции.
Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России № 2014/281.
ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НАНОЧАСТИЦ МАГНЕТИТА
Пудовкина Е.Е.1, Плескова С.Н.2
1
ФГБОУ ВПО Нижегородский государственный технический университет
им. Р.Е.Алексеева; 2ФГБОУ ВПО Нижегородский государственный университет
им. Н.И.Лобачевского, Нижний Новгород, Россия
pudovkina-kat@mail.ru
Биомедицинское применение магнитных наночастиц (МНЧ), в частности наночастиц
магнетита – FeO•Fe2O3 обусловлено их хорошими контрастирующими свойствами при МРТ,
адсорбирующей активностью при гипертермии и высокой перспективностью в области
направленной доставки лекарств и специфического связывания терапевтических агентов.
Однако для успешного практического применения необходимо выявить закономерности
воздействия МНЧ на клетки крови человека, поскольку при любых вариантах введения в
организм ксенобиотики попадают в кровь.
Целью данной работы является изучение влияния наночастиц магнетита на эритроциты
человека. Наночастицы FeO•Fe2O3 брали в конечной концентрации 0,18 мг/мл и 0,0018 мг/мл.
Определялось изменение гемолитической резистентности эритроцитов после взаимодействия с
МНЧ.
Проводилось исследование осмотической резистентности эритроцитов по методу Л. И.
Идельсона. Полученные данные не выявили статистически значимых различий степени
гемолиза эритроцитов, проинкубированных с МНЧ по сравнению с контролем. В частности, в
0,4%-ом растворе NaCl контрольное значение составило 96,3±7,3%, степень гемолиза в случае
воздействия МНЧ в концентрации 0,18 мг/мл и 0,0018 мг/мл – 93,8±12% и 93,5±10,2%
соответственно.
Для кинетического исследования гемолиза был использован метод кислотных
эритрограмм. Для оценки полученных данных был введен интегральный показатель степени
гемолиза – подсчитана площадь под кривыми на графиках «время-степень гемолиза».
Контрольное значение составило 2323,4±709,3 отн.ед. Для МНЧ в конечных концентрациях
0,18 мг/мл и 0,0018 мг/мл значение площади составило 2339,2±673,2 отн.ед. и 2601,4±245,1
отн.ед. соответственно (р˃0,05). Для контрольных исследований характерна эритрограмма с
максимумом гемолиза в среднем 105,4% на 34-й секунде исследования. Под воздействием МНЧ
максимальные значения гемолиза уменьшаются (в среднем до уровня 78,5% для концентрации
0,18 мг/мл и 43,8% для 0,0018 мг/мл), а время его наступления увеличивается (в среднем до 51
сек для 0,18 мг/мл и до 109 мин для 0,0018 мг/мл).
Таким образом, МНЧ не влияют на гемолиз эритроцитов в изоосмотических жидкостях.
Однако происходит существенное изменение эритрограммы – наблюдается тенденция к
подавлению кислотного гемолиза при внесении наночастиц.
114
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО ОПТИМУМА ЛИТОРАЛЬНЫХ И
ГЛУБОКОВОДНЫХ ВИДОВ АМФИПОД ОЗЕРА БАЙКАЛ И
ПРИБАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА ПО БИОХИМИЧЕСКИМ
ПОКАЗАТЕЛЯМ СТРЕСС-ОТВЕТА
1
Прокосов С.О. , Верещагина К.П.1, Гурков А.Н.1, Лубяга Ю.А.1, Щапова Е.П.1,
Аксенов-Грибанов Д.В.2
1
ФГБОУ ВПО Иркутский государственный университет; 2НИИ биологии Иркутского
государственного университета, Иркутск, Россия
denis.axengri@gmail.com
Целью настоящей работы было определение температурного оптимума литоральных и
глубоководных видов амфипод оз. Байкал и Прибайкальского региона по биохимическим
показателям стресс-ответа. В исследовании использовали байкальских литоральных амфипод
вида Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf., 1858) и глубоководный вид Ommatogammarus flavus
(Dyb., 1874). В качестве представителей термоустойчивой палеарктической фауны были
выбраны амфиподы вида Gammarus lacustris Sars (1863).
До проведения экспериментов амфипод содержали раздельно по видам в аэрируемых
аквариумах при температуре 6 ±0,5°С в течение 3 суток для литоральных видов и в течение 6
суток при температуре 4 ±0,5°С для глубоководных. Экспозицию организмов в широком
градиенте температур проводили в соответствии с методикой экспериментальной
акклиматизации, рекомендованной Pörtner, Kunst (Science, 2008). Фиксацию материалов
проводили в жидком азоте. Контрольные образцы фиксировали непосредственно в начале
эксперимента при температуре акклимации.
Для оценки влияния изменения (постепенного повышения и понижения) температуры
среды на показатели клеточного метаболизма (в том числе стресс-маркеров) определяли
индуцированные изменения показателей маркеров энергетического обмена (содержание
лактата, АТФ, и активности лактатдегидрогеназы), содержания стрессовых белков теплового
шока – БТШ70 и активности антиоксидантных ферментов (пероксидазы, каталазы и глутатион
S-трансферазы).
Установлено, что у исследованных байкальских и палеарктических видов амфипод,
различающихся по своим терморезистентным и термопреферентным характеристикам, в
пределах определенного температурного диапазона остаются стабильными уровни содержания
лактата, БТШ70, энергетических метаболитов, активности ферментов пероксидазы, каталазы,
глутатион S-трансферазы, лактатдегидрогеназы. Указанные температурные диапазоны
видоспецифичны: у E. verrucosus с 2,6±1,3°С до 9,5±0,8°С, у O. flavus с 1,8±1,3°С до 8,5±0,9°С,
у G. lacustris с 2,3±1,7°С до 19±5,2°С. Таким образом, для литоральных и глубоководных видов
амфипод показано, что температурные границы зоны метаболической стабильности связаны с
термопреферентными предпочтениями видов и отражают их экологические характеристики.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ (14-04-00501 а,
12-04-90039 Бел_а, 12-04-98062-р_сибирь_а, 11-04-91321-СИГ_а), программы ФЦП, а также
при поддержке программы стратегического развития ФГБОУ ВПО «ИГУ» и совместной
программы DAAD и Минообрнауки «М. Ломоносов 2014-2015».
УВЕЛИЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПЦР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ
1
Пылаев Т.Е. , Ванжа Е.В.2, Дыкман Л.А.1, Богатырев В.А.1,2, Хлебцов Н.Г.1,2
1
ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН;
2
ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского,
Саратов, Россия
pylaevte@gmail.com
Одним из наиболее распространенных методов клинической и лабораторной ДНКдиагностики является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Среди основных преимуществ
метода ПЦР следует отметить высокую чувствительность, селективность и незначительную
115
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
трудоемкость. Однако имеются существенные недостатки, такие, как высокая степень
гомологии олигонуклеотидных праймеров и ДНК анализируемого образца, склонность к
контаминации, присутствие ингибиторов реакции вследствие нарушения условий
пробоподготовки, подбора праймеров и параметров амплификации. Подобные нарушения
приводят к ложноположительному или ложноотрицательному результату ПЦР-диагностики.
При этом чувствительность и специфичность метода значительно снижается. Детектирование
продуктов амплификации методом агарозного гель-электрофореза сопровождается появлением
размытых полос («шмеров», англ. «smear» - размытие) помимо полос основного ПЦР-продукта
Традиционно, данную проблему решают путем подбора соотношения компонентов
реакционной смеси, что является многостадийной, дорогостоящей и затратной по времени
задачей. В последние несколько лет внимание исследователей привлекли наноматериалы,
способные увеличить специфичность ПЦР. Из всего исследованного в этой области арсенала
наноматериалов наибольший интерес представляют золотые наночастицы (ЗНЧ).
Использование ЗНЧ в качестве дополнительных компонентов для ПЦР обусловлено как
минимум тремя механизмами их влияния на компоненты реакционной смеси: взаимодействие с
матрицей ДНК по типу SSB-белков (SSB-белки – single-strand binding proteins, белки,
связывающие одноцепочечную ДНК); увеличение эффективности ДНК-полимеразы; и
формирование «нанореакторов» вокруг частицы золота для проведения ПЦР с большей
скоростью и точностью. Целью настоящей работы явилось детальное изучение механизмов,
определяющих эффективность ПЦР в присутствии золотых наночастиц, а также разработка
универсального подхода одностадийной оптимизации ПЦР независимо от выбора
диагностируемого объекта.
НОВЫЙ ПОДХОД В ОПРЕДЕЛЕНИИ ЖЕСТКОСТИ МОЛЕКУЛ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ПОЛИМЕРОВ
Сергеев А.В.1, Тимченко А.А.2
1
ФГБУН Институт математических проблем биологии РАН;
2
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
antonsergeevphd@gmail.com
В физике полимеров персистентная длина молекул определяется степенью жесткости этих
молекул и вычисляется обычно из гидродинамических данных для группы полимеров
различной молекулярной массы. Известно, что экстраполируя коэффициент поступательной
диффузии к бесконечной молекулярной массе, можно вычислить персистентную длину и
гидродинамический радиус для жестких и полужестких молекул. Если персистентная длина
молекулы много больше ее контурной длины, то гидродинаические параметры молекулярной
цепочки становятся независимы от ее размера и такая экстраполяция неприменима. В данном
случае мы предлагаем изобразить на графике другой вид зависимости, при которой появление
плато соответствует полной непроницаемости молекулы, а из высоты плато могут быть
вычислены такие характеристики, как длина сегмента Куна и персистентная длина.
Мы проанализировали литературные данные для нескольких синтетических полимеров с
помощью нашего подхода и определили их персистентную длину, значения которой
практически совпадают с литературными источниками. Обычно синтез полимеров дастаточно
большой длины является весьма сложной задачей. Но, в то же время, природные полимеры с
высокой молекулярной массой достаточно распространены в биологии. Типичным примером
является молекула ДНК. С увеличением контурной длины ДНК конформация молекулы
проходит несколько стадий: жесткая палочкообразная частица, полужесткий протекаемый
клубок и непротекаемый Гауссов клубок.
Мы проанализировали седиментационные данные молекул ДНК при помощи нашего
подхода. Было показано, что плато начинается с длины в 40000 пар оснований молекулы ДНК и
соответствующее значение персистентной длины составляет порядка 50 нм. Данное значение
хорошо согласуется с литературными данными. Таким образом, вышеобозначенный подход
может быть применен для анализа жесткости не только искусственных полимеров, но и
биологических молекул различной природы - начиная с нуклеиновых кислот и заканчивая
белковыми молекулами в сильных денатурантах.
116
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ
ПРОЦЕССЫ В МОЗГЕ КРЫС ПРИ ГИПОТЕРМИИ
Раджабова З.Г., Астаева М.Д., Кличханов Н.К.
ФГБОУ ВПО Дагестанский государственный университет, Махачкала, Россия
mashia@mail.ru
Для гомойотерных животных снижение температуры тела является экстремальным
состоянием. Одним из повреждающих факторов при гипотермии является стресс
обусловленная активация свободнорадикальных процессов (СРП) в тканях. Нейроны головного
мозга особенно чувствительны к активным формам кислорода и первыми повреждаются в
условиях окислительного стресса. В настоящей работе исследовано влияние раздельного и
совместного курсового (ежедневно в течение 7 дней) внутрибрюшинного введения животным
антиоксидантов аскорбиновой кислоты (100 мг/кг веса тела) и α-токоферола (по 40 мг
токоферола + 0.5 мг селена/кг веса тела) на содержание продуктов свободнорадикальных
реакций – малонового диальдегида (МДА), – характеризующего процессы, протекающие в
липидах, – а также содержание карбонилов в белках мембран синаптосом мозга крыс при
общей кратковременной гипотермии 30°С. Кратковременная (30 мин) умеренная гипотермия
стимулирует окислительную модификацию как липидов, так и белков мембран синаптосом.
При этом степень окислительной модификации мембранных белков (по анализу карбонильных
групп) выше, чем липидов. Как раздельное, так и совместное введение витаминов С и Е
предотвращает рост уровня МДА в синаптосомах при гипотермии. Введение витамина С, в
отличие витамина Е, предотвращает повышение уровня карбонильных групп в белках мембран
синаптосом при гипотермии. Совместное введение витаминов С и Е, как ожидалось,
существенно снижает степень карбонилирования белков мембран синаптосом при гипотермии.
Введение витамина С на 60% повышает уровень восстановленного глутатиона в синаптосомах.
Введение витамина Е повышает уровень глутатиона менее значительно. Совместное введение
этих витаминов предотвращает повышение уровня глутатиона в синаптосомах при гипотермии.
Таким образом, начальные этапы гипотермии стимулируют СРП в мозге, а совместное
введение витаминов С и Е предотвращает развитие окислительного стресса на уровне нейронов
мозга.
ИЗУЧЕНИЕ АТФ-ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА
ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
Рогозин М.М., Шереметьев Ю.А.
ФГБУ Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии
Министерства здравоохранения РФ, Нижний Новгород, Россия
rogozin666@yandex.ru
Изучена роль активации P2X7 рецепторов в развитии апоптоза эритроцитов человека.
Активацию рецепторов проводили с помощью АТФ в диапазоне концентраций от 1 до 5 мМ.
Влияние АТФ на эритроциты изучали в инкубационной среде не содержащей ионы кальция.
Эритроциты инкубировали в присутствии АТФ при 37С в течение 2 ч. Изучали морфологию
клеток и их агрегатов, агрегационные и деформационные свойства эритроцитов, образование
эритроцитарных микровезикул в инкубационной среде. Образование микровезикул изучали с
помощью световой микроскопии. Микровезикулы также выделяли из супернатанта с помощью
гадолиния. В осадке определяли активность маркерного фермента микровезикул
ацетилхолинэстеразу. Метгемоглобин изучали спектрофотометрическим методом. Показано,
что активация P2X7 рецепторов стимулирует образование метгемоглобина в эритроцитах.
Образуется большое количество микровезикул, обладающих высокой ацетилхолинэстеразной
активностью. Апоптозные эритроциты приобретают сферостоматоцитарную форму.
Установлено, что апоптозные эритроциты теряют способность образовывать агрегаты в форме
«монетных столбиков» в аутологичной плазме. При этом нарушаются деформационные
свойства эритроцитов. Эритроциты практически полностью теряют способность
деформироваться в искусственном потоке.
117
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ПОИСК ФАКТОРОВ, ПОДГОТАВЛИВАЮЩИХ ПРОЦЕСС БЕСПОЛОГО
РАЗМНОЖЕНИЯ У ПЛАНАРИЙ SCHMIDTEA MEDITERRANEA
Скавуляк А.Н.1, Ермаков А.М.2, Кучин А.В.1, Крещенко Н.Д.1
1
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН; 2ФГБУН Институт теоретической и
экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия
skavulyakalex@gmail.com
Планарии, свободноживущие плоские черви, размножаются путем архитомического
деления, отбрасывая заднюю часть тела – хвостовой зооид. Регенерационная способность
обеспечивается пролиферативной активностью стволовых клеток - необластов. Процесс
бесполого размножения у планарий слабо изучен. Факторы, подготавливающие и запускающие
отделение хвостового зооида – неизвестны. Ранее нами обнаружено, что при содержании
одиночных интактных планарий совместно с хвостовыми регенерантами, деление в мини
группе происходило более интенсивно, чем при содержании интактных планарий с головными
регенерантами. Цель настоящей работы - изучение клеточных механизмов, подготавливающих
процесс бесполого размножения у планарий Schmidtea mediterranea при совместном
содержании одной интактной и трех регенерирующих (отсеченных впереди глотки хвостовых
фрагментов) планарий. В опыт отбирали планарий длиной около 3 мм. Для анализа
использовали иммуногистохимический метод окрашивания препаратов с помощью антител к
Н3-фосфогистону - маркеру пролиферирующих клеток и конфокальную сканирующую
микроскопию.
Обнаружено, что у содержащихся совместно интактных и регенерирующих особей,
изменение пролиферативной активности происходит по-разному. Так, у регенерантов
относительное число митозов на единицу площади тела существенно выше, чем у интактных
планарий в течение всего периода наблюдений (с 1-го по 10-й дни). Максимальное число
митозов у регенерантов наблюдали на 2 сутки, после чего число митотических клеток
уменьшалось. Динамика изменений митотической активности у интактных животных носила
колебательный характер (с периодом примерно равным 24 ч), при этом количество митозов
было максимальным на 1 сутки наблюдения, постепенно уменьшаясь до минимального
значения к 10-му дню. Синхронные колебания числа митозов наблюдали также при отдельном
анализе хвостовой области тела. Никаких особенностей подготовки к отделению зооида,
например, усиленной митотической активности в хвостовой области не было обнаружено ни у
интактных, ни у регенерирующих особей. Соответственно, за 10 дней наблюдения никто из
интактных (n=100) и регенерирующих (n=300) животных не поделился. Вероятно, фактором,
лимитирующим (как и стимулирующим) деление планарий может служить размер тела
животных, о чем не имеется пока никаких сведений. Возможная зависимость инициации
процесса бесполого размножения от размера тела планарий может являться предметом
дальнейшего изучения. (Поддержано грантами РФФИ №14-04-31518 мол-а и №14-04-01517-а).
ДИНАМИКА ЖЕЛЕЗА, ФЕРРИТИНА, И ГЕПСИДИНА В ПЛАЗМЕ И
АСЦИТНОЙ ЖИДКОСТИ ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЯ
Стенякина М.Д.1,2, Куприянова Е.С.1,2, Зинаттулина Г.Г.1,2, Поцелуева М.М.1,2,
Сухомлин Т.К.1, Серебрякова Л.Т.1
1
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН; 2ФГБОУ ВПО
Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Россия
strikanova@gmail.com
Многие возрастные и системные заболевания, в т. ч. и онкологические, связаны с
механизмами регуляции железа как на клеточном, так и на организменном уровне.
В условиях окислительного стресса в организме происходит повреждение здоровых клеток,
в том числе и эритроцитов, что ведет к частичному высвобождению гемоглобина в плазму
крови. Железо гемоглобина провоцирует лавинообразную генерацию гидроксил-радикалов
посредством реакции Фентона. При этом антиоксидантная система организма уже не
справляется с окислительным стрессом. Очевидно, что железо может играть одну из ключевых
ролей в развитии опухоли и проявлении необратимых процессов канцерогенеза.
118
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Одними из ключевых железорегулирующих белков являются гепсидин и ферритин.
Доказано, что гепсидин является отрицательным регулятором метаболизма железа, а ферритин
выполняет защитную антиоксидантную функцию, пряча железо внутрь своей полости.
Мы выявили динамику железа, ферритина и гепсидина в плазме и асциной жидкости
опухоленосителя, а также динамику ферритина в опухолевых макрофагах. Работа проводилась
на модели развития асцитной опухоли – гепатомы Зайделя у крыс породы Вистар.
Динамика железа в плазме и асцитной жидкости показала, что в процессе роста опухоли
концентрация железа в плазме крови опухоленосителя снижалась. Неожиданным оказалось его
снижение - в 20 и более раз, т.е. в плазме опухоленосителя наблюдается железодефицитная
анемия. При этом в асците концентрация железа была выше, чем в плазме на всем протяжении
эксперимента. К концу эксперимента концентрация железа в асците увеличилась многократно.
В зоне роста опухоли концентрация гепсидина значительно выше (в 6-8 раз), чем в плазме.
При этом отмечена максимальная концентрация железа в зоне опухоли, что не противоречит
общепринятым фактам, т.е. рост концентрации железа влечет увеличение экспрессии
гепсидина. В плазме же уровень гепсидина поддерживается на постоянном уровне на
протяжении жизни опухоленосителя.
Динамика ферритина в асците практически совпадает с динамикой железа. Коэффициент
корреляции между двумя этими параметрами равен 0,94. При этом отмечено высокое
содержание ферритина в макрофагах, что говорит об активном секвестрировании железа
макрофагами в брюшной полости.
Работа поддержана проектом НИР, выполняемым в рамках госзадания Минобрнауки №
2014/281.
СОДЕРЖАНИЕ ЛИПИДОВ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ
СЕРДЦА ПРИ ИСКУССТВЕННОМ ГИПОБИОЗЕ КРЫС
Степанова Л.И.1, Морозова В.С.2, Сисолятин С.В.2, Уманская А.А.2, Хижняк С.В.2
1
Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко; 2Национальный
университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев, Украина
biohimik@ukr.net
Формирование
гипобиотического
состояния
приводит
к
гипометаболизму,
сопровождающийся снижением энергообеспечения гомойотермного организма. Митохондрии,
функциональную активности которых обеспечивает их внутренняя мембрана — основной
поставщик энергии в клетках эукариот, которые могут выполнять и роль теплогенераторов в
клетках организма. Одним из основных факторов регулирования окислительного
фосфорилирования в митохондриях может выступать модификация белок-липидных
взаимодействий их внутренней мембраны. В этой связи представляет важность исследование
липидного состава внутренней мембраны митохондрий тканей млекопитающих в состоянии
искусственного гипобиоза. Объектом исследования выбрана внутренняя мембрана
митохондрий сердца.
Опыты проводили на беспородный крысах-самцах массой 180-190 г. Для введения в
состояние искусственного гипобиоза методом гипоксии-гиперкапнии животных выдерживали в
герметичной камере объемом 3 л при температуре среды 3-4°С в течение 3–3,5 ч. Крыс
декапитировали в состоянии искусственного гипобиоза (t° тела 16°С), а также через 2 ч и 24 ч
после прекращения действия факторов гипобиоза (t° тела 37°С). Митохондрии сердца, а затем
внутреннюю
мембрану
митохондрий
получали
методом
дифференциального
центрифугирования. Липиды мембранных препаратов экстрагировали, а затем разделяли
методом тонкослойной хроматографии.
При искусственном гипобиозе увеличивалось содержание общих липидов на 15,9%, общих
фосфолипидов на 24,2%, холестерола на 40,7% внутренней мембраны митохондрий, а через 24
ч после прекращения действия факторов гипобиоза величины этих показателей приближались к
контрольным значениям. Показано перераспределение индивидуальных фосфолипидов в
состоянии гипобиоза: относительное (% от суммы фосфолипидов) содержание основных
фосфолипидов не изменялось, при этом увеличивалось содержание фосфатидилсерина и
фосфатидилинозитола (на 37,2%), сфингомиелина - на 26,7%, а кардиолипина уменьшалось на
119
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
29,3%. Через 24 ч после прекращения действия факторов гипобиоза содержание минорных
фосфолипидов не возвращалось к контрольным значениям. Показано изменение молярного
соотношения ХС/ФЛ и ХС/ФХ, что характеризует структурно-функциональное состояние
мембран. Полученные результаты свидетельствуют о модификации липидной компоненты
внутренней мембраны митохондрий печени крыс, а также об особенностях реакции
мембранных фосфолипидов на действие факторов гипобиоза.
ВЛИЯНИЕ ГИДРОСТАТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ НА СТРУКТУРНЫЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛЕТОК И МЕЖКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ ВОДЫ В
КОРНЯХ КУКУРУЗЫ
Суслов М.А., Абдрахимов Ф.А., Анисимов А.В.
ФГБУН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань, Россия
makscom87@mail.ru
Эффекты влияния давления на биологические объекты являются предметом внимания
многих исследователей, причем подавляющее количество работ связано с высокими
давлениями от 100 МПа и выше. С другой стороны, именно физиологический диапазон
давлений представляет наибольший интерес с точки зрения выяснения механизмов движущих
сил переноса водных растворов, передачи сигнальной информации, модуляции проводимости
структур (мембран, плазмодесм, клеточной стенки), стоящих на пути движения воды.
Целью данной работы является исследование на примере сегментов всасывающей зоны
проростков корней кукурузы и интактных растений влияния внешнего гидростатического
давления физиологического диапазона до 4 МПа на рост, структурные характеристики клеток,
диффузионные параметры межклеточного транспорта воды. Гидростатическое давление
создавалось с помощью пневмосистемы. Для регистрации диффузионных параметров воды
использовалась спин-эхо техника ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля.
Электронная микроскопия применялась для регистрации изменений организации клеток корня
при вариации гидростатического давления.
Воздействие внешнего давления (4МПа, 5 часов) приводило к снижению скорости роста
интактных растений до 70% от контроля с возобновлением скорости роста через сутки. При
значениях давления 2МПа наблюдалась кластеризация элементов эндоплазматической сети,
увеличение в цитоплазме числа мелких вакуолей и мультивезикулярных структур, торможение
мембранного трафика в эндомембранной системе клеток. Повышение гидростатического
давления до 4МПа приводило к фрагментарному нарушению целостности тонопласта, при этом
барьерная функция цитоплазматической мембраны не нарушалась. При давлениях порядка 2
4МПа наблюдался рост межклеточного диффузионного переноса воды. Таким образом,
мишенью воздействия давления является мембранная система клеток, при этом структурные
изменения, происходящие с ней под давлением, по крайней мере, до 4 МПа не являются
летальными для клеток.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ К+ КАНАЛОВ TREK-2 В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ
СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА
Тарасов М.В.1, Котова П.Д.1, Рогачевская О.А.1, Сысоева В.Ю.2
1
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино; 2ФГБОУ ВПО Московский
государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
doom1618@gmail.com
Ионные каналы, функционирующие в мезенхимальных стромальных клетках (МСК), могут
играть существенную роль в поддержании их плюропотентности и инициации процессов
пролиферации и дифференцировки. Между тем, механизмы электрогенеза в МСК изучены
недостаточно. Используя элетрофизиологические подходы и ингибиторный анализ, нами
исследовались ионные каналы, функционирующие в МСК и, в частности, каналы, активные в
покое.
120
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
В самых разнообразных клетках проницаемость плазматической мембраны для ионов Clявляется существенным фактором, детерминирующим мембранный потенциала в покое. Для
оценки вклада Cl- каналов в установление потенциала покоя в МСК нами использовались
различные ингибиторы анионного транспорта. В то время как 9-AC, SITS и DIDS не оказывали
существенного влияния на интегральную проводимость клеток, нифлумовая кислота (NFA) (0,2
- 4 мМ) вызывала обратимую гиперполяризацию МСК до -20 - -80 мВ, что сопровождалось
увеличением интегральной проводимости. Это явление наблюдалось во всех 50 исследованных
клетках. Поскольку данный эффект NFA частично блокировался TEA (20 мМ) и отсутствовал в
условиях диализа клеток раствором CsCl, таковой не мог быть обусловлен блокадой Clканалов. Поэтому основной мишенью NFA должны были быть не Cl- каналы, а K+ каналы,
которые стимулировались данным агентом.
Дальнейшие исследования показали, что NFA-стимулируемые токи потенцировались при
закислении наружного раствора и ингибировались при его защелачивании. Из литературных
источников известно, что чувствительность к экстраклеточному pH такого типа среди K+
каналов, активируемых NFA, проявляются только TREK-2 каналы. Еще одним свидетельством
в пользу того, что мишенью NFA в МСК являются TREK-2 каналы, было то, что NFA-токи
блокировались дилтиаземом (diltiazem) (1 мМ), который блокирует TREK-2 каналов.
Соответственно, дилтиазем вызывал деполяризацию NFA-чувствительных клеток, уменьшая их
К+ проводимость. Учитывая, что помимо TREK-2 мишенью для дилитазема могли быть и
другие ионные каналы, мы провели дополнитнльный контроль, основанный на достаточно
специфическом активирующем действие ионов Cu2+ на TREK-2 каналы, описанном в
литературе. Опыт показал, что 30 мкМ CuSO4 потенцируют NFA-активированную
проводимость. В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что МСК
экспрессируют ген TREK-2 каналов, которые функционально активны практически в каждой
клетке. Поддержано грантом РФФИ 14-04-01711 А «Сигнальные системы мезенхимальных
стромальных клеток человека».
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ рН СРЕДЫ НА СТРУКТУРУ ГЕМА
ГЕМОГЛОБИНА МЕТОДАМИ СПЕКТРОСКОПИИ КОМБИНАЦИОННОГО
РАССЕЯНИЯ И МЁССБАУЭРОВСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Тхор Е.С.
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова,
Москва, Россия
e-thor@mail.ru
Изменения структуры гема гемоглобина могут происходить при различных патологиях, а
также при связывании атома железа с лигандом. Для оценки конформации гемопорфирина
применяют спектроскопию комбинационного рассеяния, которая широко используется для
исследования структуры биологических молекул, что позволяет применять её для обнаружения
опухолевых тканей, атеросклеротических бляшек, а также оценки степени оксигенации крови.
В свою очередь Мессбауэровская спектроскопия позволяет получить информацию об
электронной структуре железа в геме гемоглобина.
В данной работе использовали сочетание методов спектроскопии комбинационного
рассеяния и Мёссбауэровскую спектроскопию. Для оценки структуры гема гемоглобина, а
также его способности связывать кислород и отдавать лиганды в эритроцитарной массе с
увеличением рН применяли спектроскопию комбинационного рассеяния. Мёссбауэровскую
спектроскопию использовали для исследования изменений электронной структуры железа гема
гемоглобина.
На спектрах гемоглобина, полученных с помощью рамановской спектроскопии при длине
волны лазера 473 нм видно, что структура спектра меняется при увеличении рН в интервале от
5,8 до 8,0. Для определения параметра связывания гема с кислородом использовали
соотношения I1580/I1548, а способность отдавать лиганд – I1375/I1580. По этим соотношениям
было установлено, что при увеличении рН среды сродство кислорода к гемоглобину падает, а
способность отдавать лиганды возрастает, что соответствует эффекту Бора.
121
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Мёссбауэровская спектроскопия позволила выявить отличия электронного состояния
железа гема гемоглобина, а именно изменение квадрупольного момента и химического сдвига,
что говорит о переходе оксигенированной формы в дезоксиформу при повышении рН.
Результаты, полученные с помощью методов спектроскопии комбинационного рассеяния,
хорошо согласуются с данными полученными методом Мёссбауэровской спектроскопии.
Связывание гема гемоглобина с кислородом вызывает не только изменение конформации гема,
но и изменения в электронном состоянии железа гема.
Такое сочетание методов изучения гема гемоглобина в дальнейшем может помочь в
диагностике патологий, например, тканевой гипоксии, сердечнососудистых заболеваний,
лейкемии и др.
ОСМОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭРИТРОЦИТОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ,
КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ В ПРИСУТСТВИИ КОМБИНИРОВАННЫХ
КРИОЗАЩИТНЫХ СРЕД
Улизко П.Ю.1, Боброва Е.Н.2, Жегунов Г.Ф.1
1
Харьковская государственная зооветеринарная академия; 2Институт проблем
криобиологии и криомедицины НАН, Харьков, Украина
prisil@i.ua
Современные методы криоконсервирования позволяют успешно хранить эритроциты
человека в течение нескольких десятков лет. Однако для эритроцитов других млекопитающих
эти методы зачастую оказываются неэффективными, что обусловлено видовыми
особенностями строения мембран клеток и их проницаемостью для криозащитных соединений.
Так, применяемый в криобанках всего мира при криоконсервировании эритроцитов человека
глицерин оказался малоэффективен при низкотемпературном хранении эритроцитов быка,
кроля и лошади. Исследования показывают более высокое криозащитное действие ДМСО при
замораживании эритроцитов этих млекопитающих, однако удается получить не более 63÷66%
сохранных клеток после криоконсервирования. Это может быть связано с тем, что высокие
концентрации ДМСО являются токсичными для клеток. Однако токсичность ДМСО может
быть снижена за счет смешения с другими криозащитными соединениями. В частности,
показано, что введение в криозащитную среду высокомолекулярных добавок снижает
вероятность внутриклеточной кристаллизации за счет дегидратации клеток на этапе экспозиции
и повышает устойчивость клеток к замораживанию. Нами была разработана комбинированная
криозащитная среда, содержащая 7,5% ПЭО-1500, 5% ДМСО, 2,5% 1,2 ПД и 2,5% сахарозы,
позволяющая получить до 75% сохранных эритроцитов быка, кроля и лошади. В данной работе
была исследована осмотическая хрупкость эритроцитов на этапе инкубации с криозащитной
средой и после замораживания для оценки повреждающего действия компонентов
криозащитной среды и низких температур. Показано, что осмотическая хрупкость эритроцитов
кроля незначительно изменяется при действии факторов криоконсервирования, что
свидетельствует об их высокой осмотической резистентности. Для эритроцитов быка
наблюдается возрастание осмотической хрупкости уже после инкубации их в криозащитной
среде. В случае эритроцитов лошади выявлено незначительное увеличение осмотической
хрупкости на этапе инкубации и существенное возрастание этого показателя после
замораживания. Моделирование трансфузии в показало, что около 94% деконсервированных
эритроцитов исследованных млекопитающих остаются сохранными после инкубации в плазме
и физиологическом растворе при температуре 37°С в течение 24 часов, что свидетельствует о
высокой сохранности осмотических свойств эритроцитов при криоконсервировании в
разработанной многокомпонентной криозащитной среде.
122
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ СОЛНЕЧНОГО СВЕТА,
ПРЕОБРАЗОВАННОГО ЛЮМИНОФОРСОДЕРЖАЩИМИ МАТЕРИАЛАМИ,
НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК РОГОВИЦЫ И СЕТЧАТКИ IN VITRO
Фахранурова Л.И., Никонова Ю.А.
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
Пущино, Россия
lfakhranurova@gmail.com
Современные методы фотозащиты сетчатки после операции факоэмульсификации
катаракты предлагают введение в состав материалов интраокулярных линз (ИОЛ) желтого
пигмента, который абсорбирует в солнечном излучении ультрафиолетовый (УФ) и синий свет.
Мы предлагаем новый подход для фотопротекции сетчатки, который основан на введении в
состав материалов ИОЛ наноразмерных люминофоров, преобразующих опасный для глаз УФ
свет и синего диапазонов в излучение оранжево-красного диапазона. Данный подход основан
на имеющихся данных о том, что свет оранжево-красного диапазона способствует
восстановлению сетчатки после физических и химических повреждений. Исследование in vitro
проводили с использованием культуры клеток сетчатки (первичная культура клеток) и
роговицы (линия SIRC) с использованием МТТ-теста.
Облучение клеток проводилось с помощью лабораторного осветителя ЛОС-1 (Россия) с
ксеноновой лампой OSRAM XBO150 (мощность 150 Вт), излучение которой в видимом
диапазоне и в УФ- диапазоне спектра близко к спектру падающего излучения Солнца на
поверхность Земли. В качестве светопреобразующих материалов были применены пластины
толщиной 0,5 мм из акрила, используемого для изготовления интраокулярных линз МИОЛ
(НПП «Репер-НН», Россия), с включением 0,1% квантовых точек CdSe/CdS (размер 5-7 нм;
НТИЦ «Нанотех-Дубна»). В качестве контроля использовали пластины МИОЛ без
люминофоров.
Проведенное in vitro исследование воздействия светового потока на жизнеспособность
культуры клеток сетчатки и роговицы показало, что световое воздействие ЛОС-1 приводит к
зависимому от дозы облучения фотоповреждению клеток. При дозах облучения 0,6-2 Дж/см2
не наблюдается значимого различия в защитном действии материалов МИОЛ, применяемых
для изготовления интраокулярных линз, и материалов МИОЛ с квантовыми точками. Однако
при повышении дозы облучения до 10-50 Дж/см2 материалы МИОЛ не справляются с защитой
клеток, в то время как МИОЛ с добавлением КТ полностью защищают клетки, оказывая даже
незначительное стимулирующее воздействие по сравнению с интактным контролем.
Проведенное нами исследование показало, что наличие даже небольшой по интенсивности
дополнительной люминесцентной компоненты в спектре солнечного света приводит к
стимуляции внутриклеточных процессов и повышению регенеративных возможностей
организма. Это открывает перспективы применения светопреобразующих материалов для
защиты сетчатки глаза от фотоповреждения и профилактики дистрофических изменений
роговицы и сетчатки. Работа сделана благодаря поддержке стипендии Президента (СП6350.2013.4).
ИССЛЕДОВАНИЕ УФ-ИНДУЦИРОВАННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ СВОБОДНОГО И ИММОБИЛИЗОВАННОГО
НА МАТРИЦЕ ХИТОЗАНА ТРИПСИНА
Холявка М.Г., Сазыкина С.М.
ФГБОУ ВПО Воронежский государственный университет, Воронеж, Россия
holyavka@rambler.ru
УФ-излучение является постоянно действующим фактором внешней среды, поглощается в
живых клетках в основном белками и нуклеиновыми кислотами и оказывает мощное
воздействие на многие физиологические процессы, протекающие в организме. Изучение
механизма действия УФ-света на биосистемы различного уровня организации, в том числе и на
белки-ферменты, является одной из центральных проблем биофизики и биохимии и позволяет
123
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
выявить
механизмы
деструктивно-модифицирующего,
регуляторного
и
лечебнопрофилактического действия УФ-излучения.
Объектом исследования был выбран бычий трипсин фирмы «MP biomedicals». В качестве
носителя использовали два вида хитозана, синтезированных ЗАО «Биопрогресс»: хитозан
пищевой кислоторастворимый ХТЗ №07 (Мr=200кДа, степень деацелирования – СД – 82%),
хитозан кислоторастворимый высокомолекулярный ХТЗ №12 (Мr=350кДа, СД=94,85%).
Иммобилизацию трипсина на хитозане осуществляли адсорбционным методом. УФоблучение растворов белка (в концентрации 1×10-5 моль/л) проводили при их непрерывном
перемешивании магнитной мешалкой в термостатируемой кювете (20±1°С) с помощью ртутнокварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390.
Дозы облучения составляли 151, 453, 755, 1510, 3020, 4530 и 6040 Дж/м2.
Установлено, что при облучении трипсина в диапазоне доз 151-1510 Дж/м2 не происходит
статистически достоверных изменений его активности: при дозах 151 и 453 Дж/м2 наблюдается
тенденция к небольшому увеличению протеолитической активности, при 755 Дж/м2 –
тенденция к ее снижению, которая усиливается при облучении в дозе 1510 Дж/м2. При
использовании в эксперименте доз 3020, 4530 и 6040 Дж/м2 мы регистрировали статистически
достоверное снижение каталитической активности соответственно на 28, 32 и 49%.
Выявлено, что матрица хитозана оказывает существенное влияние на процессы,
происходящие с молекулами иммобилизованного на ней трипсина при действии УФ-излучения.
ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ СРЕДЫ Г.САРАТОВА С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ
ФИТОИНДИКАЦИИ
Чемаркин Д.А., Скардова В.А., Симонова З.А.
ФГБОУ ВПО Саратовский государственный технический университет
им. Гагарина Ю.А., Саратов, Россия
chedial@mail.ru
Фиксация и оценка физиолого-биохимических и анатомо-морфологических изменений
городских растений дают достоверную картину условий их места произрастания и отражают
состояние урбаносреды.
Целью нашего исследования являлось выявление качества состояния среды г. Саратова с
помощью методов фитоиндикации.
В качестве материала исследования были выбраны листья Betula pendula. Районы
исследований определялись по результатам химических анализов атмосферного воздуха и
располагались в местах оживленного транспортного движения и вблизи крупных
промышленных предприятий г. Саратова. Работа проводилась в два этапа.
На первом этапе изучалась стабильность развития Betula pendula. Результаты эксперимента
показали, что экологическая ситуация в г. Саратове оценивается не ниже 3 – 5 баллов, а это
соответствует неблагоприятному состоянию окружающей среды. Критическая экологическая
обстановка (5 баллов) сложилась, в основном, вокруг крупных предприятий и в местах
массового скопления автотранспорта. Наиболее благоприятная ситуация отмечается в
Природном парке «Кумысная поляна», любимом месте отдыха горожан.
На следующем этапе определялась активность пероксидазы в листьях Betula pendula
фотометрическим методом. Обобщение данных различных вегетационных периодов (2008 –
2013 гг.) позволил сделать вывод об отчетливо выраженном характере временной динамики
содержания пероксидазы в листьях B. pendula. В начале вегетационного периода наиболее
высокие показатели пероксидазной активности были зафиксированы на участках, являющихся
крупными транспортными узлами города, минимальные - в листьях берёзы, произрастающей в
спальных районах города. Относительно высокой оказалась активность фермента в листьях,
собранных в условно-чистой среде города (Природный парк «Кумысная поляна»).
В конце вегетационного периода было зафиксировано обратное изменение активности
пероксидазы в листьях березы – в тех районах, где она была повышенной в мае, в сентябре
становилась пониженной, и наоборот. В среднем по городу активность фермента в листьях
берёзы за вегетационный период понижалась в 7 раз. Это можно объяснить тем, что растения в
течение всего вегетационного периода находятся в состоянии стресса.
124
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
Таким образом, анализ и сравнение результатов двух независимых экспериментов
показали, что в городе Саратове экологическая ситуация может рассматриваться как
неблагоприятная. Критическая экологическая обстановка отмечается в центральных районах
города с мощной транспортной развязкой.
ВЛИЯНИЕ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ НА АКТИВНОСТЬ
ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ АМИЛАЗЫ У КРЫС
Шахмуров Г.А., Кучкарова Л.С.
Национальный университет Узбекистана, Ташкент, Узбекистан
gyuloglan89@mail.ru
Известно, что в овощных культурах содержание нитратов и нитритов зачастую превышает
допустимые нормы. Поэтому целью работы было определение активности гидролитической
системы органов пищеварения на примере α-амилазы поджелудочной железы при нитратной
интоксикации. Данный фермент одним из первых подвергается воздействию ксенобиотиков в
полости желудочно-кишечного тракта и активность его легко сдвигается при воздействии
многих эндо- и экзогенных факторов.
Крысам-самцам вводили раствор нитрата натрия в дозе 20 мг/кг массы тела. Активность
фермента определяли в поджелудочной железе (Уголев, 1969) на 7-й день после обработки
крыс в ткани поджелудочной железы и содержимом тонкой кишки. Показано, что у
интоксицированных крыс активность α-амилазы ткани поджелудочной железы составляла
7011,9±89,3 мг/мин/г ткани в опыте против 9112,82±877,4 мг/мин/г ткани в контроле, т.е.
уменьшалась в 1,3 раза. В содержимом тонкой кишки активность фермента составляла 20,0±0,7
мг/мин/г ткани кишки у крыс опытной группы против 91,6±8,7 мг/мин/г ткани у крыс
контрольной группы. Снижение активности фермента в секретируемом соке поджелудочной
железы было более выраженным (в 4,6 раза) по сравнению с активностью фермента в ткани
органа под влиянием нитрата натрия. Неоднозначность уменьшения активность α-амилазы в
содержимом кишечника и в ткани поджелудочной железы у интоксицированных крыс
показывает, что параллелизм между секрецией и синтезом фермента в поджелудочной железе
при нитратной интоксикации отсутствует.
Таким образом, нитраты и нитриты угнетают как синтез, так и секрецию ферментов
поджелудочной железы. При этом репрессирующее влияние нитратов на секрецию фермента
(активности фермента в содержимом тонкой кишки) более выражено по сравнению с
воздействием его на синтез (активность фермента в ткани органа).
Выявленное уменьшение активности фермента в ткани и, особенно, в кишечном
содержимом согласуются с литературными данными в том, что задержка секреции фермента,
при нитратной интоксикации, скорее всего, обусловлена деструктивными изменениями в ткани
поджелудочной железы: спазмами сосудов, протоков, а также изменением тонуса миоцитов,
приводящими к набуханию органа. Не исключено, что это обусловлено возможным
канцерогенным воздействием нитратной интоксикации на поджелудочную железу.
ВЛИЯНИЕ γ-ОБЛУЧЕНИЯ СЕМЯН ЯЧМЕНЯ НА РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ
НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА
Чурюкин Р.С.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
радиологии и агроэкологии РАСХН, Обнинск, Россия
r.churyukin@mail.ru
Предпосевное облучение семян – это технология, позволяющая повысить экономическую
эффективность возделывания с/х культур за счет ускорения роста и развития растений,
сокращения периода вегетации, увеличения урожая, а в некоторых случаях и улучшения его
качества.
В качестве объекта исследований были выбраны семена ячменя сорта Нур (первая
репродукция, элита и суперэлита), Грейс первой репродукции урожая 2012 г. Облучение семян
125
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
проводили на установке «ГУР-120» (60Co). Дозу излучения оценивали с помощью дозиметра
ДКС–101. Мощность дозы облучения составляла от 20 до 350 Гр/ч. Для исследования
зависимости доза–эффект использовали дозы 2, 4, 6, 8, 10, 13, 16, 20, 25 и 50 Гр. Влажность
семян перед облучением определяли по ГОСТ 12041–82. Во всех случаях влажность семян
соответствовала нормам хранения воздушно–сухих семян ячменя и составляла 13-15%.
Облученные и контрольные семена проращивали в рулонах фильтровальной бумаги согласно
ГОСТу 12038-84 и рекомендациям Р.С. Бабаян, с модификациями. Проведено 3 независимых
эксперимента по оценке влияния γ-облучения семян ячменя на развитие растений на ранних
этапах онтогенеза
Результаты исследования показали, что всхожесть облученных семян не зависит от дозы в
исследованном диапазоне (2-50 Гр). Энергия прорастания также не зависит от дозы и в
большинстве исследованных вариантов повторяет тенденции изменения всхожести для сорта
Нур и Грейс. По результатам трех независимых экспериментов на семенах первой
репродукции, стимуляция роста главного корня (до 16% от контроля) наблюдалась при дозе в
20 Гр, при мощности дозы в 60 Гр/ч. (Нур, Грейс). Максимальное увеличение длины ростка (до
20% от контроля) для обоих сортов наблюдалась в диапазоне от 16 до 20 Гр при мощности
дозы в 60 Гр/ч так же в каждом из трех экспериментов. Уменьшение мощности дозы до 20 Гр/ч
или увеличение до 350 Гр/ч не приводило к увеличению длины ростка и главного корня и
зачастую наоборот, ингибировало их развитее. Эксперименты по оценке роли сортового
качества (первая репродукция, элита и суперэлита) семян сорта Нур показали, что наиболее
выражено эффект радиационной стимуляции проявляется на семенах первой репродукции.
Число корешков у проростков, выросших из облученных семян не зависело от дозы излучения
и составляло 4-6 корешков во всех вариантах эксперимента. Хранение семян после облучения в
целом негативно сказывается на эффекте стимуляции. Особенно сильно это проявляется на
семенах суперэлиты и элиты. Для семян первой репродукции стимулирующий эффект
проявляется в диапазоне доз 8-13 Гр даже после недельного срока хранения.
ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ
МОЛЕКУЛЫ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА У ОБЛУЧЕННЫХ
ЖИВОТНЫХ ПРИ ПОЕНИИ ВОДНЫМ ЭКСТРАКТОМ МИЦЕЛИЯ
ГЕРИЦИЯ ГРЕБЕНЧАТОГО (HERICIUM ERINACEUS)
Шафорост А.С.
ГНУ Институт радиобиологии НАН Беларуси, Гомель, Беларусь
asofocl@mail.ru
В связи с увеличением антропогенной нагрузки на окружающую среду, а также увеличении
облучения населения вследствие катастроф на атомных электростанциях в Чернобыле и
Фукусима-1 возникает необходимость в разработке радиозащитных препаратов нового
поколения. Использование для этого веществ, полученных из природных источников,
представляющих собой целый комплекс действующих агентов, позволяет выйти за рамки
классического понятия «радиопротектор».
Исследовано изменение зондовой флуоресценции молекулы сывороточного альбумина у
лабораторных мышей линии Af, которые подверглись воздействию γ-облучения в
полулетальной дозе (7 Гр) и принимали препарат, представляющий собой водный экстракт
мицелия (ВЭМ) гериция гребенчатого. Непосредственно измерялась интенсивность
флуоресценции сывороточного альбумина в режиме определения эффективной (ЭКА) и общей
(ОКА) концентрации альбумина. Наиболее информативны производные показатели –
отношение ЭКА/ОКА и индекс токсичности (ИТ).
Лабораторные животные были разделены на 4 группы: контроль, облучение,
профилактический прием, терапевтический прием. Суть профилактического приема препарата
состоит в том, что животные получали с питьем ВЭМ гериция до (1 г/л) и после облучения (1
г/л). В случае терапевтического приема животные получали препарат только после облучения в
концентрации 2 г/л. Таким образом, животные суммарно получили одинаковое количество
водного экстракта.
126
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
У облученных животных наблюдается некоторое снижение значения отношения ЭКА/ОКА
(0,66±0,03) по сравнению с контролем (0,69±0,02). Данный факт свидетельствует о снижении
эффективной концентрации альбумина, т.е. о подавлении его связывающей способности.
Анализ результатов применения различных схем приема изучаемого препарата, показал
наличие достоверного увеличения величины ЭКА/ОКА сравнению с контролем. При этом
различия между профилактическим (0,75±0,03) и терапевтическим (0,79±0,01) способом приема
не являются достоверными.
Увеличение отношения ЭКА/ОКА в группах, в которых животные пили водный экстракт
мицелия и затем подвергались облучению в полулетальной дозе, свидетельствует о снижении
числа занятых субстратами мест связывания в молекуле альбумина, что говорит о снижении
интоксикации организма. Этот факт может свидетельствовать о возможном радиопротекторном
действии препарата ВЭМ гериция гребенчатого.
РОЛЬ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК В РЕГУЛЯЦИИ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ
ЖИЗНИ ДРОЗОФИЛЫ В ОТВЕТ НА ИЗМЕНЕНИЕ РЕЖИМОВ ОСВЕЩЕНИЯ
Шосталь О.А., Москалев А.А., Данилов А.А
ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, Россия
olash@list.ru
Известно, что белки семейства GADD45 и транскрипционный фактор p53 играют
ключевую роль в репарации ДНК и в ответе на различные виды стресса. Однако роль данных
генов в регуляции продолжительности жизни в ответ на изменение режимов освещения ранее
не изучалась.
Цель наших исследований заключалась в изучении роли генов dGADD45 и p53 в регуляции
продолжительности жизни Drosophila melanogaster в ответ на изменение режимов освещения.
В работе исследовали линию дикого типа Canton-S в качестве контрольной линии; линию
dGADD45 – гомозигота по дефекту гена dGADD45 (генотип: y* w*; P{GawB}Gadd45NP0351) и
линию p535A-1-4– гомозигота по дефекту гена p53 (генотип: y1 w1118; p535A-1-4).
Условия эксперимента. Особи исследованных линий были разделены по полу на 3 группы.
Первая группа исследуемых линий содержалась в условиях стандартного 12 ч освещения при
интенсивности 120-130 лк, вторая группа – в условиях постоянного освещения (24 ч, 120-130
лк), третья группа – в условиях световой депривации (24 ч темнота, 0 лк). Также проводили
измерение суточной у дрозофил с разными генотипами при 12 ч, 24 ч и 0 ч режимах освещения
на 14, 35 и 50 дни жизни.
Согласно нашим результатам особи с нарушением в генах репарации ДНК оказались более
чувствительными к изменению длины светового дня и имели более выраженную разницу
между продолжительностью жизни в темноте и на свету по сравнению с линией дикого типа
Canton-S. При этом с увеличением длины светового дня (с 12 ч до 24 ч) наблюдалось ещё
большее снижение продолжительности жизни на свету по сравнению с особями дикого типа.
Полученные результаты указывают на опасность избыточного освещения и подтверждают
важную роль исследуемых генов в регуляции продолжительности жизни в ответ на изменение
длины светового дня.
Исследование суточной активности самцов и самок лабораторных линий дрозофилы при
разных режимах освещения (24 ч, 12 ч, 0 ч) в возрасте 14, 35 и 50 дней жизни показал, что
суточная активность зависит от генотипа, пола и возраста мух. Самцы более активны, чем
самки. С возрастом наблюдается снижение суточной активности самцов и самок исследуемых
линий. Изменение режима освещения (световая депривация или удлинение светового дня до 24
ч) приводит к десинхронизации суточной активности как самцов, так и самок исследуемых
линий. При этом наиболее заметное нарушение ритмов активности наблюдается при
круглосуточном режиме освещения.
127
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ДЕЙСТВИЕ ФРАКЦИЙ ЯДА NAJA OXIANA EICHWALD НА
АДФ-ИНДУЦИРУЕМУЮ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
Юнусова Э.С., Садыков Э.С., Шкинев А.В., Султаналиева Н.М.
Институт биоорганической химии им. акад. А.С.Садыкова АН РУз,
Ташкент, Узбекистан
rexa83@yandex.ru
Яд кобры Naja oxiana Eichwald, единственного представителя элапидовых змей в регионе
Центральной Азии – богатый источник фосфолипаз А2, нейро-, цито- и кардиотоксинов. Также
в нем выявлены оксидаза L-аминокислот и гидролазы: гиалуронидаза, ацетилхолинэстераза,
различные фосфатазы, в том числе нуклеотидаза (5’-НД), оксиагин и α-фибриногеназа.
Сравнительных исследований действия компонентов яда кобры на PRP ранее не проводилось.
При разделении яда на Superose-12 (0.05 M трис-НСl, pH 7.6, 4°С) было получено пять
основных фракций (фр. I- V). Фр.I (высокомолекулярная) содержала oксидазу L-аминокислот и
α-фибриногеназу; активностей ВАЭЭ и ФЛА2 не обнаружено. Фр. II-IV (компоненты с мол.
массой 15-6.5 кДа) включали основную по массе часть яда: ФЛА2, нейро- и
цитокардиотоксины. Фр. V (низкомолекулярная) образована пептидами разной мол.массы,
определяется также незначительная активность ФЛА2.
PRP получали из крови здоровых доноров по стандартной процедуре, кинетику агрегации
регистрировали общепринятым методом Борна. Яд (20 мкг) незначительно ингибировал
агрегацию в присутствии АДФ (16.5±1.1%). При этом порядок добавления в среду изучаемых
яда, фракций и/или АДФ, или преинкубация яда с АДФ не сказывались на эффекте. Фракции
(по 20 мкг) в разной степени тормозили агрегацию Tb. Так, для фр. I степень ингибирования
составила 52.8±3.91, II – 38.4±9.81, III – 23.3±3.83, IV – 12.0±3.35 и V – 22.7±7.52
соответственно. Компоненты фр. II–IV (чистые ФЛА2-I и -II и цитотоксин V”c-5, по 25 мкг)
ингибировали АДФ-агрегацию соответственно на 34±1.02, 31±1.0 и 14±0.9%, т.е. оказали
умеренное действие. Фр.I (20 мкг/мл) достоверно ингибировала АДФ-агрегацию; 3-минутная
преинкубация фр.I с индуктором приводила к 100% торможению агрегации, что может быть
связано с присутствием 5’-НД. На клетках рака груди в культуре было установлено
противоопухолевое действие фр.I (гибель 74% клеток при 1 ч инкубации 100 мкг фр.I/6х106
клеток), в связи с чем будет исследована биологическая активность ее индивидуальных
компонентов.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК ПРИ КОМБИНИРОВАННОМ
ДЕЙСТВИИ ОРАНЖЕВО-КРАСНОГО И УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО
ИЗЛУЧЕНИЙ
Юршенас Д.А.1,2, Гапеев А.Б.1
1
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино; 2ФГБОУ ВПО Самарский
государственный университет, Самара, Россия
dasha_ometova@mail.ru Россия
Негативное действие солнечного света на биологические системы обусловлено в основном
влиянием ультрафиолетового (УФ) излучения. Из-за поглощения УФ-C и большей части УФ-B
стратосферным озоновым слоем основное повреждающее действие оказывают УФ-A (95%) и
УФ-B (5%). Возникает вопрос о вкладе каждого из диапазонов УФ-излучения в повреждения
клеточной ДНК, индуцируемые солнечным излучением. Для защиты от повреждающего
действия УФ-излучения разрабатываются специальные светозащитные экраны, преобразующие
УФ-компоненту солнечного излучения в биостимулирующий оранжево-красный свет. Цель
работы состояла в оценке повреждающего действия УФ-А и УФ-B, возможности защиты
клеточной ДНК от повреждений при действии оранжево-красного света и выяснении
механизмов защитного действия.
Эксперименты выполнены с использованием общей фракции лейкоцитов периферической
крови мышей самцов линии SHK. Для облучения использовали лампу ДРШ250-3 со
светофильтрами УФС5, УФС6, ЖС20, интерференционный (313 нм) и поликарбонатный, не
пропускающий УФ-излучение, люминесцирующие экраны с люминофором на основе
128
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
квантовых точек КТ620. Уровень повреждений ДНК в лейкоцитах крови оценивали методом
«комета-тест».
Проведенные исследования показали, что при воздействии суммарным излучением от
лампы ДРШ250-3 в дозе около 6 Дж/см2 уровень повреждений ДНК в лейкоцитах составил
18.5±0.8%. При облучении крови с использованием поликарбонатного фильтра повреждений
ДНК обнаружено не было (0.24±0.08%). При эквивалентной дозе излучения облучение крови с
использованием светофильтров УФС5, УФС6, 313 нм и УФС5+ЖС20 индуцировало
повреждения ДНК в лейкоцитах около 19.1±1.7%, 1.3±0.2%, 19.4±1.2% и 22.7±1.8%
соответственно. Полученные результаты указывают на то, что основные повреждения ДНК под
действием света от лампы ДРШ250-3 обусловлены действием УФ-B. Использование
люминесцентных экранов (с активным и инактивированным люминофором) показало, что при
активном люминофоре наблюдается защитный эффект, уровень повреждений ДНК снижается в
среднем на 25%. Ранее было обнаружено, что под действием оранжево-красного света в водных
растворах продуцируются активные формы кислорода в наномолярных концентрациях,
которые могут быть медиаторами защитного эффекта. В наших экспериментах
предварительная инкубация клеток в присутствии экзогенной H2O2 в концентрациях 300-500
нМ приводила к снижению уровня повреждения ДНК, индуцируемых УФ-B, в среднем на 25%.
Обнаруженные нами эффекты представляются достаточно важными с точки зрения новых
возможностей и способов защиты клеток крови от повреждающего действия генотоксических
факторов.
КАЧЕСТВЕННЫЙ ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СОСТАВА МИКРОБНЫХ
ПОВЕРХНОСТНО АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Ягофарова А.Я., Бердимуратова К.Т., Хасенова Э.Ж., Молдагулова Н.Б.
РГП «Национальный центр биотехнологии» КН МОН РК, Астана, Казахстан
Almirayagy@mail.ru
В процессе очистки воды и почвы широко используют микроорганизмы, которые способны
синтезировать поверхностно-активные вещества (биоПАВ, биосурфактанты). Известно, что
наибольшую группу микробных поверхностно-активных веществ представляют гликолипиды.
Условия культивирования, структура и свойства биосурфактантов интенсивно изучаются.
Для наработки биосурфактантов использовали углеводородокисляющие штаммы бактерий
Pseudomonas aeruginosa КИБ и Dietzia maris MB3. Штаммы культивировали на питательной
среде СПБ с добавлением следующих гидрофобных субстратов: моторное масло, гексадекан,
керосин и.т.д. Выделение микробных поверхностно-активных веществ проводили двухкратной
экстракцией охлажденным ацетоном из надосадочной жидкости после центрифугирования при
10 000 об/мин. Продуцирование биоПАВ-ов определяли методами качественного химического
анализа по изменению цвета реакции.
Качественная реакция с нингидрином на аминогруппу (изменение цвета с зеленого на
фиолетовый) дала положительный результат, как в случае биоПАВ штамма Pseudomonas
aeruginosa КИБ, так и в случае штамма Dietzia maris MB3. Определение на наличие в составе
биосурфактантов моносахаридов, восстанавливающих дисахаридов (реакция Троммера) и
белка (биуретовая реакция) дала также положительный результат. В первой реакции наблюдали
появление желтого окрашивания, а во второй бледно-фиолетового, связанного с образованием
комплексных соединений меди.
Установлено, что биоПАВ, продуцируемые штаммом Pseudomonas aeruginosa КИБ,
реагируют с антроном (моносахариды), при этом наблюдается изменения цвета с зеленого на
синий. Наличие липидов, входящих в состав биосурфактантов отобранных штаммов,
определяли в реакции Гольдмана с красителем судан-III. Положительная реакция отмечается
изменением окраски с красного на оранжевый.
Также определяли эмульгирующую активность биоПАВ с добавлением керосина.
Установлено, что эмульгирующая активность биосурфактантов составила 35% для биоПАВ
штамма Dietzia maris MB3 и 65% для биоПАВ штамма Pseudomonas aeruginosa КИБ.
129
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОФИЗИКА И РАДИОБИОЛОГИЯ»
ЛИПОФИЛЬНОСТЬ И АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСВА КОМПЛЕКСОВ
ФЛАВОНОИДОВ С МЕТАЛЛАМИ ПЕРЕМЕННОЙ ВАЛЕНТНОСТИ
Ягольник Е.А., Гайдин С.Г.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула Россия
yea_88@mail.ru
Споcобноcть флавоноидов xелатиpовать металлы являетcя cущеcтвенным фактоpом иx
антиокcидантного дейcтвия и имеет два важныx cледcтвия. Во-пеpвыx, это удаление из cpеды
катионов металлов, cпоcобныx иницииpовать пеpекиcное окиcление липидов мембран и вовтоpыx, обpазующиеcя комплекcы флавоноидов c металлами пpоявляют бóльшую
антиокcидантную активноcть, чем cвободные флавоноиды.
В представленной работе приведены экcпеpиментальные данные об изменении
липофильности флавоноидов пpи обpазовании комплекcов c катионами железа(III) в различных
соотношениях и иx cпоcобноcти влиять на фазовое поведение липидов. Подобные явления
были получены нами ранее в отношении комплекcов флавоноидов c катионами железа(II).
Однако, если пpи взаимодейcтвии c Fe2+ наибольшей липофильноcтью обладали комплекcы c
cоотношением Fe2+:флавоноид = 1:2, то пpи взаимодейcтвии c Fe3+ наибольшая
липофильноcть наблюдаетcя пpи cоотношении Fe3+:флавоноид = 1:1, что cоответcтвует также
полученной нами величине cтеxиометpии cвязывания квеpцетина c катионами железа(III) в
водныx pаcтвоpаx. В фоcфолипидном биcлое, веpоятно, могут обpазовыватьcя комплекcы c
бóльшими величинами cоотношения Fe3+:флавоноид.
Результаты ДCК cвидетельcтвуют, что наибольшее влияние на темпеpатуpу плавления
липидов оказывают комплекcы c избытком катионов железа(III). Пpи избытке Fe3+
наблюдаетcя и наибольшая антиокcидантная активноcть, измеpяемая по уpовню МДА, а также
антиpадикальная активноcть, измеpяемая по воccтановлению молекул стабильного радикала
ДФПГ, встроенных в липидный бислой липосом. В обоиx cлучаяx наибольшей активноcтью
обладали комплекcы c cоотношением Fe3+:флавоноид =2:1, в то вpемя как в pаcтвоpе величина
cоотношения Fe3+:флавоноид = 1:1.
130
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
СЕКЦИЯ «Биохимия»
STRUCTURE OF URIDINE PHOSPHORYLASE FROM YERSINIA
PSEUDOTUBERCULOSIS AT 1.7 Å RESOLUTION AND ITS COMPLEX WITH
CYTOSTATIC ANTIBIOTIC
1
1
Balaev V.V. , Lashkov A.A. , Gabdoulkhakov A.G.1,2, Dontsova M.V.1,2, Seregina T.A.1,3
1
A.V.Shubnikov Insitute of Crystallography, Russian Academy of Sciences, Moscow;
2
Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences, Pushchino; 3Research Institute
for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, Moscow, Russian Federation
vlad_balaev@mail.ru
Cytostatic antibiotic trimethoprim is used for treatment of deseases, being caused by bacteria of
genus Yersinia. Previously its cytostatic activity on bacteria of Yersinia genus was shown to be
connected with the expression level and activity of pyrimidine phosphorylases.
In order to describe the mechanism of interaction between trimethoprim and pyrimidine
phosphorylases of Yersinia genus the structure of uridine phosphorylase Yersinia pseudotuberculosis
was solved and refined at 1.7 Å resolution – R-work = 16.2%; R-free = 19.4%; rmsd (bond/angl) =
0.006 Å/1.010°; DPI = 0.062 Å; Ramachandran statistics (MolProbity): favored regions = 98.33%,
allowed regions = 1.28%, ID PDB: 4NY1. Experimental set of the intensities, diffracted by the crystal,
was obtained on the X-ray diffractometer X8 PROTEUM (BRUKER AXS, Madison, USA;
http://www.bruker.com/) in Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences.
Interaction between the enzyme and trimethoprim molecule was investigated by means of
molecular docking in program Glide, Schrodinger Suite. Molecular dynamics modelling in
GROMACS program suite was held, for confirmation of enzyme binding with the ligand.
Trimethoxybenzene group of trimethoprim is localized in the area of enzyme phosphate-binding
site, whereas pyrimidinediamine group is localized in uracil-binding area. Highest number of
hydrogen bonds is formed between the enzyme and trimethoprim molecule at the time of 2.6 ns from
the modelling start: N1_TOP – 3.2 Å – N_Gly96/A, O1_TOP – 3.2 Å - NH2_Arg48/B, O3_TOP – 3.0
Å – N_Thr94/A. It was established that binding of the cytostatic molecule with the enzyme is stable.
Due to N1-glycoside bond absence in trimethoprim molecule, the reaction of phosphorolitic
cleavage of the ligand is impossible. Its buffering by uridine phosphorylase is the only way of their
interaction. It leads to reduction of trimethoprim effective concentration in bacteria. As a result of its
buffering the number of pharmacological drug, inhibiting pharmacological target – dihydrofolate
reductase, is decreased. This leads to the reduction of efficiency of treatment of infectious diseases
being caused by bacteria of Yersinia genus using this cytostatic drug.
The reported study was partially supported by budget financing of Institute of crystallography
Russian Academy of Sciences and by RFBR, research project No. 14-04-00952 a.
X-RAY STRUCTURE OF VIBRIO CHOLERAE URIDINE PHOSPHORYLASE IN
COMPLEX WITH 6-METHYLURACIL AT ATOMIC RESOLUTION
Prokofev I.I.1, Lashkov A.A.1,2, Gabdulkhakov A.G.1,2, Mironov A.S.3, Betzel C.4,
Mikhailov A.M.1
1
A.V.Shubnikov Insitute of Crystallography, Russian Academy of Sciences, Moscow;
2
Institute of Protein Research, Russian Academy of Sciences, Pushchino; 3State Research
Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, Moscow, Russian
Federation; 4University of Hamburg, Hamburg, Germany
alashkov83@gmail.com
Uridine phosphorylase (UPh; EC 2.4.2.3) – an enzyme catalyzing the reaction of phosphorolytic
pyrimidine nucleoside cleavage and reverse nucleoside synthesis reaction from (deoxy-) riboso-1phosphate and nitrogenous bases. Catalytic reaction with 5-alkyl and 5-halogen substituted pyrimidine
bases realized by UPh runs and is reversible. In case of 6-alkylsubstituted pyrimidines (6-methyluracil
(6-MU)) the reaction passes only in the nucleoside phosphorolysis direction and does not pass in
nucleoside synthesis direction. It was proposed in publications that chemical group, binding aromatic
131
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ring in the 6th position of 6-MU, is able to provide additional steric limitations for chemical reaction
passing in the nucleoside synthesis direction. X-ray analysis of uridine phosphorylase from pathogenic
bacteria Vibrio cholerae (VchUPh) complex with 6-methyluracil was held in order to determine
structural origins of this fact. Pharmaceutical companies has a demand on 6-MU both as immune
stimulating, anabolic drug and as supplementary drug for antibiotic therapy.
X-ray data sets were obtained from the crystals of the complex on the P13 station, PETRA III
(EMBL/DESY, Hamburg, Germany). Atomic resolution structure (1.17 Å) of the complex was solved,
refined and deposited to Protein Data Bank (ID PDB: 4K6O; Rwork = 10.9%; Rfree = 12.8%;
RMSDbonds = 0.016 Å RMSDangles = 1.185˚; DPI = 0.04 Å, Rama_plot_favored = 98.59%).
It was established that 6-MU binds by the means of hydrogen bonds with amino acid residues of
uracil-binding site of the VchUPh – Gln165, Arg167 and indirectly through water molecule with
Arg222. It was shown that 6-MU position versus binding amino acid residues corresponds in general
with uracil position in VchUPh binding site (RCSB ID: 3PNS). 6-methyluracil methyl group does not
prevent ligand binding with enzyme molecule, at least in the absence of reverse reaction second
substrate – riboso-1-phosphate. In its presence methyl group atoms of 6-methyluracil prevent C1 atom
ribose-1-phosphate from getting closer with N1 atom of 6-MU. This does not allow the conversion
reaction from 6-methyluracil to 6-methyluridine to pass. In case of direct reaction 6-methyluridine
methyl group does not prevent nucleophilic attacking on N1-glycoside bond by phosphate-anion. The
results of the work could be useful for the design of biotechnological pyrimidine nucleoside and free
bases synthesis processes by means of nucleoside phosphorylases possessing various substrate
specifity.
The reported study was partially supported and by RFBR, research project No. 14-04-00952 a.
STRUCTURE OF UPH FROM SALMONELLA TYPHIMORIUM COMPLEXED
WITH TYMIDINE AT 2.4Å RESOLUTION
Sotnichenko S.E.1, Lashkov A.A.1, Gabdoulkhakov A.G.1,2, Dontsova M.V.1,2
1
Institute of Crystallography Russian Academy of Sciences, Moscow; 2Institute of Protein
Research Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russian Federation
sombrios@mail.ru
Uridine phosphorylase (UPh, E.C. 2.4.2.3) – is a nucleoside phosphorylase that catalyzes
reversible phosphorolysis of uridine to uracil and ribose-1-phosphate. Apart from this, UPh from
Escherichia coli bacterium, in particular, catalyzes reaction with thymidine (THM), but with smaller
reaction speed.
Structure of UPh from Salmonella typhimorium (StUPh) complexed with THM was solved and
refined at 2.4 Å resolution. Refinement statistics are: Rfactor, = 22.20%, Rfree = 24.22%, R.M.S.D.
(bond length) = 0.007 Å, R.M.S.D. (bond angles) = 1.337°, DPI = 0.283 Å Ramachandran statistics
(Procheck): 90.3% of residues in most favored regions, 9.2% of residues in additionaly allowed
regions, 0.5% of residues in generously allowed regions. Merohedral twining was defined in the
structure with twinning law - «h, -h, -k, -l».
The analysis of the structure of StUPh complexed with THM showed that substrate molecule
forms hydrogen bonds with amino acid residues: Arg168, Glu166, Met197, Glu198, Arg91, Thr94.
Unfortunately, it was not possible to locate water molecule, binding the enzyme, that was observed in
other our structures. This fact could be related with twinning presence. The interaction between
substrate molecule and His8, which was observed in other structures of UPh (for instance, StUPh
structure with uridine (ID PDB: 2HWU)), was not revealed.
THM hydrophobic surrounding consists of the following amino acid residues: Ile220, Phe7 and
Phe162. That differs from other structures of UPh (for instance, in the structure of StUPh with uridine
hydrophobic surrounding consists of Ile220, Val221, Phe162 ). This fact is explained by the presence
of methyl group in THM attached to the fifth position of heterocyclic ring.
Thus, the obtained data allows assuming that the absence of the interaction with His8 and with
Phe7 leads to charge redistribution and tension of N-glycoside bond reduction. The latter leads to the
decrease in the speed of catalytic reaction.
132
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ПАЛЬМИТИНОВОЙ И
α,ω- ТЕТРАДЕКАНДИОЛОВОЙ ЖИРНЫХ КИСЛОТ КАК ИНДУКТОРОВ
СВОБОДНОГО ОКИСЛЕНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ
Адакеева С.И., Дубинин М.В., Ведерников А.А., Самарцев В.Н.
ФГБОУ ВПО Марийский государственный университет, Йошкар-Ола, Россия
samvic56@mail.ru
Исследовано действие на митохондрии печени свободных жирных кислот: пальмитиновой
(ПК) и α,ω-тетрадекандиоловой (ТДК). Ранее было установлено, что стимуляция дыхания
митохондрий ПК обусловлена возвращением протонов в матрикс при участии белковпереносчиков внутренней мембраны ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, а также
активацией циклоспорин А (ЦсА)-чувствительного транспорта электронов по дыхательной
цепи. В то время как стимуляция дыхания ТДК обусловлена только активацией ЦсАчувствительного транспорта электронов.
В настоящей работе разобщающие активности ПК и ТДК оценивались количественно по
увеличению скорости дыхания митохондрий, жирной кислотой, отнесенному к ее
концентрации (удельная разобщающая активность, VU); кроме того, оценивались три
составляющие VU: чувствительная к карбоксиатрактилату (VCatr), чувствительная к глутамату
(VGlu) и чувствительная к циклоспорину А (VCsA). Последние три величины характеризуют
участие ADP/ATP-антипортера, аспартат/глутаматного антипортера и чувствительной к ЦсА
системы транспорта электронов, соответственно. Установлено, что ПК в концентрации 30 мкМ
стимулирует дыхание митохондрий в 2,5 раза. В этом случае протонофорный разобщитель
FCCP в концентрациях 40 нМ, снижая разность электрических потенциалов (∆ψ) на 17%, не
влияет на VU, VCatr, VGlu и VCsA. К+/Н+ антипортер нигерицин, вызывающий в
концентрации 20 нМ увеличение ∆ψ до максимального уровня, существенно уменьшает VU,
VCatr и VGlu, но увеличивает VCsA. По-видимому, такой эффект нигерицина обусловлен
перемещением ПК с внутреннего монослоя внутренней мембраны на наружный монослой.
Показано, что ТДК в концентрации 0,4 мМ стимулирует дыхание митохондрий в 2 раза, при
этих условиях FCCP и нигерицин не влияют на VCsA. Малонат в концентрации 0,2 мМ,
ингибирующий максимальную скорость дыхания в присутствии 50 мкМ 2,4-динитрофенола на
45%, в присутствии ПК не влияет на VCatr и на VGlu, но существенно снижает VCsA. При
аналогичных условиях в присутствии ТДК малонат также существенно снижает VCsA. Сделан
вывод о том, что стимуляция дыхания митохондрий печени ПК частично и ТДК полностью
обусловлена активацией циклоспорин А-чувствительного транспорта электронов по
дыхательной цепи без снижения ∆ψ. Предполагается, что такие эффекты ПК и ТДК связаны с
локализацией их анионов на наружной поверхности внутренней мембраны.
Работа выполнена в рамках гос. задания Министерства образования и науки РФ (№ 1365) и
при финансовой поддержке РФФИ (грант № 14-04-00688).
КР-СПЕКТРОСКОПИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
ИНФАРКТЕ МИОКАРДА
Акимова Е.А, Кузьмичева Л.В, Балашов В.П.
ФГБОУ ВПО Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева,
Саранск, Россия
Leakimo@yandex.ru
Опыты проведены на 5 белых беспородных крысах массой 200 г. Инфаркт миокарда
моделировали перевязкой левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка левого
предсердия в течение 30 мин. Маркерами повреждения миокарда нами учитывались: частота
развития нарушений ритма сердца, характер аритмий, латентный период возникновения
ишемических аритмий, частота эктопической активности. ЭКГ регистрировали во II
стандартном отведении на протяжении всего опыта при помощи осциллоскопа ОСИ-01
(Россия). Запись ЭКГ осуществляли через каждые 5 минут на электрокардиографе ЭКИТ-03М
(Россия). Операцию выполняли под наркозом. Исследование выполнено на романовском
спектрометре in via Basis фирмы Renishaw с короткофокусным высокосветосильным
133
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
монохроматором (фокусное расстояние не более 250 мм). Для возбуждения романовских
спектров использовался лазер (длина волны излучения 532 нм, мощность излучения 100 мВт,
объектив 100x). Оцифрованные спектры обрабатывали в программе WIRE 3.3. Произведена
коррекция базовой линии сглаживание спектров. Для анализа конформации и О2-связывающих
свойств гемоглобина (Гб) использовали следующие полосы КР спектров эритроцитов (указаны
положения максимумов): 1172, 1355, 1548–1588, 1618, 1668 см-1.
Как показали наши исследования, при ишемии наблюдаются изменения конформации
гемопорфирина гемоглобина эритроцитов крови по отношению к контролю. Так, через 30
минут после проведения экспериментальной ишемии достоверно уменьшается на 10,9%
(p<0,05) способность гемоглобина связывать лиганды (в том числе кислород), определяемая по
отношению I1355/I1550. При этом сродство гемоглобина к кислороду (I1580/I1548) снижается
на 13,7% (p<0,05). Относительное количество оксигемоглобина, определяемое по отношению
I1375/(I1355+I1375), увеличивается на 10,8% (p<0,05), а способность гемоглобина выделять
лиганды (I1375/I1580) остается на уровне контрольных значений (0,55 ± 0,01 отн. ед. (p<0,05)).
Наблюдается увеличение на 35,3% (p<0,05) содержание комплексов гемоглобина с оксидом
азота при отсутствии связи между железом и глобином, определяемые по отношению
I1668/I1580. Все вышеперечисленные изменения отражаются в увеличении на 12,4% (p<0,05)
выраженности симметричных и ассиметричных колебаний пиррольных колец гемопорфирина
(I 1375/I1172).
ИЗМЕНЕНИЯ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ
ДЕЙСТВИИ НАНОЧАСТИЦ КОЛЛОИДНОГО СЕРЕБРА IN VITRO
Алесова Н.М., Кандрашкина Ю.С., Кузьмичева Л.В., Тютяев Е.В.
ФГБОУ ВПО Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева,
Саранск, Россия
stasya-anastas@mail.ru
Изучали влияние наночастиц коллоидного серебра (НЧС) на эритроциты крови человека.
Исследование проводили на крови больных острой пневмонией, отягощенной анемией (взяли
за контроль). Эксперимент выполнен в соответствии с требованиями этического комитета
Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарева. В эксперименте кровь
человека инкубировали с НЧС (100 мг/мл) в течение 60 мин и 3 часов при комнатной
температуре. Применяемое нами коллоидное серебро содержит частицы с радиусом 205 pm и
концентрацией 0,9*10-5 М. Контроль за состоянием морфологии эритроцитов производили при
помощи метода лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ). Как показали наши
исследования площадь эритроцитов и содержание в них гемоглобина в контроле составляет
145,002±23,369 мкм2 и 0,207±0,029 мкг соответственно. Содержание МДА, продукта ПОЛ, и
активность каталазы составляют 0,69±0,02 мкМ/л и 19,20±1,56 мкат/л. Сорбционная емкость
клеток в пределах 21,57±2,01 опт.ед. При инкубации крови с НЧС в течение 60 мин
наблюдаются увеличение содержания гемоглобина в эритроцитах на 41% (p<0,05).
Таким образом, НЧС приводят к стабилизации морфологических параметров клетки,
которые проявляются в увеличении площади клеток и содержания в них гемоглобина. При
этом нормализуются показатели в системе ПОЛ/АОА и сорбционной емкости клеток.
МНОГОКРАТНАЯ ГИПОТЕРМИЯ СНИЖАЕТ РИСК СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В МОЗГЕ
Астаева М.Д., Исмаилова Ж.Г.
ФГБОУ ВПО Дагестанский государственный университет, Махачкала, Россия
jamilja@mail.ru
Температура тела является важным фактором, определяющим постоянство скорости
физиологических процессов – одно из важнейших условий жизнедеятельности организма.
Проблема адаптации к холоду является одной из важнейших проблем современной
биологической науки. Однако при гипотермии в тканях различных органов млекопитающего
134
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
возникает опасность возникновения окислительного стресса – процесса, связанного с
интенсификацией
окислительно-восстановительных
реакций
и,
соответственно,
свободнорадикальных процессов.
Для оценки интенсивности свободнорадикальных процессов в головном мозге при
многократной умеренной гипотермии крыс нами были исследованы интенсивность
окислительной модификации белков мембран синаптосом по содержанию в них карбонильных
групп и содержание восстановленного глутатиона в супернатанте после шока синаптосом.
Было обнаружено, что при гипотермии 30°С содержание карбонильных групп в белках
мембран синаптосом увеличивается более чем в полтора раза, что свидетельствует об
активации образования активных форм кислорода. При гипотермии 20°С содержание
карбонильных групп в белках мембран синаптосом уменьшается по сравнению с гипотермией
30°С, но остается выше контроля, что является выражением защитной функции глубокой
гипотермии. Гипотермия 30°С после многократной гипотермии приводит к снижению
содержания карбонильных групп в мембранных белках на 22,5%. Гипотермия 20°С после
многократной гипотермии существенного влияния на уровень карбонильных групп не
оказывает. Снижение интенсивности окислительной модификации белков в синаптосомах коры
головного мозга крыс при многократной гипотермии, вероятно, связано с адаптацией к
холодовому воздействию, и увеличением антиоксидантной защиты организма. В связи с этим
нами было исследовано содержание глутатиона в супернатанте после шока синаптосом коры
головного мозга крыс. Гипотермия 30°С не оказывает существенного влияния на содержание
глутатиона, в то время как при гипотермии 20°С содержание глутатиона в синаптосомах крыс
увеличивается в 2,5 раза по сравнению с контролем. Гипотермия 30°С после многократной
гипотермии приводит к повышению содержания глутатиона в синаптосомах как относительно
гипотермии 30°С, так и относительно контроля. Гипотермия 20°С после многократной
гипотермии приводит к увеличению содержания глутатиона в синаптосомах в 2,8 раз по
сравнению с контролем.
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что многократная гипотермия
снижает риск окислительного стресса в головном мозге крыс.
ВЛИЯНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ КОРДОВОЙ КРОВИ НА
СОДЕРЖАНИЕ АДЕНИЛОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ В ДЕКОНСЕРВИРОВАННЫХ
КЛЕТКАХ ЛЕЙКОКОНЦЕНТРАТА
Ахатова Ю.С.1, Гулевский А.К.1, Сысоев А.А.2, Сысоева И.В.2
1
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН, Харьков, Украина; 2Институт
биологии южных морей им. А.О.Ковалевского НАН, Севастополь, Украина
Julija_Veselovskaja@meta.ua
Установлено, что известный препарат «Актовегин», являющийся гемодериватом из крови
молочных телят, стимулирует процессы энергетического обмена в клетках, в том числе
потребление кислорода, транспорт и утилизацию глюкозы. Ранее нами было показано, что
низкомолекулярная фракция (до 5 кДа) из кордовой крови (ФКК), имеющая общую природу с
препаратом «Актовегин», в составе инкубационной среды способствует накоплению глюкозы
клетками лейкоконцентрата. В связи с этим мы предполагаем, что механизм действия ФКК
связан с влиянием на энергетический метаболизм клеток. Цель исследования – изучить влияние
ФКК на содержание АТФ, АДФ и АМФ в деконсервированных клетках лейкоконцентрата.
Лейкоконцентрат, полученный из донорской крови, криоконсервировали с 5%
диметилацетамида. Выделение фракции из кордовой крови крупного рогатого скота проводили
методом ультрафильтрации. Ультрафильтрат лиофилизировали и хранили при -80°С. ФКК в
среду инкубации вносили в количестве 0,15 мг/мл. Содержание аденилатов в клетках
оценивали с помощью хемилюминесцентного анализа.
Показано, что после криоконсервирования содержание аденилатов в клетках изменяется,
при этом аденилатный пул (АТФ+АДФ+АМФ), показывающий потенциал энергетических трат
клеток, составляет всего 55,9% от исходной величины. Концентрация АТФ в нативных клетках
составляет 11,88±1,47 мкг/мг белка, а после криоконсервирования – 4,52±0,47 мкг/мг белка.
Инкубация клеток в среде с ФКК способствовала достоверному повышению данного
135
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
показателя до 6,05±0,34 мкг/мг белка. Количество АДФ в деконсервированных клетках
остается на уровне контроля, однако внесение ФКК в среду инкубации способствует его
повышению с 4,24±1,86 мкг/мг белка до 8,56±1,28 мкг/мг белка. Содержание АМФ в
деконсервированных клетках в 1,5 раза превышает контрольный показатель, по-видимому, это
свидетельствует о расщеплении АТФ до АДФ, а при дальнейшем отщеплении остатка
фосфорной кислоты – до АМФ. Инкубация клеток в ФКК-содержащей среде приводит к
увеличению содержания АМФ в 2 раза по сравнению с контролем. Увеличение содержания
АДФ и АМФ в клетках лейкоконцентрата под действием ФКК вероятно, отражает повышение
интенсивности расщепления АТФ. Важно отметить, что внесение ФКК в среду инкубации
деконсервированных клеток способствует повышению общего аденилатного пула до уровня
контроля, что свидетельствует о восстановлении энергетического потенциала.
Таким образом, полученные результаты подтверждают предположение о том, что механизм
действия ФКК связан со стимуляцией обмена аденилатов в клетках.
ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ В КЛЕТКАХ
ЛИНИИ MCF-7 ПРИ ДЕЙСТВИИ ГЕНОТОКСИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И
ПОДАВЛЕНИИ ФУНКЦИЙ БЕЛКА P53
Балакина А.А.1, Мумятова В.А.1, Кукушкина Ю.И.2, Терентьев А.А.1
1
ФГБУН Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка; 2ФГБОУ ВПО
Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского,
Нижний Новгород, Россия
stasya.balakina@gmail.com
Активные формы кислорода (АФК) могут увеличивать опухолеобразование путем
активации сигнальных путей пролиферации, ангиогенеза и матастазирования. Известно, что
проаптотический механизм действия ряда генотоксических соединений может быть АФКопосредованным. Нормальные физиологические концентрации белка р53 поддерживают
оксидативный статус клеток, однако увеличение или снижение содержания р53 индуцирует
окислительный стресс через регуляцию экспрессии анти- и прооксидантных генов. Таким
образом, изучение изменений активности ферментов и экспрессии генов антиоксидантной
системы (АОС) опухолевых клеток в ответ на различные цитотоксические препараты позволяет
выявить роль АФК в механизмах клеточной гибели.
В качестве объекта исследований были выбраны клетки линии MCF-7 (аденокарцинома
молочной железы человека), содержащие белок р53 дикого типа. В работе использовали
следующие генотоксические соединения: актиномицин Д, этопозид, цисплатин, сатраплатин, а
также аминонитроксильные комплексы платины (IV) – ВС131 и ВС149. Соединения добавляли
в культуральную среду в дозе IC50 с экспозицией 6 и 12 ч. Для подавления функций белка р53
использовали обработку клеток пифитрином.
Действие актиномицина, цисплатина, сатраплатина и комплексов платины (IV) вызывало
увеличение активности супероксиддисмутазы (СОД), а добаление пифитрина значительно
снижало этот показатель за исключением комплекса ВС149. Иное действие на активность
фермента показал этопозид: при экспозиции 6 ч изменений в активности не наблюдали, однако
после 12 ч действия активность СОД снижалась в 3 раза, а добавление пифитрина
индуцировало в обоих случаях значительное увеличение активности фермента. В случае
этопозида и аминонитроксильных комплексов платины присутствие пифитрина увеличивало
активность каталазы так при 6, так и при 12 ч действия. Таким образом, подавление функций
белка р53 оказывает существенное влияние на активность супероксиддисмутазы и каталазы в
клетках линии MCF-7.
Все исследуемые генотоксические соединения приводили к активации транскрипции генов
sod1, sod2, cat и gpx1, что может являться доказательством важной роли АОС в механизмах
клеточного ответа на генотоксические воздействия. Подавление функций белка р53
индуцировало существенное снижение экспрессии исследуемых генов после 12 ч экспозиции,
что говорит как о важной роли р53 в регуляции транскрипции генов АОС, так и о роли
компонентов АОС в механизмах клеточного ответа на генотоксические воздействие.
136
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ГЕНДЕРНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ НИЗКОГО УРОВНЯ МАО А НА
СОДЕРЖАНИЕ ГОРМОНОВ И АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ ДЕТОКСИКАЦИИ
ПЕЧЕНИ И МОЗГА В ОРГАНИЗМЕ МЫШЕЙ СТОКА CD-1
Веткина А.С., Фаттахова А.Н.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
fairy31february@yahoo.com
Цель работы: сравнительный гендерный анализ биохимической активности печени и мозга,
гормонального гомеостаза при условии патологически низкой активности МАО А у мышей
стока CD-1.
Материалы и методы. Опыты проводились на белых SPF мышах стока CD-1. Самки (n=25)
и самцы (n=25) получали внутрибрюшинно инъекции моклобемида в течение 10 суток. После
эвтаназии с помощью СO2 в плазме крови определяли концентрации гормонов с помощью
коммерческих тестов. Из печени и мозга выделяли микросомы и определяли концентрацию
цитохромов P450 и активность P450 3А4 с эритромицином. В микросомах печени и мозга
определяли активность МАО А с адреналином. Полутонкие криосрезы мозга опытных и
контрольных мышей получали с помощью криостата и окрашивали гематоксилином Майера и
Карацци, анализировали с помощью светового инвертированного микроскопа.
Результаты. В ходе исследования были выявлены различия в уровне гормонов у самцов и
самок. На фоне ингибирования МАО А уровень кортизола у самцов был ниже по сравнению с
контрольной группой. У самок наблюдалась обратная картина – уровень кортизола в опытной
группе был выше по сравнению с контролем. Уровень пролактина у самцов опытной группы
был снижен по сравнению с контрольной, у самок опытной группы уровень пролактина был
выше по сравнению с контролем. Концентрация ДГЭА-С была повышена у опытных животных
обоих полов по сравнению с контрольными группами. Было также показано, что низкая
активность МАО А сопровождалась увеличением содержания цитохромов системы P450 в
мозге и печени животных обоих полов в опытной группе по сравнению с контрольной.
Показано, что низкий уровень МАО А вызывал понижение активности гидроксилирования
эритромицина в микросомах мозга самок, но вызывал повышение активности в микросомах
мозга самцов. Анализ полутонких криосрезов мозга мышей выявил множественные разрывы
капилляров и полнокровие сосудов у опытных животных.
Заключение. C помощью вивальной модели с пониженным уровнем МАО А показано, что
в результате повышения уровня нейромедиаторов в результате подавления окисления
происходят значительные биохимические и гормональные перестройки организма мышей, в
результате которых в различных отделах мозга мышей наблюдается полнокровие и
геморрагические микроинсульты. Гендерный анализ всех параметров показал, реакции самок и
самцов на снижение активности МАО А были противоположны.
ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕКСА
ФОТОРЕЦЕПТОРНОГО Са2+-СЕНСОРА РЕКОВЕРИНА С КАРКАСНЫМ
БЕЛКОМ КАВЕОЛИНОМ-1
1,2
Владимиров В.И. , Сенин И.И.3, Григорьев И.И.3, Зерний Е.Ю.3, Зинченко Д.В.1
1
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН; 2ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественнонаучный институт, Пущино; 3НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского
Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
vasiliy.i.vladimirov@gmail.com
Нейрональный кальциевый сенсор рековерин – фоторецепторный белок, ингибирующий
фосфорилирование (десенситизацию) фотоактивированного родопсина родопсинкиназой и, тем
самым, принимающий участие в Са2+-зависимой регуляции зрительной трансдукции. В
присутствии фоторецепторных мембран, обогащенных рафт-структурами, происходит
повышение Са2+-чувствительности опосредуемого рековерином процесса десенситизации
родопсина.
137
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
Одним из ключевых белковых компонентов рафт-структур является кавеолин-1 –
трансмембранный каркасный белок, способный взаимодействовать с сигнальными белками
посредством
специального
«поддерживающего»
цитоплазматического
домена
(81FDGIWKASFTTFTVTKYWFYR101), и, таким образом, организующий их сигнальную
активность. Анализ первичной структуры рековерина выявил наличие канонической
последовательности, являющейся потенциальным участком связывания кавеолина-1 в целом
ряде белков. Участок расположен вне гидрофобного кармана рековерина, отвечающего за
присоединение родопсинкиназы, и входит в состав альфа-спирали второго Са2+-связывающего
центра (EF2) белка.
На основании проведенного анализа выдвинуто предположение о наличии прямого
взаимодействия кавеолина-1 с рековерином, которое может оказывать влияние на Са2+чувствительность последнего. В работе продемонстрирована способность рековерина
взаимодействовать с фрагментом цитоплазматического домена кавеолина-1 F81-R101
(полученным в виде химерного белка с глуатион-S-трансферазой) в присутствии Са2+.
Образование комплекса приводит к снижению кооперативности связывания кальция
рековерином, с одновременным сдвигом соответствующей константы диссоциации в сторону
более низких концентраций катиона. Показано, что повышение Са2+-чувствительности
рековерина обусловлено стабилизацией открытой конформации его второго Са2+связывающего центра (EF2). В то же время, присутствие цитоплазматического домена
кавеолина-1 не оказывает влияния на эффективность ингибирования родопсинкиназы. Таким
образом, транслокация рековерина в фоторецепторные рафт-структуры, содержащие кавеолин1, повышает Са2+-чувствительность регуляторной активности белка, адаптируя ее к
физиологическому диапазону изменения концентрации катиона в фоторецепторной клетке.
АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В
ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА
Волосникова Ж.А.1, Столяров А.А.2, Ермолаева А.А.1, Хатамов А.К.1,
Соловьев В.Б.1, Генгин М.Т.1
1
ФГБОУ ВПО Пензенский государственный университет; 2Пензенский областной
онкологический диспансер, Пенза, Россия
jeannette-s@yandex.ru
Ведущую роль в развитии опухоли играют цитокины. Уровень цитокинов и биологические
свойства обусловлены особенностями функционирования ферментативных систем обмена
биологически активных пептидов. Поэтому важным представляется исследование активности
ферментов обмена регуляторных пептидов. Цель работы - изучение активности КП Е и ФМСФКП – ключевых ферментов процессинга регуляторных пептидов – в тканях больных со
злокачественными и доброкачественными новообразованиями.
Изучение активности ферментов в тканях было проведено у 50 пациентов Пензенского
онкологического диспансера в возрасте от 35 до 70 лет. Активность КП Е определяли
модифицированным методом Fricker и Snyder. 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл
(опыт) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl или к смеси 140 мкл
вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора GEMSA (контроль).
Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл
предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на
воде. Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл
1М раствора HCl. Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5
мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы
разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин. Флуоресценцию
хлороформной фазы измеряли на флуориметре флюорат АБЛФ-Т при λex = 360 нм и λem = 530
нм в кювете толщиной 1 см. Активность ФМСФ-КП определяли аналогично активности КП Е.
Но в качестве субстрата использовался дансил-фен-лей-арг, в качестве ингибитора - ФМСФ.
Концентрацию белка в гомогенате определяли по Lowry.
Результаты эксперимента показали, что активность ФМСФ-КП и КП Е достоверно выше в
злокачественных новообразованиях молочных желез, желудка, кишечника, чем в
138
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
доброкачественных новообразованиях в этих же органах. Также отмечается увеличение
активности ФМСФ-КП, в отличие от КП Е, в злокачественных опухолях почек по сравнению с
доброкачественными. Это может быть ценным диагностическим маркером при
злокачественных новообразованиях почек.
Наиболее выраженное повышение активности КП Е и ФМСФ-КП - в 10 раз, наблюдаемое
при низкодифференцированной аденокарциноме желудка, говорит о зависимости между
интенсивностью роста и агрессивностью опухоли и интенсивностью процессинга регуляторных
пептидов при канцерогенезе. Возможно, что высокая активность этих карбоксипептидаз может
быть причиной, а не следствием злокачественного перерождения клетки.
ВЛИЯНИЕ ПИРАЦЕТАМА НА АКТИВНОСТЬ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Е
В НЕРВНОЙ ТКАНИ КРЫС
Гамзин С.С., Кручинина А.Д., Григорьева О.М.
ФГБОУ ВПО Пензенский государственный университет, Пенза, Россия
S.S.Gamzin@ya.ru
В последние годы все большее распространение получают когнитивные нарушения
различного генеза. В составе комплексной терапии таких состояний довольно часто
встречаются так называемые ноотропные средства. Эта фармакологическая группа включает в
себя достаточно разнообразные по химической структуре соединения, которые оказывают
влияние на высшие интегративные функции мозга, в т.ч. улучшают память, облегчают процесс
обучения, повышают устойчивость мозга к повреждающим факторам как у людей, страдающих
заболеваниями мозга, так и у здоровых лиц.
Первым представителем данной фармакологической группы стал пирацетам, до сих пор
считающийся эталонным ноотропом. Несмотря на колоссальное количество проведенных
исследований, окончательный механизм действия пирацетама до сих пор полностью не
расшифрован. Нами предположено вовлечение пептидергических систем мозга в
опосредование эффектов пирацетама.
В образовании активных форм регуляторных пептидов участвуют карбоксипептидазы, в
частности карбоксипептидаза Е, отщепляя остатки аргинина и лизина с C-конца пропептидов,
переводит их в биологически активную форму.
Таким образом, целью данной работы было определение активности КПЕ при действии
пирацетама.
Работа выполнена на самцах белых беспородных крыс возрастом 3 месяца и массой 200 250 г, содержащихся в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде.
Животным опытной группы в течение 14 суток интраперитонеально вводили пирацетам.
Животные контрольной группы получали физиологический раствор. Из эксперимента
животных выводили под хлороформным наркозом. Выделяли отделы головного мозга и в
полученных тканях определяли активность КПЕ флуориметрическим методом Fricker и Snyder.
Для статистической обработки полученных данных привлекали 3s-критерий и t-критерий
Стьюдента.
В результате исследования установлено, что получение животными пирацетама влияет на
активность КПЕ следующим образом: в гипофизе активность КПЕ повышается в 1,56 раз
(p<0,05), в продолговатом мозге – снижается в 1,21 раз (p<0,05), в гиппокампе активность КПЕ
повышается в 1,23 раз (p<0,05), в амигдале – повышается в 1,17 раз (p<0,05) по сравнению с
контрольной группой животных.
Таким образом, установлено активное вовлечение пептидергических систем мозга в
реализацию ноотропных эффектов пирацетама.
139
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СТЕПЕНИ ГИДРАТАЦИИ НА АКТИВНОСТЬ
НЕЙРАМИНИДАЗЫ ВИРУСА ГРИППА
Гребёнкина Н.С., Контаров Н.А., Юминова Н.В., Зверев В.В.
ФГБУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток
им. И.И.Мечникова РАМН, Москва, Россия
nataliagrebyonkina@mail.ru
Известно, что функционирование многих белков и ферментов зависит от степени
гидратации их поверхностей. Так, Хургиным Ю. И. с соавторами была показана зависимость
активности альфа-химотрипсина от величины упругости паров воды. О влиянии гидратации на
функциональную активность вирусных антигенных белков на сегодняшний день ничего
неизвестно. При этом гидратация может оказывать влияние на связывание того или иного
антигенного белка с рецептором «клетки-мишени», влиять на интерпретацию данных по
определению активности антигенного белка.
В наших исследованиях в качестве модели поверхностного антигенного вирусного белка
была выбрана нейраминидаза вируса гриппа. С помощью модели адсорбции БрунауэраЭммета-Теллера (БЭТ) рассчитаны величины монослоя воды am при различных значениях
упругости паров воды. Из полученных изотерм БЭТ можно сделать вывод о наличии
гистерезиса, заключающегося в различном значении монослоя am при сорбции и десорбции
воды с поверхности фермента, что связано, вероятно, с высокой степенью кооперативности
образующейся гидратной оболочки. Максимальное связывание молекул воды наблюдалось при
значении упругости паров p/ps = 0,65 и составило am = 224 молекул H2O на одну молекулу
фермента. При сопоставлении с расчетной площадью поверхности тетрамера нейраминидазы (S
= 256 нм2) и учитывая максимальную площадь проекции молекулы воды можно сделать вывод
о полном покрытии монослоем воды всей поверхности фермента. При данном значении am
наблюдалась максимальная активность нейраминидазы, минимум активности фермента
приходился при значении am = 98 молекул H2O на молекулу фермента, что соответствовало
значению упругости паров воды p/ps = 0,38.Таким образом, для нейраминидазы вируса гриппа
показана зависимость ферментативной активности от степени гидратации поверхности
фермента.
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ И СОСТОЯНИЯ
ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ГИПОКСИИ
Декина И.С., Логинов А.В., Новожилова О.С.
ФГБОУ ВПО Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева,
Саранск, Россия
dekina-irina@rambler.ru
Изучали изменение морфофункциональных параметров эритроцитов и активности
ферментов – лактатдегидрогеназы (ЛДГ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ) периферической крови
крыс при острой и хронической гипоксии. Для эксперимента брали белых беспородных крыс
обоего пола. Животных разделяли на 3 группы: первая группа – контрольная, вторая группа –
животные, которые подвергались острой гипоксии, третья группа – животные, которые
подвергались многократной гипоксии в результате физической нагрузки. Материалом
исследования служила эритроцитарная взвесь, полученная из крови белых беспородных крыс.
При однократной нагрузочной гипоксии количество гемоглобина снижается на 60%, а при
многократной нагрузочной гипоксии - на 80% по сравнению с контрольной группой. Контроль
за состоянием морфологии эритроцитов производили при помощи метода лазерной
интерференционной микроскопии (ЛИМ). Исследования показали, что средняя площадь
эритроцитов в группе контрольных животных составила 9,39 ± 0,5*10-9мкм (р <0,05). При
однократной физической нагрузке площадь эритроцитов уменьшилась до 7,92 ± 0,5*10-9мкм (р
<0,05), что ниже контрольного значения на 15,7%. При многократной нагрузочной гипоксии по
сравнению с контролем площадь эритроцитов составила 9,01 ± 0,45*10-9мкм (р<0,05),что на 4%
ниже контроля.
140
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
Исследуемые ферменты принимают непосредственное участие в клеточном метаболизме
кислорода. Активность ЛДГ в контрольной группе животных составила 323,7 ± 0,59 Е/л
(р<0,05). В условиях острой гипоксии общая активность ЛДГ индикаторного фермента,
характеризующего состояние энергетического обмена, увеличилась на 23% по сравнению с
интактными животными. У животных, подвергшихся кратковременным тренировкам,
наблюдалось снижение общей активности ЛДГ на 20% по сравнению с контролем. Это может
быть связано с активацией путей утилизации глюкозы, что свидетельствует о подготовленности
и формировании устойчивости организма к гипоксии. СДГ прочно связана с дыхательной
цепью митохондрий. В контрольной группе животных активность СДГ составила 19,3 ± 0,32
нмоль сукцината / мин на 1мг белка (р< 0,05). У животных 1 опытной группы наблюдалось
уменьшение активности СДГ на 32,8% (р<0,05) по сравнению с контрольной группой. У
животных 2 опытной группы после многократной нагрузочной гипоксии активность СДГ
возросла на 15,8% по сравнению с контрольной группой, что, скорее всего, связано с адаптивно
‒ приспособительными реакциями.
СЕКРЕЦИЯ И МЕМБРАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА
КЛЕТКАМИ ФИБРОБЛАСТОВ ВНК-21
Евдокимовская Ю.В., Скарга Ю.Ю., Снигирева А.В., Врублевская В.В.,
Моренков О.С.
ФБГУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
obedyvpoldnik@gmail.com
Ранее нами было показано, что появление в культуральной среде ряда белков теплового
шока (БТШ hsp72, hsc73, hsp96/grp94) не является результатом пассивного выхода белков из
мертвых клеток, а обусловлено процессами секреции БТШ по ЭПР/Гольджи-независимому
механизму.
Обнаружено, что максимальная концентрация внеклеточного пула hsp72, hsc73 и
hsp96/grp94 наблюдается через 30-60 мин после начала инкубации клеток в культуральной
среде. При дальнейшей инкубации (1-2 ч) уровень БТШ в среде остается неизменным, либо
незначительно снижается. При более длительной инкубации клеток (3-6 ч) уровень БТШ в
среде снижается приблизительно на 30% для hsp72/hsc73 и 50% для hsp96/grp94. Уменьшение
количества внеклеточных БТШ можно объяснить как интернализацией БТШ клетками, так и
неспецифической сорбцией секретированных белков с поверхностью клеток и/или
культуральных флаконов. Кроме того, мы проводили эксперименты с постоянной заменой
инкубационной среды, когда через каждый час в течение 6 ч среду удаляли из флаконов и
добавляли к клеткам эквивалентный объем свежей среды. Было показано, что уровень
внеклеточных БТШ во всех культуральных образцах (с первого по шестой час) оставался
одинаковым, что свидетельствует о постоянном выходе БТШ из клеток. Мы предполагаем, что
накопление белка в среде может являться сигналом для регуляции выхода БТШ из клеток по
принципу отрицательной обратной связи.
Помимо обнаружения секретированных форм БТШ, мы также наблюдали мембранноассоцированные БТШ. Методом непрямой иммунофлуоресценции было показано, что hsc73
окрашивается на плазматических мембранах клеток ВНК-21. Области окрашивания hsp73 на
мембране часто совпадали с сайтами окрашивания белка caveolin-1. При выделении из клеток
липидных рафтов было обнаружено, что hsc73 и маркерный белок рафтов caveolin-1
выделяются в одной фракции, что свидетельствует о локализации hsc73 в липидных рафтах
клеток. В то же время, hsp96/grp94 не был обнаружен нами в одной фракции с маркерным
белком рафтов.
Чтобы исследовать вклад поверхностно-ассоциированных БТШ в накопление белков в
среде, мы обрабатывали клетки трипсином для удаления мембранных белков (клетки
тщательно отмывали от трипсина, остатки трипсина ингибировали инкубацией клеток с
сывороткой), после чего инкубировали клетки в культуральной среде. Было обнаружено, что
обработка клеток трипсином не влияла на выход hsp72, hsc73 и hsp96/grp94 из клеток. Таким
образом, можно заключить, что появление БТШ в среде обусловлено секрецией этих белков
клетками, а не диссоциацией БТШ, связанных с клеточной поверхностью.
141
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ГЕМОГЛОБИНА ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ
МЕТГЕМОГЛОБИНЕМИИ
Калашникова А.А., Таганова Е.В., Кузьмичева Л.В., Новожилова О.С.,
Тютяев Е.В.
ФГБОУ ВПО Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева,
Саранск, Россия
elenuba@mail.ru
В работе была использована модель "чистой" метгемоглобинемии, путем инкубации 1%
раствора нитрита натрия на физиологическом растворе с эритроцитами в соотношении 1:1 в
течение 20 мин. Исследование проводили через 15 мин и 90 мин после воздействия.
Исследование выполнено на рамановском спектрометре in via Basis фирмы Renishaw с
короткофокусным высокосветосильным монохроматором (фокусное расстояние не более 250
мм). Для возбуждения рамановских спектров использовался лазер (длина волны излучения 532
нм, мощность излучения 100 мВт, объектив 100х). Оцифрованные спектры обработаны в
программе WIRE 3.3. Произведена коррекция базовой линии, сглаживание спектров. Для
анализа конформации и О2-связывающих свойств гемоглобина (Гб) использовали следующие
полосы КР спектров эритроцитов (указаны положения максимумов): 1172, 1355, 1375, 15481552, 1580-1588, 1618, 1668 см-1. Как показали наши исследования, в эритроцитах крови
несколько изменяется конформация гемопорфирина гемоглобина по отношению к контролю.
Так, достоверно снижается конформационное изменение пиррольных колец, определяемое по
соотношению спектров I1375/I1172, через 15 и 90 мин на 35,3% (p<0,05) и 40,5% (p<0,05)
соответственно. Относительное количество оксигемоглобина (I1375/(I1355 + I1375)) снижается
через 15 мин на 12,7% (p<0,01), при этом увеличивается сродство гемоглобина к лигандам
(I1355/I1550)/(I1375/I1580) на 28,2% (p<0,01). Достоверно увеличивается количество
комплексов гемоглобина с NO, при наличии связи между железом и глобином (I1618/I1580),
через 15 мин, на 52,9% (p<0,01). Увеличивается перекисное окисление липидов мембран
эритроцитов, определяемое по накоплению МДА, на 23% и снижение каталазной активности на
13%. Все это приводит к деформации эритроцитов, клетки приобретают «звездчатое» строение.
Таким образом, при метгемоглобинемии наблюдаются изменения в свойствах гемоглобина,
которые проявляются в увеличении сродства гемоглобина к лигандам (NO) и комплексов
гемоглобина с NO, при этом снижается сродство гемоглобина к кислороду.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ХЛОРИДА КАЛИЯ НА СОРБЦИЮ
Н+ И ОН- ИОНОВ НА ЖЕЛАТИНЕ, КАЗЕИНЕ И АЛЬБУМИНЕ
Кергенцев А.А.1, Новикова Ю.И.2, Дмитриева И.Б.1
1
ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая
академия Министерства здравоохранения РФ; 2ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский
государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
anton_kergencev@mail.ru
Одним из важнейших параметров водных дисперсий белка является изоэлектрическая
точка белка, в значительной степени определяющая свойства и структуру белков в водных
растворах. Значение рН изоэлектрической точки рНиэт белка соответствует равенству нулю
электрокинетического
потенциала.
Эту
величину
определяют
из
результатов
электрокинетических исследований, изучением устойчивости дисперсий, зависимости степени
набухания и вязкости от рН дисперсионной среды. Другой не менее важной характеристикой
является значение точки нулевого заряда рНтнз белка, соответствующее равенству
положительно и отрицательно заряженных активных центров в молекуле белка. Эту величину
определяют из результатов адсорбционных измерений. На величину рНиэт и рНтнз влияет состав
дисперсионной среды. Если в растворе отсутствуют компоненты, способные сорбироваться
специфически на активных группах белка (специфическое взаимодействие – не простое
кулоновское электростатическое взаимодействие), то значения рНиэт и рНтнз совпадают, в
противоположном случае их значения могут сильно отличаться. Положение изоэлектрическая
142
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
точка белков в значительной степени влияет на процессы структурирование белков, а точка
нулевого заряда белков отражает их способность взаимодействовать с компонентами в
растворе (как с неорганическими, так и органическими электролитами).
Цель настоящего исследования состоит в изучении влияния хлорида калия на величину
адсорбции ионов Н+ и ОН- и рНтнз белков.
В качестве объектов исследования выбраны три белка: альбумин, казеин и желатин.
Адсорбция Н+ и ОН- на белках изучалась методом потенциометрического титрования в
диапазоне рН от 3,0 до 10,5 и при варьировании концентрации хлорида калия от 1·10-3 до 1,0
моль/л. Титрование проводили в атмосфере азота для исключения влияния углекислого газа.
Установлено, что рНтнз для всех изученных белков зависит от концентрации хлорида калия
и не совпадает с их изоэлектрической точкой, что ионы, входящие в состав хлорида калия
могут взаимодействовать с активными центрами молекул белков не только за счет простых
электростатических – кулоновских сил, но и за счет иных сил, например, ван-дер-ваальсовых.
БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕПАТОСТЕАТОЗА ПРИ
ОТСУТСТВИИ ЗАПАСОВ ВИТАМИНА А
Кобылянская О.Н., Шмараков И.А.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы, Украина
kobilyanska93@mail.ru
Среди патологий печени стремительно возрастает доля неалкогольного ожирения, в основе
которого лежит нарушение транспорта, аккумуляции и метаболизма нейтральных жиров.
Указанная патология выступает ключевым элементом развития метаболического синдрома,
сопутствующим проявлением которого является инсулинорезистентность и развитие диабета 2
типа. Особо актуально раскрытие механизмов вовлечения природных биорегуляторов в
развитие указанных процессов с целью применения полученных знаний в коррекции
метаболических нарушений. В этом аспекте большое внимание привлекают ретиноиды
(витамин А и его метаболиты), запасы которых прогрессивно утрачиваются при развитии
патологий печени. Цель работы установить особенности развития гепатостеатоза и
инсулинорезистентности при отсутствии эндогенно депонированных ретинил эфиров. В
эксперименте использовали мышей, нокаутных по гену лецитин: ретинолацилтрансферазы, ЕС
2.3.1.135 (Lrat-/-), лишенных эндогенно депонированных ретинил эфиров. Гепатостеатоз
вызвали путем содержания животных в течение 16 недель на высокожировой диете,
обогащенной транс-жирами и с высоким содержанием фруктозы.
Результаты проведенных исследований показали, что у мышей дикого типа наблюдались
классические признаки развития неалкогольного ожирения печени, а именно увеличение
уровня триацилглицеролов печени на 35% и холестерола на 25%. Одновременно
фиксировалось нарушение соотношения транспортных форм липидов, проявляющееся в
возрастании уровня липопротеинов низкой плотности на 50% с одновременным увеличением
уровня триацилглицеролов и общего холестерола на 50% и 30%, соответственно. У животных
данной группы развивались признаки инсулинорезистентности, ее выражение в достоверно
высоких показателях уровня глюкозы и замедлении темпов клиренса глюкозы, определенных в
тесте толерантности к глюкозе. Повышенный уровень гликозилированного гемоглобина на 30%
свидетельствовал о персистентности процессов, характеризующих развитие диабета 2 типа.
Вместе с тем животные, лишенные эндогенно депонированных ретинил эфиров (Lrat-/-), были
резистентными к индукции неалкогольного ожирения печени при содержании на
высокожировой диете. У животных данной группы исследуемые показатели не отличались от
величин, характерных для животных, содержавшихся на стандартной диете. Таким образом,
полученные результаты указывают, что эндогенно депонированные ретинил эфиры вовлечены
в процессы развития неалкогольного ожирения печени и инсулинорезистентность.
143
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ АМИНОНИТРОКСИЛЬНЫХ
КОМПЛЕКСОВ ПЛАТИНЫ (IV) НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ MCF7
Комлева Н.В., Балакина А.А., Лапшина М.А., Сень В.Д., Терентьев А.А.
ФГБУН Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка, Россия
komlevanataly@gmail.com
Противоопухолевые препараты на основе комплексов платины вызывают серьезные
побочные эффекты, связанные с повышенным образованием активных форм кислорода и
окислительным стрессом. Поскольку, нитроксильные радикалы обладают антиоксидантными
свойствами, актуальным направлением исследований является синтез и изучение
противоопухолевой активности комплексов платины с нитроксильными радикалами различной
структуры. Целью работы являлось исследование цитотоксичности аминонитроксильных
комплексов платины (IV) на опухолевых клетках MCF7 (аденокарцинома молочной железы
человека).
Были изучены аминонитроксильные комплексы платины (IV) с общей структурой
Pt(IV)(NH3)(R•NH2)Cl2X2, где R•NH2 – нитроксильный радикал, а X – аксиальные лиганды
(остатки алифатических карбоновых кислот – уксусной, масляной, валериановой, капроновой и
каприловой). В качестве препаратов сравнения использовали цисплатин и сатраплатин.
Определение цитотоксичности комплексов платины проводили с помощью МТТ-теста через 72
часа инкубации с соединениями.
Обнаружено, что аминонитроксильные комплексы платины (IV) превосходят по
цитотоксичности цисплатин. Показано, что сатраплатин и его структурный аналог с
нитроксильным радикалом существенно не различаются по цитотоксичности. Выявлено, что
удлинение аксиальных лигандов приводит к увеличению липофильности аминонитроксильных
комплексов платины (IV) и значительному усилению их цитотоксических свойств. Следует
отметить, что аминонитроксильные комплексы платины (IV) с разными нитроксильными
радикалами не отличались по токсичности для опухолевых клеток.
СПЕЦИФИЧЕСКОЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА
ИЗ КУКУРУЗЫ С СЕРИНОВОЙ ПРОТЕАЗОЙ FXIIA НЕ ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ЕГО
ПРОТЕИНАЗА-СВЯЗЫВАЮЩЕЙ ПЕТЛЕЙ
1
Корнеева В.А. , Трубецков М.М.2, Атауллаханов Ф.И.1,2,3, Пантелеев М.А.1,2,3
1
ФГБУН Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН;
2
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова;
3
Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и
иммунологии им. Д.Рогачева, Москва, Россия
vera.korneeva@gmail.com
Канонические ингибиторы сериновых протеаз, как правило, взаимодействуют с ферментом
своей протеаза-связывающей петлей. Мы выбрали в качестве модельной системы
активированный фактор свертывания XII (FXIIa) и ингибитор трипсина из кукурузы (corn
trypsin/factor XIIa inhibitor, CHFI). FXIIa -это сериновая энтеропептидаза, а CHFI, являясь
ингибитором трипсина, избирательно ингибирует FXIIa с Ki = 24 нМ, оказывая минимальное
влияние на работу других протеаз плазмы крови. Целью данной работы является проверка
гипотезы о том, что протеаза-связывающая петля CHFI является самостоятельным
структурным элементом, достаточным для селективного ингибирования сериновой протеазы и
изучение влияния внепетельных участков канонического ингибитора на процесс его
взаимодействия с протеазой.
Были получены шесть мутантов CHFI, укороченных с N – и/или С-конца. Мутант CHFI 234, лишенный первой и пятой дисульфидной связи и укороченный на 11 и 19 аминокислотных
остатков на его N - и С-конце, соответственно, не показал существенных изменений в
способности ингибировать FXIIa (Ki = 3,2 ± 0,4нм). Мутант CHFI -123, укороченный на 34
аминокислотные остатка с С-конца, ингибировал FXIIa с Ki = 116 ± 16нм, что на два порядка
хуже по сравнению с диким типом (Ki = 1.0 ± 0.1нМ). Чтобы исключить взаимодействие CHFI c
144
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
FXIIa вне активного центра, был синтезирован циклический пептид (аминокислотные остатки
20-45 (1BEA, PDB), представляющий собой изолированную протеаза-связывающую петлю
CHFI). В данном пептиде Cys29 был заменен на Asn , чтобы избежать образования
нежелательных дисульфидных мостиков между не спаренными цистеинами разных пептидов.
Изолированная протеаза-связывающая петля не ингибировала FXIIa в хромогенном тесте с
субстратом H-D-Pro-Phe-Arg-pNA-2HCl, но частично сохраняла ингибирующую активность в
отношении трипсина (Ki = 11,7 ± 1,2 мкм). CHFI ингибирует трипсин с Ki = 2.1 ± 0.6 нМ.
Наши результаты показывают, что протеиназа-связывающая петля является необходимой,
но не достаточной для осуществления взаимодействия между FXIIa и CHFI, другие участки
ингибитора также вносят вклад в процесс специфического ингибирования.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ КОНСТАНТ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
АПОФОРМЫ ПРОСТАГЛАНДИН-H-СИНТАЗЫ С ГЕМОМ
Кривошей А.В., Вржещ П.В.
Международный учебно-научный биотехнологический центр
Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
Kicking-Foot@yandex.ru
Фермент простагландин-H-синтаза (PGHS; К.Ф.1.14.99.1) осуществляет синтез
простагландинов из арахидоновой кислоты. Простагландины являются медиаторами,
ответственными за важные физиологические процессы: свёртывание крови, репродуктивные
функции, работа желудочно-кишечного тракта, реакции иммунного ответа и др.
PGHS катализирует две последовательные реакции: циклооксигеназную, в ходе которой
арахидоновая кислота окисляется двумя молекулами кислорода и превращается в
простагландин G2 (PGG2), и пероксидазную, в результате которой PGG2 преобразуется в PGH2
в присутствии донора электронов. В ходе обеих реакций фермент подвергается необратимой
инактивации.
Катализ обеих реакций способна проводить только холоформа PGHS (комплекс белка с
кофактором гемом). В предыдущих работах определяли только равновесную константу
диссоциации комплекса, причём оценивали её значение только косвенным путём, поэтому эти
значения расходились на 1-2 порядка. Индивидуальные константы скорости реакций процесса
комплексообразования не определялись.
В настоящем исследовании кинетику ассоциации и диссоциации холоформы PGHS изучали
с использованием апоформы фермента, полученной методом восстановления гемового железа
дитионитом натрия в анаэробных условиях и дальнейшего окисления системы кислородом.
Концентрацию холоформы PGHS детектировали по скорости циклооксигеназной реакции в
различных условиях. Для простейшей модели найдены значения константы скорости
присоединения гема к апоферменту (3*105 М-1*сек-1) и константы скорости отщепления гема от
холофермента (3,9*10-3 сек-1). Соответственно, равновесная константа диссоциации составляет
1,3*10-8 М при 25°C.
ВЛИЯНИЕ ФЛУОКСЕТИНА НА АКТИВНОСТЬ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Е
В НЕРВНОЙ ТКАНИ КРЫС
Кручинина А.Д., Гамзин С.С., Григорьева О.М.
ФГБОУ ВПО Пензенский государственный университет, Пенза, Россия
a.d.kruchinina@mail.ru
В настоящее время депрессия является одним из наиболее распространенных психических
нарушений. Возникновение патологического состояния связывают с нарушениями в
функционировании лимбико-таламической и гипоталамо-гипофизарной структур мозга. До сих
пор точно не известны механизмы формирования заболевания. Согласно моноаминовой теории
данное психическое заболевания связывают с недостатком биогенных аминов, таких как
серотонин, норадреналин, дофамин. В связи с этим в фармакотерапии данного заболевания
145
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
находят широкое применение антидепрессанты, относящиеся к селективным ингибиторам
обратного нейронального захвата моноаминов.
Флуоксетин является наиболее популярным представителем класса селективных
ингибиторов обратного нейронального захвата серотонина в синапсах нейронов центральной
нервной системы.
Считается, что формирование психических расстройств обусловлено дисбалансом
взаимодействий между норадренергической, серотонинергической, дофаминергической, а
также пептидергической системами.
Целью данного исследования является изучение влияния флуоксетина на активность
фермента обмена регуляторных пептидов – карбоксипептидазы Е в различных отделах мозга
крысы и надпочечниках.
Эксперимент проводился на трехмесячных самцах белых беспородых крыс массой 200-250
г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Флуоксетин вводили животным
внутрибрюшинно в течение 14 дней, контрольным животным вводили физиологический
раствор. Животных декапитировали под хлороформным наркозом, определяли активность
карбоксипептидазы Е флуориметрически модифицированным методом Fricker и Snyder в
отделах мозга. Полученные результаты обрабатывались при помощи методов статистического
анализа: 3S критерия и t критерия Стьюдента.
По данным исследования было установлено достоверное увеличение активности
карбоксипептидазы Е в 1,7 раза в гипофизе (р<0,05), снижение активности карбоксипептидазы
Е в 1,72 раза в четверохолмии (р<0,05), в 1,56 раз в амигдале (р<0,05)по сравнению с
контрольными животными.
Полученные данные свидетельствуют о влиянии селективных ингибиторов обратного
нейронального захвата серотонина на функционирование пептидергической системы.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ N-ТЕРМИНАЛЬНЫХ ТАГОВ НА
АВТОУБИКВИТИНИРОВАНИЕ E3 УБИКВИТИН ЛИГАЗЫ ПАРКИН И
ЕГО TV7 СПЛАЙС ВАРИАНТ
Крюкова М.В.1, Тамаркин М.А.1, Клушина Д.Д.1, Лисов А.С.1, Липкин А.В.1,
Качалова Г.С.1,2
1
ФГБУ Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»;
2
ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва, Россия
mar-1-ya@yandex.ru
В разнообразных клеточных процессах, таких как протеасомная деградация, эндоцитоз и
репарация ДНК, используют в качестве сигнальной метки убиквитин для посттрансляционной
модификации клеточных белков. Каталитический остаток цистеина Е3 убиквитин лигаз,
обеспечивает специфичность формирования тиоэфирного интермедиата с целевым белком.
RING Е3 лигазы наиболее представительный класс, включающий почти 90% всех известных Е3
лигаз. RING Е3 лигаза - паркин, белок, кодируемый PARK2 геном, одним из 7 генов мутации
которых приводят к нейродегенеративным нарушениям при наследственных формах
паркинсонизма. Паркин классифицирован как новый субкласс RBR Е3 лигаз семейства, в
которых RBR мотиву из двух RING доменов, разделенных IBR (In-Between-Ring) доменом,
предшествует еще один RING0 и убиквитин-подобный (Ubl) домены. Установлено, что паркин
способен убиквитинировать не только целевые клеточные белки, но и обладает также
способностью к автоубиквитинированию. Показано, что в структуре нативного паркине, его Nтерминальный Ubl домен может ингибировать автоубиквитинирование паркина. Представляет
также интерес роль С-терминальных RING доменов в активности паркина, так как именно в
этой области содержится наибольшее количество мутаций, выявленных при наследственных
заболеваниях. Кроме того, поскольку исследования активности паркина в клетках in vivo, как
правило, проводятся с использованием рекомбинантного паркина, содержащего различные Nтерминальные таги, важно также выяснить влияние размеров тагов и их структурной роли на
автоубиквитинирующую активности паркина.
В данной работе приводятся описание генетически сконструированных рекомбинантных
форм полноразмерного паркина, имеющих в качестве N-терминальных тагов глютатион-S-
146
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
глютатион (GST 26kD), мальтоза-связывающий белок (MBP 43kD) и 6xHis (0.7kD). Для
выявления структурной роли убиквитин-подобный домена и С- терминальных RING доменов
паркина на его автоубиквитинирующую способность, получены также делеционные
конструкции, содержащие те же N-терминальные таги с нуклеотидной последовательностью,
кодирующей 80-293 аминокислотные остатки паркина, соответствующего TV7 сплайс
варианту. Определена автоубиктинирующая активность проэкспрессированных и очищенных
рекомбинантных форм полноразмерного и делеционного варантов паркина. Проведен
сравнительные анализ активности полученных химерных рекомбинантных белков и паркин
продуктов их протеолиза протеазами, соответствующими сайтам расщепления, включенным в
конструкции между фьюжн белками.
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
НА КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ЦИТОХРОМА Р450
Кузиков А.В.1, Махова А.А.2, Шумянцева В.В.1, Арчаков А.И.1
1
ФГБУ Научно-исследовательский институт биомедицинской химии
им. В.Н.Ореховича РАМН; 2ГБОУ ВПО Первый Московский медицинский университет
им. И.М.Сеченова Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
alexejc@yandex.ru
В клинической практике все чаще применяется комплексная терапия при лечении
основного заболевания. На сегодняшний день влияние широко используемых в
фармакотерапии метаболических лекарственных препаратов на активность главной системы
биотрансформации лекарств – цитохром Р450-монооксигеназной системы изучено
недостаточно. Эффективность и безопасность проводимой фармакотерапии напрямую зависит
от функциональной активности монооксигеназной системы. Многие биологически активные
соединения, применяющиеся в комплексной терапии, являются мощными ингибиторами,
индукторами или прямыми активаторами каталитической активности различных изоферментов
цитохрома Р450.
Целью настоящей работы явилось: 1) разработка электрохимического метода анализа
каталитической активности цитохрома Р450, 2) разработка скринингового электрохимического
метода оценки влияния метаболических препаратов на активность цитохрома Р450.
Исследование in vitro активности цитохрома Р450 является весьма сложной задачей.
Цитохромы Р450 являются мембранными белками, работа которых требует участия редокспартнерных белков, коферментов НАДФН или НАДН. Таким образом, исследование
цитохрома Р450 сопряжено со сложным реконструированием монооксигеназной системы.
Электрохимические методы анализа каталитической активности цитохрома Р450 не требуют
реконструирования системы, использования дорогостоящих редокс-партнеров и неустойчивых
коферментов, донором электронов для их работы служит электрод. Высокая чувствительность
метода позволяет использовать минимальное количество фермента (до 10-15 моль/электрод).
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ СЕКРЕТИРУЕМОЙ ЛИТИЧЕСКОЙ ЭНДОПЕПТИДАЗЫ Л5
В БИОГЕНЕЗЕ ВЕЗИКУЛ LYSOBACTER SP. XL1
Кудрякова И.В., Сузина Н.Е., Цфасман И.М., Васильева Н.В.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
kudryakovairina@yandex.ru
Образование везикул является физиологической особенностью грамотрицательных
бактерий. Несмотря на то, что к настоящему времени накоплено много экспериментальных
данных относительно формирования (биогенеза) везикул разными таксонами бактерий, этот
процесс до конца не понят.
Грамотрицательная бактерия Lysobacter sp. XL1 секретирует в культуральную жидкость
пять бактериолитических ферментов (Л1-Л5). Ранее было показано, что фермент Л5
147
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
(эндопептидаза) попадает в окружающую среду посредством внешнемембранных везикул.
Совокупность данных литературы, а также собственные экспериментальные результаты
позволили предположить, что у одной бактерии образование везикул может происходить по
нескольким механизмам, в одном из которых участвует секретируемый белок Л5.
Для подтверждения выдвинутого предположения препарат везикул, полученный из
культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1, был фракционирован в плотностном градиенте
сахарозы. В результате получено несколько фракций, которые охарактеризованы
биохимическими методами и методом электронной микроскопии. Были выявлены две
субпопуляции везикул: везикулы 30% фракции сахарозы диаметром 45-65 нм, содержащие
белок Л5, и везикулы 35% фракции сахарозы диаметром 65 – 90 нм, не содержащие его. Кроме
того, метод электрофореза в ПААГ показал, что исследуемые фракции отличны друг от друга и
по спектру мажорных белков. Полученные данные могут свидетельствовать в пользу
выдвинутого предположения о протекании биогенеза везикул Lysobacter sp. XL1 по нескольким
механизмам, в одном из которых участвует секретируемая эндопептидаза Л5. Также был
изучен фосфолипидный состав везикул и проведен сравнительный анализ с фосфолипидами
внешних и цитоплазматических мембран Lysobacter sp. XL1, что позволило в целом
охарактеризовать везикулы Lysobacter sp. XL1. На основании полученных данных и данных
литературы была предложена модель биогенеза везикул Lysobacter sp. XL1.
Дальнейшее изучение этого процесса у Lysobacter sp. XL1 внесет вклад в понимание
биогенеза везикул у грамотрицательных бактерий.
Работа поддержана грантом РФФИ №11-04-01937-а и программой У.М.Н.И.К. 2012 – 2013.
УЧАСТИЕ ЭКТОИНА В ОСМОАДАПТАЦИИ ГАЛОТОЛЕРАНТНОГО
МЕТАНОТРОФА METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z
Кузьмин М.В.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия
mix.kuzmi2011@gmail.com
В последние годы для получения практически значимых для человека веществ, например,
биопротекторов и биостимуляторов используются микроорганизмы, так как зачастую
химический синтез оказывается нерентабельным.
Области с экстремальными физико-химическими условиями занимают значительную часть
поверхности, они населены микробными сообществами, которые приобрели специфические
механизмы психро-, термо- и осмоадаптации. Экстремофильные и экстремотолерантные
микроорганизмы могут служить источниками получения биопротекторов, биостимуляторов, и,
следовательно, объектами для создания новых биотехнологий.
Осмопротекторы – вещества, способствующие поддержанию водного баланса в клетке,
взаимодействуя с молекулами воды. К осмопротекторам относится широкая категория веществ.
Из аминокислот такую роль играют пролин и глутамат, из сахаров – трегалоза и сахароза.
Наиболее распространёнными являются бетаин и эктоин. Циклическая иминокислота эктоин
является мощным водоудерживающим биопротектором, способным оптимизировать работу
внутриклеточной системы шоковых белков, стабилизировать клеточные мембраны,
гидратировать кожу, блокировать внутриклеточные повреждения, вызываемые УФ-лучами.
Благодаря своим свойствам эктоин активно используется в косметологии и медицине.
Обнаружено, что в ответ на повышение внешней солёности галофильные и
галотолерантные метанотрофы аккумулируют в качестве осмопротекторов глутамат, сахарозу и
эктоин
(1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин
карбоновую
кислоту).
Объектом
исследования служила чистая культура облигатного метанотрофа Methylomicrobium
alcaliphilum 20Z. Для изучения поведения Methylomicrobium alcaliphilum 20Z и его мутантов по
синтезу осмопротекторов в экстремальных условиях были сняты кривые роста на питательных
средах с 1%, 3% и 5% содержанием NaCl. Было показано, что при солёности среды с 1% NaCl
плотность культуры мутанта M. alcaliphilum 20Z, накапливающего в качестве осмопротектора
только эктоин (∆sps) в 2 раза выше, чем у мутанта, использующего сахарозу (∆ectBC). При
солёности среды в 3% плотность культур одинакова (≈ 1,4 A), а при солёности среды в 5%
культура ∆ectBC не растёт, в то время как культура ∆sps не изменяет своей плотности.
148
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
Полученные данные указывают на то, что сахароза используется у M. alcaliphilum 20Z в
качестве осмопротектора при низкой солености среды (<3%), в то время, как эктоин - при более
высокой солености, что также свидетельствует о том, что эктоин является более эффективным
осмопротектором по сравнению с сахарозой.
СЕЗОННЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА
ФОСФОЛИПИДОВ В ТКАНИ И ЯДРАХ ПЕЧЕНИ ГИБЕРНИРУЮЩЕГО
ЯКУТСКОГО СУСЛИКА SPERMOPHYLUS UNDULATUS
Лахина А.А., Маркевич Л.Н., Коломийцева И.К.
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
lakhina88@gmail.com
Гибернация (зимняя спячка) – глубокое и длительное оцепенение в зимний период года,
которая позволяет мелким млекопитающим значительно сэкономить энергетические ресурсы
организма за счет почти 100 кратного снижения уровня метаболизма и перехода на
использование жиров взамен углеводов. Печень - орган, занимающий центральное место в
обмене липидов. Представляет большой интерес исследование фосфолипидов печени,
поскольку печень секретирует фосфолипиды в кровь в составе липопротеидов. Важно также
исследование фосфолипидов ядер печени. Фосфолипиды - неотъемлемые компоненты всех
клеточных мембран и сигнальных систем клетки. Фосфолипиды ядер принимают участие в
регуляции метаболизма нуклеиновых кислот. Мы поставили своей задачей изучить
соотношение фосфолипид/белок (мкг фосфолипида на 1 мг белка) и фосфолипидный состав
печени и ядер печени якутского суслика Spermophylus undulatus в трех состояниях: 1. летние, 2.
зимние активные, 3. зимние спящие. Сопоставление данных, полученных на летних и зимних
активных, позволяет судить о сезонных изменениях; сопоставление результатов измерений на
зимних активных и зимних спящих позволяет судить о функциональных изменениях при
спячке. Ядра печени получали методом дифференциального центрифугирования. В гомогенате
печени гибернирующих сусликов было обнаружено увеличение количества фосфатидилсерина
(ФС) и кардиолипина (КЛ). Известно, что КЛ содержится только в митохондриях и ядрах
гепатоцитов. Возможно, что увеличение КЛ в печени отражает адаптацию митохондрий к
изменению энергетического метаболизма у гибернирующих сусликов.
Будут представлены данные о сезонных и функциональных изменениях количества
фосфолипидов в ядрах печени гибернирующих сусликов.
ГЕПАТОПРОТЕКТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКЗОГЕННОЙ РНК
Марчишак Т.В., Шмараков И.А.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы, Украина
march-tanya@mail.ru
Экзогенная рибонуклеиновая кислота (РНК), а также продукты ее частичного гидролиза,
синтетические поли- и олигонуклеотиды обладают широким спектром биологического
действия. На сегодняшний день препараты на основе олигонуклеотидов РНК нашли широкое
применение в коррекции таких патологий печени как хронический вирусный и токсический
гепатит, неалкогольный стеатогепатит, а также метаболический синдром и связанные с ним
ожирение и инсулинорезистентность. Высокая биологическая активность препаратов РНК
стимулирует к изучению их гепатопротекторной активности при острых токсических
поражениях печени.
Цель работы - оценить гепатопротекторную активность препарата на основе дрожжевой
РНК при тиоацетамид-индуцированной гепатотоксичности.
Показано, что развитие тиоацетамид-индуцированной гепатотоксичности сопровождалось
увеличением миелопероксидазной активности (МПО) в паренхиме печени на 35% и гаммаглутамилтранспептидазной активности (ГГТ) в сыворотке крови на 30%. На клеточном уровне
гепатотоксичность проявлялась увеличением в печени уровня ТБК-активных соединений в 5
раз, белковых карбонильных производных на 57% и снижением уровня белковых тиоловых
149
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
групп и восстановленного глутатиона в 3 раза. Одновременно пероральное введение смеси
олигонуклеотидов РНК в дозе 200 мг/кг мышам обладало выраженным гепатопротекторным
эффектом при тиоацетамид-индуцированной острой гепатотоксичности. Через 48 часов после
введения примененного классического гепатотоксина у животных, получавших препарат
экзогенной РНК, не обнаруживалось признаков поражения и воспаления паренхимы печени. В
отличие от животных группы опытного контроля (получали ТАА, но не РНК) введение
животным РНК после индукции гепатотоксичности сопровождалось снижением исследуемых
МПО и ГГТ активностей. Введение экзогенной РНК приводило к атенуации
свободнорадикального повреждения биополимеров печени, индуцированного введением
тиоацетамида. В частности выявлялось существенное уменьшение ТБК-активных продуктов и
восстановление уровня белковых тиоловых групп, хотя сохранялось отличие от контрольных
показателей на величину 20%. Вместе с тем уровень восстановленного глутатиона и белковых
карбонильных производных у животных этой группы находились на уровне референтных
величин.
Таким образом, полученные результаты обосновывают применение препаратов на основе
экзогенных РНК с целью коррекции острой гепатотоксичности.
ДЕЙСТВИЕ НИТРОАРГИНИНА НА НИТРОЗИЛИРУЮЩИЙ И
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС В ОРГАНИЗМЕ ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЯ И
ИНТЕНСИВНОСТЬ РОСТА ОПУХОЛИ IN VIVO
Наумов А.А., Куприянова Е.С., Поцелуева М.М.
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт; ФГБУН
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия
exzikutor@rambler.ru
В процессе роста асцитной опухоли в организме в плазме крови развивается
окислительный и нитрозилирующий стресс. Было высказано предположение, что изменение
баланса активных форм кислорода и азота может быть эффективным в регулировании
интенсивности опухолевого процесса и в увеличении продолжительности жизни
опухоленосителя. Для предотвращения развития нитрозилирующего стресса было предложено
использовать ингибитор NO-генерирующей системы. В данной работе был использован
ингибитрор NO-синтаз – нитроаргинин.
В ходе эксперимента подопытным животным, начиная со 2-х суток после трансплантации
опухоли, вводилось 25 мкг/кг нитроаргинина в физрастворе ежесуточно. В ходе эксперимента
были изучены изменения динамики основных метаболитов оксида азота, АФК-генерирующей
активности фагоцитов и концентрации опухолевых клеток в крови и асцитной жидкости по
сравнению с нормальным течением опухолевого процесса.
Как и ожидалось, в случае внутрибрюшинных инъекций блокатора NO, снижается
нитрозилирующий стресс в организме за счет снижения общего синтеза NO. Так использование
нитроаргинина привело к снижению концентрации нитротирозина на 2-3 нМ, S-нитрозотиолов
~5 µМ, нитритов – 1-3 µM. При этом обнаружено заметное усиление потенциальной АФКгенерирующей способности макрофагов, связанное, как мы предполагаем, со снижением
регуляторного воздействия NO на активность НАДФН-оксидазы макрофагов. Исследуя
динамические изменения в численности фагоцитов в зоне патологии и в крови при инъекции
нитроаргинина, установлено, что в асцитной жидкости наблюдается заметное снижение
количества макрофагов, в то время как в крови концентрация ПМЯЛ не менялась. Снижение
концентрации эффекторных клеток в зоне роста опухоли отчасти может компенсироваться
увеличением их активности, но это невозможно из-за глубокой гипоксии в зоне опухоли. При
исследовании влияния L-NAME на опухолевый рост было отмечено, что инъекции ингибитора
NO-синтазы способствуют росту концентрации опухолевых клеток, что может быть
обусловлено снижением концентрации макрофагов и низкой АФК-генерирующей активности.
Работа поддержана проектом НИР, выполняемым в рамках госзадания Минобрнауки №
2014/281.
150
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ МИКРОВЕЗИКУЛ КРОВИ НА ДИНАМИКУ
ФИБРИНООБРАЗОВАНИЯ
Набиуллина Р.М.1, Мустафин И.Г.1, Зубаирова Л.Д.1, Литвинов Р.И.2,
Файзуллин Д.А.3
1
ГБОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет Министерства
здравоохранения РФ; 2ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный
университет; 3ФГБУН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН,
Казань, Россия
nabiullina.rosa@yandex.ru
Существуют значительные индивидуальные вариации структуры фибринового сгустка, так
как и генетические и экзогенные факторы определяют баланс между стабильностью и
подверженностью сгустка фибринолизу. В крови присутствуют микровезикулы, механизм
образования которых, заключающийся в «отшнуровке» от наружной клеточной мембраны,
обеспечивает им прокоагулянтные свойства.
Целью настоящего исследования явилась оценка кинетики фибринообразования под
влиянием циркулирующих микровезикул, образующихся in vivo у здоровых людей.
Методы. Венозную кровь 15 здоровых доноров стабилизовали 3,8% цитратом натрия и
центрифугировали дважды 1500 g, 15 минут и далее 10000 g, 5 мин, 21°C для получения
свободной от тромбоцитов плазмы (СТП). Применяли фильтрацию СТП через фильтр с
размерами пор 0,1мкм (Millipore) для получения обедненной микровезикулами плазмы (ОМП).
Подсчет микровезикул в СТП и ОМП производился методом проточной цитометрии.
Турбидиметрическое исследование свертывания СТП и ОМП производили после
рекальцификации по увеличению оптической плотности среды. Полученные сгустки
исследовали методом сканирующей микроскопии.
Результаты. Количество микровезикул в СТП составило 10,75±4,5x104/мкл; ОМП –
1,03±0,47х104/мкл, то есть при выбранном режиме фильтрации достигалось удаление ~90%
микровезикул. При сравнительной турбидиметрии рекальцифицированных СТП и ОМП
выявлено, что удаление популяции микровезикул, размером больше 0,1 мкм, сопровождается
удлинением лаг периода Т1, времени возрастания оптической плотности Т2, повышением
максимальной оптической плотности А350 и снижением tg α. При обогащении ОМП
фосфолипидами происходило укорочение лаг периода Т1 и снижение максимальной
оптической плотности А350 по сравнению с ОМП. Вместе с тем, время возрастания оптической
плотности Т2 сокращалось, а tg α повышался по сравнению с СТП. Это свидетельствует о том,
что фосфолипидная поверхность микровезикул, является не единственным фактором,
обеспечивающим их влияние на кинетику фибринообразования и структуру фибрина.
Поскольку в наших экспериментах свертывание не инициировалось тромбином, то лаг-период
включает в себя как время, необходимое для генерации тромбина в образце, так и время
образования мономеров фибрина из фибриногена. Более медленная полимеризация приводит к
формированию более толстых волокон фибрина с высокой оптической плотностью. Этот факт
нашел подтверждение при сканирующей микроскопии сгустков СТП и ОМП.
ЖЕЛЕЗОХЕЛАТИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ СПИРОЦИКЛИЧЕСКИХ
ГИДРОКСАМОВЫХ КИСЛОТ НА ОСНОВЕ АЛИФАТИЧЕСКИХ
α-АМИНОКИСЛОТ
1
Неганова М.Е. , Шевцова Е.Ф.1, Выстороп И.В.2, Мищенко Д.В.2
1
ФГБУН Институт физиологически активных веществ РАН; 2ФГБУН Институт
проблем химической физики РАН, Черноголовка, Россия
neganova83@mail.ru
Существуют многочисленные данные о роли окислительного стресса и увеличении пула
металлов переменной валентности, в частности, железа при канцерогенезе. С одной стороны,
избыток железа служит фактором риска развития онкологических заболеваний, вследствие
активации ферритина, цитохрома Р450 и генерации активных форм кислорода (АФК). С другой
151
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
стороны, существуют данные, что Fe(II) наряду с Zn(II), может использоваться в качестве
металла-кофактора для таких металлоферментов, как гистоновые деацетилазы (HDAC) и
матриксные металлопротеиназы (MMP), которые непосредственно вовлечены в
неопластический процесс. Изменение окислительно-восстановительного статуса клетки и
концентрации ионов железа в биологической системе может являться одним из способов
регулирования активности HDAC и в целом, канцерогенеза.
В
настоящей
работе
проведена
оценка
железохелатирующей
способности
спироциклических гидроксамовых кислот, полученных на основе алифатических αаминокислот. Метод основан на конкуренции хелатирования железа между известным
стабильным хелатором железа - феррозином и исследуемыми соединениями. Все соединения в
рабочей концентрации 10-4 Моль проявили железохелатирующую активность. При этом
соединения, содержащие 2,2,6,6-тетраметилпиперидиновый цикл являлись наиболее
активными хелаторами (процент связывания ионов Fe2+ 74% - 92%, а величины ЕС50 (~1,5 * 104
Моль).
Таким образом, изученные спироциклические гидроксамовые кислоты могут выступать в
качестве основы для создания фармакологических агентов для противоопухолевой терапии с
железохелатирующим механизмом действия.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 13-03-01142).
СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ ПЛАЗМЫ КРОВИ КРЫС В
УСЛОВИЯХ АЛИМЕНТАРНОЙ ДЕПРИВАЦИИ ПРОТЕИНА
Николаев Р.А., Копыльчук Г.П., Бучковская И.М.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы, Украина
romanfromukrain@gmail.com
Белки плазмы крови участвуют в поддержании осмотического давления, образовании
буферной системы, определении вязкости и процессе свертывания крови; защищают организм
от проникновения чужеродных белков, являются резервом аминокислот для организма.
Известно, что развитие патологических состояний сопровождается нарушением постоянства
гомеостаза с изменениями соотношения белковых фракций плазмы крови.
В связи с этим цель работы – определить содержание белковых фракций плазмы крови
крыс в условиях алиментарной депривации протеина. Моделирование белковой
недостаточности проводили путем содержания животных на полусинтетическом
низкопротеиновом рационе (⅓ от общепринятой суточной нормы белка) в течение 28 дней.
Результаты исследований показали, что в плазме крови крыс, находящихся на
низкопротеиновой диете, наблюдается снижение содержания общего белка и альбуминов крови
в 1,5 и 1,6 раза соответственно по сравнению с показателями контрольной группы животных.
Поскольку известно, что длительное голодание приводит к использованию соответственных
белков плазмы, то чрезмерное снижение уровня альбуминов крови в нашем случае, вероятно,
связано с нарушением белоксинтезирующей функции печени или повышенным распадом этого
белка. Поэтому можно предполагать, что снижение уровня общего белка и альбумина в плазме
крови при белковой недостаточности, очевидно, выступает подтверждением нарушения
метаболизма аминокислот с последующим развитием дефектопротеинемии.
Одновременно на фоне снижения уровня альбуминов плазмы крови опытных животных
наблюдается повышение содержания α-, β- и γ-глобулинов. Следует отметить, что наиболее
интенсивно повышается уровень α-глобулинов, превышая значения контроля в 1,5 раза.
Очевидно, чрезмерное образование белков острой фазы, среди которых центральное место
принадлежит С-реактивному белку, обусловлено изменением биосинтетического и
метаболического профиля клеток организма в условиях белковой недостаточности.
Таким образом, алиментарная депривация протеина сопровождается снижением уровня
альбуминов плазмы кровы крыс с одновременным повышением содержания глобулиновых
фракций.
152
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
НЕФРОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФЕРМЕНТА-АНТИОКСИДАНТА
ПЕРОКСИРЕДОКСИН-6-СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И
КОНДИЦИОНИРОВАННОЙ СРЕДЫ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ
КЛЕТОК НА СОСТОЯНИЕ ПОЧЕК ПРИ ИШЕМИЧЕСКИРЕПЕРФУЗИОННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ТКАНЕЙ
Палутина О.А.
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН; ФГБОУ ВПО Пущинский государственный
естественно-научный институт, Пущино, Россия
Olesia-alis@rambler.ru
Ишемически-реперфузионное (ИР) повреждение органов является одной из основных
проблем трансплантологии. При ИР повышается генерация активных форм кислорода, что
приводит к повреждениям тканей и секреции медиаторов воспаления. Так, ИР почек является
причиной развития острой почечной недостаточности, и как следствие распространению
тяжелых заболеваний у пациентов и высокой смертности после трансплантации.
Цель исследования является выявление нефропротекторного действия модифицированного
фермента-антиоксиданта
пероксиредоксин-6-супероксиддисмутазы
(PSH)
и
кондиционированной среды мезенхимальных стволовых клеток (MCS-CM) на состояние почки
после ишемии.
В экспериментальном исследовании использовалась стандартная, воспроизводимая модель
повреждения почки при ИР (окклюзия правой почечной ножки продолжительностью 45 мин) с
одновременной нефрэктомией левой почки.
Биохимические анализы показали, что при ИР в первые сутки повышается уровень
креатинина и мочевины в крови более чем в 2 и в 3раза соответственно. Введение MCS-CM
после ишемии почти не снижает уровень этих показателей, а введение PSH отдельно и
совместно с MCS-CM существенно изменяет биохимическую картину, приближая показатели к
норме.
Гистологические исследования образцов после ИР выявили обширную дистрофию
нефронов и почечных канальцев, как в корковом, так и в мозговом слоях. Постишемическое
внутривенное введение растворов MCS-CM незначительно снижает степень повреждения
тканей, а растворы PSH и смеси PSH и MCS-CM улучшают морфологическое состояние почек:
уменьшается степень дистрофии тканей до локальных повреждений при сохранении
функционально-значимых структур.
Иммуногистохимические исследования образцов с ИР показали наличие большого
количества апоптотических клеток в канальцах. Постишемическое введение PSH отдельно и
совместно с MSC-CM снижает уровень апоптоза, хотя остается наличие локальных
апоптотических процессом в основном в юкстамедуллярной зоне.
Таким образом, можно сказать, что изучаемые вещества PSH и MCS-CM обладают
нефропротекторным действием и могут быть включены в состав перфузирующего раствора в
качестве веществ с антиоксидантным, антиапоптотическим и антивоспалительным действиями,
снижая при этом степень ИР повреждения трансплантата.
ОЦЕНКА УРОВНЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У ДЕТЕЙ БОЛЬНЫХ
САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА
Пешкова А.Д., Ле Минь Ж., Невзорова Т.А.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
alinapeshkova@list.ru
В настоящее время сахарный диабет (СД) является одной из важных проблем мировой
биологии, медицины и здравоохранения. Патогенез СД 1 типа – сложный многоэтапный
процесс, на сегодняшний день его считают классическим аутоиммунным заболеванием, в
основе которого лежат генетические факторы и факторы внешней среды.
Некоторыми авторами показано, что важная роль в патогенезе СД 1 типа принадлежит
активации процессов свободнорадикального окисления. При данном состоянии нарушается
153
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
баланс между прооксидантами и антиоксидантами, что может привести к выработке в
чрезмерном количестве активных форм кислорода (АФК).
Тем не менее, механизм, который может спровоцировать окислительный стресс (ОС) при
СД 1 типа, до конца не изучен. Вероятно, увеличение уровня АФК и развитие ОС может
являться не только причиной, но и показателем, свидетельствующим об инициации
патологических процессов.
Цель данной работы: характеристика окислительного стресса у детей больных сахарным
диабетом 1 типа на разных этапах заболевания
Объектами исследования являлись сыворотки крови детей больных СД 1 типа, любезно
предоставленные Селищевой А.А. НИИ Морфологии человека РАМН, АНО «Институт
биомедицинских проблем» г. Москва. Сыворотки в трех разных группах с разными историями
заболевания: I группа – СД 1 типа от первично выявленных до 1 года; II группа – СД 1 типа от
1 года до 10 лет; Контрольная группа – условно здоровые доноры.
Для
оценки
ОС
применялись
биохимические,
спектрофотометрические
и
колориметрические методы анализа.
У детей, болеющих менее 1 года СД 1 типа, достоверно повышена активность каталазы и
составляет 366 мкмоль/мин по сравнению с активностью каталазы в норме (14 мкмоль/мин).
У больных СД 1 типа на поздней стадии заболевания в сыворотке крови достоверно
повышено содержание каротиноидов и составляет 193 мг/мл по сравнению с нормой (44,06
мг/мл).
У больных СД 1 типа с длительной историей заболевания (более 1 года) достоверно
повышено количество триеновых коньюгатов и составляет 0,73 мг/мл по сравнению с нормой
(0,51 мг/мл).
У детей, болеющих СД 1 типа менее 1 года и с длительной историей заболевания (более 1
года) достоверно повышена активность cупероксиддисмутазы составляет 751,24%/мг и
461,78%/мг соответственно, по сравнению с нормой (224, 1%/мг).
ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В
ОРГАНИЗМЕ СЫЧА ВОРОБЬНОГО (GLAUCIDIUM PASSERINUM L., 1758)
Пудовкин Н.А., Смутнев П.В.
ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова,
Саратов, Россия
niko-pudovkin@yandex.ru
Активные формы кислорода (АФК) являются нормальными метаболитами обменных
процессов и выполняют определенную физиологическую роль в функционировании клетки. Но
при определённых состояниях АФК начинают проявлять свою реакционную способность,
связанную с токсической окислительной деструкцией белков, липидов и др. Исходя из этого,
изучение процессов перекисного окисления липидов в организме является актуальной задачей.
Объектом исследований был выбран Воробьиный сыч - Glaucidium passerinum,
(Linnaeus,1758).
Определение содержания малонового диальдегида проводили тиобарбитуровым методом.
Антиоксидантную обеспеченность организма оценивали по активности фермента каталазы в
сыворотке крови и гомогенатах тканей.
В ходе проведенных исследований было установлено, что концентрация малонового
диальдегида (МДА) в ткани печени составила 8,033±0,012 нмоль/г, относительно низкое
содержание МДА в можно объяснить тем, что в норме в митохондриях печени нарабатывается
около 0,2 нмоля О2•-/мин/мг белка. За счет действия Mn-зависимой супероксиддисмутазы и
пероксидазы содержание О2 и Н2О2 поддерживается на низком уровне. В миокарде исходное
содержание МДА составило 12,830±0,011 нмоль/г. относительно высокое содержание МДА в
миокарде можно объяснить интенсивными обменными процессами, протекающими в данном
органе. В мышцах концентрация МДА составила – 6,166±0,045 нмоль/г. Мышцы являются
одними из основных ловушек активных форм кислорода, которые образуются как продукты
окислительно-восстановительных реакций ферментативной и не ферментативной природы. В
154
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
желудочно-кишечном тракте концентрация МДА составила 8,233±0,061 и 11,761±0,012 нмоль/г
в желудке и кишечнике соответственно.
Каталаза является гемопротеином, катализирует реакцию расщепления Н2О2. В печени
активность данного фермента составила 98,541±2,012 ммоль/л. Антиоксидантная система этого
органа выделяется высокой эффективностью всех своих компонентов. Такие уровни
активности каталазы свидетельствуют о том, что в гепатоцитах процессы ПОЛ протекают с
высокой интенсивностью, а указанным ферментам принадлежит ключевая роль в АО защите
данного органа. В мышцах активность каталазы равнялось 44,231±1,023 ммоль/л. Такой
уровень активности связан, возможно, с невысоким, по сравнению с другими исследованными
органами, содержанием липидов, но при этом низкое содержание МДА может объясняться и
относительно высокой активностью каталазы.
Исходная активность фермента в мышце сердца равнялось 33,156±1,333 ммоль/л.
В желудочно-кишечном тракте активность каталазы составила 44,362±1,045 ммоль/л и
47,201±1,054 ммоль/л в желудке и кишечнике соответственно.
Таким образом, самая высокая активность фермента каталазы и содержание малонового
диальдегида отмечено в ткани печени, что является закономерным процессом с точки зрения
функциональных особенностей данного органа.
АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ
В РАЗЛИЧНЫХ КОМПАРТМЕНТАХ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Разуваева А.В.
ФГБОУ ВПО Новосибирский национальный исследовательский государственный
университет; ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины
СО РАН, Новосибирск, Россия
alena.p.92@mail.ru
ДНК – главный носитель генетической информации в клетке – может повреждаться
различными агентами физической и химической природы. Наличие ДНК в клетке не
ограничено одним лишь ядром. В других органеллах – митохондриях и хлоропластах (у
растений) – содержится собственная ДНК.
В клетках человека митохондриальный геном, по сравнению с ядерным, более доступен
для действия окислительного стресса, что объясняется, главным образом, близостью
электронно-транспортной цепи. Долгое время считалось, что репарация ДНК в митохондриях
отсутствует. И хотя для большинства путей репарации это действительно так, эксцизионная
репарация оснований (ЭРО) протекает активно и важна для поддержания целостности
митохондриальной ДНК.
ЭРО удаляет широкий спектр химических модификаций оснований ДНК. Этот процесс
инициируется ферментами ДНК-гликозилазами. В связи с ограниченным числом белков,
кодируемых в митохондриальном геноме, необходимость репарации ДНК в митохондриях
подразумевает транспорт белков репарации, в том числе ДНК-гликозилаз, закодированных в
ядерном геноме и синтезированных в цитоплазме.
Для многих ДНК-гликозилаз (8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза, урацил-ДНК-гликозилаза,
MUTYH и др.) известно существование отдельных ядерной и митохондриальной изоформ,
однако ферментативные свойства неядерных форм остаются малоизученными. В связи с этим
цель данной работы состояла в характеристике профиля активности ферментов ЭРО ДНК в
ядре и в митохондриях клеток человека.
Исследования проводились на двух линиях раковых клеток человека – RPMI-8226 (клетки
миеломы) и MCF-7 (клетки аденокарциномы молочной железы). Из клеток этих линий были
приготовлены общий, цитоплазматический, митохондриальный и ядерные экстракты, в
которых с использованием модельных субстратов была оценена активность ферментов ЭРО.
В ходе работы было установлено, что во всех клеточных компартментах хорошо
представлена урацил-ДНК-гликозилазная, АП-эндонуклеазная активности и гликозилазная
активность окисленных пиримидинов. 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазная и алкиладенин-ДНКгликозилазная активности встречаются в ядре и митохондриях, что согласуется с
литературными данными о существовании соответствующих изоформ этих гликозилаз.
155
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛА А
И ИХ КОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Пылина Я.И.1, Шадрин Д.М.1, Велегжанинов И.О.1, Тарабукина И.С.2, Белых Д.В.2
1
ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН;
2
ФГБУН Институт химии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, Россия
yanapylina@yandex.ru
В связи с большим числом и тяжестью побочных эффектов классической химиотерапии и
радиотерапии опухолей одной из важнейших задач современной науки является комплексный
междисциплинарный поиск путей повышения эффективности химио- и радиотерапии, а также
развития альтернативных способов лечения онкологических заболеваний. Среди
альтернативных подходов для лечения некоторых типов опухолей ведущее место занимает
фотодинамическая терапия. Поэтому разработка новых фотосенсибилизаторов является одной
из приоритетных задач в рамках развития фотодинамической терапии опухолей.
Выполнив синтез нескольких десятков новых производных, и обладая возможностями
дальнейшего направленного изменения химических структур, мы поставили перед собой цель
проанализировать их темновую и световую цитотоксичность (флуориметрическим методом в
микрокультурах – FCMA) на опухолевых и нормальных первичных культурах человеческих
клеток.
В результате на темновую цитотоксическую активность было протестировано три
производных хлорофилла а (С37H43N5O5 (1), С34H36N4O3 (2) и С43H53N5O4 (3)) и их
металлокомплексы с Zn, Cu, Co, Pd и Ni (всего 18 веществ), для которых были получены
зависимости индекса выживаемости раковых клеток линии HeLa и нормальных фибробластов
ФЛЭЧ-104 от концентрации испытуемых веществ (0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ и 100
мкМ). Было установлено, что наибольшей темновой цитотоксической активностью среди
исследуемых
веществ
обладают
комплексные
соединения,
где
в
качестве
комплексообразователя выступает Zn (при концентрации 10 мкМ индекс выживаемости (в %)
производных 1, 2, 3 для клеток линии HeLa и ФЛЭЧ соответственно составил 0,36±0,10,
0,55±0,13, 10,88±3,10 и 10,78±1,84, 16,86±4,67, 41,52±5,15),наименьшей комплексы с Cu (при
концентрации 10 мкМ индекс выживаемости (в %) производных 1, 2, 3 для клеток линии HeLa
и ФЛЭЧ соответственно составил 76,91±7,43, 72,34±5,57, 88,80±4,23 и 90,03±15,19, 74,92±11,58,
82,50±14,74), Pd (при концентрации 10 мкМ индекс выживаемости (в %) производных 1, 2, 3
для клеток линии HeLa и ФЛЭЧ соответственно составил 55,42±4,13, 67,53±4,51, 83,93±5,13 и
72,14±15,49, 62,30±10,05, 76,91±12,69) и Ni (при концентрации 10 мкМ индекс выживаемости
(в %) производных 1, 2, 3 для клеток линии HeLa и ФЛЭЧ соответственно составил 81,27±4,41,
90,85±3,83, 76,79±2,19 и 99,77±19,19, 71,94±11,79, 90,03±17,04). Наименее токсичные
металлокомплексы требуют дальнейшего изучения на предмет фотосенсибилизирующей
активности, тогда как наиболее токсичные могут рассматриваться как потенциальные
действующие вещества для создания препаратов классической химотерапии.
ТИОЛ-ДИСУЛЬФИДНАЯ РЕДОКС-СИСТЕМА БЕЛКОВ МЕМБРАН
ЭРИТРОЦИТОВ КРЫС ПРИ ГИПОТЕРМИИ
Рашидова М.А., Вагидова С.С.
ФГБОУ ВПО Дагестанский государственный университет, Махачкала, Россия
madina.211@mail.ru
Одними из важнейших функциональных групп белков являются сульфгидрильные группы,
которые необходимы для формирования многих функций белков. Сульфгидрильные группы
характеризуются высокой химической реакционной способностью, легко вступая в
разнообразные реакции со многими типами соединений. В условиях окислительного стресса
SH-группы белков могут подвергаться окислению с образованием соответствующих
дисульфидов. Повышение соотношения S-S/SH, обозначаемое как окислительный индекс,
считается одним из показателей окислительной (главным образом под действием свободных
радикалов) модификации мембранных белков. В условиях холодового стресса у
156
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
гомойотермных животных интенсифицируются процессы образования активных форм
кислорода в тканях, что может привести к окислительным повреждениям мембранных белков.
В данной работе исследовано содержание SH-групп и S-S-связей, а также их соотношение
(S-S/SH) в белках мембран эритроцитов крыс при гипотермии. Гипотермию вызывали
наружным охлаждением. Температуру тела снижали до 30°С (умеренная гипотермия) и 20°С
(глубокая гипотермия) в течение 30 и 60 мин., соответственно. Полученные нами данные
показали, что при умеренной гипотермии на 19% снижается общее количество титруемых SHгрупп в белках мембран эритроцитов. В то же время заметно (на 32,5%) увеличивается
количество дисульфидых связей в них. В целом, эти изменения на 63% увеличивают
окислительный индекс мембранных белков.
Таким образом, умеренная гипотермия стимулирует процессы окислительной
модификации белков мембран эритроцитов. Необходимо отметить, что при гипотермии 30°С
наблюдается заметное перераспределение SH-групп в белках, в результате чего отношение
доступных SH-групп к скрытым тиоловым группам возрастает в 2 раза. Повышение этого
соотношения в большей степени связано со снижением (на 41%) количества скрытых SH-групп
в белках. Эти данные свидетельствуют о конформационных переходах мембранных белков
эритроцитов при умеренной гипотермии. При глубокой гипотермии наблюдается определенная
тенденция к нормализации уровня SH-групп и S-S-связей в мембранных белках. Уменьшение
степени окислительной модификации мембранных белков при этом, видимо, связано со
снижением интенсивности генерации активных форм кислорода, восстановлением
дисульфидных связей, а также частичным протеолизом окислительно-модифицированных
белков.
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ N-КОНЦЕВЫХ ПЕПТИДОВ
БЕЛКОВ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
МЕТОДОВ ДЕРИВАТИЗАЦИИ NH2-ГРУПП
Сазонов А.В.1,2, Сурин А.К.3, Швец В.И.2, Черновская Т.В.1
1
ЗАО «Биокад», Московская область; 2ФГБОУ ВПО Московский государственный
университет тонких химических технологий им. М.В.Ломоносова, Москва;
3
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
sazonov@biocad.ru
Последовательность N-концевого фрагмента белка важна в оценке качества
терапевтических белков. Правильность N-концевой последовательности говорит о правильной
трансляции белка и служит подтверждением первичной структуры белка. Определение Nконцевого пептида белка необходимо и для подтверждения правильности процессинга. Для
этой цели применяется метод секвенирования с использованием деградации по Эдману.
Невысокая чувствительность, высокие требования к чистоте пептидов, невозможность
секвенирования модифицированных по концевой аминогруппе пептидов сильно ограничивают
возможности этого метода.
В настоящее время задача определения N-концевой последовательности белка решается
преимущественно методом тандемной масс-спектрометрии. Однако во многих работах
отмечается высокий процент ложноположительных идентификаций пептидов. В связи с этим
существует необходимость развития новых методов, позволяющих специфично и с высокой
точностью определять последовательность N-концевого пептида.
Была предложена схема селективного секвенирования N-концевых пептидов
терапевтических белков, включающая в себя полную блокировку аминогрупп белка
посредством ацетилирования; трипсинолиз с последующей дериватизацией образовавшихся
аминогрупп модификатором с S-S группой; отрицательный отбор N-концевых пептидов с
помощью сорбента, с которым связываются пептиды, модифицированные по аминогруппе;
тандемный масс-спектрометрический анализ и установление последовательности выделенного
пептида. Исследованы некоторые параметры, влияющие на эффективность реакции
ацетилирования свободных аминогрупп белка. Показано, что такие параметры, как
температура, время реакции, рН значительно влияют на эффективность реакции. Подобраны и
157
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
оптимизированы условия дериватизации белков различными модификаторами. Методика
апробирована на нескольких белках терапевтического значения.
Полученные результаты могут быть использованы для решения следующих задач:
1) определение аминокислотных последовательностей N-концевых пептидов неизвестных
или отсутствующих в протеомных базах данных белков;
2) идентификация и определение места пост-трансляционной модификации на N-конце
белка;
3) валовая идентификация протеома в клетке.
СОДЕРЖАНИЕ ГЕМОГЛОБИНА И ОКСИГЕМОГЛОБИНА В ЭРИТРОЦИТАХ
КРОВИ КРЫС ПРИ БЕЛКОВОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
Скрипник М.Г., Копыльчук Г.П.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы, Украина
skripnik.maryana@mail.ru
Гемоглобин – железосодержащий функциональный белок эритроцитов, способный
обратимо связываться с кислородом, обеспечивая его перенос ко всем тканям организма, и
участвующий в обратном транспорте углекислоты. Очень часто развитие патологических
состояний разного генеза сопровождается снижением уровня гемоглобина и изменениями
количественного соотношения его лигандных форм.
В связи с этим целью работы было определить содержание гемоглобина и оксигемоглобина
в эритроцитах крови крыс при белковой недостаточности.
Результаты исследований показали, что в гемолизате эритроцитов крови крыс,
содержащихся на полусинтетическом рационе с частичной недостаточностью белка (⅓
массового количества белка от общепринятой нормы), наблюдается снижение концентрации
гемоглобина в 1,4 раза по сравнению с показателями контроля. Вероятно, данный факт, с одной
стороны, связан с нарушением синтеза полипептидных цепей глобина вследствие дефицита
аминокислот, с другой – с подавлением связывание атома железа гема с глобином. Кроме того,
снижение уровня гемоглобина в крови однозначно может приводить к кислородному
голоданию тканей. Действительно, в ходе экспериментальных исследований нами обнаружено,
что в гемолизате эритроцитов на 28 сутки пребывания животных на низкобелковой диете
происходит снижение уровня оксигемоглобина в 1,5 раза по сравнению с показателями
контрольной группы животных. Известно, что координационные свойства гема определяют
способность молекулы гемоглобина к присоединению молекулярного кислорода благодаря
образованию аксиальных связей между ионом Fe2+ и аминокислотными остатками
полипептидных цепей глобина. Вероятно, недостаточность белка в пищевом рационе приводит
не только к деформации структурно-пространственной организации гемоглобина, но и к
нарушению функционирования кислородосвязывающего участка гема.
Таким образом, белковая недостаточность сопровождается снижением гемоглобина и
оксигемоглобина в эритроцитах крови крыс.
ПОЛУЧЕНИЕ ХИМЕРНОГО БЕЛКА GFP-ЛИЗОЦИМ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
ПРОЦЕССОВ НУКЛЕАЦИИ БЕЛКОВЫХ КРИСТАЛЛОВ ПРИ ПОМОЩИ
КОНФОКАЛЬНОЙ МИКРОСПЕКТРОСКОПИИ
Симановская А.А.1, Горященко А.С.2, Липкин А.В.1, Качалова Г.С.1,2
1
ФГБУ Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»;
2
ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва, Россия
anna.eltsina@gmail.com
В современных структурных, геномных и протеомных проектах рентгеноструктурный
анализ (РСА) кристаллов биополимеров является основным методом определения
пространственной структуры биологических макромолекул и их комплексов. Это важно как
для решения фундаментальных проблем механизмов их функционирования, участия в
метаболической регуляции и организации надмолекулярных структур, так и для рационального
158
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
дизайна новых лекарственных препаратов и биокатализаторов. Ограничение применения РСА
для таких исследований связанны с доминированием эмпирических подходов выращивания
биокристаллов, в основном, метода проб и ошибок, что согласно статистике проводимых
структурно-геномных проектов приводит к успеху лишь в 10% случаев. Для разработки общих
теоретических представлений о процессах кристаллизации макромолекул необходимы новые
экспериментальные подходы, особенно при изучении механизма зародышеобразования
кристаллической фазы, а также формирования обратимых ассоциатов (кластеров) в
насыщенных растворах биополимеров на стадии, предшествующей возникновению зародышей.
Для исследования процессов нуклеации белковых кристаллов предложено использовать
метод лазерной сканирующей конфокальной спектрометрии. В качестве объекта исследования
был выбран фьюжн-белок лизоцима(HEWL) и ЕGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein –
(S65T) мутантный вариант зеленого флуоресцентного белка), флуоресцентные свойства
которого необходимы для визуализации процессов кристаллизации рекомбинантного
лизоцима. EGFP использован, так как его пик поглощения (484 нм) существенно удален от
ультрафиолетовой области, к которой близок максимум возбуждения GFP (395 нм), что
предпочтительней при работе с методами оптической микроскопии, а также позволяет
избежать радиационного разрушения S-S мостиков лизоцима ультрафиолетовым излучением. В
данной работе представлены результаты по конструированию, экспрессии, очистки и
предварительной кристаллизации ЕGFP и ЕGFP-HEWL рекомбинантных белков. Приведены
сравнительные спектральные и физико-химические характеристики полученных белков и
обсуждаются предварительные условия их кристаллизации.
АГРЕГАЦИЯ И ОБРАЗОВАНИЕ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР
ИНСУЛИНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ L-АРГИНИНА
Смирнова Е.Ю., Гурвиц Б.Я.
ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва, Россия
smeu1989@mail.ru
Показано,
что
аминокислота
L-аргинин,
являющаяся
низкомолекулярным
шапероноподобным агентом, используемым для подавления агрегации частично развернутых
белков, при определенных условиях способна индуцировать процесс агрегации. Этот
парадоксальный феномен продемонстрирован на примере рекомбинантного инсулина человека.
Методом динамического лазерного светорассеяния исследовали кинетику агрегации инсулина
при различных условиях инкубационной среды. В частности, при изменении значений рН
среды от 7,0 до 8,0 выявлены противоположно направленные эффекты аргинина на агрегацию
инсулина на основе электростатических взаимодействий. При pH 7,0 наблюдали традиционное
подавление процесса агрегации инсулина, индуцируемой дитиотреитолом, в присутствии
аргинина при концентрациях, более 10 мМ, в то время как при рН 8,0 – значительное усиление
агрегации при концентрациях аргинина 10–100 мМ. При значении pH 7.5 аргинин не влиял на
агрегацию инсулина.
С использованием атомно-силовой и трансмиссионной электронной микроскопии
показано, что инсулин в присутствии аргинина образует гетерогенные структуры –
гранулярные частицы диаметром 3–5 нм, которые выстраиваются в цепи длиной до 200 нм.
Спектры флуоресценции, полученные с использованием тиофлавина Т, позволили
предположить, что образующиеся агрегаты имеют префибриллярную структуру. Спектры
кругового дихроизма выявили дестабилизирующий эффект аргинина, что может приводить к
усилению агрегации белка. Это было также подтверждено в экспериментах с использованием
флуоресцентного гидрофобного зонда bis-ANS, показавших, что в присутствии аргинина
значения интенсивности флуоресценции значительно повышаются.
Полученные результаты свидетельствуют о возможности тонкой регуляции процесса
агрегатообразования под действием природного низкомолекулярного агента с помощью
изменения рН среды в узком диапазоне физиологических значений, что расширяет
современные представления о функционировании инсулина в живой системе и его
использовании в медицине. Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и
клеточная биология» и грантом РФФИ 14-04-01530.
159
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ПЕРВИЧНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕМЕЙСТВА CYP74 ПЛАУНКА
SELAGINELLA MOELLENDORFII
Смирнова Е.О., Горина С.С., Мухтарова Л.Ш., Топоркова Я.Ю.,
Гоголев Ю.В., Гречкин А.Н.
ФГБУН Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань, Россия
yelena.smirnova@aiesec.net
В регуляции ответа растений на стрессовые факторы важная роль принадлежит ферментам
липоксигеназной сигнальной системы, включающим цитохромы Р450 семейства СYP74 –
алленоксидсинтазы (АОС), гидропероксидлиазы (ГПЛ) и дивинилэфирсинтазы (ДЭС). Среди
них дивинилэфирсинтазы остаются наименее изученными. Охарактеризованные ферменты, в
основном, принадлежат растениям семейства пасленовые и утилизируют 9-гидроперекиси
жирных кислот. Охарактеризованы только две 13-специфичные дивинилэфирсинтазы чеснока и
льна. Однако имеются сведения о присутствии дивиниловых эфиров в растениях разных
таксонов. Среди двудольных это представители семейства лютиковые, а среди однодольных
это представители семейства ирисовые и спаржевые.
Плаунок Selaginella moellendorffii является в своем роде уникальным объектом, поскольку в
тканях этого растения в норме встречается большое разнообразие дивиниловых эфиров, а в
геноме содержится 6 генов, предположительно кодирующих дивинилэфирсинтазы. Они
обладают небольшой степенью сходства с представителями известных подсемейств CYP74,
вследствие чего их отнесли к новым подсемействам CYP74K, CYP74M, CYP74M. Гены
ферментов CYP74M1, CYP74M2 и CYP74M3 были клонированы, соответствующие ферменты
охарактеризованы. Они представляют собой не сходные изоформы, катализирующие
образование одной группы продуктов, а четко различающиеся ферменты, ответственные за
образование широкого спектра дивиниловых эфиров, структура которых определена с
помощью ГХ-МС, ЯМР и УФ-спектроскопии. Значение такого разнообразия образуемых
дивиниловых эфиров для жизнедеятельности растения еще предстоит выяснить.
Работа поддержана грантами РФФИ 12-04-01140-a, 12-04-97087-р, 14-04-01532-а и 12-0497059-р, MK-4886.2013.4 и ВНШ-1890.2014.4.
РОЛЬ ИЗОФОРМ ЭКСТРАКЛЕТОЧНОГО HSP90 В ИНВАЗИИ ОПУХОЛЕВЫХ
КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
Снигирева А.В., Врублевская В.В., Моренков О.С.
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
snigireva.s@gmail.com
Экстраклеточный белок теплового шока 90 (eHsp90) участвует в процессах, связанных с
подвижностью клеток, инвазией и метастазированием. eHsp90 представлен двумя изоформами,
но их роль в инвазии клеток не определена. Показано, что фрагмент 236-350 аа молекулы Hsp90
(F-5 фрагмент) стимулирует миграцию клеток. Мы предположили, что Hsp90-зависимая
стимуляция инвазии также связана с указанной областью Hsp90. Целью работы стало изучение
роли изоформ экстраклеточного Hsp90 (Hsp90α и Hsp90β) в инвазии опухолевых клеток
фибросаркомы человека (НТ1080) in vitro. Исследования проводили с использованием двух
экспериментальных моделей - Hsp90-индуцированной инвазии, при которой инвазию клеток
активировали нативным Hsp90 с последующим ингибированием Hsp90-специфичными
поликлональными антителами; и неиндуцированной Hsp90-зависимой инвазии клеток.
Нативный Hsp90 выделяли из мозга мыши. Были синтезированы пептиды,
соответствующие фрагментам Hsp90α и Hsp90β, не имеющие гомологии между собой, и пептид
из области F-5 фрагмента, одинаковый для обеих изоформ Hsp90. К пептидным фрагментам, а
также к полноразмерному Hsp90, получены поликлональные антитела, которые очищали с
использованием специфического сорбента на основе агарозного геля, с пришитым Hsp90 и
пептидами.
В модели Hsp90-индуцированной инвазии клеток, Hsp90 в концентрациях 1-10 мкг/мл
стимулировал инвазию клеток фибросаркомы человека in vitro на 65-77%. Контрольные белки
(Hsp70, BSA) не влияли на инвазию клеток. Антитела к Hsp90α и Hsp90β ингибировали
160
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
стимуляцию инвазии клеток на 45,7±5% и 38,7±5%, соответственно. Антитела к F-5 фрагменту
практически полностью снимали активирующий эффект Hsp90 (73,5±5%), наравне с
антителами, специфичными к полноразмерной молекуле Hsp90. В модели неиндуцированной
инвазии клеток, антитела к Hsp90α и к Hsp90β ингибировали инвазию клеток на 16,2±7% и
17,0±6,5%,
соответственно.
Наибольший
ингибирующий
эффект
(26,5±5%)
на
неиндуцированную инвазию обнаружили антитела к F5-фрагменту Hsp90. Антитела из
сыворотки неиммунных кроликов, не влияли на инвазию клеток в обеих экспериментальных
моделях.
Полученные результаты свидетельствуют об участии двух изоформ eHsp90 в стимуляции
инвазии опухолевых клеток. Поликлональные антитела к F-5 фрагменту Hsp90 выражено
ингибировали инвазию клеток фибросаркомы человека как в модели Hsp90-индуцированной,
так и неиндуцированной инвазии. Полученные результаты позволяют рассматривать
экстраклеточный Hsp90, в особенности F-5 фрагмент белка, в качестве перспективной
молекулярной мишени, ингибирование которой может тормозить метастазирование
опухолевых клеток.
ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АНТИМИКРОБНЫХ
ПЕПТИДОВ ИЗ КУЛЬТУРЫ LACTOBACILLUS PLANTARUM 8РА-3
Соболева А.В., Колобов А.А., Гришина Т.В.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
oriselle@yandex.ru
Профилактика и терапия заболеваний, вызываемых патогенными микроорганизмами,
является одной из важнейших задач современной медицины. Антимикробные пептиды
пробиотических лактобактерий можно рассматривать в качестве потенциальных
антибактериальных и противогрибковых лекарственных веществ, перспективных для
последующего создания медицинских препаратов. Секвенирование генома промышленного
пробиотического штамма Lасtobacillus plantarum 8PA-3 выявило наличие локуса, отвечающего
за синтез двух бактериоцинов EF и NC8.
В работе охарактеризован спектр молекулярных масс пептидов, обладающих
антимикробной активностью, выделенных из культуры Lactobacillus plantarum 8РА-3.
Экстракцию низкомолекулярных бактериоциноподобных пептидов проводили из культуры
Lactobacillus plantarum 8PA-3 препаративными методами: кислотная экстракции пептидных
фракций раствором 5% уксусной кислоты и ультрафильтрация через фильтры 10 кДа и 1 кДа.
Фракционирование
группы
низкомолекулярных
полипептидов
осуществляли
хроматографическими методами, такими как катионообменная хроматография и обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная хроматография на хроматографе ÄKTAexplorer 10S.
Хромато-масс-спектрометрический анализ производили на приборе LC/MS Agilent Tehnologies.
В процессе хромато-масс-спектрометрического анализа полученной ранее фракции
антимикробных пептидов с молекулярной массой до 10 кДа было показано наличие множества
однозаряженных компонентов белковой низкомолекулярной матрицы (масса/заряд 300-750),
входящей в состав питательной среды MRS, а также присутствие относительно
высокомолекулярных пептидов с молекулярной массой: 2946,7 Да; 3784,2 Да; 3883,9 Да; 3896,2
Да; 3900,0 Да; 4611,1 Да; 5454,9 Да и 6280,4 Да.
Несмотря на наличие высокой антимикробной активности полученной фракции
низкомолекулярных пептидов из культуры Lасtobacillus plantarum 8PA-3, спектр молекулярных
масс пептидов, охарактеризованных с помощью хромато-масс-спектрометрического анализа, не
соответствуют массам предсказанных бактериоцинов.
Работа
выполнялась
в
рамках
гранта
НИР
СПбГУ
Ф-№0.37.123.2011
«Морфофизиологические и биохимические аспекты антимикробного воздействия
бактериоцинов».
161
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ИЗМЕНЕНИЯ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ В УСЛОВИЯХ
ИНДУЦИРОВАННОГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА
Сорока Ю.В., Демкив И.Я., Лисничук Н.Е.
ГВУЗ Тернопольский государственный медицинский университет
им. И.А.Горбачевского, Тернополь, Украина
duduchka@ukr.net
В условиях индуцированного 1,2-диметилгидразином (ДМГ) аденокарциноматоза толстой
кишки на фоне применения компонентов химиотерапии изучены изменения цитокинового
профиля в организме белых крыс.
Химически
индуцированный
канцерогенез
моделировали
согласно
методики
В.П.Дерягиной (2009). В качестве препаратов химиотерапии использовали Доксорубицин и
Метатрексат по методике И. В. Зариповой (2008). Иммуноферментным методом определяли
концентрации провоспалительных (TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6) и противосполаительныъх
цитокинов (IL-4 и IL-10), используя стандартные наборы реактивов, адаптированные для белых
крыс.
В условиях ДМГ- канцерогенеза отмечено выраженное возрастание концентраций
провоспалительных цитокинов IL-1β (на 38,1%), IL-6 (на 21,5%), TNFα (на 166,9%) по
сравнению с группой контроля. Одновременно установлено снижение концентрации IL-2
(на 13,7%) относительно аналогичного показателя в группе интактных животных. Анализ
полученного цифрового материала обнаружил существенный рост содержания
противовоспалительных цитокинов IL-10 (в 2,2 раза) и IL-4 (на 98,7%) в группе животных с
ДМГ-канцерогенезом по сравнению с контрольными показателями. Сочетанное с введением
ДМГ применение цитостатиков способствовало существенному возрастанию содержания
IL-1β (в 2,6 раза), IL-6 (в 2,3 раза) и TNFα (в 3,2 раза) по сравнению с аналогичными
показателями у интактных животных. Содержание IL-2 в этой группе снизилось как
относительно аналогичного показателя в контрольной группе животных (на 33,9%), так и по
сравнению с группой животных, которым вводили только ДМГ (на 23,4%). У животных с ДМГиндуцированной неопластической интоксикацией на фоне введения цитостатиков отмечено
усиление продукции IL-10 (возрастание концентрации на 151,3%) и IL-4 (повышение уровня на
145,3%) по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы животных. Следует
отметить, что эти показатели были также достоверно выше, чем аналогичные у животных с
ДМГ- канцерогенезом.
Таким образом, в условиях хронической неопластической интоксикации в сочетании с
цитостатической терапией наблюдаются существенные изменения цитокинового профиля,
характеризующиеся возрастанием концентраций всех исследуемых классов цитокинов, кроме
IL-2, концентрация которого существенно уменьшалась.
АКТИВНОСТЬ ПЕРЕКИСЬ-РАЗРУШАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ И
ФЕРРОКСИДАЗЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРЫС С МОДЕЛЬНЫМ
САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ I ТИПА
Сосновский Д.А., Маркин Д.Н.
ГБОУ Пензенской области Губернский лицей-интернат для одарённых детей,
Пенза, Россия
sosnovsky@ro.ru
В настоящее время сахарный диабет является одной из острых проблем, стоящих перед
медицинской наукой. Сахарный диабет (СД) – это группа эндокринных заболеваний, для
которых характерна недостаточность гормона инсулина, в результате чего развивается
гипергликемия. Одним из типов СД является диабет I типа. Он развивается в результате
деструкции β-клеток поджелудочной железы и приводит к абсолютной недостаточности
инсулина. Известно, что СД изменяет все виды обмена веществ. Одним из проявлений может
стать активация свободнорадикальных процессов. Для сдерживания роста количеств
свободных радикалов, организм имеет антиоксидантную систему, компонентами которой
являются перекись-разрушающие ферменты и ферроксидаза. Поэтому целью нашей работы
162
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
стала оценка вовлеченности перекись-разрушающих ферментов и ферроксидазы в сдерживание
развития окислительного стресса при модельном сахарном диабете I типа.
Работа выполнена на 3-х месячных самцах белых беспородных крыс массой 200-250 г,
содержащихся в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. Для
моделирования СД I типа животным интраперитонеально вводили стрептозоцин (50 мг/кг). Для
оценки различий формировали контрольную группу животных, которые получали
физиологический раствор. Животных выводили из эксперимента через 240 часов после
моделирования заболевания. Методом центрифугирования получали сыворотку крови, в
которой определяли активности перекись-разрушающих ферментов и ферроксидазы. Для
статистической обработки полученных данных использовали t-критерий Стьюдента.
В результате исследования установлено повышение активности перекись-разрушающих
ферментов в 1,2 раз (p<0,05) по сравнению с контрольной группой животных. Активность
ферроксидазы возрастала в 1,3 раза (p<0,05) по сравнению с контрольной группой животных.
Полученное данные убедительно свидетельствуют о вовлеченности антиоксидантной
системы в сдерживание развития окислительного стресса при модельном сахарном диабете I
типа.
ОСОБЕННОСТИ СУБЪЕДИНИЧНОГО СОСТАВА РАЗНЫХ ФОРМ
ПРОТЕАСОМ, ВЫЯВЛЕННЫЕ МЕТОДАМИ НАТИВНОГО И
ДВУМЕРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Степанова А.А., Ерохов П.А., Шарова Н.П.
ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва, Россия
stepannette@gmail.com
Нативный электрофорез является мощным инструментом анализа четвертичной структуры
таких крупных белковых комплексов, как протеасомы, однако существует ряд факторов,
которые ограничивают применения этого метода. Наличие ДНК сильно ухудшает разрешение
белковых полос при нативном электрофорезе. Целью работы являлся поиск оптимального
метода проведения нативного и двумерного электрофорезов для анализа субъединичного
состава протеасом.
Образцами служили осветленные гомогенаты печени крысы, из которых разными
способами удаляли ДНК: ферментативным гидролизом, осаждением анионитами. Для удаления
ДНК осаждением были синтезированы поликатионы на основе инулина, активированного
периодатом, с разной плотностью посадки спермидина или спермина (Сд-Ин и Сн-Ин,
соответственно). Другой анионообменник, использованный в работе, - DEAE-Sephacel.
Сохранение активности протеасом определяли по гидролизу флуорогенного субстрата SucLLVY-AMC, качество полученного образца оценивали в ходе электрофореза в 1% агарозе (100
мМ Трис-HCl pH 7.5, 5 мМ ЭДТА) и градиентном (3.5-12%) полиакриламидном геле (50 мМ
бис-трис-глицин рН 8.0, 5 мМ ЭДТА). Затем с дорожек первого направления проводили
электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия, после которого методом
иммуноблоттинга выявляли субъединицы протеасом.
Проведение ферментативного расщепления нуклеиновых кислот приводит к быстрому
падению активности протеасом, поэтому этот метод не может быть использован для
подготовки образцов к проведению электрофореза протеасом. Спермидин-инулин с
определенной плотностью посадки групп позволяет очистить осветленные гомогенаты тканей
от нуклеиновых кислот, но значительно ухудшает разрешение белковых полос при нативном
электрофорезе за счет связывания с белками и формирования агрегатов. Осаждение
нуклеиновых кислот с помощью DEAE-Sephacel приводит к улучшению разрешения белковых
полос и позволяет сохранить активность образца.
Разработанные нами методики подготовки образцов и проведения нативного
электрофореза позволяют разрешить до 5 типов каталитически активных форм протеасом,
различающихся набором регуляторов их активности. Кроме того, было установлено, что
иммунная субъединица протеасом LMP2, играющая роль в борьбе клетки с последствиями
окислительного стресса и в развитии иммунологической толерантности к трансплантату,
неравномерно представлена в разных формах протеасом. Данную иммунную субъединицу
163
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
содержат 20S протеасомы и протеасомы, связанные с регулятором 11S, в то время как у 26S
протеасом она практически не выявляется.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №
14-04-31013 мол_а.
ВЛИЯНИЕ СЕРАНИТРОЗИЛЬНОГО КОМПЛЕКСА ЖЕЛЕЗА С
ЦИСТИАМИНОВЫМ ЛИГАНДОМ НА ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ
ФАКТОР NF-kB
1
Ступина Т.С. , Гуглева Т.С.2, Санина Н.А.1, Терентьев А.А.1
1
ФГБУН Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка; 2ФГБОУ ВПО
Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского,
Нижний Новгород, Россия
stupina.tat@gmail.com
Транскрипционный фактор NF-κB является одним из важнейших белков, способных
контролировать экспрессию генов клеточного цикла, апоптоза и иммунного ответа. При
нарушении регуляции NF-κB возникает воспаление, развитие вирусных инфекций и рака.
Большой интерес вызывают доноры оксида азота, которые способны нитрозилировать белок
NF-κB по цистеинам и ингибировать его функции.
Целью данной работы являлось исследование влияния донора оксида азота
серанитрозильного
комплекса
железа
с
цистеаминовым
лигандом
[Fe2(µS(CH2)2NH3)2(NO)4]•2,5H2O (комплекс CysAm) на транскрипционный фактор NF-кB.
Эксперименты проводили на линии клеток аденокациномы молочной железы человека M-HeLa
(Институт цитологии РАН).
Для определения цитотоксичности исследуемого комплекса был использован метод МТТокрашивания. Для изучения S-нитрозилирования белок NF-кB очищался из ядерных экстрактов
путем иммунопреципитации. Определение нитрозилирования белка NF-κB проводилось
методом иммуноблотинга с антителами к S-нитрозоцистеину. Оценка ДНК-связывающей
активности проводилась методом торможения в геле с использованием олигонуклеотида,
содержащего консенсусную последовательность для связывания белка NF-κB.
Было показано, что комплекс CysAm проявляет высокую цитотоксичность и вызывает
гибель клеток. Цитотоксическое действие комплекса CysAm на клетки сопровождается
изменением активности ядерной транслокации белка NF-κB. Обнаружено S-нитрозилирование
субъединицы p65 белка NF-κB, а также подавление его ДНК-связывающей активности в
присутствии комплекса CysAm in vitro.
Таким образом, донор оксида азота – комплекс CysAm – влияет на функции белка NF-κB в
клетках M-HeLa, изменяя эффективность ядерной транслокации, вызывая его
нитрозилирование и ингибируя его ДНК-связывающую активность.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН
«Фундаментальные науки – медицине».
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ 2-ЗАМЕЩЕННЫХ-3,5-ДИНИТРО-1, 4, 5, 6ТЕТРАГИДРОПИРИДИНОВ С АМИНОКИСЛОТНЫМ ОСТАТОКОМ
НА РОСТ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ
1
Сурова И.И. , Панферова Е.И.1, Атрощенко Ю.М.1, Ковтун И.В.2
1
ФГБОУ ВПО Тульский государственный педагогический университет
им. Л.Н.Толстого; 2ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет, Тула, Россия
Lady-elfa@yandex.ru
Производные с тетрогидропиридиновым каркасом широко представлены в клинической
практике среди противовирусных, антимикробных, противовоспалительных и обезболивающих
средств. Нами синтезированы новые производные 2-замещенных N-(3,5-динитро-1,4,5,6тетрагидропиридин-2-ил)-аминокислотного ряда частичным восстановлением связей
164
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ароматического кольца соответствующего 2-замещенного-3,5-динитропиридина под действием
тетрагидробората натрия.
Следующим этапом работы стало исследование влияния полученных тетрагидропиридинов
на рост озимой пшеницы. Для исследования были приготовлены их водные растворы в
концентрациях 10-4, 10-6, 10-8, 10-10, 10-12, 10-14 М. Судя по полученным данным, исследуемое
соединение оказывает достоверный ингибирующий эффект на энергию прорастания и
всхожесть семян озимой пшеницы, особенно при концентрациях 10-12 и 10-4 М. Так, энергия
прорастания семян, выращенных на растворах указанной концентрации, снижается в 2 раза
относительно контроля, что может быть следствием нарушения мобилизации запасных
соединений (белков, углеводов и жиров) из-за ингибирования ключевых ферментов (протеиназ,
амилаз и липаз). Однако это предположение требует дальнейших экспериментов.
Также проведенное исследование показало, что выращивание растений озимой пшеницы
на растворах в присутствии исследуемого соединения, приводит к замедлению роста эпикотиля
при всех изученных концентрациях. Снижение длины эпикотиля в 1,5-2,5 раза относительно
контроля могло быть следствием нарушений метаболизма развивающихся растений, в
частности, процесса фотосинтеза. Длина гипокотиля достоверно снижалась в присутствии 10-12
и 10-4 М исследуемого соединения. Данный факт мог быть связан с возможностью нарушений
процесса клеточного деления. Дальнейшее исследование подтвердило высказанное
предположение. Митотический индекс клеток гипокотиля пшеницы озимой, выращенной на
среде с 10-12 и 10-4 М соединения, был меньше в 1,7 и 2,5 раза соответственно относительно
контроля.
Таким образом, 2-замещенные-3,5-динитро- 1, 4, 5, 6-тетрагидропиридины с
аминокислотным остатком проявляют ингибирующую активность на рост пшеницы озимой.
ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ
MYCOBACTERIUM SMEGMATIS
Трутнева К.А., Шлеева М.О., Демина Г.Р., Капрельянц А.С.
ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва, Россия
trutneva-k@mail.ru
Латентность туберкулеза имеет важное медицинское значение, так как одна треть мирового
населения латентно инфицирована возбудителем туберкулеза – Mycobacterium tuberculosis.
Один из наиболее важных аспектов, касающихся этого явления - изучение причин
устойчивости покоящихся форм к стрессовым воздействиям факторов внешней среды и
выяснение причин неэффективности антибиотиков. Очевидно, что под этим явлением лежат
как метаболические, так и структурные изменения в покоящихся клетках. Были получены
овоидные покоящиеся формы Mycobacterium smegmatis с измененной морфологией и
пониженной метаболической активностью. Такие уникальные клетки обладали значительно
утолщенной клеточной стенкой и устойчивостью к антибиотикам.
Анализ мембранных белков методом двумерного электрофореза показал значительные
отличия в составе белков покоящихся и активных клеток Mycobacterium smegmatis. В том
числе, в покоящихся клетках присутствует уникальный белок, принадлежащий к семейству
PadR-подобных белков. Так же в этих клетках большем количестве представлены
трегалозофосфатаза; гистон-подобный белок; белок-транспортер (extracellular solute-binding
protein), связывающийся с растворимыми веществами; 3-кетоацил-ACP-редуктаза, гепаринсвязывающий гемаглютинин и белок LpqE.
В цитозольной фракции такие ферменты, как малатсинтетаза, аланиндегидрогеназа и
алкогольдегидрогеназа являются более выраженными у покоящихся клеток по сравнению с
активными. Кроме этого, обнаружено много сходных белков, имеющихся как в активных, так и
в покоящихся клетках Mycobacterium smegmatis. К этим белкам относятся: глицеролкиназа,
металлопептидаза,
оксидоредуктаза,
синтетаза
миколовых
кислот,
фосфоенолпируваткарбоксилаза,
супероксиддисмутаза,
метилмалонатсемиальдегиддегидрогеназа,
пропионил-коэнзимА-карбоксилаза,
6-фосфоклюконатдегидрогеназа,
фумаратгидратаза,
альдегиддегидрогеназа,
фруктоза-1,6-бифосфатаза,
фосфорибозиламин-глицинлигаза, транскетолазa. Стоит отметить, что в цитозольной фракции
165
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
также обнаружен уникальный для покоящихся клеток белок семейства PadR и белок семейства
USP (universal stress protein).
Эти данные свидетельствуют о том, что в покоящемся состоянии у бактерий наблюдаются
изменения как в составе мембран, так и в цитозоле, влекущие за собой морфологические и
физиологические изменения в клетках Mycobacterium smegmatis.
2-(1,5-ДИНИТРО-6-ОКСИ-3,7-ДИАЗАБИЦИКЛО[3.3.1]НОН-3-ИЛ)АМИНОКИСЛОТЫ КАК ОСНОВЫ ДЛЯ ДИЗАЙНА НОВЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Сурова И.И., Атрощенко Ю.М.
ФГБОУ ВПО Тульский государственный педагогический университет
им. Л.Н.Толстого, Тула, Россия
eledhwen_1@mail.ru
Интерес исследователей к 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонановым производным связан с тем,
что они являются основой огромного числа природных продуктов, некоторых алкалоидов
(гранатанол, луканин, спартеин), терпенов (изосативен) значительное количество которых
биологически активно. С химической точки зрения производные бицикло[3.3.1]нонана удобные модели для стереохимических и конформационных исследований. В последнее время
найдены молекулы-хамелеоны, которые под действием разных растворителей подвергаются
конформационным изменениям. Основой таких молекул является, в том числе, и 3,7диазабицикло[3.3.1]нонан. Эти наблюдения интересны с медицинской и фармакологической
точек зрения, т.к. связаны с проблемами лекарств, а именно, с трудностями транспортировки
гидрофильных лекарств через липофильные биологические мембраны.
Введение в подобные структуры аминокислотного фрагмента позволяет существенно
повысить вероятность биологической активности подобных производных. Нами были
получены
2-(1,5-динитро-6-окси-3,7-диазабицикло[3.3.1]нон-3-ил)-аминокислоты
из
2гидрокси-3,5-динитропиридина в ходе реакции Манниха.
Полученные 3,7-диазабицикло [3.3.1]нонаны были выделены в индивидуальном виде, их
строение доказано методом ЯМР1Н-спектроскопии. Ряд этих производных был подвергнут
компьютерному скринингу с целью предсказания биологической активности и расчета
параметров
Липински.
Так
по
«Правилу
пяти»
2-(1,5-динитро-6-окси-3,7диазабицикло[3.3.1]нон-3-ил)-аминокислоты соответствуют предусмотренным параметрам: Mr
= 302.243 до 419.394 (в зависимости от заместителя), LogP<10.
Спектр биологической активности синтезированных 2-(1,5-динитро-6-гидрокси-3,7диазабицикло[3.3.1]нон-3-ил)- аминокислот включает в себя множество фармакологических
эффектов, вероятность проявления которых выше 50%, это и антидиабетические, против
ожирения, лечение фобических расстройств, антивирусная и т.д., что делает их
перспективными для дальнейшего биологического тестирования.
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ C1Q ИЗ СЫВОРОТКИ
КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Умнякова Е.С.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
umka-biolog@mail.ru
Система комплемента играет важную роль в осуществлении функций врожденного
иммунитета. Она представляет собой систему протеолитических белков, которые
последовательно активируют друг друга, запуская каскад реакций, что приводит к опсонизации
патогена и его элиминации фагоцитами, а также к клеточному лизису за счет формирования
мембран-атакующего комплекса.
166
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
Неконтролируемая активация или недостаточность компонентов каскада комплемента
являются первопричиной патофизиологических процессов многих заболеваний, в том числе и
таких как системная красная волчанка и астма. Таким образом, изучение активации и
регуляции каскада важны для лечения или предотвращения такого рода заболеваний.
Для проведения исследований на тему влияния антимикробных пептидов на активацию
каскада комплемента получали белок C1q. Эта рецепторная молекула связывается с Fcфрагментами молекул IgG или IgM в составе иммунного комплекса, запуская каскад по
классическому пути.
Выделение C1q из сыворотки крови проводили по описанному в литературе методу,
используя сочетание аффинной и ионообменной хроматографий, для быстрой очистки белка и
получения C1q в препаративных количествах. Метод был несколько модифицирован:
1. Внесли изменения в процедуру аффинной хроматографии.
В литературе описан метод для выделения C1q с использованием аффинной матрицы с
иммобилизованным иммунным комплексом (ИК). К матрице ковалентно присоединены IgG
человека, являющиеся в данной системе антигеном, к этой системе добавлялись IgG кролика к
IgG человека в качестве антител. В нашей работе тоже был использован подход,
подразумевающий создание иммобилизованного ИК. В качестве антигена использовали
миелопероксидазу человека (МПО) и в эту систему добавляли IgG кролика к МПО человека в
качестве антител. Нами было показано, что для успешного выделения C1q можно использовать
данный иммунный комплекс.
2. Поменяли очередность проводимых процедур, т.е. после осаждения белков проводилась
ионообменная хроматография на КМЦ, а затем проводили аффинную хроматографию. Нам
удалось увеличить выход белка в несколько раз.
Таким образом, разработанный нами метод может быть использован для получения C1q из
сыворотки крови с высоким выходом белка.
ИССЛЕДОВАНИЕ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЧАСТИЦ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ
ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM МЕТОДОМ
ДИНАМИЧЕСКОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА
1
Усанов П.С. , Бурыгин Г.Л.2, Сигида Е.Н.2, Федоненко Ю.П.2, Хлебцов Б.Н.2,
Щеголев С.Ю.1,2
1
ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского;
2
ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,
Саратов, Россия
burygingl@gmail.com
Липополисахариды (ЛПС) являются основным классом молекул, формирующих внешний
слой наружной мембраны грамотрицательных бактерий. В целом молекулы ЛПС, называемые
также эндотоксинами, при попадании в организм животных и человека могут активировать
иммунную систему и вызывать развитие воспалительных реакций. В водных препаратах ЛПС
вследствие амфифильности макромолекул при определенных условиях могут возникать
мицеллоподобные надмолекулярные комплексы различного размера и структуры. Однако такие
комплексы ЛПС в водной среде, строение которых, так или иначе, определяет их
взаимодействия с различными объектами окружающей среды, в настоящее время исследованы
недостаточно.
Одним из информативных инструментов изучения надмолекулярной организации
биомакромолекул, позволяющий определять размер надмолекулярных комплексов и
распределение частиц по размерам, является метод динамического рассеяния света (ДРС).
Таким образом, представляет интерес исследование структуры водных систем ЛПС,
позволяющее судить об возможных фазовых превращениях и параметрах образуемых
надмолекулярных частиц (НМЧ), что и явилось целью данной работы, достигаемой с
применением метода ДРС.
В данной работе нами были исследованы температурные зависимости интенсивности
рассеяния, среднего размера и степени полидисперсности НМЧ в водных растворах ЛПС
бактерий рода Azospirillum. В диапазоне до +24 - 34°С (в зависимости от препарата ЛПС)
167
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
отмечено скачкообразное изменение интенсивности рассеяния на графиках ее зависимости от
температуры и значительная гетерогенность системы по размерам частиц. При достижении
температуры +24 - 34°С (и выше) для водных растворов ЛПС наблюдался существенно более
сглаженный характер этой зависимости и резкое снижение гетерогенности дисперсных систем
НМЧ, что делало возможным корректное определение размера методом ДРС. Для каждого
температурного интервала относительной стабильности оптических характеристик дисперсных
систем наиболее вероятный модальный гидродинамический диаметр НМЧ составил: 9.9 ± 0.7
нм (A. lipoferum Sp59b), 22.7 ± 0.7 нм (A. irakense KBC1), 25.0 ± 0.6 нм (A. halopraeferens Au4) и
31 ± 2 нм (A. brasilense Cd). Установлено, что для сравнительной оценки значений числовой и
массово-объемной концентраций НМЧ полимерного вещества во взвеси водных систем ЛПС
может быть использована теория рассеяния света в приближении оптически мягких релеевских
частиц при допущении, что при достижении определенных значений температуры в
исследованных системах образуются однослойные мицеллы, размер и концентрация которых
зависит от особенностей химического строения ЛПС.
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ В
РАЗЛИЧНЫХ ФРАКЦИЯХ СЫВОРОТКИ МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА
Фатеева С.Е., Леонова Л.Е.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
fateewasveta@yandex.ru
Грудное молоко – это комплекс из нескольких сотен различных компонентов. Сыворотка
молока содержит множество биологически активных веществ, основная функция которых
сформировать у новорожденного систему защиты от патогенных микроорганизмов. В
сыворотке присутствуют минеральные вещества, различные органические молекулы, углеводы,
белки и пептиды, в том числе и различные белковые антимикробные факторы, такие как
лизоцим, лактоферрин, α-лактальбумин, миелопероксидаза, лактопероксидаза, дефенсины и
некоторые другие. В исследованиях проведенных нами ранее было сделано предположение, что
антимикробные белки и пептиды в сыворотке молока присутствуют в виде комплексов. Исходя
из этого предположения, и была сформулирована цель: выявить наличие белковых комплексов
и межбелковые взаимодействия в сыворотке молока человека.
Для достижения поставленной цели необходимо провести фракционирование сыворотки
молока человека и получить различные по размерам и массам белки и пептиды в свободном
состоянии и в виде комплексов различной величины с помощью мембран с различным
размером пор.
Сыворотку зрелого молока человека получали с помощью центрифугирования при 25000 g.
Затем сыворотка была разделена на отдельные фракции методом ультрафильтрации на
мембранах: 1) более 100 кДа, 2) от 100 до 50 кДа, 3) от 50 до 30 кДа, 4) от 30 до 10 кДа, 5)
менее 10 кДа. Каждая полученная фракция была охарактеризована методом аналитического
электрофореза в денатурирующих условиях по молекулярной массе. Подвижность белков в
выделенных фракциях была показана методом аналитического электрофореза в кислой среде в
присутствии мочевины. Кроме этого, используя антимикробный тест против условно
патогенных штаммов грамположительной бактерии L.monocytogenos, грамотрицательной
бактерии E.coli и грибка C.albicans была определена антимикробная активность.
Для выявления белков из сыворотки молока, находящихся в комплексах с другими белками
и пептидами. Использовали два метода: 1) повышение ионной силы раствора до 2М NaCl; 2)
изменение рH раствора. Затем сыворотку, содержащую 2М NaCl, обессолили методом
ультрафильтрации и получили фракции с белками различной молекулярной массы. Наличие
лактоферрина, миелопероксидазы, лактопероксидазы и дефенсинов выявляли методом «дот»иммуноферментного анализа.
Показано, что белки и пептиды сыворотки молока обладают наибольшей антимикробной
активностью против L.monocytogenos и наименьшей против C.albicans.
168
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ НА МИТОХОНДРИИ ПЕЧЕНИ В
ПРИСУТСТВИИ И ОТСУТСТВИИ Са2+
Хорошавина Е.И., Дубинин М.В., Ведерников А.А., Шиляева А.В., Самарцев В.Н.
ФГБОУ ВПО Марийский государственный университет, Йошкар-Ола, Россия
Katya_bs@mail.ru
Известно, что накопление в клетках печени при холестазе токсичных, гидрофобных
желчных кислот (ЖелК), может служить причиной их гибели. Считается, что ЖелК могут
проявлять цитотоксичность путем влияния на митохондрии. Ранее установлено, что
длительный холестаз у крыс, вызванный перекрытием желчных протоков, приводит к
угнетению функций печени. Это сопровождается набуханием митохондрий, падением
мембранного потенциала (∆ψ), а также освобождением цитохрома с, что, как предполагается,
является следствием открытия неспецифической поры во внутренней мембране органелл.
Показано, что открытие такой поры, индуцированной ЖелК, усиливается в присутствии Ca2+ и
ингибируется циклоспорином А (ЦсА).
В настоящей работе изучено влияние ряда гидрофобных ЖелК: литохолевой (ЛХК),
дезоксихолевой (ДХК), ксенодезокисхолевой (КДХК), холевой (ХолК), а также гидрофильной
урсодезоксихолевой кислоты (УДХК)
на ЦсА-нечувствительную
Ca2+-зависимую
неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий печени крыс. Показано,
что все перечисленные ЖелК способны индуцировать Ca2+-зависимую неспецифическую
проницаемость митохондрий печени, что соответствует литературным данным. Индукция
такой проницаемости сопровождается набуханием органелл, падением ∆ψ, а также выходом
Ca2+ из матрикса митохондрий. Предварительно добавленный ЦсА лишь частично ингибирует
набухание органелл, но не предотвращает падение ∆ψ и выход Ca2+. Установлено, что в
условиях отсутствия Ca2+ в среде инкубации, добавление к митохондриям печени ЛХК, ДХК,
КДХК, являющихся наиболее гидрофобными из использованных нами ЖелК, приводит к
снижению ∆ψ и увеличению скорости потребления кислорода органеллами. Такое влияние
ЛХК, ДХК и КДХК связано с их способностью разобщать окислительное фосфорилирование в
митохондриях печени. Однако, снижение ∆ψ и активация дыхания митохондрий,
индуцированные этими ЖелК, являются обратимыми и далее сменяются практически полным
восстановлением ∆ψ и ингибированием потребления кислорода митохондриями. В отличие от
них, ХолК, являющаяся менее гидрофобной, а также гидрофильная УДХК, в тех же
концентрациях практически не влияют на ∆ψ и скорость дыхания митохондрий печени. Однако
при существенном увеличении их концентрации наблюдаются эффекты схожие с действием
гидрофобных ЖелК. Сделан вывод, что характер влияния ЖелК на энергетику митохондрий
печени в условиях их инкубации без Ca2+ зависит от гидрофильно-гидрофобного индекса этих
кислот.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (в рамках
государственного задания № 1365).
АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫХ ФЛАГЕЛЛИНОВ
ТИПОВЫХ ШТАММОВ A. BRASILENSE, A. HALOPRAEFERENS И A. IRAKENSE
Черний Ю.В., Беляков А.Е., Сигида Е.Н., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,
Саратов, Россия
chernij_yuliya@rambler.ru
Гликозилирование
флагеллина
бактериальных
жгутиков
редкий
процесс
посттрансляционной модификации прокариот, достаточно хорошо изученный для бактерий,
являющихся возбудителями инфекционных заболеваний человека и животных. Значительно
меньше подобных знаний для симбионтов растений, несмотря на то, что флагеллины с
углеводными фрагментами встречаются от фитопатогенов (Acidovorax, Agrobacterium) до
клубеньковых бактерий Rhizobium. Особое место в изучении структуры и свойств углеводных
фрагментов бактериальных флагеллинов занимают представители рода Azospirillum. Для
типового штамма Azospirillum brasilense Sp7 показано ковалентное связывание белка
169
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
флагеллина с полисахаридными цепями в отличие от моно- или олигосахаридного
гликозилирования этих белков других бактерий.
В данной работе показано присутствие углеводных фрагментов в составе флагеллинов
полярных жгутиков бактерий типовых штаммов других двух видов азоспирилл: Azospirillum
halopraeferens Au4 и Azospirillum irakense KBC1. Вестерн-блот позволил выявить
взаимодействие флагеллинов полярных жгутиков A. brasilense Sp7, A. halopraeferens Au4 и A.
irakense KBC1 с антителами к ЛПС этих штаммов, что свидетельствует о присутствии в Hантигене азоспирилл антигенных детерминант O-антигенов. В связи с тем, что перечисленные
виды бактерий по последовательности нуклеотидов в гене 16S рРНК находятся в разных
субкластерах группы Azospirillum-Skermanella-Rhodocista, выявленный нами феномен
антигенной близости углеводных фрагментов флагеллинов с ЛПС, скорее всего, является
признаком, свойственным всей группе микроорганизмов. Выдвинуто предположение, что
феномен гликозилирования флагеллина является родовым признаком бактерий рода
Azospirillum. Если для бактерий A. brasilense Sp7 антигенный перекрест связан с присутствием
общих углеводных фрагментов в составе флагеллина и ОПС, то для штаммов A. halopraeferens
Au4 и A. irakense KBC1 выяснение причин взаимодействия антител к ЛПС с их флагеллинами
требует дальнейших химических исследований. Методом газо-жидкостной хроматографии
ацетатов полиолов установлено, что углеводные фрагменты флагеллина полярного жгутика и
О-специфический полисахарид бактерий штамма A. irakense KBC1 имеют остатки рамнозы,
маннозы и галактозы в соотношении ~ 3:1:2.
Таким образом, выявленное нами гликозилирование флагеллинов полярных жгутиков
азоспирилл общими с ЛПС углеводными фрагментами, возможно, играет важную роль в
процессах формирования эффективного симбиоза этих бактерий с растениями.
АКТИВНОСТЬ КЛЮЧЕВЫХ ЭНЗИМОВ СИНТЕЗА И КОНЪЮГАЦИИ
ГЛУТАТИОНА В ГЕПАТОЦИТАХ КРЫС ПРИ
БЕЛКОВОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
Чопик Н.В., Борщовецкая Н.Л., Копыльчук Г.П., Бучковская И.М.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы, Украина
NataliaChopik@ukr.net
Глутатион (GSH) – важный компонент антиоксидантной системы организма,
предотвращающей токсическое действие активных форм кислорода и электрофильных
метаболитов, самостоятельно и как кофактор ряда ферментов выступает восстановителем
липопероксидов и перехватчиком свободных радикалов.
Целью работы было определение активности γ-глутамилцистеинсинтетазы и
глутатионтрансферазы как ключевых энзимов синтеза и конъюгации глутатиона в гепатоцитах
крыс при белковой недостаточности.
Результаты исследований показали, что в гепатоцитах животных, находящихся на
полусинтетической низкопротеиновой диете, на 28 сутки эксперимента наблюдается снижение
активности γ-глутамилцистеинсинтетазы в 1,3 раза по сравнению со значениями контроля.
Известно, что γ-глутамилцистеинсинтетаза катализирует первую АТР-зависимую стадию
синтеза глутатиона из цистеина. Эта стадия является лимитирующей, поскольку определяется
именно активностью данного фермента и наличием цистеина. Следует отметить, что
активность γ-глутамилцистеинсинтетазы регулируется содержанием глутатиона по типу
обратной связи, поэтому снижение ее активности автоматически приводит к уменьшению
количества этого трипептида в клетках.
Нами показано, что в гепатоцитах крыс при белковой недостаточности наблюдается
снижение уровня восстановленного глутатиона в 1,4 раза по сравнению со значениями
контрольной группы животных. Вероятно, в условиях белковой недостаточности снижение
уровня GSH в клетках печени крыс обусловлено не только снижением активности γглутамилцистеинсинтетазы, но и недостаточностью предшественников-аминокислот – в
первую очередь цистеина. С другой стороны, уменьшение содержания GSH в гепатоцитах при
белковой недостаточности может инициировать развитие оксидативного стресса, что
подтверждается одновременным снижением уровня глутатионтрансферазной активности в 9
170
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
раз по сравнению с контролем. Вероятно, данный факт приведет к нарушению процессов
детоксикации, поскольку глутатионтрансфераза выступает ключевым энзимом конъюгации
токсических эндогенных метаболитов.
Таким образом, белковая недостаточность сопровождается снижением активности
ключевых энзимов синтеза и конъюгации глутатиона в гепатоцитах крыс.
ПРОЦЕССЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И
АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ В ТКАНЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА, ПЕЧЕНИ
И СЕЛЕЗЕНКЕ КРЫС ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОМ РОСТЕ КАРЦИНОМЫ
ГЕРЕНА В УСЛОВИЯХ ПЕРОРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ
АНТИОКСИДАНТНОГО ПРЕПАРАТА
Чорненькая Н.Н.
УНЦ Институт биологии Киевского национального университета им. Тараса Шевченко,
Киев, Украина
raetska@ya.ru
Изучение биохимических механизмов злокачественного роста с выявлением возможных
подходов к его коррекции с помощью антиоксидантных препаратов составляет одно из
ведущих направлений комплексных онкологических исследований.
Поэтому, целью данной работы было воспроизвести экспериментальную модель
аденокарциномы (карцинома Герена) и исследовать процессы перекисного окисления липидов
(ПОЛ) и ферменты антиоксидантной системы в тканях органов крыс с карциномой Герена в
динамике ее роста при введении антиоксидантного препарата.
Объектом исследования было 130 белых лабораторных крыс-самок массой 180±20 г,
содержавшихся на стандартной диете вивария. Животным трансплантировали карциному
Герена путем подкожной инъекции в область бедра задней конечности 20%-ной суспензии
опухолевых клеток в 0,9%-ном растворе NaCI. Части животных ежедневно в течение 25 суток
после прививки опухоли вводили антиоксидантный препарат «Гринизация Грин R» в разных
дозах (115 мг/кг и 270 мг/кг). Животных декапитировали через 25 суток. Содержание белка в
гомогенатах определяли методом Гринберга. Содержание вторичных продуктов ПОЛ
оценивали в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) согласно (В.Н.Ореховича,1977).
Активность каталазы определяли согласно (Королюк М.А.,1988). Активность общей
супероксиддисмутазы (СОД) оценивали методом (Nishikimi M.,1972).
Отмечен рост содержания ТБК в печени, селезенке и мозге крыс при росте карциномы
Герена в 2-3 раза по сравнению с контролем. Введение препарата способствовало снижению
интенсивности ПОЛ в печени и селезенке крыс при применении высокой дозы препарата (270
мг/кг). Данные по активности СОД указывают на то, что рост злокачественных опухолей
сопровождался снижением активности данного фермента в 1,5-2 раза во всех исследуемых
органах крыс, по сравнению с интактными животными. Введение препарата в обеих
использованных дозах обусловливали незначительный рост активности СОД в тканях крыс с
карциномой по сравнению с контролем. Активность каталазы в печени, селезенке и мозге крыс
с карциномой Герена снижалась в 2-2,5 раза. Введение препарата в дозе 115 мг/кг приводит к
росту активности каталазы в 1,5-2 раза во всех исследуемых органах крыс. В дозе 270 мг/кг
препарат вызывает рост активности каталазы.
Итак, на основании проведенных исследований установлено, что злокачественный рост
приводит к изменениям значений ПОЛ. Нарушение интенсивности ПОЛ в результате
злокачественного роста сопровождалось изменениями активности ферментов антиоксидантной
системы. Показано, что введение антиоксидантного препарата способствует нормализации
процессов пероксидации.
171
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
ГЛУТАТИОН-S-ТРАНСФЕРАЗНАЯ И СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗНАЯ
АКТИВНОСТЬ В ПОСТМИКРОСОМАЛЬНОЙ ФРАКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС В
УСЛОВИЯХ РАЗНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ω-3 И ω-6
ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫМИ ЖИРНИМЫ КИСЛОТАМИ
Швед Х.М., Кеца О.В., Петрик О.А.
Черновицкий национальный университет им. Юрия Федьковича, Черновцы, Украина
hristina.shved@mail.ru
Омега-6 (ω-6) и омега-3 (ω-3) полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) являются
важными регуляторами ряда физиологических процессов в организме. Входя в состав
фосфолипидов всех клеточных мембран, они участвуют в передаче импульсов и работе
рецепторов, являются предшественниками эйкозаноидов. Оптимальное соотношение ω-6 и ω-3
ПНЖК в пищевом рационе должно составлять от 10:1 до 1:1. Насыщение организма ω-6 или ω3 ПНЖК может привести к усилению свободнорадикальных процессов и нарушению
функционирования прооксидантно-антиоксидантной системы, основными компонентами
которой являются глутатион-S-трансфераза (ГSТ) и супероксиддисмутаза (СОД).
Цель работы – определить ферментативную активность глутатион-S-трансферазы и
супероксиддисмутазы в постмикросомальной фракции печени крыс в условиях
дифференциального обеспечения ω-6 и ω-3 ПНЖК.
Результаты проведенных исследований показали, что в группы крыс, содержащих на
полусинтетической диете обогащенной ω-6 ПНЖК в течение шести недель ферментативная
активность ГSТ в 20 раз превышала показатели контрольной группы животных. В то же время
у крыс, получавших только ω-3 ПНЖК активность ГSТ превышала показатели контроля в 3
раза. Повышение активности ГSТ может быть следствием активации процессов
свободнорадикального окисления макромолекул в клетках, поскольку ГSТ активно использует
восстановленный глутатион для осуществления антиоксидантной функции – восстановления
органических пероксидов. Восьминедельное удержания крыс на диете обогащенной ω-6 ПНЖК
приводит к снижению ферментативной активности ГSТ, что может быть следствием
окислительной модификации энзима.
Анализ ферментативной активности СОД показал, что удержание животных в течение
шести недель на диете обогащенной ω-6 ПНЖК приводит к повышению ферментативной
активности СОД в 1,6 раза по сравнению с контролем, что может быть следствием генерации
супероксидного радикала, превращение которого в относительно менее активный пероксид
водорода и молекулярный кислород катализирует СОД. Подобная тенденция наблюдается и в
группы крыс, получавших рацион обогащенный ω-3 ПНЖК. На дальнейших этапах
эксперимента наблюдается понижение ферментативной активности СОД, вероятно, в
результате свободнорадикального окисления фермента.
Таким образом, удержание крыс в течение шести недель на рационе обогащенном ω-6
ПНЖК, приводит к повышению ферментативной активности ГSТ и СОД в
постмикросомальной фракции печени крыс по сравнению с контролем с последующим
понижением на восьмую неделю эксперимента.
ВЛИЯНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФОСФОЛИПИДА, ПРИРОДЫ РАСТВОРИТЕЛЯ
И ЭЛЕКТРОЛИТОВ НА ПРОЦЕССЫ АГРЕГАЦИИ ЛИПОСОМ
Шудрикова Д.А., Дворцова В., Чухно А.С.
ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия Министерства
здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
shudrikova.darya@mail.ru
В последнее десятилетие особое внимание уделяется конструированию лекарственных
средств на основе наночастиц, в частности, липосом. Микрокапсулирование лекарственных
препаратов в липосомах позволяет доставлять лекарственные средства в нужную точку
организма, позволяя уменьшать необходимую для терапевтического эффекта дозу препарата.
Существенными ограничивающими факторами при использовании липосомальных форм
является размер липосом, их способность в определенных условиях агрегироваться и
172
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «БИОХИМИЯ»
разрушаться. Используя различные условия синтеза липосом можно получать частицы с
различными размерами, монодисперсные или полидисперсные. На процессы агрегации
липосом влияют неорганические электролиты, входящие в состав крови. В состав крови входят
иона калия, натрия, магния, кальция, железа, карбонатные анионы и т.д.
Целью работы является изучение процессов агрегации липосом в водных растворах
электролитов и исследование взаимосвязи поверхностного натяжения водных дисперсий
липосом и размером липосом.
Синтез липосом осуществлялся диспергированием 5 мл раствора фосфолипида с различной
концентрацией в 45 мл дистиллированной воды. Растворы фосфолипидов с различной
концентрацией готовились из насыщенных растворы фосфолипида в различных растворителях
(в этиловом, изопропиловом спиртах и в четыреххлористом углероде) методом
последовательного разбавления. Концентрация насыщенных растворов определялась
аналитически. Липосомы получали с помощью ультразвукового диспергатора. Время
диспергирования составляло 5 и 10 минут. Размер липосом определяли методом исследования
спектров мутности дисперсий, основанным на законах светорассеяния Рэлея. Поверхностное
натяжение определяли методом отрыва кольца с помощью тензиометра Дю Нуи.
Изучение влияния электролитов на агрегацию липосом проводили методом титрования. В
качестве коагулирующих электролитов использовались водные растворы NaNO3, BaCl2, AlCl3,
Na2SO4, C6H5O7Na3. В ходе работы установлено, что размер липосом зависит от концентрации
фосфолипида в органическом растворителе и в водной дисперсии, от природы растворителя,
агрегация липосом под действием электролита увеличивается с ростом заряда ионов
электролита.
ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРИРОВАНИЯ ВОДНЫХ ДИСПЕРСИЙ
ЖЕЛАТИНА ВИСКОЗИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Эрдни-Гаряев С.Э., Чухно А.С.
ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия Министерства
здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
shaman-bazooka@rambler.ru
В настоящее время активно развиваются исследования процессов структурирования белков
в водных растворах. Актуальность таких исследований обусловлена все возрастающим
использованием лекарственных препаратов на основе водных дисперсий белков в медицине.
Особенно эффективны такие препараты, если они водятся в организм человека внутривенно в
виде капельниц или инъекций. Эффективность и возможность введения водных дисперсий
белков в организм человека внутривенно в большой степени определяется их реологическими
свойствами.
Цель настоящего исследования состояла в изучении влияния концентрации белка в водных
дисперсиях на их реологические свойства. В качестве объектов исследования был выбран
желатин. Водные растворы желатина готовились в диапазоне концентраций от 0,05 до 0,5 г на
100 мл раствора. Изучение реологических характеристик проводилось вискозиметрическим
методом с помощью вискозиметра Оствальда при варьировании концентрации белка, рН
дисперсионной среды и времени старения белковых растворов.
В работе установлено, что при концентрации желатина менее 0.01 г/100 мл водный раствор
желатина является ньютоновской жидкостью, то есть вязкость не зависит от давления и
жидкость начинает течь при сколь угодно малом давлении, а время течения прямо
пропорционально давлению. С ростом концентрации желатина вязкость возрастает, и её
величина зависит от давления. Раствор начинает течь при достижении предельного напряжения
сдвига, соответствующего усилию необходимому для частичного разрушения структуры,
мешающей течению. Величина предельного напряжения сдвига возрастает с ростом
концентрации желатины и при концентрации равной или более 0,5 г/100мл структурирование в
дисперсии настолько велико, что без её предварительного разрушения перемешиванием,
течение в вискозиметре не происходит. Наиболее сильное влияние концентрации желатина на
реологические свойства растворов наблюдается в области значений рН, близких к
изоэлектрическому состоянию белка.
173
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
СЕКЦИЯ «Математическая биология и биоинформатика»
ON A SOLUTION OF THE BIODIVERSITY PARADOX
Kalmykov L.V.1, Kalmykov V.L.2,3
1
Institute of Theoretical and Experimental Biophysics RAS; 2Institute of Cell Biophysics
RAS; 3Pushchino State Institute of Natural Sciences, Pushchino, Russia
lev.kalmykov@gmail.com
The competitive exclusion principle (also known as the Gause's Principle) postulates that
‘complete competitors cannot coexist’. This principle contradicts with the observed biodiversity. This
contradiction is known as the biodiversity paradox. Previously we proved that due to a soliton-like
behaviour of colliding population waves complete competitors can indefinitely coexist in one closed
homogeneous habitat on one and the same limiting resource under constant conditions of environment,
without any trade-offs and cooperations. This ‘soliton-like’ mechanism implements well-timed
regeneration of all essential resources and their optimal allocation among competitors. It was modeled
by the logical deterministic individual-based cellular automata. We formulated a system of logical
rules of transitions between the states of a cellular automata lattice site as axioms of population
dynamics. A two-dimensional hexagonal lattice is closed to a torus by periodic boundary conditions in
order to avoid boundary effects. Each site of the lattice simulates a microhabitat containing resources
for existence of one individual of any species. An individual can occupy only one microhabitat. A life
cycle of an individual lasts one iteration of the automaton. Individuals are immobile in lattice sites and
populations waves spread due to reproduction of individuals. Our mechanistic models of population
dynamics provide direct insight into mechanisms under study. All mechanisms of interspecies
competition under study are directly visible at all stages of population dynamics at micro-, mini(meso-) and macro-levels. Since the ‘soliton-like’ mechanism of coexistence violates the known
formulations of the competitive exclusion principle we were forced to reformulate the principle in
according with our results as follows: ‘If each and every individual of a less fit species in any attempt
to use any limiting resource always has a direct conflict of interest with an individual of a most fittest
species and always loses, then, all other things being equal for all individuals of the competing
species, these species cannot coexist indefinitely and the less fit species will be excluded from the
habitat in the long run’. According to this definition an implementation of competitive exclusion in
nature requires the too strict conditions. The stringency of this formulation of competitive exclusion
eliminates the contradictions between the principle and the observed biodiversity and thus the
biodiversity paradox is no longer exists.
МАТЕМАТИЧЕСКОЕ И ЧИСЛЕННОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ
МОЛЕКУЛЯРНОГО АВТОРЕПРЕССИЛЯТОРА
Акиньшин А.А.
ФГБУН Институт математики им. С.Л.Соболева СО РАН, Новосибирск, Россия
andrey.akinshin@gmail.com
Исследование посвящено изучению генных сетей – специальных комплексов
координировано функционирующих генов, обеспечивающих формирование различных
фенотипических признаков организмов. Реальные генные сети являются очень сложными и
большими объектами, проводить их полноценный анализ весьма затруднительно. В
определённых ситуациях при условиях постоянства внешней среды удаётся выделить
небольшие подсети, которые условно можно считать автономными, и описать поведение их
основных элементов динамической системой. Подробное изучение топологии построенной
математической модели является очень важной задачей, т.к. позволяет сформировать всё
множество возможных режимов функционирования исходной биологической системы.
В данной работе рассматривается молекулярный авторепрессилятор, который представляет
собой единственный генетический элемент, репрессирующий собственный синтез.
Концентрация соответствующего белка описывается динамической переменной x(t), скорость
изменения концентрации определяется дифференциальным уравнением с запаздывающим
174
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
аргументом x'(t) = f(x(t − τ)) − m·x(t), где f(x) выражена монотонно убывающей функцией и
описывает обратную отрицательную связь (в приложениях чаще всего представлена функцией
Хилла), m – константа скорости деградации вещества (в простейшем случае можно считать, что
деградация происходит по линейному закону).
Доказано, что рассматриваемая система обладает единственной стационарной точкой
(соответствующей гомеостазу молекулярной системы). Выведены условия существования
циклических траекторий в динамической системе (соответствующих осциллирующим режимам
функционирования авторепрессилятора), построена зависимость периода цикла от величины
запаздывания T(τ), описана общая топология системы.
Полученные результаты можно использовать при изучении биологических систем разного
уровня сложности, т.к. авторепрессирующие генетические элементы являются достаточно
распространённым явлением в составе генных сетей высоких размерностей. Доказан ряд
теорем,
позволяющих
отобразить
осциллирующие
траектории
молекулярного
авторепрессилятора в траектории циклических симметричных систем, базирующихся на
функциях Хилловского типа.
На основе полученной математической теории разработан программный комплекс
PhasePortraitAnalyzer, позволяющий конструировать, моделировать и изучать режимы
функционирования описанного класса биологических систем. Численные методы расчётов
реализованы на языке R с использованием пакета deSolve.
SARP – АЛГОРИТМ ДЛЯ ПОИСКА УЧАСТКОВ С ИЗМЕНЕННЫМ
СОДЕРЖАНИЕМ АМИНОКИСЛОТ В БЕЛКОВЫХ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ
Антонец К.С., Нижников А.А.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет; СанктПетербургский филиал Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН,
Санкт-Петербург, Россия
kirantonez@gmail.com
Современные успехи в области полногеномного секвенирования сформировали острую
потребность в высокоэффективных методах аннотирования последовательностей. Важным
этапом аннотирования является не только поиск последовательностей, кодирующих белки и
регуляторные участки, но и выявление внутри белковых последовательностей участков,
отличающихся от остальных по частотам встречаемости (композиции) аминокислот. Эти
участки часто связаны с выполнением белком определенных функций, а также их важно
учитывать при определении филогении белковых последовательностей. Параметром, удобным
для выявления таких участков, является вероятность случайного возникновения
последовательности при известных частотах аминокислот в среднем в протеоме. Чем сильнее
композиция аминокислот на участке последовательности отличается от композиции всего
протеома, тем ниже вероятность возникновения такой последовательности. Именно поэтому
один из известных и широко используемых способов поиска участков с композиционными
отличиями состоит в нахождении последовательностей с наименьшей вероятностью (ПНВ).
Вместе с тем, его очевидными недостатками являются большие вычислительные затраты и
квадратичная зависимость времени вычисления от длины последовательности.
Мы предложили свой оригинальный вариант поиска ПНВ, названный SARP (Sequence
Analysis based on the Ranking of Probabilities) и не использующий метод перебора [Antonets and
Nizhnikov, Evol. Bioinform., 2013, V.9 P.263–273]. Суть SARP состоит в том, что он
осуществляет поиск коротких подпоследовательностей, которые должны включаться в ПНВ, и
дальнейшее расширение этих участков для определения точных границ ПНВ. На каждом
последующем шаге происходит добавление к подпоследовательности одной аминокислоты,
поочередно, с начала и с конца. Из возможных вариантов подпоследовательностей (с
добавлением одной аминокислоты с начала, с конца или с обеих сторон
подпоследовательности) выбирается наименее вероятная (то есть наиболее обогащенная какойлибо аминокислотой (или группой аминокислот). В результате достигается крайне
значительное, до 230 раз, снижение затрат по времени на поиск ПНВ, в сравнении с
175
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
алгоритмами, опубликованными другими авторами. Разработанный нами алгоритм SARP
может быть применен для решения широкого круга задач. В частности, он позволяет
осуществлять поиск ПНВ сразу для большого количества белков или групп протеомов, что
важно при сравнении эволюции композиционно-аномальных участков и создании веб-сервисов
для поиска ПНВ.
МОДЕЛИРОВАНИЕ ПЕРЕКЛЮЧЕНИЯ ПОЛЯРИЗАЦИИ В ТОНКИХ
ПЛЕНКАХ НА НАНОУРОВНЕ
1
Геворкян В.Е. , Парамонова Е.В.2, Авакян Л.А.1, Быстров В.С.2
1
ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону;
2
ФГБУН Институт математических проблем биологии РАН, Пущино, Россия
v.geworkian@yandex.ru
Cегнетоэлектрические тонкие плёнки Ленгмюра–Блоджетт (ЛБ), основанные на
сополимерах поливинилиденфториде (ПВДФ) и поли(винилиденфторид-трифторэтилене)
(П(ВДФ-ТрФЭ)), демонстрируют явление переключения поляризации на наноуровне с
локальным переключением сегнетоэлектрической поляризации.
Для корректного определения механизмов поляризации (или формирования избыточного
поверхностного электрического заряда) и способов управления ими необходимо иметь
правильную и соответствующую молекулярную модель механизмов физических процессов,
происходящих в поверхностных слоях образца. С этой целью в данной работе было выполнено
детальное компьютерное моделирование и последовательное изучение молекулярных моделей
структуры ПВДФ. Моделирование проводилось с использованием программного пакета
HyperChem 8.0. Мы исследовали дипольный момент и поляризацию ПВДФ влияние
приложенного электрического поля на структуру моделей молекулярных цепей различной
длины и в различных конформациях. При проведении моделирования и расчетов в данной
работе были использованы различные вычислительные методы, включая квантово-химические
расчеты, основанные на полуэмпирических методах (Parameterization Method 3: PM3). На
первом этапе был рассмотрен минимальный структурный блок, содержащий основной
молекулярный мотив ПВДФ-сополимера …–CH2–CF2–… шесть раз. Полученные значения
величин (дипольный момент для цепочки из 6 элементов 13.96 Д и для цепочки из 10 элементов
20.94 Д) близки к рассчитанным другими авторами в разных подходах.
ВНУТРЕННИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ШАЙНА–ДАЛЬГАРНО У
ПРОКАРИОТ
Гаранина И.А.
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова,
Москва, Россия
irinagaranina24@gmail.com
В процессе инициации трансляции бактерий и архей малая субъединица рибосомы
связывается с последовательностью Шайна–Дальгарно (ШД) в 5'-некодирующей области гена.
Внутри генов есть последовательности похожие на последовательности ШД, с которыми так же
возможно связывание рибосомы, что может вызывать нежелательные трансляционные паузы.
Во время трансляции рибосомы накапливаются в районах, имеющих большое сродство к антиШайна–Дальгарно (антиШД) последовательности. Целью данной работы было исследовать
частоту и силу отбора против таких последовательностей в геномах прокариот.
Гексануклеотиды типа GGNGGN и NGGNGG имеют набольшее сродство к
последовательности анти-ШД. Мы показали корреляцию между их частотой в геномах и
минимальной свободной энергией гибридизации с последовательностью анти-ШД. Эта
зависимость показывает насколько сильна недопредставленность гексануклеотидов с высоким
сродством к рРНК. Среди исследованных 247 полных геномов бактерий и архей сила
зависимости φ варьировала в пределах от 0.94 до −0.3, причем 83% микроорганизмов имеют
φ>0.5. Для того, чтобы выяснить, с чем может быть связан такой разброс, мы проанализировали
176
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
различные свойства бактериальных геномов: размер, ГЦ-состав, количество генов, средний
размер генов, важность генов для конкретной бактерии. φ положительно коррелирует с
размером генома и ГЦ составом. Одной из причин этого могут быть перекрывающиеся гены,
доля которых в геноме увеличивается с уменьшением размера генома. Обычно, перекрывание
генов небольшое – 1 или 4 нуклеотида, поэтому при перекрывания последовательности ШД,
ответственные за инициацию трансляции, могут находиться внутри предыдущего гена. Было
показано уменьшение φ у перекрывающихся генов, особенно ближе к концу гена.
Частота внутригенных ШД может влиять на скорость трансляции и процесс сворачивания
белков, это гипотеза подтверждается тем, что у генов длиной меньше определенного порога
частоты таких последовательностей повышаются по сравнению с более длинными генами. В
важных генах, которые не теряются у близкородственных штаммов данной бактерии и поэтому,
скорее всего, являются необходимыми для ее жизнедеятельности, недопредставленность
гексануклеотидов с высоким сродством к рРНК выражена сильнее, чем в остальных генах, как
и отбор против этих последовательностей.
Таким образом, наша работа показывает важность взаимодействия рРНК с внутригенными
последовательностями ШД и как оно устроено в разных геномах и генах.
МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МАЛЫХ ПЕПТИДОВ НА СТАБИЛЬНОСТЬ
БЕТА-СТРУКТУР
Кадочников В.В., Швецов А.В., Егоров В.В.
ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова,
Гатчина, Россия
vlkadochnikov@gmail.com
Образование амилоидных агрегатов сопутствует целой группе болезней, называемых
амилоидозами, которые характеризуются конформационными изменениями белков.
Примерами могут служить болезнь Альцгеймера, Паркинсона, прионные заболевания.
Понимание механизмов образования фибрилл и префибриллярных олигомеров играет важную
роль для нахождения ингибиторов этого процесса. В качестве модельного объекта был выбран
участок альфа-лактальбумина человека (35–51 а.о. – WT), для которого ранее было показана
склонность к образованию амилоидоподобных бета-структур и агрегации.
Было проведено молекулярно-динамическое (МД) моделирование мономеров WT в водном
боксе. Мы предположили, что терминальные участки GYDT (L) и TEYG (R) могут влиять на
конформационную стабильность WT. Для проверки этой гипотезы к модели мономера были
добавлены тетрапептиды R и L и получены траектории МД длиной 100 нс смеси, которые
использовались для анализа.
Из анализа полученных данных можно сделать предположение, что тетрапептиды
стабилизируют бета-структуры, за счет которых происходит олигомеризация WT. Таким
образом, было показано, что короткие пептиды могут выступать в качестве инициаторов
фибриллогенеза.
ИССЛЕДОВАНИЕ ОТВЕРЖДЕНИЯ РЯДА ОЛИГОМЕРНЫХ СМОЛ МЕТОДОМ
МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ
Косарев А.В., Коваленко Д.О.
ФГБОУ ВПО Саратовский государственный технический университет
им. Гагарина Ю.А., Саратов, Россия
aleteia@inbox.ru
Отверждение олигомерных смол является одним из процессов, играющих важную роль в
химической технологии полимеров. По механизму отверждения происходит формование
полимерных материалов на основе термореактопластов, при формовании изделий из
реактопластов, процессы склеивания, герметизации и формирования лаковых пленок.
Нами разработаны математические модели, характеризующие отверждение смол ЭД-20,
СФ-342A, ПН-15. Найдены соотношения для объемов глобулярной фазы отвержденных смол
177
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
как функция молекулярных параметров отверждающейся системы (молекулярного объема,
функциональности), определены объемные доли отвержденной фазы. Моделирование процесса
отверждения реализовывалось в рамках глобулярного подхода к формированию структуры
сетчатого полимера. Общий алгоритм моделирования включал в себя следующие стадии:
составление кинетической схемы отверждения; выбор фрагмента молекулярной структуры,
отвечающего слою отверждения, нахождения объема формирующейся глобулярной фазы как
функции числа ее слоев; нахождение изменения объема полимерной фазы из кинетических
данных процесса отверждения, определение максимального количества слоев глобулярной
системы в точке гелеобразования, определение степени конверсии олигомерной смолы в
сетчатый продукт. При этом при рассмотрении отверждения смолы ЭД-20 учитывалось, что
этот процесс протекает по механизму поликонденсации с отвердителем ПЭПА, для смолы СФ342А – по механизму поликонденсации без отвердителя, для смолы ПН-15 – по
свободнорадикальному механизму в присутствии стирола
Модель позволяет прогнозировать изменение технологических параметров отверждения до
точки гелеобразования и актуальна для решения задач химической технологии и полимерного
материаловедения.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКА SURFACTANT В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО
КОМПОНЕНТА ГИБРИДНЫХ МАТЕРИАЛОВ С
ЛУБРИКАТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ
Липницкая С.А.
ФГАОУ ВПО Волгоградский государственный университет, Волгоград, Россия
lipnitskaya.sofya@gmail.com
Ключевым компонентом нанопленки синовиальной жидкости суставного хряща является
белок PRG4, синтез которого в условиях нормального функционирования сустава результирует
на амортизирующую, лубрикативную и смазывающую способность синовиальной оболочки,
преимущественно, за счет физико-химических характеристик. У поверхностно-активного
вещества в гиалиновом хряще показатель коэффициента трения мал (по сравнению с другими
биоматериалами) и колеблется в пределах от 0,005 до 0,02, что обусловливает минимизацию
трения суставных поверхностей, а значит, и износа.
Было выдвинуто предположение, согласно которому белки сурфактанта (SP), которые
легко могут быть получены при бронхоальвеолярном лаваже, обладают достаточно высоким
сходством с белком PRG4. Целью работы было обосновать возможность и целесообразность
использования изоформ сурфактанта (SP-А и SP-D), для того, чтобы рассматривать его в
качестве потенциального лубриканта в гибридных биоматериалах технологического и
медицинского назначения.
Обоснование гипотезы: при обзоре литературы найдены основные функции SP-А и SP-D,
характеризующие эти коллектины, как подходящие компоненты для лубриканта.
В результате биоинформационного анализа последовательностей определены значимые
структурные сходства в мотивах белков семейства PRG4 и SP и отобраны наиболее
гомологичные изоформы белка сурфактанта. Актуальность их использования в качестве
лубриканта в гибридных биоматериалах технологического и медицинского назначения
очевидна, как и очевиден широкий спектр их применения: от биотехнологических производств
и до восстановительной хирургии суставов. Например, технический результат при
культивировании клеток-продуцентов может состоять в повышении износостойкости
(уменьшение трения, снижение температуры) оборудования (сокращение издержек из-за
повреждения биоматериала) и сохранении клеточных популяций в биореакторах после
внесения гибридной смазки на основе сурфактанта на его рабочие поверхности перед
эксплуатацией.
178
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
НЕЙРОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОШИБОК В МОТИВАЦИОННОМ КОНТЕКСТЕ
У ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ
Лыжко Е.В.1, Молиадзе В.2, Махортых С.А.1, Синячкин М.2
1
ФГБУН Институт математических проблем биологии РАН, Пущино, Россия; 2Клиника
детско-юношеской психиатрии университета имени Гете,
Франкфурт-на-Майне, Германия
lyzko@yandex.ru
Более глубокое понимание нейронных систем, основанных на импульсном управлении,
имеет большое значение для психиатрии. Особый интерес в этой области представляет собой
изучение реакций торможения, основанное на исследовании нейронной архитектуры,
управляющей двигательной реакцией. Так как реакции торможения, происходящие в моторной
коре, могут носить мотивационный характер, то для изучения реакций торможения был
использован тест «Go/NoGo» для двух испытаний (без мотивации и с мотивацией). Тест
представлял собой набор цифр от 1 до 9, появляющихся в случайном порядке. При появлении
всех цифр кроме цифры 5 испытуемый должен нажимать на кнопку. Для обеих групп
эксперимент длился 30 минут и состоял из 10 блоков. Для первой группы испытуемых между
блоками появлялось слово «Pause», для второй – появлялась информация о количестве
правильных ответов. По окончанию второй группы эксперимента испытуемый получал
денежное вознаграждение согласно заработанным баллам. Эксперимент проводился с
одновременной записью ЭЭГ и МЕГ данных. Обработка данных проводилась с использованием
программного обеспечения FieldTrip. После предобработки данные были разделены на три
группы испытаний: правильное нажатие кнопки, неправильное нажатие и правильное
ненажатие. Затем был проведен частотно-временной анализ данных в частотном диапазоне от 3
до 30 Гц. Для двух групп испытаний: правильное и неправильное нажатие (испытания
формировались относительно нажатия кнопки) был проведен статистический анализ мощности
частоты с использованием кластерного метода для 15 испытуемых. Статистический анализ
показал наиболее выраженные значимые различия частотной мощности после нажатия кнопки
в области моторной и зрительной коры. В области моторной коры наблюдалось большее
значение мощности в альфа-диапазоне частот в интервале от 0 до 200 мс и тета-диапазоне – от
0 до 400 мс для испытаний с неправильным нажатием. Для этих же испытаний в области
зрительной коры наблюдалось меньшее значение мощности в альфа-диапазоне частот в
интервале от 200 до 600 мс. В испытаниях с мотивацией в центральной области коры
наблюдалось меньшее значение мощности в альфа-диапазоне частот в интервале от 100 до
150 мс, относительно испытаний осуществляемых без мотивации. При сравнении двух других
групп: правильное ненажатие и неправильное нажатие (испытания формировались
относительно появления стимула) статистический анализ показал большее значение мощности
в альфа-диапазоне частот в области зрительной коры в интервале от 0 до 300 мс.
ПОИСК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ АТФАЗ P-ТИПА В ТРАНСКРИПТОМЕ
DUNALIELLA TERTIOLECTA
1
Маталин Д.А. , Шувалов А.В.1, Беляев Д.В.1, Юрченко А.А.2, Попова Л.Г.1
1
ФГБУН Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Москва; 2ФГБОУ
ВПО Санкт-Петербургский государственный университет, Центр геномной
биоинформатики им. Ф.Г.Добржанского, Санкт-Петербург, Россия
dmatalin@mail.ru
АТФазы Р-типа представляют собой обширную группу интегральных мембранных белков,
которые имеются у всех живых организмов и выполняют различные функции связанные,
прежде всего с активным транспортом веществ через мембрану, ионным гомеостатированием и
энергизацией биологических мембран. Используя энергию гидролиза АТФ, они переносят
через мембраны протоны и катионы одно- и двухвалентных металлов (Na+, K+, Ca2+, ионов
тяжелых металлов), а также фосфолипиды.
179
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
Dunaliella – род галотолерантных морских микроводорослей, обитающих в средах с
высоким содержанием NaCl (морская вода, соленые озера). Известно, что в ионном
гомеостатировании цитоплазмы этих водорослей участвуют АТФазы Р-типа. В частности, в
плазматической мембране морской микроводоросли Dunaliella maritima функционально
идентифицированы H+-АТФаза и Na+-АТФаза Р-типа. Функционирование Na+-АТФазы в этой
водоросли обеспечивает ее высокую солеустойчивость, выводя избыток ионов Na+ из
цитоплазмы в наружную среду против градиента электрохимического потенциала. Ген Na+АТФазы D. maritima пока не был клонирован. В этой водоросли, очевидно, могут
присутствовать и другие ион-транслоцирующие АТФазы P-типа для экспорта присутствующих
в морской воде токсичных ионов.
Мы собрали и проанализировали аннотированный в базе данных Sequence Read Archive
(SRX 047443) транскриптом микроводоросли Dunaliella tertiolecta. Риды были отфильтрованы
по качеству и длине в программе FastQC, а затем собраны в контиги длиной 201–14338
нуклеотидов в программе Trinity. Поиск последовательностей, кодирующих Na+-АТФазы, в
файле с контигами осуществлялся с помощью программы tblastx. Для поиска использовали
консенсусы, полученные при выравнивании известных АТФаз Р-типа различных организмов,
прежде всего зеленых водоро слей. Выравнивания были сделаны по 3 группам АТФаз Р-типа:
(1) H+-АТФазы, (2) Ca+-АТФазы и (3) катион-транслоцирующие АТФазы (прежде всего
немногочисленные известные Na+-АТФазы).
Было обнаружено 15 контигов длиной от 961 до 5241 нуклеотидов, большинство из
которых соответствуют размерам, близким размерам кодирующих последовательностей
АТФаз. Анализ этих последовательностей в tblastx выявил среди них несколько групп по
схожести с известными АТФазами P-типа: (1) H+-АТФазы, (2) Ca+-АТФазы, (3) медьтранслоцирующие АТФазы, (4) АТФазы, транслоцирующие ионы тяжелых металлов, (5)
катион-транслоцирующие АТФазы и (6) фосфолипид-транслоцирующие АТФазы.
Работа поддержана РФФИ, грант № 13−04−01098.
МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ АУКСИНА НА
ФОРМИРОВАНИЕ СОСУДИСТОГО ПАТТЕРНА КОРНЯ РАСТЕНИЯ
Новоселова Е.С., Миронова В.В., Омельянчук Н.А., Казанцев Ф.В., Лихошвай В.А.
ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
novoselova@bionet.nsc.ru
Сосудистая система корней растений разных видов обладает определенным паттерном –
взаимным расположением определенного количества флоэмных и ксилемных элементов в
центральном цилиндре корня. Экспериментально было показано, что ауксин является
ключевым регулятором дифференцировки клеток прокамбия по ксилемному и флоэмному
пути. Неравномерно распределяясь в тканях корня, ауксин действует как морфоген и
направление дифференцировки клетки задается локальной клеточной концентрацией ауксина
[Aloni, 2011]. Экспрессия белков транспортеров ауксина PIN и AUX регулируется его
концентрацией [Vieten et al., 2005]. Однако точные механизмы влияния ауксина на
организацию сосудистой системы корня до сих пор остаются недостаточно изученными.
В данной работе представлена 2D модель, описывающая распределение ауксина в клетках,
имитирующих клеточный слой поперечного среза сосудистой системы корня. Процессы
синтеза белков транспортеров ауксина и маркеров дифференцировки, диффузии и активного
транспорта ауксина между клетками, процессы деградации/диссипации белков и ауксина
описаны на основе закона действующих масс и в терминах обобщенных функций Хилла
[Likhoshvai, Ratushny, 2007, Mironova et al., 2010, Mironova et al., 2012]. Сборка модели
осуществлена средствами модуля MGSModeller. Численные эксперименты и визуализация
результатов расчетов проводились в пакете Matlab. Подобраны значения параметров, при
которых рассчитанный паттерн распределения ауксина и его белков транспортеров
соответствует разным типам организации сосудистых систем корня. С помощью модели
проверен ряд гипотез о возможных ключевых факторах влияния ауксина на организацию
сосудистой системы корня и выдвинуто предположение, что интенсивность поступления
ауксина из побега в клетки сосудистой системы и регуляция ауксином синтеза транспортеров
180
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
ауксина являются морфогенетическими факторами, обеспечивающими формирование
различных типов сосудистой системы корня.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект 13−01−00344), Программ Президиума
РАН «Молекулярная и клеточная биология» (проект 6.6) и СО РАН (интеграционный проект
№80) и бюджетного проекта (VI.61.1.2).
ПРОГРАММА ДЛЯ РАСЧЕТА АНИЗОТРОПИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И
ВИЗУАЛИЗАЦИИ МИКРОВЯЗКОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ПО
ДАННЫМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ
Баранов С.И.1, Нурминский Г.Н.2, Нурминский В.Н.2,3
1
ФГБОУ ВПО Иркутский государственный университет путей сообщения;
2
Национальный исследовательский Иркутский государственный технический
университет; 3ФГБУН Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН,
Иркутск, Россия
vadyanurm@mail.ru
Одним из способов оценки микровязкости биологических мембран является использование
флуоресцентных зондов в спектроскопии или микроскопии. При этом об изменении
микровязкости липидов в мембранах судят по параметрам флуоресценции липофильных зондов
(например, ДФГ, ТМА-ДФГ, лаурдан и др.), включенных в липидный бислой изолированных
мембран. В случае использования зонда лаурдан определяют величину генерализованной
поляризации (GP). Лаурдан реагирует сдвигом флуоресценции с 440 нм до 490 нм, если
молекула зонда окружена молекулами воды, что характерно для жидко-кристаллической фазы
липидов, в отличие от более плотноупакованной гелевой фазы. Таким образом, по значениям
GP лаурдана можно составить представление о микровязкости мембраны в гидрофильногидрофобной области липидного бислоя. В случае использования зондов АНС, ДФГ, ТМАДФГ измеряют их вращательную подвижность внутри липидной фазы мембран по поляризации
флуоресценции. Для этого измеряют величину анизотропии флуоресценции зонда.
При использовании конфокальной микроскопии в исследовании микровязкости мембран
возникают сложности, связанные обработкой большого массива данных, получаемых от
конфокального микроскопа. Данные представляют собой изображения, отражающие
информацию об интенсивности флуоресценции или файл данных с информацией о количестве
испускаемых в результате флуоресценции фотонов в каждом пикселе изображения.
Данный программный продукт предназначен для автоматизации расчетов биофизических
параметров при исследовании микровязкости биологических мембран с помощью
флуоресцентной микроскопии.
Он позволяет выполнять следующее:
Загрузить полученные на микроскопе данные о флуоресценции мембранного препарата и
отобразить их как изображения для каждого канала.
Сохранить полученные изображения.
Выбрать необходимые участки для анализа на изображении мембранного препарата.
Проанализировать полученные данные.
Построить гистограмму распределения значений исследуемого параметра (GP или
анизотропия).
В ходе разработки была решена проблема с отображением исследуемых данных. Перед
обработкой данных производится сведение двух каналов по средству выбора максимального
значения в каждой точке по минимальному пределу. Анализ включает в себя расчет значений
GP или анизотропии флуоресценции мембранного зонда по данным лазерной сканирующей
микроскопии. Программа существенно ускоряет обработку данных флуоресцентной
микроскопии при изучении микровязкости мембран.
181
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
ИНТЕРНЕТ-РЕСУРС ДЛЯ АППРОКСИМАЦИИ ЭНЦЕФАЛОГРАММ
Оплачко Е.С., Рыкунов С.Д., Устинин М.Н.
ФГБУН Институт математических проблем биологии РАН, Пущино, Россия
oplachkoe@gmail.com
Разработана система для анализа данных энцефалографии, в данный момент доступны
возможности построения высокоточного разложения в ряды Фурье полных спектров,
разложения в ряды Фурье скользящим окном и восстановления временных рядов по заранее
рассчитанному спектру. Исполнение в виде веб-приложения даёт возможность использовать
систему без установки дополнительного программного обеспечения и не требует от
пользователя наличия значительных вычислительных мощностей. Организация системы в виде
веб-приложения позволяет снизить порог вхождения для использования кластера, так как не
требует от пользователя специфических навыков работы с кластерным программным
обеспечением.
Интернет-ресурс состоит из четырех функциональных блоков: пользовательского вебинтерфейса, системы хранения, системы управления вычислительными ресурсами и набора
расчетных программ. Веб-интерфейс написан на языке PHP и служит для загрузки входных
данных, задания параметров расчета, визуализации и скачивания результатов. Система
хранения представляет собой связку из скриптов на языках Python и PHP и базы MySQL, в
которой хранятся ссылки на файлы данных, формализованные описания энцефалографических
экспериментов, основные параметры расчетов и визуализации полученных спектров. Система
управления ресурсами состоит из набора программ, написанных на языке Python с
использованием библиотеки SAGA, и менеджера ресурсов SLURM. Использование такой
связки предоставляет возможности создания очереди вычислительных заданий, распределения
ресурсов между пользователями системы и, при необходимости, легкого расширения
вычислительной мощности системы путём добавления в неё дополнительных вычислительных
узлов или использования сторонних вычислительных мощностей, например, существующего
кластера. Использование библиотеки SAGA позволяет взаимодействовать с такими системами
управления очередями, как PBS, TORQUE, SGE (Sun/Oracle Grid Engine), SLURM и LSF, также
имеется механизм для взаимодействия с Amazon EC2. Расчетные программы написаны на
языке Python с использованием библиотек numpy, scipy и numexpr. Такое сочетание библиотек
позволяет быстро разрабатывать и внедрять новые расчетные методы, и манипулировать
данными в формате Matlab. Для визуализации используется библиотека Matplotlib.
Работа выполняется при поддержке РФФИ, проекты 13-07-12183, 13-07-00162, 14-0731309.
ЭВОЛЮЦИОННО НОВЫЕ ГЕНЫ: ГДЕ НАЧИНАЕТСЯ ЭКСПРЕССИЯ?
Полев Д.Е.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
dmitrii.polev@spbu.ru
При изучении процессов возникновения генов de novo, т.е. на основе бессмысленных
участков ДНК, особый интерес представляют процессы раннего становления генов, такие как
формирование активного промотора и зарождение функции. В литературе высказывались
предположения, что для тестирования и отладки функций новых генов есть некие
специализированные органы, например семенники. Альтернативная гипотеза предполагает, что
формирующиеся гены испытываются во всех органах и тканях. Данная работа направлена на
решение вопроса о том, используют ли многоклеточные животные, на примере приматов,
специализированные органы для апробации новых генов.
Для биоинформатического анализа из литературы был взят список из 270 белоккодирующих генов, специфичных для приматов. Из них отбирали гены с актуальным
идентификатором в базе данных Ensembl, наличием в первом экзоне уникальных участков,
достаточных для идентификации по коротким фрагментам кДНК, и с отсутствием
перекрывания первого экзона с экзонами других генов. Таких генов было выявлено 34.
182
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
Экспрессию генов выявляли по наличию специфических фрагментов кДНК в транскриптомных
базах данных с использованием алгоритма BLAST. В качестве запроса использовалась
последовательность ДНК соответствующего вида, ортологичная последовательности первого
экзона гена человека. Подготовка баз данных осуществлялась с помощью пакетов SRA Toolkit
и BLAST. В настоящий момент проанализированы транскриптомы мозга, мозжечка, сердца,
печени, почки и яичка от человека, шимпанзе (P. paniscus, P. troglodytes), гориллы (G. gorilla) и
макаки (M. mulatta).
При существовании специализированного органа для испытания генов ожидали увидеть
значительное преобладание случаев, в которых экспрессия эволюционно молодого гена
наблюдается только в одном органе, но значительно меньше случаев, в которых экспрессия
гена наблюдается хотя бы в одном другом органе, но не наблюдается в этом органе. Было
выявлено, что яичко действительно наиболее часто встречается в первой группе и наименее
часто – во второй, однако не является уникальным органом в этом плане. Учитывая неполную
представленность органов в анализе, полученные данные свидетельствуют об отсутствии
специализированного органа эволюции генов, но согласуются с тем, что в быстро
эволюционирующих органах, таких как яичко и мозг, экспрессируется больше новых генов.
Работа выполняется при поддержке гранта Президента Российской Федерации для
государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук (грант №
МК−1152.2013.4).
БЫСТРОЕ РАСПОЗНАВАНИЕ ПРОТЯЖЕННЫХ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ
ФРАГМЕНТОВ В НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ
Пятков М.И., Панкратов А.Н.
ФГБУН Институт математических проблем биологии РАН, Пущино, Россия
mpyatkov@gmail.com
ДНК эукариотов более чем наполовину состоит из повторяющихся последовательностей,
большая часть из которых является некодирующими. Выявление повторяющихся структур, их
классификация и исследование возможной роли в геноме является одним из приоритетных
направлений биоинформатики. При этом значимость подобных структур обуславливается тем,
что они используются как маркеры при филогенетических и эволюционных исследованиях, а
также тесно связаны с крупными геномными перестройками. Однако поскольку ДНК
постоянно подвергается мутационным процессам, возникает сложность определения подобных
повторяющихся фрагментов, что напрямую связано с тем, что копии повторов становятся
неточными. Для решения задачи поиска неточных повторов предложено множество подходов,
каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Одним из наиболее
распространенных недостатков является сложность определения протяженных повторов,
вследствие того, что большинство алгоритмических подходов базируется на методах
локального и глобального выравнивания нуклеотидной последовательности дискретными
методами.
Для решения задачи поиска протяженных повторов нами предлагается метод, который
базируется на аппарате аналитической аппроксимации сигналов с помощью классических
ортогональных базисов. Предлагается использовать аппроксимирующие возможности рядов
Фурье посредством анализа функций, получаемых из нуклеотидной последовательности,
например таких как GC-состав. Также было показано, что алгоритмы спектрального анализа в
основе которых используются ортогональные разложения могут быть эффективно
распараллелены для современных компьютерных архитектур.
Эффективность разработанного подхода можно оценить воспользовавшись разработанной
программой SBARS (https://github.com/mpyatkov/sbars), которая предназначена для анализа
нуклеотидные последовательности на разных масштабах, представляя результаты в виде
точечной матрицы.
Работа поддержана проектами РФФИ №14−07−31306, №14−07−00924.
183
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
ИССЛЕДОВАНИЕ ТОПОЛОГИИ ГИДРАТНЫХ ОБОЛОЧЕК БЕЛКОВ С
ПОМОЩЬЮ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ
Рубцова Е.В.
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова,
Москва, Россия
ev.rubcova@physics.msu.ru
Большинство белов активны только в присутствии достаточного количества воды.
Молекулы воды и водородные связи – значимые структурные компоненты в различных
биомакромолекулярных системах, таких как мембраны, фибриллярные и глобулярные белки.
Топология водных оболочек белков важна для понимания многих процессов, протекающих в
живых клетках.
Анализ поверхностей белков, для которых известна кристаллическая структура,
показывает, что существует первая гидратная оболочка, средняя плотность которой отличается
от плотности объёмной воды на 10%. Этот факт даёт основания предполагать, что вода вблизи
поверхностей белков обладает нехарактерными (для объёмной воды) геометрическими и
топологическими свойствами. Задача определения топологии гидратной оболочки требует
разумного сочетания использования численных методов (методов минимизации, с помощью
которой система приходит в ненапряжённое состояние, методов интегрирования уравнений
движения, которые используются в молекулярной динамике) и параметров физических
составляющих процесса: силового потенциала, типа модели воды, их совместной
непротиворечивости, параметров минимизации и динамики.
В работе изучались фибриллярные и глобулярные белки, для моделирования
использовалась модель воды TIP3P, силовое поле CHARMM, были рассмотрены конкретные
примеры водных оболочек белков. Мы представили сеть водородных связей в виде графа,
вершинами которого являются кислороды, рёбрами – водородные связи между
соответствующими молекулами. Затем находили значения различных инвариантов (диаметр
графа, индекс Винера и т.д.) для проверки изоморфизмов графов различных белков. Нас также
интересовало нахождение циклов в графе, так как модель Бульёнкова предлагает в качестве
структурного элемента твист-ванну, состоящую из 6 вершин.
Показано, что в гидратных оболочках могут существовать структуры, соответствующие
параметрической модели связанной воды Бульёнкова с большой степенью точности. Были
изучены различные статистические характеристики: распределение плоских углов O–O–O,
торсионных углов О–О–О–О, распределение циклов с различным количеством вершин.
Показано, что сеть водородных связей гидратных оболочек некоторых белков могут быть
представлены в виде сети гексациклов, так как 95% молекул воды входят в состав хотя бы
одного гексацикла, дано объяснение функции распределения торсионных углов О–О–О–О,
были найдены почти идеальные твист-ванны, приведены значения инвариантов графов
гидратных оболочек, проведено сравнение свойств воды в гидратной оболочке и объёмной
воды.
РАСПОЗНАВАНИЕ И АНАЛИЗ УСТОЙЧИВОСТИ СТРУКТУРНЫХ МОТИВОВ
ТИПА α–α УГОЛОК В ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКАХ
1
Руднев В.Р. , Панкратов А.Н.1, Куликова Л.И.1, Тихонов Д.А.1, Дедус Ф.Ф.1,
Ефимов А.В.2
1
ФГБУН Институт математических проблем биологии РАН;
2
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
volodyarv@mail.ru
Определение пространственной структуры белка является актуальной и трудоемкой
задачей. Ни один из множества разработанных теоретических методов предсказания
пространственной структуры белков, вторичных и супервторичных структур не является
совершенным и абсолютно надежным. Это связано с тем, что прогнозирование вторичной
структуры белка (α и β структур) по первичной структуре является некорректно поставленной
задачей, поскольку вторичная структура зависит от третичной структуры.
184
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
В представленной работе предложен комбинированный подход к решению задачи
теоретического предсказания пространственной структуры супервторичных структур на
примере структурного мотива типа α–α уголок.
В ходе исследований были достигнуты следующие результаты:
Разработаны методы анализа и распознавания α-α уголков в глобулярных белках на основе
спектрально-аналитического метода. С помощью разработанных методов получена
представительная выборка α–α уголков в базе данных PDB, соответствующих заданному
эталону 1D1L Cα: 15−37. Выявлены характерные признаки α–α уголков в аминокислотных
последовательностях, что позволяет осуществлять распознавание α–α уголков в первичных
структурах белковых молекул, опираясь так же на эти признаки.
Так же, в рамках данной работы была выдвинута, и проведена проверка гипотезы об
автономной устойчивости α–α уголков в водной среде. Под автономной устойчивостью в
данном случае понимается устойчивость пространственной структуры исследуемого
структурного мотива, отдельно от белковой молекулы, в которой данная структура была
обнаружена.
Обнаруженное свойство автономной устойчивости позволит проводить верификацию
предсказанных α–α уголков методом молекулярной динамики. При относительно небольшой
величине супервторичных структур, молекулярно-динамический расчёт осуществляется
довольно быстро.
ДВИЖЕНИЕ КИНКА ДНК ПОД ДЕЙСТВИЕМ СЛУЧАЙНОЙ СИЛЫ
Рясик А.А., Гриневич А.А., Якушевич Л.В.
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
arc7an@gmail.com
Рассматривается модель, описывающая вращательные колебания азотистых оснований
ДНК в плоскости, ортогональной оси молекулы. Для описания движения кинка используется
модификация
уравнения
синус-Гордона,
учитывающая
неоднородность
ДНК
(последовательность оснований), влияние диссипации и действие случайной внешней силы.
Уравнение решалось численно с помощью метода конечно-разностных схем. Были
рассчитаны траектории движения кинка в двух разных последовательностях:
1) в искусственной последовательности, состоящей из четырех однородных областей
polyA, polyT, polyC и polyG;
2) в последовательности плазмиды pTTQ18, которая содержит четыре функциональнозначимые области (промотор, терминатор и 2 кодирующие области) и четыре некодирующих
участка. Всего восемь областей.
Во втором случае для выполнения расчета мы «разрезали» последовательность оснований
таким образом, чтобы левый конец соответствовал промотору, а правый – некодирующему
участку. Усреднив коэффициенты модельного уравнения по областям, мы получили 8 наборов
коэффициентов. Граничные и начальные условия были заданы таким образом, чтобы кинк
начинал движение в области промотора и двигался по направлению к терминатору.
Результаты расчета представлены в виде траекторий движения кинка на плоскости (t, z).
Показано, что поведение кинка, распространяющегося вдоль молекулы ДНК под влиянием
трения и случайной силы, отличается от его поведения в случае, когда диссипация
присутствует, а случайная сила нет. Это отличие заключается в том, что кинк не
останавливается, как это происходи при учете только диссипативных сил, а продолжает
движение, совершая случайные блуждания возле положения покоя. В случае, когда положение
покоя находится в области, в которой потенциальная энергия кинка выше, чем в соседней
области, и расстояние до разделяющей их границы невелико, то в результате случайных
блужданий кинк может перейти в область с наименьшей потенциальной энергией, а
вероятность такого перехода зависит от этого расстояния.
185
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
ЭВОЛЮЦИЯ ТОКСИНОВ ПАУКОВ
Сачкова М.Ю., Гришин Е.В., Василевский А.А.
ФГБУН Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН, Москва, Россия
sachkovamasha@mail.ru
В процессе эволюции живые организмы приобретают приспособления, позволяющие им
занимать разнообразные экологические ниши. Выработка яда позволила паукам стать
успешными охотниками за насекомыми. Большинство представителей отряда Araneae
«остановили свой выбор» на пептидных токсинах, причем каждый яд является сложной смесью
нескольких групп гомологичных токсинов, так называемой комбинаторной библиотекой. Как и
для многих других ядовитых животных, наиболее вероятным механизмом возникновения
такого разнообразия токсинов являются множественные дупликации генов, которые
впоследствии подвергаются ускоренной эволюции и дивергируют.
Мы провели анализ библиотек кДНК из ядовитых желез двух видов пауков –
Cheiracanthium punctorium и Oxyopes takobius. У каждого из них зрелые последовательности
токсинов образуют несколько структурных групп. У O. takobius это линейные цитолитические
пептиды, нейротоксины с пространственной укладкой цистинового узла (ноттины),
содержащие 3, 4 или 5 дисульфидов, а также химерные двудоменные токсины, «составленные»
из линейного и ноттинового доменов. У C. punctorium это одно- и двудоменные ноттины,
содержащие 4 и 8 дисульфидных связей, соответственно.
С помощью сравнения количества синонимичных и несинонимичных нуклеотидных замен
в генах, кодирующих каждую из групп токсинов, мы проверили, подвергаются ли они
ускоренной эволюции. Удивительно, но оказалось, что совсем не для всех групп токсинов
характерно это явление. Для многих групп свойственен негативный отбор, удаляющий
большинство несинонимичных нуклеотидных замен в кодирующих их генах. У обоих видов
диверсифицирующему отбору подвержены только однодоменные ноттины, причем у
O. takobius только те, которые содержат 3 дисульфидные связи. Таким образом, у
рассмотренных пауков некоторые группы токсинов активно дивергируют, в то время как
другие более консервативны. По-видимому, механизмы эволюции токсинов пауков отличаются
от тех, что мы наблюдаем среди токсинов других ядовитых животных.
Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»,
РФФИ и стипендией Президента РФ.
ДРОБНО-УСТОЙЧИВАЯ СТАТИСТИКА В БИОИНФОРМАТИКЕ
Сибатов Р.Т., Саенко Ю.В.
ФГБОУ ВПО Ульяновский государственный университет, Ульяновск, Россия
ren_sib@bk.ru
В работе делается обзор о применении дробно-устойчивых распределений в
биоинформатике и молекулярной биологии. Дробно-устойчивые законы являются
предельными для сумм независимых, одинаково распределенных случайных величин. Гауссов
закон единственный из этого семейства обладает конечной дисперсией. Остальные законы
характеризуются «тяжелыми» степенными хвостами. Одно из приложений связано со
статистической обработкой данных ДНК-микрочипов с целью фильтрации дифференциально
экспрессирующих генов и оценки корреляций между профилями экспрессии.
В работе анализируются данные по радиационно-индуцированной динамике экспрессии
генов в клетках K562, Me45 и HCT116, полученные с помощью микроматриц Affymetrix серии
HGU133А. Проведено сравнительное изучение динамики изменения экспрессии генов
ключевых сигнальных путей связанных с программируемой клеточной смертью и репарацией
ДНК в раковых клетках с нормальным и мутантным геном ТР53. Другое приложение –
описание аномальной диффузии регуляторного белка в процессе поиска специфического сайта
с учетом трехмерного блуждания, сплайсинга вдоль молекулы ДНК, и межсегментных
перескоков.
186
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
Получено дробно-дифференциальное уравнение переноса, на основе которого
рассчитываются распределения темпов нахождения «мишени» регуляторным белком.
Стратегия поиска Леви оказывается более эффективной по сравнению с броуновским
движением вдоль молекулы ДНК. Результаты сравниваются с экспериментальными данными
для процесса поиска рестриктазой EcoRV, которые были получены с помощью технологии
оптического пинцета. Также в работе рассматривается применение статистики Леви в вопросе
биологической интерпретации фрактальной природы ДНК, интерпретируемой как
дальнодействующие корреляции в нуклеотидных последовательностях.
МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОМЕЖУТОЧНОГО ВЕТВЛЕНИЯ
В НЕЙРОННЫХ СЕТЯХ
Сулейманов Я.А., Гафаров Ф.М., Хуснутдинов Н.Р.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
yaniscom@mail.ru
Разработана математическая модель, для описания и исследования ветвления аксона в
нейронных сетях во время развития нервной системы. В данной работе представлена модель,
которая описывает рост нейронной сети, принимающей во внимание ветвящийся процесс
аксонов.
Модель основана на следующих экспериментальных данных и гипотезах: развитие
нейронных связей зависит от активности нейронов; направление движения конуса роста аксона
управляется диффундирующими химическими веществами AGM (молекулы управления
аксоном); интенсивность роста аксона зависит от активности нейрона; ветвление аксона
зависимый от активности процесс; аксональные ветвления управляются химическими
веществами; деполяризация заставляет нейроны выпускать молекулы управления аксонами;
тип возможного соединения определяется постсинаптическим образом во время
синаптогенезиса.
Для определения концентрации AGM используется уравнение диффузии с источником,
зависящего от времени. Источником является нейрон. Активизация или изменение активности
нейронов осуществляется двумя способами. Первый способ происходит путем стимуляции
нейрона внешним источником, например сигналы, полученные из зрительной, обонятельной и
осязательной системы. Во втором способе активность нейрона (предсинаптический нейрон)
может измениться влиянием другого нейрона (постсинаптический нейрон) в результате
образования связи между этими нейронами. Предсинаптический нейрон в зависимости от типа
связи может подавлять либо увеличивать активность постсинаптического нейрона. Модель
была реализована в компьютерной программе.
Смоделировано ветвление аксона с промежуточным образованием ветви из оси аксона. В
численном моделировании были созданы условия схожие с условиями экспериментов с
биологическими нейронами, когда применялись различные виды веществ (TTX, DNQX или
APV/DNQX), подавляющие активность нейрона. Бралось одинаковое количество нейронов с
различной активностью для каждого численного эксперимента, и наблюдали за ростом
нейронной сети. Из численных экспериментов получили нейронные сети с различным числом
связей между нейронами и различным числом ветвей. В результаты число образованных ветвей
при различных значениях активности нейронов совпадают с результатами экспериментов с
биологическими нейронами, когда были применены различные вещества. Так же из численных
экспериментов сделаны выводы, что процесс ветвления зависит от концентрации AGM вокруг
наконечника аксона и в точке ветвления.
Предложенная модель позволяет моделировать развитие нейронных сетей, которое может
происходить в биологических нейронных сетях.
187
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
СОВМЕСТНЫЙ АНАЛИЗ НАБОРА МОДЕЛЕЙ ПОПУЛЯЦИИ ЛЕММИНГОВ
Тращеев Р.В.1, Саранча Д.А.2
1
ФГБУН Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино;
2
ФГБУН Вычислительный центр им. А.А.Дородницына РАН, Москва, Россия
tslav85@mail.ru
При построении модели «растительность-лемминги-песцы» (РЛП) предложен метод
комплексных исследований, который включает в себя всю последовательность операций и
направлен на создание набора взаимосвязанных математических моделей. Центральное место в
наборе моделей занимает упрощенная модель в виде разностного уравнения (РУ),
связывающего численности леммингов Ln в двух соседних годах.
Анализ РУ позволил обосновать гипотезу: ведущее значение в формировании колебаний
численности леммингов имеют три показателя – скорость прироста биомассы в благоприятный
год, максимальная численность и выживаемость в наиболее неблагоприятных условиях (или же
два безразмерных показателя: P – относительная скорость прироста популяции и d – доля
гарантированно выживших зверьков).
Исследование РУ показало, что при сценарии изменения параметра d от 1 до 0
последовательно возникают зоны стабильности с устойчивыми циклами. Внутри зоны
стабильности период циклов постоянный, при переходе от одной зоны к другой период
изменяется в последовательности натурального ряда (1, 2, 3, 4, …). Зоны стабильности
отделены друг от друга переходными зонами с более сложными режимами. Наличие
переходных зон находится в некотором соответствии с зарегистрированной динамикой
реальных популяций. При отсутствии четкого трехлетнего цикла, характерного для Таймыра, в
более теплых регионах встречаются двух и пятилетние временные интервалы между пиками
численности.
Анализ имитационной модели РЛП показал, что в ней так же возникают описанные зоны.
Полученное разностное уравнение может служить простым инструментарием для прогноза
возможной численности леммингов (и песцов). Для оценки же, влияния сложных воздействий,
например, последствий антропогенных показателей, необходимо использовать детальную
модель.
Получены формулы, связывающие РУ с исходной имитационной моделью РЛП. С
помощью РУ, используя формулы пересчета, удалось произвести параметрический анализ
имитационной модели РЛП и определить зависимость периода цикла от биологически
значимых параметров имитационной модели «растительность-лемминги-песцы».
Проведены оценки параметров РУ по имеющимся данным динамики численности
леммингов на Таймыре и проведено сопоставление реальных данных и результатов
вычислительных экспериментов с моделью в виде РУ.
О МОДИФИКАЦИИ ПРОСТОГО МЕТОДА ПОИСКА ГЕНОТИПОВ
АССОЦИИРОВАННЫХ С ДОЛГОЛЕТИЕМ
Федоров Д.А.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
iilhj@yandex.ru
Метод описанный в тезисах 17-й конференции, обычно не приводит к статистически
значимым результатам, к тому же он требует наличия по крайней мере двух выборок: лиц
старшего возраста, и новорожденных; при этом он не использует информацию об изменении
частот генотипов исследуемого гена у лиц старшего возраста при проведении процедуры
последовательного удаления из выборки лиц моложе определённого возраста, даже, если в
выборке лиц старше 69 лет в наличии лишь два генотипа, что случается достаточно часто, т.к.
редкие генотипы в выборке лиц старше 69 лет, обычно отсутствуют, особенно у мужчин.
Нижеследующая процедура позволяет устранить выявленные недостатки метода.
Итак, пусть в группе лиц старше определённого возраста (для определённости 69 лет) по
анализируемому минисателлиту в наличии лишь два генотипа. Определяем их частоты. Затем
188
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
исключаем из выборки лиц моложе 70 лет и определяем частоты генотипов для лиц 70 лет и
старше. И так далее пока частота одного из генотипов не станет равной 1. Увеличение частоты
этого генотипа при проведении процедуры последовательного удаления из выборки лиц
моложе определённого возраста будет преобладающим направлением изменений. Будем
считать сдвиги в преобладающем направлении «типичными». Затем следует исключить из
рассмотрения те возрасты, в которые частоты генотипов не меняются, а количество оставшихся
«нетипичных» сдвигов будем считать эмпирическим значением G-критерия знаков. Пример.
О.С. Глотов исследовал три группы. В первой 47 новорожденных мальчиков. Во второй 58
мужчин в возрасте 20−50 лет без более точного указания их возраста. В третьей 28 мужчин
старше 69 лет. При этом частота генотипа 5./5 по NOS34b/4a (двуаллельному из 4(4a) и 5(4b)
тандемных повторов) у мужчин Северо-запада России с возрастом не уменьшается: у
новорожденных эта частота равна 58%, у мужчин возраста от 20 до 50 лет 67%, у мужчин
возраста 69 лет и старше 71%, у мужчин возраста 70 лет и старше 74%, у мужчин возрасте 71 и
старше 78%, у мужчин возраста 73 лет и старше 82%, 74 лет и старше 86%, 75 лет – 91%, и для
8 мужчин 76 лет и старше – 1. Используя критерий знаков, учитывая, что частота 5./5 год от
года растёт, начиная от новорожденных, мужчин от 20 до 50 лет и далее от 69 и старше до 76
лет и старше (когда она становиться равной 1) и только от 71 и старше до 72 лет и старше
уменьшается на 1% в связи с тем, что количество лиц с каждым из генотипов уменьшается на 1
человек, получим, что долголетие мужчин с генотипом 5./5 по сравнению с мужчинами с
генотипом 4./5 статистически значимо различается (р=0.01) (генотип 4./4 в Третьей группе
отсутствовал).
СИСТЕМНАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ ПРОТЕОМНОГО АНАЛИЗА
КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ NEISSERIA GONORRHOEAE
Хлебус Э.Ю.1,2, Алтухов И.А.1,2, Малахова М.В.1, Побегуц О.В.1, Ильина Е.Н.1,
Алексеев Д.Г.1,2
1
ФГБУН Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА,
Москва; 2ФГАОУ ВПО Московский физико-технический институт (государственный
университет), Долгопрудный, Россия
elkhlebus@gmail.com
Протеомное тестирование с последующей биоинформатической обработкой данных –
движущая сила современной биологической науки, в том числе системной биологии прокариот.
Целью нашего исследования был системный анализ данных протеомного профилирования
штаммов N. gonorrhoeae с целью обнаружения новых молекулярных механизмов
лекарственной устойчивости.
В работе были исследованы три штамма вида N. gonorrhoeae, проявляющие разные
фенотипические свойства, а именно: клинический изолят i19.05 (донор), проявляющий
устойчивость к пенициллину; чувствительный к пенициллину клинический изолят n01.08
(реципиент); и NG03(SurAmut, Omp85mut) – штамм, полученный в ходе трансформации клеток
реципиента n01.08 фрагментами геномной ДНК донора i19.05. Штамм-трансформант, в
отличие от реципиентного штамма, проявлял сниженную восприимчивость к пенициллину.
Для трех изучаемых штаммов в трех биологических повторах проведен массспектрометрический LC-MS/MS анализ, осуществлена идентификация пептидов с помощью
программного пакета Mascot v2.2.07. После этого проводился безметочный количественный
протеомный анализ с использованием программного пакета Progenesis LC-MS (Nonlinear
Dynamics). С помощью этой программы было квантифицировано 986 белков. Для
статистического анализа использовался язык программирования R. Сравнительный
количественный анализ был проведен с использованием t-теста Стьюдента, каждому белку для
трех сравнений был поставлен в соответствие p-value. По результатам проведенных расчетов
было отобрано 122 белка, достоверно различающихся по количеству между штаммами.
Полученные результаты помогут дать ответ в изучении механизмов устойчивости гонококка на
системном уровне.
189
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
ПОСТРОЕНИЕ И ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВОКСЕЛЬНОЙ МОДЕЛИ
ДВУХКЛЕТОЧНОГО ЭМБРИОНА МЫШИ
Шаба Л.Н., Филиппов С.В.
ФГБУН Институт математических проблем биологии РАН, Пущино, Россия
sni.86@mail.ru
Целью работы является визуализация клетки, посредством построения ее воксельной
модели по оптическим сечениям.
Серия из 37 снимков, представляющих собой оптические сечения (полученные на
конфокальном микроскопе Leica TCS SPE с шагом 2 мкм и разрешением 512×512)
двухклеточного эмбриона мыши, криофиксированного методом сверхбыстрой заморозки с
последующей низкотемпературной дегидратацией в вакууме и заключенного в оптически
прозрачную заливочную среду на основе эпоксидной смолы Эпон-812, были любезно
предоставлены д.б.н., проф. Погореловым А.Г.
Выбранный экспериментаторами метод получения вышеназванных данных был
обусловлен необходимостью сохранения прижизненного объема и формы эмбриональной
клетки. Следствием использования данной методики стала оптическая прозрачность препарата
двухклеточного эмбриона мыши и, как итог, – низкая контрастность изображения.
Такой характер исходных данных потребовал создания методики повышения их контраста,
шумоподавления, отсечение оптических плотностей, соответствующих заливочной среде.
Эти операции проводились в динамическом графическом редакторе Photo-Reactor,
посредством построения конвейера обработки изображений, состоящего из модулей: Invert,
Levels, Noise Reduction, Hard Clip. Оставшиеся единичные шумы и оптические артефакты
вокруг клетки были удалены вручную.
Для визуализации, воксельная модель, представленная в виде набора графических файлов,
была загружена в Blender 2.69 в форме трехмерной текстуры. Псевдоокрашивание 3D-текстуры
выполнялось с помощью встроенной в 3D-редактор передаточной функции (Ramp). Воксельная
модель формировалась из 3D-текстуры через каналы плотности и цвета свечения.
ПОИСК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ХЛОРИДНЫХ КАНАЛОВ И
ТРАНСПОРТЕРОВ СЕМЕЙСТВА CLC В ТРАНСКРИПТОМЕ DUNALIELLA
TERTIOLECTA
1
1
Шувалов А.В. , Беляев Д.В. , Юрченко А.А.3, Шувалова Е.Ю.2, Маталин Д.А.1,
Балнокин Ю.В.1
1
ФГБУН Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Москва;
2
ФГАОУ ВПО Волгоградский государственный университет, Институт приоритетных
технологий, Волгоград; 3ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный
университет, Центр геномной биоинформатики им. Ф.Г.Добржанского,
Санкт-Петербург, Россия
laursen1243@mail.ru
Белки семейства CLC (ChLoride Channel) широко распространены в живой природе и
найдены во всех царствах живых. Свое название, CLC, семейство получило в честь потенциалзависимого хлоридного канала электрического ската Torpedo marmorata (CLC-0), который был
первым клонированным CLC.
У эукариот известные Сl−/H+-антипортеры локализованы в мембранах внутриклеточных
органелл, тогда как у прокариот – в плазматической мембране. В животных клетках Сl−/H+антипортеры осуществляют Сl−/H+-обмен между цитозолем и внутриклеточными
компартменами, у бактерий – между цитозолем и наружной средой. Сl−/H+-обмен
сопровождается деполяризацией мембран, что ускоряет работу локализованных в них H+АТФаз. Вовлечение Сl−/H+-антипортеров в регуляцию активности H+-АТФаз играет важную
физиологическую роль. Стимуляция H+-АТФаз у эукариот усиливает закисление некоторых
внутриклеточных компартментов. У бактерий участие Сl−/H+-антипортера в поддержании
высокой активности H+-АТФаз связывают с обитанием в кислой среде, когда клетки
190
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА»
экспортируют H+ наружу, против его градиента электрохимического потенциала большей
величины.
Анализ
филогенетических
связей
CLC
путем
сравнения
аминокислотных
последовательностей показывает деление на группы, включающие CLC эукариотических и
прокариотических организмов. Локализованные в клеточных эндомембранах CLC Arabidopsis
thaliana (AtCLCa-d, g) относится к эукариотической ветви, а локализованные в хлоропластах
AtCLCe и AtCLCf обнаруживают родство с бактериальными CLC.
Мы собрали и проанализировали аннотированный в базе данных Sequence Read Archive
(SRX 047443) транскриптом микроводоросли Dunaliella tertiolecta. Риды были отфильтрованы
по качеству и длине в программе FastQC, а затем собраны в контиги длиной 201–14338
нуклеотидов в программе Trinity. Поиск последовательностей, кодирующих CLC, в файле с
контигами осуществлялся с помощью программы tblastx.
В транскриптоме было обнаружено 15 контигов, длинной от 474 до 2952 нуклеотидов,
отвечающих последовательностям CLC. При анализе в tblastx последовательности разделились
на несколько групп, в каждой из которых имеются контиги длиной, близкой предполагаемой
длине генов CLC. К первой группе относятся контиги схожие c CLC растений эукариотической
ветви. Во второй группе находятся контиги, схожие с растительными CLC, локализованными в
хлоропластах. В третьей группе оказались последовательности, схожие с CLC (CLC6 и CLC7)
животных (в первую очередь рыб и рептилий).
Работа поддержана РФФИ, грант № 13−04−01098.
191
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
СЕКЦИЯ «Микробиология и вирусология»
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА L-ТРАНСФОРМАЦИИ S.TYPHIMURIUM
ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
Арсенюк А.Ю.1, Павлова И.Б.1, Игнатьев П.С.2
1
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии,
гигиены и экологии РАСХН; 2ООО «Лаборатории АМФОРА», Москва, Россия
aarsenuk@gmail.com
Разработана оригинальная методика определения стабильности L-форм патогенных
бактерий на примере популяции Salmonella typhimurium с применением метода сканирующей
электронной (СЭМ), а также лазерной интерференционной (МИМ) микроскопии. Процесс Lтрансформации исследовали после воздействия абиотического (тетрациклин) и биотического
(биологически активные вещества, продуцируемые Bacillus subtilis) факторов.
Выявлены закономерные морфологические признаки L-форм, способных реверсировать в
исходное состояние. С появлением методов оптической микроскопии, обладающих
сверхразрешением, стало доступно изучение процесса L-трансформации в режиме реального
времени на живых бактериях (без фиксации и окрашивания). Полученные на лазерном
интерференционном микроскопе МИМ-321 трехмерные фазовые портреты позволили не только
однозначно идентифицировать L-формы бактерий, но и выявить отличия в морфологии
стабильных и нестабильных (способных к реверсии) L-форм.
METHYLOPILA TURKIENSIS SP. NOV. – НОВЫЙ АЭРОБНЫЙ
МЕТИЛОТРОФНЫЙ ФИТОСИМБИОНТ
Агафонова Н.В.1, Капаруллина Е.Н.2
1
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт;
2
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
lady_dragona@mail.ru
Метанол является природным метаболитом растений и источником углерода и энергии для
аэробных метилобактерий. Показано, что в филлосфере многих растений доминируют
розовоокрашенные метилобактерии, снабжающие растения различными биоактивными
соединениями. Из филлосферы Bougainvillea sp. L. на среде с метанолом выделен бесцветный
штамм Side1, отнесенный к новому виду рода Methylopila. Большинство представителей этого
рода ранее были выделены из активного ила.
Цель работы – физиолого-биохимическая и таксономическая характеристика нового
аэробного метилотрофного фитосимбионта - штамм Side1 и анализ его влияния на морфогенез
растений.
Штамм Side1 – грамотрицательный факультативный метилотроф, реализующий ицлсериновый путь С1-метаболизма. На основании секвенирования генов 16S рРНК, mxaF и mauA
имеет уровень сходства 97,0-98,0%, 96,0-97,0% и 97,0-98,0%, соответственно, с
представителями рода Methylopila, а уровень ДНК-ДНК гомологии с ними не превышает 37%.
Хемотаксономический и MALDI-TOF/MS анализы подтверждают новый видовой статус
исследуемого штамма.
Обнаружена способность штамма Side1 синтезировать фитогормоны – ауксины (4-5
мкг/мл). Показано, что новый изолят способен к синтезу сидерофоров, специфически
связывающих ионы железа, что может ограничивать рост фитопатогенов. Кроме того, штамм
Side1 солюбилизирует нерастворимый Ca3(PO4)2 с образованием в культуральной жидкости до
167,3 мкг/л растворенного фосфора.
В опытах по инокуляции клетками нового штамма стерильных семян гороха (Pisum
sativum) выявлено, что к 10 суткам высота стебля и масса филлосферы колонизованных
метилобактериями (опытных) растений превышала показатели контрольных (стерильных) в 2-3
раза. Также отмечено увеличение массы и количества боковых корней (2-4х) в опыте по
192
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
сравнению с контролем. Колонизованные штаммом Side1 растения картофеля (Solánum
tuberósum) отличались от неколонизованных (45 сутки) значительным увеличением в высоте
стебля (1,5-1,7х), количестве листьев (1,5-1,7х) и длине корневой системы (1,7-2,6х). При этом
масса зеленой части опытных растений была в 3, а корневой системы – в 5.5 раз больше в
сравнении с неколонизованными растениями.
Таким образом, штамм Side1, выделенный из Bougainvillea sp. L., методами полифазной
таксономии, включая секвенирование генов 16S рРНК, mxaF, mauA и ДНК-ДНК
гибридизацию, MALDI-TOF/MS анализ, идентифицирован как новый вид – Methylopila
turkiensis sp. nov. Установлено, что новый аэробный метилотрофный фитосимбионт оказывает
положительное влияние на морфогенез растений и может быть использован в препаратахстимуляторах роста растений.
СТРУКТУРНО-МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РИЗОБАКТЕРИЙ
CUCURBITA PEPO L.
Артамонова М.Н.
ФГБОУ ВПО Ульяновский государственный университет, Ульяновск, Россия
artamonovamn2013@yandex.ru
Одним из наиболее общих интегральных показателей структурно-функционального
состояния бактерий и их мембран являются структурно-механические свойства, изучение
которых стало возможным благодаря использованию атомно-силовой микроскопии. Упругость
и вязкость являются фундаментальными механическими свойствами микроорганизмов,
определяющими их функциональность. Известно, что структурные трансформации в мембране
приводят к изменению её упругости с последующей деформацией клетки.
Целью работы явилось изучение упруго-механических свойств ризобактерий тыквы
обыкновенной (Cucurbita pepo L.) на основе определения модуля упругости при атомносиловой микроскопии.
В работе было изучено 24 штамма бактерий, выделенных из ризосферы Cucurbita pepo L.
Упруго-механические свойства ризобактерий изучали в стационарной фазе роста (10-18 ч
культивирования) при различных температурных показателях: +50°С (1 группа), 0°С (2
группа), -50°С (3 группа). Исследования проводили с использованием сканирующего зондового
микроскопа Solver P47-PRO (NT-MDT, Россия) при помощи зондов с золотым напылением
серии NSG10 (NT-MDT, Россия) размером 95х30 мкм, с жесткостью балки 17 Н/м, радиусом
закругления иглы 10 нм. Анализ морфометрических показателей полученных изображений
проводили с использованием штатного программного обеспечения микроскопа Debug Nova
1.1.0.1847.
Исследования показали, что структурно-механические свойства ризобактерий изменялись в
зависимости от температуры их культивирования. Бактериальные клетки 1 группы оказывались
менее упругими по сравнению с ризобактериями 2 и 3 группы. Показатели модуля упругости
ризобактерий 1 группы составил 3,6±0,1 Мпа, 2 группы – 5,1±0,7 Мпа, 3 группы – 6,0±1,1 Мпа.
Динамика адгезивной активности оказалась обратно пропорциональной изменению
температурного фактора. Сила адгезии бактерий 1 группы составила 544,0±59,8 нН. При
снижением температуры адгезивное взаимодействие достоверно увеличивалось, и во 2 и 3
группах сила адгезии составила 2250,8±51,3 нН.
Таким образом, установлено, что снижение температуры в процессе культивирования
влияет на структурно-механические и морфологические свойства ризобактерий. Показатель
упругости изменялся обратно пропорционально относительно температуры. Снижение
температуры сопровождалось повышением показателей силы адгезии.
193
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЛОКУСЫ РАЗВИТИЯ ДРОЖЖЕЙ НА РАСТЕНИЯХ
ХЛОПЧАТНИКА ПРИ ПОРАЖЕНИИ ТЛЕЙ И БЕЗ НЕЁ
Бабажанова В.А.
Нукусский филиал Ташкентского педиатрического медицинского института,
Нукус, Узбекистан
venus82@inbox.ru
Дрожжи относятся к числу наиболее типичных и многочисленных обитателей филлосферы.
Это определяется особенностями их метаболизма и трофическими преферендумами: дрожжи –
типичные копиотрофы, быстро усваивающие простые сахара (глюкозу, сахарозу, галактозу),
входящие в состав растительных экссудатов. Эпифитные дрожжи и растения совместно
образуют единую симбиотическую коэволюционирующую систему, которая может служить
хорошей моделью для изучения многих фундаментальных вопросов экологии и эволюции.
Кроме того, взаимоотношение эпифитной микрофлоры с растениями интересно с практической
точки зрения, например при поражении хлопчатника тлей, которое вызывает пороки хлопкаволокна. Учитывая специфичность выделений тли, нам представлялось интересными
обсеменность дрожжами растений, и оценить их значение при этом.
В конце лета и осенью выделяемые тлями жидкие сахаристые экскременты пачкают
растения и склеивают волокна в раскрывающихся коробочках. Появляется «шира», на которой
нередко развиваются сажистые грибки. Вредность тлей заметно проявляется в условиях
дефицита влажности воздуха. В условиях дефицита влажности воздуха всасывание соков тлями
производится не только и не столько для удовлетворения потребностей питания, сколько для
восполнения расхода влаги тела. При этом особый интерес представляют деструкторы
целлюлозы волокна хлопчатника, т.к. это прекрасный для них субстрат. В результате
деятельности микроорганизмов происходит гидролиз сахаров и формируется клейкость
волокна. Формирование клейкости волокна-хлопка сырца существенно ухудшает его качество
и осложняет переработку.
Численность дрожжевых микроорганизмов колеблется в пределах 104, 105 с тлей, без тли
на один порядок ниже. Видовое наполнение бедное 2-12 видов. От начала до конца вегетации –
5 видов дрожжей. С помощью углеводных бумажных дисков определен набор простых и
сложных сахаров, усваиваемых ими. В результате подробного изучения их морфологокультуральных и физиолого-биохимических признаков установлен таксономический состав
дрожжей. Получено 17 чистых культур дрожжей, из них 3 культуры осуществляли деструкцию
около 20 сахаров. Другие частично трансформировали глюкозу, сахарозу, лактозу, маннит.
Таким образом, эпифитное сообщество дрожжей предпочитает специфические локусы,
богатые углеводами, органическими кислотами и.т.п. Поскольку дрожжи – сахаролитики, они
охотно формируются на поверхностях растений, пораженных тлями, развитие которых
вызывает накопление сахаристых выделений.
ОСОБЕННОСТИ РЕАССОРТАЦИИ ВИРУСОВ ГРИППА ПТИЦ
ПОДТИПА Н5 С ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫМ ДОНОРОМ АТТЕНУАЦИИ
Баженова Е.А., Ларионова Н.В., Иванова Е.В., Федорова Е.А.,
Дубровина И.А., Киселева И.В.
ФГБУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН,
Санкт-Петербург, Россия
sonya.01.08@mail.ru
На сегодняшний день наряду с уже циркулирующим калифорнийским штаммом вируса
гриппа А (H1N1)pdm потенциальную угрозу пандемии представляют высокопатогенные
вирусы гриппа птиц A (H5N1), которые уже преодолели видовой барьер и могут передаваться
от птиц к человеку. В связи с высокой изменчивостью вирусов гриппа возникают опасения, что
в дальнейшем могут произойти новые генетические изменения, которые позволят вирусам
данного сероподтипа передаваться непосредственно от человека к человеку. Поэтому возникла
насущная необходимость подготовки резервных вакцинных штаммов против птичьего гриппа,
194
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
которые, безусловно, необходимо иметь на случай неожиданного появления в циркуляции
вирусов гриппа, подобных птичьим.
Живая гриппозная холодоадаптированная вакцина содержит гены гемагглютинина и
нейраминидазы актуального «дикого» штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние белки
(PB2, PB1, PA, NP, M, NS) – от холодоадаптированного донора аттенуации. При подготовке
вакцинных штаммов против гриппа птиц мы столкнулись с невозможностью получения
штаммов с заданной вакцинной формулой генома 6:2, поскольку у всех полученных
реассортантов наблюдалась прочная связь между генами PB2 и птичьей нейраминидазой,
которые всегда наследовались реассортантами вместе. Для выяснения причины невозможности
переноса в ХА реассортантный штамм РВ2 гена от донора аттенуации, а NA – от вируса гриппа
птиц H5N1, нами было проведено скрещивание с донором аттенуации низкопатагенного вируса
гриппа птиц другого подтипа - А/H5N2. В результате было показано, что, также как и в случае
вирусов гриппа А/H5N1, все полученные реассортанты наследовали гены PB2 и NA вместе
либо от донора аттенуации, либо от дикого родителя. Однако, если для скрещивания в качестве
источника «донорских» генов использовали не сам донор, а вакцинный штамм против гриппа А
(H1N1) pdm, подготовленный на его основе, то прочную связь между генами РВ2 и NA удалось
разорвать.
Таким образом, все выше сказанное говорит о том, что вирусы гриппа, несущие
гемагглютинин Н5 обладают уникально прочной связью между генами РВ2+NA, которую не
удается разобщить при непосредственном скрещивании с донором аттенуации и требуют
использования в качестве внутренних генов вакцинного штамма, несущего HA и NA от
генетически удаленного от донора вируса.
ХАРАКТЕРИСТИКА МАЛАТДЕГИРОГЕНАЗ ИЗ ОБЛИГАТНЫХ
МЕТАНОТРОФОВ METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z И
METHYLOSINUS TRICHOSPORIUM OB3B
Бочарова К.А.1, Розова О.Н.2
1
ФГАОУ ВПО Уральский федеральный университет им. первого Президента России
Б.Н.Ельцина, Екатеринбург; 2ФГБУН Институт биохимии и физиологии
микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино, Россия
rozovaolga1@rambler.ru
Метанотрофы - уникальная группа аэробных бактерий, структурно и функционально
специализированных на использование метана в качестве источника углерода и энергии.
Облигатный метанотроф I морфотипа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z ассимилирует углерод
метана через рибулозомонофосфатный (РМФ) путь и характеризуется разомкнутым циклом
Кребса из-за отсутствия активности α-кетоглутаратдегидрогеназы. У метанотрофа II морфотипа
Methylosinus trichosporium OB3b функционируют сериновый путь С1-ассимиляции, более
энергоемкий по сравнению с РМФ путем, и полный цикл Кребса. В связи с
вышеперечисленными метаболическими особенностями, из двух представителей метанотрофов
нами были получены и охарактеризованы рекомбинантные малатдегидрогеназы (МДГ),
катализирующие обратимое образование оксалоацетата (ОА) из малата.
МДГ M. alcaliphilum 20Z - гомодимер (2×35 кДа), с оптимальными значениями рН 10,0 и
температуры 60-65°С и удельной активностью 21 и 15 Е/мг белка в прямом и обратном
направлениях, соответственно. Активность МДГ увеличивалась в 2 раза через 3 ч прогревания
при 30, 40 и 50°С, однако не обнаруживалась после прогревания при 60°С. Аллостерические
эффекторы фермента не найдены. МДГ в 2 раза более специфична к малату (Kcat/Km = 7343),
чем к ОА (Kcat/Km = 3326). Предположено, что в клетках M. alcaliphilum 20Z фермент
предпочтительно функционирует в направлении образования ОА.
МДГ Ms. trichosporium OB3b - гомотетрамер (4×35 кДа), имеет оптимумы рН 9,5 и 60°С.
Фермент выдерживал 3-х часовое прогревание при температурах от 30 до 60°С без потери
активности, но инактивировался прогреванием при 70°С в течение 1 ч. В присутствии Ca2+ (1
мМ) активность фермента возрастала в 2 раза. Аллостерические эффекторы не обнаружены.
МДГ активнее в направлении образования малата (188 Е/мг белка), чем в реакции окисления
малата в ОА (78 Е/мг белка) и в 50 раз специфичнее к ОА (Kcat/Km для малата = 1855, Kcat/Km
195
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
для ОА = 92851). Свойства МДГ у Ms. trichosporium OB3b коррелируют с ключевой ролью
малата, являющегося одним из центральных метаболитов серинового пути.
МДГ M. alcaliphilum 20Z и Ms. trichosporium OB3b проявляют всего 17% идентичности
транслированных аминокислотных последовательностей и принадлежат I и III классам МДГ,
соответственно.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК
ЛАКТОБАЦИЛЛ КАК ФАКТОР ИХ АУТОАГРЕГАЦИИ И
ФОРМИРОВАНИЯ БИОПЛЕНОК
Бруслик Н.Л., Яруллина Д.Р., Коннова С.А., Ильинская О.Н.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет,
Казань, Россия
nbruslik@yandex.ru
Формирование биопленок является многостадийным процессом, при котором происходят
поверхностные взаимодействия микроорганизмов с субстратом, а также между собой.
Выраженность физико-химических свойств поверхности бактерий может влиять на их
аутоагрегацию и формирование биопленок. В то же время, аутоагрегация сама может быть
фактором образования биопленок. Роль каждого из перечисленных параметров в этих
процессах до конца не установлена.
Цель работы: анализ влияния физико-химических свойств поверхности лактобацилл на
аутоагрегацию и формирование биопленок, а также выяснение роли аутоагрегации в данном
процессе.
В работе использовали 19 штаммов лактобацилл, полученных из кисломолочных
продуктов. Гидрофобность бактериальной поверхности определяли по степени адгезии на
неполярном углеводороде н-гексадекане, основность оценивали по адгезии на кислом
углеводороде хлороформе. Заряд поверхности клеток измеряли методом микроэлектрофореза.
Способность клеток к аутоагрегации оценивали по их седиментации в течение 5 часов.
Образование биопленок исследовали в 96-ти луночных полистироловых планшетах с
окрашиванием полученных биопленок генцианвиолетом.
Установлено, что гидрофобность и основность клеточной поверхности проявляют или
усиливают свое влияние на аутоагрегацию и формирование биопленок при достижении ими
определенной степени выраженности. Высокий уровень гидрофобности связан с увеличением
аутоагрегации (r = 0,22) и со снижением интенсивности формирования биопленок (r = -0,51).
При этом высокая степень основности, напротив, связана с усилением образования биопленок
(r = 0,31) и с подавлением аутоагрегации (r = -0,72). Влияние заряда поверхности на
аутоагрегацию и формирование биопленок тем сильнее, чем более отрицательна его величина.
При более отрицательных значениях наблюдается подавление аутоагрегации (r = -0,81), но
усиление образования биопленок (r = 0,61). В случае аутоагрегации это, вероятно, является
следствием отталкивания одноименных зарядов на поверхности клеток, однако, причины
усиления формирования биопленок на полистироле, также имеющем отрицательный заряд,
нуждаются в уточнении. Кроме того, интенсивная аутоагрегация не была связана с
образованием биопленок (r = -0,1).
Таким образом, влияние физико-химических свойств поверхности лактобацилл на
аутоагрегацию и формирование биопленок проявляется только при их высоких значениях. При
этом, аутоагрегация усиливается при выраженной гидрофобности клеточной поверхности,
тогда как образование биопленок оказывается более интенсивным при увеличении основности
и величины отрицательного заряда.
196
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАИБОЛЕЕ ПРЕДСТАВЛЕННЫХ БЕЛКОВ В
ЦИТОПЛАЗМЕ КЛЕТОК ОБЛИГАТНОГО МЕТАНОТРОФА
METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z
Бут С.Ю.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
mii80@rambler.ru
Метан - существенный компонент глобального цикла углерода, является доминирующей
частью природного газа, попутного газа и возобновляемого биогаза. Аэробные метанотрофные
бактерии – единственная группа прокариот, способных расти на метане. Галофильный
метанотроф I типа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z с рибулозомонофосфатным (РМФ) путем
ассимиляции метана, растущий с высокой скоростью в широких диапазонах рН и солености, с
известной последовательностью генома - перспективный объект биотехнологий на основе
метана.
В ряде случаев гетерологичная экспрессия целевых генов галофилов в клетках Escherichia
coli не всегда возможна, поскольку приводит к получению неактивных ферментов или
выпадению синтезируемых белков в тельца включения, поэтому необходимо использовать
метод гомологичной экспрессии ферментов в клетках хозяина. Для разработки такого метода у
метанотрофов необходимо знание о наиболее представленных белках в клетках и промоторных
последовательностях кодирующих генов.
Для определения мажорных белков в клетках Mm. alcaliphilum 20Z был проведен МАЛДИ
масс-спектрометрический анализ 10 основных белковых полос, полученных ПААГэлектрофорезом и вырезанных из геля. Показано, что основными мажорными белками
цитоплазмы являются β-субъединица метанмонооксигеназы и большая субъединица
метанолдегидрогеназы, что ожидаемо, поскольку данные ферменты отвечают за ключевые
реакции для метанотрофных бактерий – окисление метана до формальдегида. Кроме того,
обнаружены трансальдолаза и транскетолаза, а также фруктозобисфосфат альдалаза и
пируватфосфатдикиназа – ключевые ферменты РМФ пути и пирофосфат зависимого гликолиза,
соответственно. Среди выделенных белковых полос идентифицируются серин-глиоксилат
аминотрансфераза, пероксиредоксин и два белка с неизвестной функцией. Интересно наличие
среди мажорных белков серин-глиоксилатаминотрансферазы – фермента серинового цикла,
функционирование которого у Mm. alcaliphilum 20Z не показано, хотя в геноме метанотрофа
присутствуют гены данного пути. При анализе генома Mm. alcaliphilum 20Z выявлены
предполагаемые промоторные области генов, кодирующих обнаруженные белки.
Таким образом, в клетках Mm. alcaliphilum 20Z определены наиболее высоко
экспрессируемые белки и определены их промоторные области. Полученные результаты будут
служить базой для дальнейшего изучения метанотрофов, а также для создания гомологичной
экспрессионной системы на основе штамма Mm. alcaliphilum 20Z.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 14-04-31890 мол_а.
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ
СВИНЕЙ С ДЕЛЕЦИЕЙ ГЕНА EP402R
Бурмакина Г.С., Малоголовкин А.С., Титов И.А., Колбасов Д.В.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и
микробиологии РАСХН, Покров, Россия
Lila5757@yandex.ru
Африканская чума свиней (АЧС) – вирусная остропротекающая геморрагическая
лихорадка домашних и диких свиней с летальностью достигающей 100%. Вирус африканской
чумы свиней (АЧС) является уникальным представителем семейства Asfarviridae и
единственным ДНК-содержащим арбовирусом. До сих пор не разработаны эффективные
средства специфической профилактики АЧС.
Современные исследования по изучению роли отдельных генов вируса АЧС в основном
направлены на создание рекомбинантных (химерных) вирусов с измененными или удаленными
197
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
генами с дальнейшим изучением фенотипических свойств данных вирусов на культурах клеток
и восприимчивых животных.
Независимые исследования ряда отечественных и иностранных ученых позволили выявить
гликопротеин вируса АЧС СD2v, отвечающий за его адгезию эритроцитов на поверхности
инфицированных вирусом клеток. Филогенетический анализ более чем 70 штаммов вируса
АЧС показал корреляцию между генетическими кластерами на основе нуклеотидных
последовательностей гена EP402R, кодирующего белок CD2v, и выявленными ранее
серогруппами. Таким образом, поверхностный гликопротеин CD2v вероятно играет важную
роль в модуляции механизмов иммунного ответа.
Целью данной работы являлось создания рекомбинантного вируса АЧС с делецией гена
EP402R для изучения роли белка CD2v.
Для получения делеционного мутанта вируса АЧС была сконструирована
рекомбинационная кассета несущая два плеча рекомбинации. При одновременной трансфекции
культуры клеток СOS-1 рекомбинационной кассетой содержащей комплементарные
нуклеотидные последовательности для удаления гена EP402R (в направлении 5' и 3’) из генома
и инфицировании ее вирусом АЧС за счет гомологической рекомбинации были получены
рекомбинантные клоны. Для дальнейшего скриннинга клонов использовали метод предельных
разведений (10-15 последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток cos-1) и
селекции мутантных вариантов вируса по репортерной флюоресценции за счет введенного в
состав вируса гена EGFP. Чистота клональной популяции рекомбинатного вируса была
подтверждена в ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими фрагмент гена EP402R.
Полученный рекомбинантный вирус был способен реплицироваться в перевиваемой культуре
клеток cos-1 и первичной культуре клеток макрофагов.
Таким образом, в результате исследований был получен рекомбинантный вирус АЧС с
делецией гена EP402R, содержащий репортерный ген EGFP. В дальнейшем данный вирус будет
использован для изучения роли белка CD2v в репродукции вируса, вирулентности, а также его
влиянии на иммунный ответ хозяина.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ PHYSCOMITRELLA PATENS И
ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
1,2
Виноградова С.В. , Шевердина Е.И.1,2, Головешкина Е.Н.2, Игнатов А.Н.1,2
1
ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов;
2
ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, Россия
coatprotein@bk.ru
В настоящее время накоплен большой массив данных о взаимодействиях растения и
патогена на примере модельных покрытосеменных растений. Однако информация об иммунной
системе филогенетически древних растений, например, мха (Physcomitrella patens Hedw.)
ограничена. Таксон Bryophyta (Мохообразные) является древнейшим из наземных растений,
которые разошлись с предками покрытосеменных растений не менее 450 миллионов лет назад.
Изучение механизмов взаимодействия P. patens с фитопатогенными бактериями может пролить
свет на молекулярные механизмы формирования иммунитета, эволюционного происхождения
систем пассивного и активного иммунитета растений, происхождения паразитизма у
фитопатогенных растений и изучения эволюции функций отдельных генов, участвующих во
взаимоотношении растения и патогена.
Целью нашей работы является создание и изучение модели растение-патоген для бриофита
P. patens и фитопатогенных бактерий.
На первом этапе работы нами были проведены эксперименты по определению
вирулентности фитопатогенных бактерий по отношению к P. patens и по оптимизации методов
инокуляции. В результате проведенных экспериментов в качестве объектов для дальнейшего
изучения были отобраны наиболее вирулентные штаммы Xanthomonas arboricola и
Pseudomonas syringae.
Геномы некоторых штаммов фитопатогенных бактерий, вирулентных для P. patens, были
секвенированы. В результате сравнительного анализа последовательностей полных геномов
штаммов X. arboricola и P. syringae, вирулентных для P. patens, с имеющимися полными
198
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
геномами других штаммов и видов родственных бактерий выявлены гены-кандидаты,
потенциально определяющие вирулентность. Так, в результате анализа штамма X. arboricola
3004 было обнаружено 137 блоков-последовательностей и 240 генов, уникальных только для
вновь секвенированного генома. 121 последовательность может считаться потенциальными
генами-кандидатами вирулентности. В результате анализа генома штамма P. syringae 1845
обнаружено 166 генов, не принадлежащих к консервативным подсистемам. Из них 76
последовательностей не имеют гомологии ни у одного из ранее секвенированных геномов и
были найдены только у P. syringae 1845, что дает основание считать данные
последовательности потенциальными генами-кандидатами вирулентности.
Работа выполняется при поддержке гранта РФФИ 13-04-40104-Н.
ВЛИЯНИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА МОРФОЛОГИЮ И УЛЬТРАСТРУКТУРУ
КЛЕТОК МИКОПЛАЗМЫ ACHOLEPLASMA LAIDLAWII. РОЛЬ МАЛОГО
БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА
Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н.
ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
innvish@gmail.com
Микоплазмы (класс Mollicutes) – самые маленькие микроорганизмы, способные к
самостоятельному воспроизведению. Несмотря на кажущуюся «некомплектность» их геномов,
микоплазмы являются успешными патогенами людей, млекопитающих, птиц, насекомых и
растений. «Вездесущую» микоплазму Acholeplasma laidlawii выделяют из почвы, компоста и
сточных вод, а также из тканей людей, животных и растений. При неблагоприятных условиях
среды A. laidlawii образует «спящие» формы (минитела), отличающиеся от обычных клеток
меньшим размером, повышенной устойчивостью к биогенным и абиогенным стрессовым
факторам и фитопатогенностью. A. laidlawii входит в топ-5 контаминантов клеточных культур,
способна длительное время выживать при низкой температуре, расти до высоких титров в
культурах клеток и на питательных средах. На сегодняшний день нет достоверных сведений о
способности A. laidlawii вызывать заболевания у человека. Однако, A. laidlawii активно
продуцирует в окружающую среду внеклеточные мембранные везикулы, которые содержат
факторы вирулентности, и способствуют возникновению хромосомных аберраций в
лимфоцитах периферической крови человека. Кроме того, в своё время A. laidlawii выделяли из
костного мозга людей, больных лейкемией. Вероятно, A. laidlawii может подавлять иммунную
систему человека и способствовать возникновению раковых клеток крови. Мы предполагаем,
что большой вклад в повышенную стрессоустойчивость, а также в вирулентность A. laidlawii
вносят стрессовые белки – шапероны. Одним из самых важных, по-видимому, является белок
«скорой помощи» IbpA, малый белок теплового шока альфа-кристаллинового типа,
продуцирующийся в значительном количестве (до 7,24% тотального белка) в стрессовых
условиях.
В данной работе мы исследовали влияние теплового шока на морфологию и
ультраструктуру клеток A. laidlawii, а также на локализацию белка IbpA. Нами показано, что
при тепловом шоке значительно увеличивается количество «спящих» форм, способных
длительное время переживать неблагоприятные условия среды, а также внеклеточных
мембранных везикул, в состав которых входит большое количество факторов вирулентности.
Методами иммуно-электронной микроскопии нами было установлено, что значительная часть
молекул IbpA в условиях стресса локализуется как на внеклеточных мембранных везикулах,
так и в формирующихся «спящих» клетках микоплазм. Мы предполагаем, что IbpA A. laidlawii
может играть роль термопротектора для компонентов «спящих» форм и термолабильных
факторов вирулентности.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований, грант № 13-0402070.
199
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
СВОЙСТВА АЦЕТАТКИНАЗЫ ГАЛОТОЛЕРАНТНОГО АЛКАЛОФИЛЬНОГО
МЕТАНОТРОФА METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z
Гавлетдинова Ю.З.1,2, Розова О.Н.1
1
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН;
2
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт,
Пущино, Россия
rozovaolga1@rambler.ru
Галотолерантный облигатный метанотроф Methylomicrobium alcaliphilum 20Z накапливает
в качестве основного осмопротектора циклическую иминокислоту эктоин, предшественниками
которого являются аспартат и ацетил-КоА. Изучение путей синтеза ацетил-КоА у
галофильных/толерантных метанотрофов важно для усиления их метаболического потенциала
как продуцентов эктоина и других органических соединений из метана. Обнаружено, что геном
метанотрофа кодирует фосфокетолазный путь распада фосфосахаров, образующихся при
первичной ассимиляции С1-соединений, который может быть поставщиком ацетил-КоА
дополнительно к реакции, катализируемой пируватдегидрогеназным комплексом. В данной
работе изучены свойства одного из ферментов фосфокетолазного пути - ацетаткиназы (АК).
Клонированием гена ack из ДНК Mm. alcaliphilum 20Z был получен электрофоретически
гомогенный препарат АК-His6 и проведена его биохимическая характеристика.
АК Mm. alcaliphilum 20Z - гомодимер с молекулярной массой субъединицы 35 кДа,
катализирует обратимое образование ацетилфосфата из ацетата и АТФ с удельной активностью
50 Е/мг белка при температуре 30°С и оптимальном значении рН 8,0. АК проявляла
максимальную удельную активность (240 Е/мг белка) при 70°С. АК термостабильна, поскольку
сохраняла 50% активности после прогревания при 70°С в течение 3 ч. Активность АК зависела
от двухвалентных металлов Mg2+ (100%), Mn2+ (100%) или Co2+ (68%), но не обнаруживалась в
присутствии Ba2+, Ca2+, Zn2+ или Cu2+. Несмотря на галофильную природу метанотрофа, ионы
Na+ не влияли на активность ацетаткиназы. Такие метаболиты, как фруктозо-6-фосфат,
фруктозо-1,6-бисфосфат, эритрозо-4-фосфат, рибозо-5-фосфат, ФЕП, пируват, АМФ, ФФн, Фн,
серин, цитрат, глицерат, лактат, малат, оксалоацетат не оказывали значительного влияния на
активность фермента.
Проведенный филогенетический анализ АК Mm. alcaliphilum 20Z выявил 96%-ю
идентичность транслированных аминокислотных последовательностей с ферментом из Mm.
buryatense, другими ближайшими ортологами являются АК из метанотрофов Methylosarcina
fibrata и Methylomonas methanica, а также из актиномицета Microbispora sp ATCC PTA-5024
(50-55% идентичности). С ацетаткиназами из другого галотолерантного метанотрофа
Methylobacter marinus АК Mm. alcaliphilum 20Z проявляла низкое сходство (до 25 и 36%
идентичности), что указывает на влияние латерального переноса генов на эволюцию
ацетаткиназ у метанотрофов.
ОБРАЗОВАНИЕ НАНОЧАСТИЦ АКТИНОМИЦЕТАМИ
Гулиева С.М., Шахгелдиева Н.А., Гасанова С.А.
Бакинский государственный университет, Баку, Азербайджан
sevinc0011@mail.ru
Наряду с ферментами с помощью методов биотехнологии получают аминокислоты,
витамины, органические кислоты (уксусную, лимонную), антибиотики, вакцины, сыворотки.
Естественные биореакторы (микроорганизмы) могут быть использованы также для получения
различных наночастиц серебра, золота, цинка и т.д.
Некоторые микроорганизмы, помещенные в раствор солей золота, способны действовать
как химический восстановитель, превращая внутри своих клеток ионы золота в наночастицы
металла диаметром от 5 до 15 нм. Получать ранее частицы в таком узком диапазоне размеров
биологическими методами не удавалось. С помощью данного метода можно получить
наночастицы серебра, а также сплавов золота и серебра, которые находят широкое применение
в различных нанотехнологических производствах. Полученные таким образом наночастицы
могут найти применение в самых разных областях: например, в диагностике с использованием
200
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
иммунохимии, в системах разделения клеток (клеточной сепарации), выделения нуклеиновых
кислот, в контроле лекарств.
Были исследованы актиномицеты, выделенные из почвенных образцов различных районов
Азербайджана. Штаммы актиномицетов выращивали в жидкой питательной среде (среда Гаузе)
для образования мицелия. Мицелий отделяли, промывали и помещали в раствор AgNO3. После
инкубации проводили спектрофотометрический анализ. Из 28 исследуемых штаммов 2 штамма
(С25 и М11) демонстрировали поглощение на длине волны 400-430 нм. Для дальнейших
исследований были выбраны эти два штамма.
ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ И МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ТЕРМОТОЛЕРАНТНЫХ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙПРОДУЦЕНТОВ БИОПАВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ГРУНТОВЫХ И ВОДНЫХ
ОБРАЗЦОВ РОССИИ, КАЗАХСТАНА И АНТАРКТИДЫ
Делеган Я.А.1,2, Ветрова А.А.2, Иванова А.А.2, Гафаров А.Б.2, Филонов А.Е.1,2
1
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт;
2
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Пущино, Россия
mewgia@ya.ru
В связи с обширным загрязнением нефтью грунтов и водных систем углеводороды
различного химического строения являются одним из наиболее распространенных источников
углерода и энергии, принимающих участие в микробном метаболизме. Способность
утилизировать нефтепродукты присутствует даже у бактерий, выделенных из экосистем, не
подверженных углеводородному загрязнению. Возможность применения бактерийдеструкторов нефти для очистки загрязненных экосистем изучена в основном для регионов,
расположенных в умеренном климате.
В ходе работы проводили поиск бактериальных штаммов, способных осуществлять
деструкцию нефти при повышенных температурах, и анализ физиолого-биохимических свойств
этих штаммов с целью дальнейшего применения отобранных культур для очистки грунтов в
регионах с жарким климатом. Бактериальные культуры выделяли из образцов грунта и воды,
отобранных в Подмосковье, на Байкале, в Казахстане и в Антарктиде. Методом периодического
накопительного культивирования в жидкой минеральной среде с нефтью было выделено 86
штаммов, 18 из которых являются термотолерантными, т.е. способными утилилизировать
углеводороды при повышенной (45-50°С) температуре.
Идентификацию термотолерантных бактерий проводили путем анализа нуклеотидной
последовательности фрагментов генов 16S рРНК. Было выявлено, что штаммы являются
представителями пяти различных родов: Gordonia, Stenotrophomonas, Paenibacillus,
Pseudomonas и Rhodococcus. Все исследуемые штаммы, включая культуры видов Rhodococcus
erythropolis и ‘Pseudomonas teessidea’, выделенные из образцов антарктической воды, способны
утилизировать нефть, а также отдельные ароматические и алифатические углеводороды,
входящие в состав различных фракций нефти, в качестве единственного источника углерода и
энергии при температурах окружающей среды 45-50°С.
Анализ способности бактерий к продукции поверхностно-активных веществ (биоПАВ)
показал, что большинство бактерий при культивировании на минеральных средах с
гидрофобными источниками углерода продуцирует биоПАВ, вследствие чего поверхностное
натяжение культуральной жидкости снижается с ~72 мН/м до 48-50 мН/м.
Анализ исследуемых бактерий на способность к минерализации дизельного топлива в
присутствии различных концентраций соли выявил, что микроорганизмы рода Gordonia
утилизируют углеводороды в присутствии 10% соли. Для остальных углеводородокисляющих
штаммов максимальная концентрация соли в среде составила 5%.
201
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА
МОРФОЛОГИЮ PENICILLIUM ADAMETZII И
БИОСИНТЕЗ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
Демешко О.Д., Михайлова Р.В.
Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
demeshkoo@mail.ru
Грибы рода Penicillum – перспективные продуценты биологически активных соединений.
Среди них особый интерес вызывают ферменты класса оксидоредуктаз, которые находят
применение в медицине и биоэлектронике. Наиболее широкое практическое использование из
оксидоредуктаз получила глюкозооксидаза (ГО) (КФ 1.1.3.4).
Продуцент ГО – Penicillium adametzii ЛФ F-2044.1 (далее – P. adametzii) получен в
лаборатории ферментов Института микробиологии НАН Беларуси. ГО P. adametzii является
компонентом отечественного биосенсора «Глюкосен» для экспресс-анализа содержания
глюкозы в крови больных сахарным диабетом. Технология производства препарата
«Глюкозооксидаза» основана на глубинном культивировании P. adametzii, однако морфогенез
роста гриба исследован недостаточно. Формы развития P. adametzii в условиях глубинной
культуры и их связь с биосинтезом целевого продукта важны для усовершенствования
биотехнологического процесса.
Цель работы – исследование влияния условий культивирования P. adametzii на
морфологическую форму продуцента и биосинтез ГО.
Изучали влияние скорости перемешивания питательной среды (100-230 об/мин),
температуры (26°С-30°С) и рН среды культивирования (от 3,0 до 9,0) на морфологические и
биосинтетические особенности гриба.
Установлено, что на морфогенез гриба оказывала влияние активная кислотность среды.
При исходном рН среды 3,0 – мицелиальный рост гриба и на 15% по сравнению с контролем
(рН 5,0) повышался уровень накопления ГО, а при исходном рН 5,0 - 9,0 рост продуцента был в
форме пеллет, при этом снижались показатели биосинтеза ГО. Предполагается, что повышение
образования ГО связано с мицелиальным типом роста гриба. Культивирование продуцента при
30°С приводило к снижению на 43% накопления фермента по сравнению с контролем (26°С).
При данных условиях продуцент образовывал пеллеты. Выявлено, что перемешивание
питательной среды в диапазоне 100-210 об/мин приводило к пеллетному росту гриба, а 230
об/мин – к образованию двух морфологических форм роста гриба. Анализ биосинтеза ГО P.
аdametzii в зависимости от интенсивности перемешивания питательной среды показал, что
использование перемешивания в диапазоне 100-150 об/мин значительно снижает все
показатели биосинтеза фермента. Максимальный уровень образования ГО P. аdametzii – 10,96
ед/мл был установлен при перемешивании питательной среды со скоростью 210 об/мин. При
данных параметрах процесса также максимальными были значения продуцирующей
способности мицелия гриба и удельной активности ГО.
НОВЫЕ ДАННЫЕ О ТРАНСКРИПЦИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ
ГЕНА АЦК-ДЕЗАМИНАЗЫ У METHYLOBACTERIUM RADIOTOLERANS
Екимова Г.А., Федоров Д.Н.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН;
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт,
Пущино, Россия
ekimova_g@mail.ru
Многие бактерии, стимулирующие рост растений, синтезируют фермент, способный
регулировать уровень гормона этилена в их тканях. Этот фермент, 1-аминоциклопропан-1карбоксилат(АЦК)-дезаминаза, деградирует АЦК –предшественника этилена, играя важную
роль в благоприятном воздействии бактерий на растения в условиях стресса.
Транскрипционная регуляция гена АЦК-дезамииназы (acdS) изучена только у Pseudomonas
putida UW4. Выше acdS располагается ген acdR, кодирующий регулятор из lrp-семейства,
который присоединяется к комплексу АЦК с белком AcdB и связывается с областями
202
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
промотора acdS, обеспечивая его транскрипцию. АЦК-дезаминаза расщепляет АЦК до аммиака
и α-кетобутирата - предшественника лейцина. При высокой концентрации лейцина lrp-октамер
распадается, останавливая транскрипцию acdS.
Поиск генов АЦК-дезаминаз среди аэробных метилобактерий выявил, что геном acdS
обладает ряд представителей рода Methylobacterium, многие из которых - симбионты растений.
Анализ in silico генома Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 показал, что выше
структурного гена acdS расположен ген acdR, траскрибирующийся в обратном направлении,
однако, не обнаружена последовательность, сходная с геном acdB P. putida.
Для определения роли AcdR в регуляции АЦК-дезаминазы путем гомологичной
рекомбинации с E. coli получен мутант M. radiotolerans с делецией в гене acdR. Штамм не
обладал активностью АЦК-дезакминазы, что говорит о непосредственном участии AcdR в
регуляции экспрессии гена acdS.
Для исследования функциональной активности AcdR использован модифицированный
метод определения промоторных областей. Ген acdR M. radiotolerans клонировали в плазмиде
pAC5mut2 под контроль ИПТГ-индуцибельного промотора Ptrc. Промоторную область гена
acdS M. radiotolerans клонировали в плазмиде pSB40N, несущей lacZα в качестве репортерного
гена. Этими векторами трансформировали клетки E. coli XL1-Blue.
Обнаружено, что при росте на среде LB в присутствии хромогенного красителя X-gal
клетки не окрашивались в синий цвет. Это указывает на то, что ген lacZα не транскрибировался
с промоторной области гена acdS РНК-полимеразой E. coli.
Добавление в среду ИПТГ привело к появлению окраски у клеток E. coli XL1-Blue,
содержащих векторы pAC5mut2:acdR и pSB40N:РacdS. Это объясняется тем, что ИПТГ
индуцирует экспрессию гена acdR, продукт которого связывается с последовательностью
промотора acdS гена M. radiotolerans, что приводит к активации транскрипции гена lacZα.
Таким образом, можно предположить, что белок AcdR - активатор транскрипции гена acdS.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №14-04-32202-мол_а.
ЭФФЕКТ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК НА АДГЕЗИЮ БАКТЕРИЙ
STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS
Ерошенко Д.В., Лемкина Л.М., Коробов В.П.
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,
Пермь, Россия
dasha.eroshenko@gmail.com
Известно, что матрикс биопленок включает в себя такие экзополимеры, как полисахариды
и ДНК. Адгезия клеток к поверхности является ключевым этапом в процессе образования
биопленки, но роль внеклеточной ДНК в этом процессе ещё остается не ясной. В этой работе
мы исследовали роль экзогенной ДНК на процесс адгезии клеток Staphylococcus epidermidis.
Полную геномную ДНК выделяли из S. epidermidis 33 с использованием набора «Bacterial
Genomic DNA Miniperp Kit» («AxyPrep», Китай) по прописи фирмы-изготовителя. Количество
ДНК определяли по степени поглощения при длине волны 260 нм на спектрофотометре UV-300
(«Zhimadzu», Япония). Нативную или инактивированную кипячением в течение 10 мин ДНКазу
I типа («Биолот», Россия) вносили в среду LB с добавлением 5 мМ Mg2+ до конечной
активности 57 ед/мг.
Для изучения адгезии клетки лог-фазы S. epidermidis 33, дважды отмытые 0,14 М NaCl,
вносили в среду питательную среду LB с добавлением ДНКазы (нативной или
инактивированной) или экзогенной ДНК до концентрации 107 КОЕ/мл. В качестве контроля
использовали среду LB (для опыта с ДНК) или LB с добавлением 5 мМ Mg2+ (для опыта с
ДНКазой). Полученные суспензии разливали по 2 мл в полистироловые чашки Петри
(«Медполимер», Россия.) После инкубации (37°С, 30 мин) планктонные клетки удаляли, а
сорбированные трижды промывали фосфатным буфером (10 мМ, рН 7,2). После высушивания
на воздухе количество связавшихся бактерий оценивали прямым подсчетом клеток с помощью
микровизора µViso-103 («Ломо», Россия) после окрашивания генцианвиолетом (0,1%),
просматривая по 10 полей зрения в каждой чашке при увеличении ×2500 раз. Количество
живых клеток определяли стандартным методом высева аликвот десятикратных разведений на
203
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
плотную среду LB. Опыты проводили в трехкратной повторности. Статистическую обработку
полученных результатов проводили с использование программы «Prism 6» (GraphPad Software).
Было показано, что внесение в среду инкубации экзогенной ДНК в количестве 15 мг/мл
приводило к увеличению числа сорбированных клеток в 1,4–1,6 раза и к увеличению
концентрации живых клеток на 20% по сравнению с контролем. Тогда как присутствие в среде
инкубации нативной ДНКазы снижало степень адгезии клеток стафилококков на 70–85%, тогда
как инактивированная форма фермента не влияла на процесс сорбции. Следует так же
отметить, что в случае нативного фермента наблюдалось повышение концентрации живых
клеток в 2 раза по сравнению с контролем. Выявленный эффект экзогенной ДНК на процесс
адгезии бактериальных клеток, по-видимому, связан с изменением поверхностного заряда
клеток.
КЛОНИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПГБ-СИНТАЗЫ ИЗ
METHYLOBACTERIUM EXTORQUENS
Замахаева С.А., Федоров Д.Н.
1
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт;
2
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
s.zamakhaeva@ya.ru
Полигидроксибутират (ПГБ) – биодеградабельный, биосовместимый, термопластичный
полимер, который используется в медицине, сельском хозяйстве, а так же в качестве
упаковочного материала. ПГБ является естественным запасным веществом многих видов
бактерий и активно нарабатывается при несбалансированных условиях роста. Высокая
стоимость выделения полимера является существенным недостатком, т.к. субстратом для
многих бактерий, запасающих ПГБ, является глюкоза. Но аэробные метилобактерии,
использующие метанол и другие С1-соединения в качестве источников углерода и энергии,
перспективны для промышленного производства биополимера, ввиду дешевизны ростовых
субстратов. В геномах представителей рода Methylobacterium нами обнаружены
множественные гены ПГБ-синтаз. Для оценки свойств различных ПГБ-синтаз и понимания
роли нескольких ферментов, закодированных в одном геноме, необходимо исследовать
кинетические свойства этих ПГБ-синтаз.
Цель данной работы – клонировать и охарактеризовать ПГБ-синтазу из M. extorquens AM1 .
Для получения препарата рекомбинантного белка проведили следующие этапы: при
помощи ПЦР амплифицировали фрагмент ДНК, содержащий полную последовательность гена
ПГБ-синтазы phaC из M. extorquens AM1 и затем этот фрагмент клонировали в экспрессионном
векторе pHUE. Полученной плазмидой трансформировали клетки E. coli Rosetta и
индуцировали синтез белка добавлением ИПТГ. Рекомбинантный белок PhaC , содержащий
полигистидиновую метку на N-конце, выделяли из грубого клеточного экстракта методом
металл-хелатной хроматографии.
Электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях показали, что
ПГБ-синтаза M. extorquens является мономером. Электрофорезом в денатурирующем ПААГ
установили молекулярную массу субъединицы PhaC, которая составила 68 кДа.
Рекомбинантная ПГБ-синтаза проявляла ферментативную активность в присутствии
дитионитробензоата (ДТНБ) и гидроксибутирил-КоА, несмотря на наличие убиквитиновой и
гистидиновой меток на N-конце белка. Спектрофотометрически установили активность ПГБсинтазы, которая составила 1,5 мкмоль/мин/мг белка.
Таким образом, нами впервые был клонирован ген и проведена первичная характеристика
ПГБ-синтазы из метилобактерий.
Работа поддержана грантом РФФИ №13-04-01520-а.
204
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
НОВАЯ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗА MORGANELLA MORGANII ZM
Замалютдинова Н.М., Миннуллина Л.Ф., Арапова А.О.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
nelya-zamalutdinova@mail.ru
Целью данной работы явилась идентификация гена металлопротеиназы M. morganii и
выяснение роли фермента в вирулентности.
Нами были получены клинические изоляты бактерий рода Enterobacteriaceae. На
основании различных методов идентификации бактерии были определены до вида. Для
дальнейшей работы была выбрана бактерия Morganella morganii ZM. Мы провели анализ
протеолитической активности в культуральной жидкости и клеточном лизате бактерий. В
качестве субстратов были выбраны белки актин, азоказеин и желатин. Было показано, что в
культуральной жидкости отсутствует протеолитическая активность, либо она незначительна.
При анализе клеточного лизата была выявлена протеолитическая активность, расщепляющая
азоказеин, желатин и актин. Активность подавлялась в присутствии о-фенантролина и не
подавлялась в присутствии PMSF. Таким образом, в клеточном лизате содержались
металлопротеиназы. Данные металлопротеиназы обнаруживались в среде в значимом
количестве на 12-24 час культивирования и сохранялись до 48 часа. В геноме морганеллы был
идентифицирован ген, кодирующий гипотетическую металлопротеиназу. Фермент относится к
суперсемейству глуцинкинов. Была секвенирована и проанализирована регуляторная область
гена. Идентифицированы старт-кодон, стоп-кодон, а также элементы регуляции транскрипции
и трансляции: -10 бокс, -35 бокс, сайт Шайна-Дальгарно. Ген клонировали в вектор pBAD 24
под индуцибельный промотор арабинозного оперона.
Изучали инвазию бактерий Morganella morganii ZM в эукариотические клетки HeLa
количественным гентамициновым методом. Показано, что морганелла инвазирует в
эукариотические клетки. Количество внутриклеточных бактерий возрастало при повышении
концентрации вносимых бактерий и времени инвазии. Выявлена зависимость эффективности
инвазии от времени роста бактериальной культуры. Показано, что наиболее эффективно
инвазирует молодая культура, находящаяся на экспоненциальной стадии роста. Видимо, это
связано с изменением физиологии бактерий на поздних стадиях роста и снижением
вирулентности.
СОПОСТАВЛЕНИЕ ТРАДИЦИОННЫХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ
АНАЛИЗА ПОЧВЕННЫХ МИКРОБИОТ
Зверев А.О., Андронов Е.Е., Першина Е.В.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург, Пушкин, Россия
azver.bio@gmail.com
В настоящее время в исследованиях таксономической структуры микробных сообществ
окружающей среды фактически осуществлен переход от традиционных методов, связанных с
культивированием, к молекулярным методам, объектом которых является ДНК (РНК),
выделенная непосредственно из исследуемых объектов. Такой подход обеспечивает анализ
микробных сообществ во всей полноте, включая некультивируемый компонент, доля которого
в некоторых микробных сообществах, например, в почве может превышать 95%.
Использование техники высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 16S рРНК
обеспечивает недостижимую ранее глубину и точность анализа.
Однако исследований, которые демонстрируют соотношения между традиционными и
молекулярными подходами, все еще недостаточно. В настоящем исследовании мы изучали
образец почвы с использованием ряда традиционных и молекулярных методов: 1) для
определения общей микробной биомассы использовали метод субстрат-индуцированного
дыхания, в ходе которого производилось инкубирование почвы с 2% раствором глюкозы.
Количество выделившейся углекислоты определялось на газовом хроматографе. Библиотеки
ДНК и РНК, полученные из опытных и контрольных образцов, были просеквенированы,
последовательности были идентифицированы и описаны при помощи методов
205
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
биоинформатики. 2) для определения разнообразия популяций, способных к росту на
питательной среде, использовался глюко-пептонный агар. Идентификацию образовавшихся
колоний выполнили при помощи секвенирования ДНК-библиотек, полученные данные
сопоставили с анализом библиотек, полученных в п.1.
В настоящем сообщении мы представляем полученные результаты, основным из которых
являются следующие: 1) при сравнении разнообразия ДНК- и кДНК-библиотек гена 16S рРНК
лишь 14% сообщества проявляют выраженную положительную реакцию на добавление
глюкозы; 2) выявлены последовательности, специфические как для ДНК-пула, так и для РНКпула; 3) при анализе посевов на чашках Петри была найдена как некоторая часть
идентифицированых в первой части эксперимента ДНК- и кДНК-библиотекам, так и не
встреченные ранее.
Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-01371.
ИСТОЧНИКИ УСТОЙЧИВОСТИ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К
ВОЗБУДИТЕЛЮ SEPTORIA TRITICI ROB ET. DESM
Зеленева Ю.В., Судникова В.П.
Среднерусский филиал ГНУ Тамбовского научно-исследовательского института
сельского хозяйства РАСХН, Тамбов, Россия
zelenewa@mail.ru
Установлено, что патогенный комплекс возбудителей септориоза пшеницы в Центрально –
Черноземном регионе представлен тремя видами септориальных грибов: Septoria tritici Rob et.
Desm., Stagonospora avenae f. sp. triticea Jhons., Stagonospora nodorum [Berk] Castellani & E. G.
Germano. Устойчивость сортобразцов определяли к возбудителю S. tritici, доминирующему во
всех агроклиматических зонах ЦЧР.
Для выявления доноров и источников устойчивости к S. tritici нами проведена оценка более
5000 яровых сортообразцов пшеницы, представленных различными эколого-географическими
группами. Материалом для исследований служили коллекции промышленных видов пшеницы
из тринадцати эколого-географических групп: международного питомника SIMMIT
(СИММИТ), национальных питомников США, Бразилии, Мексики, Кении, Эфиопии, России и
других стран.
В результате проведённой работы была создана региональная коллекция источников и
доноров устойчивости яровой пшеницы к популяции S. tritici, характерной для ЦЧР.
Преимущественно это сорта Бразилии (Кк – 34412, 34414, 34416 и др.), США (Кк – 31185,
31224, 31287 и др.), Мексики (Кк – 33555, 33814, 34619, 34622, 34625, 34629, 34636, 34881) и из
Международного питомника СИММИТ (Кк – 31470-3, 33859, 33863 и др.). Кроме того, в
группу устойчивых вошли сортообразцы пшеницы к – 31170, Индия; к – 31162, Непал; Кк –
33553, 33554 Чили; и 3 отечественных образца: Эстивум 56 и Эстивум 609 (Самарский
НИИСХ), а также гибридная линия И – 99 (СНИФС).
В число испытываемых образцов были включены сорта, проявившие устойчивость к
патогену S. tritici в питомниках СИММИТ и ряде зарубежных стран. В результате проведённых
исследований из 58 рекомендованных доноров устойчивости к патогену S. tritici из зарубежной
селекции для условий ЦЧР могут использоваться только 16 сортообразцов (27,6%). Все они
сложные гибриды Международного питомника СИММИТ под номерами каталога ВНИИФ: Кк
– 33859, 33863, 33868, 33870, 33872, 33873, 33875, 33877, 33879, 33880, 33881, 33883, 33889,
33901, 33910, 33919.
Большинство рекомендуемых доноров обладали комплексной устойчивостью к
эпифитотийно опасным патогенам (бурая и стеблевая ржавчина, пыльная и твёрдая головня,
мучнистая роса).
Следовательно, выявленные источники и доноры устойчивости к S. tritici можно
рекомендовать для включения в селекционные программы при выведении болезнеустойчивых
сортов пшеницы к септориозу.
206
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
МИКРОБНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ СНЕЖНИКОВ ПЛАТО ЛАГО-НАКИ
Калашников А.А.1, Булат С.А.2
1
ФГБОУ ВПО Кубанский государственный университет, Краснодар;
2
ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова,
ФГБУ Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»,
Санкт-Петербург, Россия
kalash23rus@mail.ru
В настоящий момент большой интерес представляют собой исследования экстремальных
мест обитания. А также микроорганизмов населяющих данные экониши. По сравнению с
микроорганизмами нормальных мест обитания, микроорганизмы экстремофилы изучены слабо.
Например, возможно применение ферментных систем работающих при температурах ниже
нормальных. Появление молекулярно-биологических методов исследования, дало возможность
исследовать состав микрофлоры холодных мест обитания напрямую, минуя стадию
культивирования.
Целью данного исследования является исследование микробного биоразнообразия
снежников плато Лаго-наки. Образцы снега были взяты с одного из постоянных снежников.
Забор проб был произведён в августе. В этот период снег максимально таит и остаются
постоянные, нетающие слои снега. Из полученных образцов снега в стерильных условиях было
проведено выделение ДНК. Затем мы провели первичную амплификацию ДНК с
универсальными праймерами w001mCFm/1492R и 338Fb/com2mo. Полученные образцы
проверяли при помощи электрофореза в 1,6% агарозном геле. Фрагменты гена 16sРНК
клонировали в компетентных клетках E.coli. Полученные клоны были подвергнуты
амплификации с универсальными праймерами w001mCFm/1492R и 338Fb/com2mo. С
получившимися клонами мы провели рестрикционный анализ по трём рестриктазам. При
помощи, полученных, рестрикционных карт мы сгруппировали клоны одинаковых филотипов.
Для ДНК фрагментов каждого филума были определены нуклеотидные последовательности.
Выравнивание, сравнение и идентификацию последовательностей проводили с помощью
программы CLUSTALW2 и алгоритма nBLAST базы данных GenBank. Статистическую оценку
достаточности размера библиотеки клонов проводили путем расчета покрытия по индексу
Шеннона - Уивера.
В результате работы была получена библиотека клонов размером 60 образцов. С помощью
рестрикционного анализа мы распределили клоны на 6 групп и 30 единичных образцов. После
секвенирования представителей каждой из групп нуклеотидные последовательности сравнили с
базой данных GenBank . Образцы дали совпадения по базе данных от 97% до 99% с
представителями: Caulobacter segnis ATCC 21756, Candidatus Saccharimonas aalborgensis,
Candidatus Saccharibacteria bacterium RAAC3, Rhodobacter sphaeroides, Verrucomicrobium
spinosum DSM 4136 NZ_ABIZ01000001, Polaromonas sp. JS666. По результатам статистической
обработки можно сделать вывод, что выборка библиотеки в 60 клонов покрывает всего 30%
всего биоразнообразия. Дальнейшие работы будут заключаться в увеличении библиотеки генов
и анализом разнообразия по рибосомальной РНК.
КОМБИНАТИВНАЯ ИНФЕКЦИЯ ПЧЕЛ РНК-СОДЕРЖАЩИМИ ВИРУСАМИ
Калашников А.Е.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства РАСХН,
Москва, Россия
aekalashnikov@yandex.ru
Одним из паразитарных заболеваний пчел является варрооз (варроатоз) – тяжело
протекающее заболевание личинок, куколок и взрослых пчел при поражении их клещом Varroa
destructor (Genersch E., Aubert M. 2010), который, как было установлено, является
переносчиком вирусных инфекций пчел (Bereneyi O. et al, 2006, Bereneyi O. et al, 2007,).
Нами было проведено исследование семей пчел, пораженных варроатозом на территории
Адыгеи, Московской области и Удмуртии. В условиях разведения пчел на пасеках с высокой
степенью заклещеванности нами выявлено инфицирование хотя бы одним из исследуемых
207
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
вирусов DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV, CBPV (Berenyi O., et al, 2006). Показано, что в одной
из исследуемых пасек (Кизнерский район) не выявлено никаких РНК-содержащих вирусов
пчел. Показано, что во всех выборках в целом наиболее часто встречается DWV, затем SBV,
KBV, CBPV и ABPV.
На территории Удмуртии в образцах клещей обнаружен DWV и ABPV. Показано, что SBV
был обнаружен в пчелах той же семьи и не обнаружен в клещах. Причем ABPV присутствует в
клещах и не обнаружен в пчелах той же семьи (выборка д. Кенервай).
Обнаружены различия при выявлении одного и того же типа вируса двумя различными
парами праймеров DWV-1-DWV-2 и ABPV-1-ABPV-2 (Chen Y.P., et al, 2006): ABPV-2 не был
обнаружен ни в одной из исследуемых выборок пчел и клещей. Полученные данные
свидетельствуют о том, что при помощи праймеров DWV-2 не всегда удавалось обнаруживать
наличие вирусной РНК, в то время как не наблюдалось ни одного случая, когда вирусная РНК
была обнаружена при помощи пары праймеров DWV-2 и не была при помощи DWV-1,
вероятно, вследствие изменчивости генома вируса при его адаптации к новому хозяину.
Показано, что имеет место множественная (комбинированная) инфекция пчел двумя и более
вирусами (вплоть до шести одновременно), при этом наиболее часто обнаружена инфекция
двумя вирусами одновременно. Доказана закономерность обнаружения именно определенных
комбинаций вирусов у пчел. Таким образом, наиболее часто встречаются комбинации DWVABPV-CBPV-SBV-BQCV, затем DWV-ABPV-CBPV-KBV-BQCV, DWV-ABPV-KBV-SBVBQCV, DWV-ABPV-CBPV-BQCV и DWV-SBV-BQCV.
Работа поддержана грантом РФФИ 08-04-13740-офи_ц и Госконтрактом Минобрнауки
«Молекулярно-генетический анализ биоразнообразия растений, животных и человека»
14.740.12.0826 (2011-1.4-501-001).
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ РАЗНЫХ ШТАММОВ SERRATIA MARCESCENS К
ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА
1
Камалетдинова Л.Х. , Ширшикова Т.В.1, Богомольная Л.М.2, Марданова А.М.1,
Шарипова М.Р.1
1
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Институт
фундаментальной медицины и биологии, Казань, Россия; 2Техасский аграрнотехнический университет, Колледж Стейшн, Техас, США
leysan92@gmail.com
Аэробные бактерии в процессе эволюции приспособились к жизни в присутствии
кислорода. Для защиты генетического материала от разрушительного действия активных форм
кислорода в клетках бактерий присутствуют такие ферменты как каталазы и пероксидазы.
Грамотрицательная бактерия Serratia marcescens способна вызывать различные
заболевания растений, насекомых, животных и человека. В частности, было показано, что
S.marcescens способна вызывать заболевания мочеполового тракта, сепсис, респираторные и
глазные инфекции. S. marcescens обладает различными факторами вирулентности. Известно,
что вирулентность патогенных бактерий может регулироваться различными факторами и в
частности гомосеринлактоном. Важную роль в вирулентности могут играть различные
эффлюкс-сиcтемы бактерий.
Штаммы S. marcescens SR41-8000, S. marcescens SM6 и S. marcescens TT392 различаются
по чувствительности к перекиси водорода. Наиболее выражена разница в чувствительности
между диким штаммом S. marcescens SR41-8000 и его производным мутантным ТТ392.
Мутантный штамм S. marcescens TT392 практически полностью терял способность к росту в
первые часы культивирования. Lag-период культуры увеличивался до 4 часов.
Показано, что в культуральной среде штамма S. marcescens SM6 уже через час
культивирования концентрация перекиси снижалась практически до нуля, в то время как в
культуральной среде других штаммов перекись водорода исчезала только через 2 часа. За это
время значительная часть культуры погибала, что и обуславливало более медленный рост
культуры. Поскольку перекись водорода является нестабильным соединением и с течением
времени может инактивироваться, в качестве контроля определяли ее концентрацию в среде LB
208
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
без бактерий. В этих условиях концентрация перекиси водорода в среде практически не
изменялась в течение 4-5 часов.
Таким образом, дикие штаммы S. marcescens SR41-8000 и S. marcescens SM6 незначительно
различаются по чувствительности к перекиси водорода. Наиболее устойчивым к перекиси
водорода оказался штамм S. marcescens SR41-8000. Устойчивость, видимо, связана с
бактериальными метаболитами, способными инактивировать перекись водорода в среде
культивирования. Мутантный штамм S. marcescens TT392 значительно отличался от диких
штаммов. Он был получен из штамма SR41-8000 и не обладает характерной для S. marcescens
нуклеазной активностью и антибиотикоустойчивостью. Кроме того, в мутантном штамме
отсутствует система рестрикции. Мутации в геноме этого штамма, по-видимому, косвенно
нарушают защитные механизмы бактерии к активным формам кислорода.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ФЛАВОНОИДОВ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА ЛИПОПОЛИСАХАРИДА БАКТЕРИЙ
AZOSPIRILLUM BRASILENSE SP245
Каневский М.В.1,2, Петрунина А.А.2
1
ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН;
2
ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского,
Саратов, Россия
matvejkanev@mail.ru
Флавоноиды – вторичные метаболиты растений фенольной природы, играющие важную
роль в растительно-бактериальных взаимодействиях. Ранее показано, что эффект воздействия
флавоноидов на ризобактерии реализуется в изменении состава и структуры гликополимеров
поверхности бактерий: экзо-, капсульных и липополисахаридов (ЛПС). Однако характер
воздействия флавоноидов на состав ЛПС клеточной мембраны азоспирилл остаётся
малоизученным.
Целью настоящей работы было исследование влияния присутствия в среде выращивания
флавоноидов (кверцетина и рутина) на свойства поверхности и макромолекулярную
организацию ЛПС бактерий A. brasilense Sp245. Бактерии культивировали на селективной
синтетической среде с малатом натрия до окончания экспоненциальной фазы роста в
присутствии различных концентраций флавоноидов (от 9,4 мкг/мл до 1,2 мг/мл).
ЛПС экстрагировали из сырой биомассы ЭДТА-экстрагирующим буфером. Экстракты
подвергали протеиназной обработке, а затем проводили ДСН-ПААГ-электрофорез.
Визуализацию углеводных компонентов осуществляли окрашиванием нитратом серебра с
предварительным перйодатным окислением.
Установлено, что добавление в среду флавоноидов приводило к изменению
макромолекулярной организации ЛПС. Также было показано, что эффект воздействия
флавоноидов проявляется на низких (от 9,4 до 37,5 мкг/мл) и высоких (300 мкг/мл)
концентрациях. При культивировании бактерий в присутствии кверцетина и рутина в
мембранном пуле ЛПС присутствовали молекулы с разной длиной О-цепи, при этом
увеличивалось содержание высокомолекулярных фракций гликополимера. Известно, что от
длины цепи О-специфического полисахарида зависит способность молекулы определять
доступность специфических сайтов связывания бактерий с макропартнёром.
Методом твёрдофазного иммуноферментного анализа было показано, что культивирование
бактерий в присутствии флавоноидов снижает уровень сродства антиген-антитело, что может
свидетельствовать о появлении в составе ЛПС дополнительных антигенных детерминант.
Таким образом, впервые установлен волнообразный характер эффекта ответных реакций
азоспирилл на присутствие в среде культивирования флавоноидов, проявляющийся в
изменении свойств макромолекулярной организации ЛПС внешней мембраны азоспирилл и
физико-химических свойств поверхности бактериальной клетки.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (проект 11-04-00533).
209
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ПОЛИАМИНЫ СПОСОБСТВУЮТ ФОРМИРОВАНИЮ ПЕРСИСТОРНЫХ
КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI
Караваева Е.А., Кашеварова Н.М., Ткаченко А.Г.
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
karavaeva.elena2009@yandex.ru
Персисторы – это субпопуляции микроорганизмов с «замершим» метаболизмом,
фенотипически толерантные к антибиотикам. Основная роль в развитии покоящегося
состояния клеток, как для спонтанной, так и индуцированной персистенции, отводится токсинантитоксиновым парам белков, однако с каждым годом описывается вклад в этот процесс все
новых регуляторных факторов (продуктов экспрессии генов системы SOS-ответа, генов
теплового и холодового стрессов и др.).
Нами сделано предположение, что в качестве потенциальных регуляторов персистенции
могут выступать полиамины (ПА) (путресцин, спермидин, кадаверин), алифатические
углеводороды с двумя и более аминогруппами. Установлено, что ПА требуются для
нормального протекания различных биохимических и физиологических процессов в клетках
всех живых организмов. Кроме того, доказано участие ПА в регуляции экспрессии генов,
участвующих в адаптации ко многим видам стресса.
С целью изучения возможной роли ПА в персистообразовании полиамин-зависимые
мутантные штаммы E. coli SHT03 и SL60 культивировали в синтетической минеральной среде
М9 в условиях присутствия и отсутствия путресцина. В течение роста производили отбор
клеток, одну часть из которых высевалась на агаризованую среду для подсчета
колониеобразующих единиц (КОЕ), а другую переносили в свежую среду М9, содержащую
аминогликозидный антибиотик нетилмицин в концентрациях 2,8, 8, 16 мкг/мл для штамма
SHT03 и 8, 16, 32 мкг/мл для SL60. Использованные концентрации антибиотика на несколько
порядков превышали минимальную подавляющую концентрацию (МПК) для исследуемых
штаммов. После трехчасовой экспозиции с аминогликозидом клетки полиамин-дефицитных
штаммов высевали на чашки с LB-агаром для подсчета КОЕ спустя 24 ч инкубирования.
Частоту персистообразования (ЧП) подсчитывали путем деления величины КОЕ/мл в культуре
после инкубации с нетилмицином на КОЕ/мл в культуре без добавки антибиотика.
Нами показано, что ЧП полиамин-дефицитных штаммов, выращенных в среде с внесением
путресцина, была на несколько порядков выше, чем в варианте без добавки ПА. Данный
эффект наблюдался при всех исследованных нами концентрациях нетилмицина. ЧП достигала
пика при переходе клеток в стационарную фазу. Наибольшее значение наблюдалось при
минимальной концентрации антибиотика.
Таким образом, внесенные в среду ПА стимулируют персистообразование E. coli.
Механизм, лежащий в основе данного эффекта, предположительно обусловлен модулирующим
эффектом ПА на экспрессию генов, участвующих в персистенции.
МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА МНОГОЛЕТНЕМЕРЗЛЫХ ПОРОД
ОАЗИСОВ АНТАРКТИДЫ
Караевская Е.С.1, Булат С.А.2, Ривкина Е.М.1
1
ФГБУН Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН,
Пущино; 2ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова,
ФГБУ Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»,
Гатчина, Россия
katya_k_s@mail.ru
Культуральными и некультуральными методами нами были охарактеризованы мерзлые
отложения возрастом от 7 до 50 тыс. лет. Районами отбора образцов были остров Кинг Джордж
(станция Беллинсгаузен), оазис Ширмахера (станция Новолазаревская), холмы Ларсемана
(станция Прогресс 2), оазис Бангера (станция Оазис II), берег Хобса (станция Русская).
Полученные данные позволили сравнить общую численность клеток, КОЕ аэробных
бактерий, а также разнообразие культивируемых и некультивируемых бактерий и
некультивируемых архей в мерзлоте разного возраста, происхождения и геокриологических
210
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
условий. Среди культур аэробных бактерий, выделенных из различных районов нами
идентифицированы представители родов Pedobacter, Kocuria, Microbacterium, Micrococcus,
Frigobacterium, Leifsonia, Acinetobacter, Streptomyces, Rhodococcus, Bacillus, Devosia,
Salinebacterium, Polaromonas, Cryobacterium.
Среди бактериальных филотипов из морских отложений острова Кинг Джордж –
представителей родов Firmicutes, Flavobacterium, Arthrobacter, Syntrophomonas, Streptomyces,
Spirosoma, Nitrosospira, Caldilinea , Algidimarina, Acidisphaera, Gaiella, Sandarakinorhabdus,
Sphingomonas, Motilibacter, Blastocatella, Methylibium, Desulfosporosinus, Desulfobacterium,
Tissierella, среди архейных филотипов – родственные родам Methanosarcina, Nitrososphaera,
Methanobrevibacter, Methanogenium, Methanolobus и Methanoculleus, а также филотипами,
родственными представителям аммоний-окисляющих архей, термофилов и ацидофилов.
Архейные филотипы двух образцов отложений оазиса Бангера характеризовались двумя
доминантными филотипами класса Methanomicrobia.
ОБНАРУЖЕНИЕ SNP МАРКЕРА ГЕТЕРОГЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ
ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
Каторкин С.А., Бурмакина Г.С., Малоголовкин А.С., Колбасов Д.В.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и
микробиологии РАСХН, Покров, Россия
katorkin2012@mail.ru
Начиная с 2007 года вспышки африканской чумы свиней (АЧС) постоянно регистрируются
на территории Российской Федерации. ДНК-содержащий вирус поражает домашних свиней и
кабанов. Уровень смертности достигает 100%. На протяжении пяти лет циркуляции вируса
АЧС на территории нашей страны не было отмечено изменений в биологических и
генетических свойствах вируса и течении болезни. Тем не менее, результаты недавних
исследований говорят о возможной гетерогенности вирусной популяции среди
циркулирующих изолятов вируса.
Целью наших исследований являлось провести анализ коллекции изолятов вируса АЧС,
выделенных на территории России в 2009-2013 г.г. для обнаружения генетических изменений в
структуре наиболее вариабельных участков генома вируса.
Для решения поставленной цели использовали методы генотипирования и AFLP генома
вируса АЧС, рекомендованные международным эпизоотическим бюро (МЭБ), а также
предложенный нами анализ нуклеотидных последовательностей участка гена B602L.
В работе использовали 50 изолятов вируса АЧС, выделенных от вспышек болезни с
территорий Ростовской, Волгоградской, Тверской, Смоленской, Воронежской, Тульской,
Тамбовской, Псковской, Саратовской, Владимирской и Ярославской областей, Краснодарского
и Ставропольского края, а также республике Беларусь.
С использованием стандартных протоколов анализа генома вируса АЧС, нами не было
выявлено генетических изменений в составе генов p72, p54, p30, CD2v. Однако использование
нуклеотидного секвенирования участка гена B602L выявило несинонимическую замену
аденина на тимина в позиции генома вируса АЧС. Достоверность замены проверили
независимой постановкой полимеразной цепной реакции и повторным нуклеотидным
секвенированием.
В результате анализа SNP мутации среди изолятов вируса АЧС было установлено, что
замена в гене B602L впервые регистрировалась среди изолятов 2010 г, выделенного из Южного
федерального Округа (Ростовская область и Краснодарский край). Более поздние вспышки
болезни (2011-2013гг) сопровождались увеличением количества обнаруженных мутантных
вариантов вируса АЧС. Интересно также, что в регионах эндемичных по АЧС (Тульская и
Тверская области) мутантный вариант вируса доминировал.
На основании проведенных исследований нами впервые установлена гетерогенность
изолятов вируса АЧС, циркулирующих на территории Российской Федерации. Мутация в гене
B602L может являться SNP маркером для экспресс-анализа изолятов вируса АЧС и служить
дополнительным методом молекулярной эпидемиологии.
211
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА ANCYLOBACTER ABIEGNUS
Кичемазова Н.В., Бухарова Е.Н., Карпунина Л.В.
ФГБОУ ВПО Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова,
Саратов, Россия
natali8519@mail.ru
В настоящее время в современной биотехнологии и микробиологии остается актуальной
задача поиска микроорганизмов-продуцентов экзополисахаридов (ЭПС) с уникальными
свойствами. В дальнейшем эти биополимеры находят применение в различных отраслях
промышленности, медицины, сельского хозяйства и др. Для того, чтобы наметить перспективы
применения бактериального ЭПС, необходимо изучить его моносахаридный состав,
молекулярную массу, вязкость растворов.
Целью работы явилось изучение химического состава и некоторых физико-химических
свойств ЭПС Ancylobacter abiegnus Z-0056. Культура бактерий A. abiegnus Z-0056 была
любезно предоставлена нам для исследований сотрудниками Института микробиологии имени
С.Н.Виноградского РАН. Этот организм является представителем олиготрофных
ацидофильных бактерий, использующих в качестве источника углерода и энергии вещества,
образующиеся в процессе разложения древесины ксилотрофными грибами. Ранее нами было
обнаружено, что бактерии A. abiegnus Z-0056 выделяют в среду ЭПС анцилан; были подобраны
условия, необходимые для максимального продуцирования этого биополимера.
В настоящей работе были изучены химический состав и некоторые физико-химические
свойства этого экзополисахарида. Для получения ЭПС культуру выращивали при 25°С в
течение 100 ч на термостатируемом шейкере-инкубаторе, при 200 об/мин на среде МСО,
которая содержала модифицированные соли Хатнера, сукцинат натрия, дрожжевой экстракт,
витамины, нитрат аммония, фосфат калия. ЭПС выделяли по ранее описанному методу. При
помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии было показано, что анцилан состоит
из глюкозы, маннозы, галактуроновой кислоты в соотношении 1:2:2. Было обнаружено наличие
следовых количеств галактозы, арабинозы и фукозы. Молекулярная масса ЭПС составила 10-20
кДа. Анализ динамической вязкости 1% раствора ЭПС A. abiegnus Z-0056 показал, что при
+25°С она составляет 52 мПа•с.
ОСОБЕННОСТИ СИМБИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ РЕЛИКТОВОГО БОБОВОГО
РАСТЕНИЯ VAVILOVIA FORMOSA (STEV.) AN. FED. И ЕГО РИЗОБИЙ
Кимеклис А.К.1, Сулима А.С.1, Сафронова В.И.1, Белимов А.А.1, Чижевская Е.П.1,
Пинаев А.Г.1, Пухаев А.Е.2, Попов К.П.3, Андронов Е.Е.1
1
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт
сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург;
2
ФГБОУ ВПО Горский государственный аграрный университет, Владикавказ;
3
ФГБУ Северо-Осетинский государственный природный заповедник, Алагир, Россия
kimeklis@gmail.com
Бобово-ризобиальный симбиоз – одна из наиболее красивых моделей для изучения
коэволюции сигнальных систем растения-хозяина и бактерии-симбионта, обеспечивающих
строгую хозяйскую специфичность симбиоза. К настоящему времени симбиотические гены
бобовых и ризобий детально изучены, что является хорошей предпосылкой для эволюционного
анализа.
Объектом нашего исследования является реликтовое многолетнее бобовое растение –
Вавиловия прекрасная (Vavilovia formosa), являющаяся эндемиком нескольких регионов
Кавказа и, вероятно, наиболее близким родственником общего предка горохов. В 2012 г. в
заповеднике на территории Северной Осетии удалось обнаружить популяцию вавиловии и
отобрать несколько растений с клубеньками для дальнейших исследований. По литературным
данным вавиловия практически не поддаётся культивированию в условиях ex vivo, о её
способности образовывать клубеньки в лабораторном микровегетационном эксперименте
212
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ничего не известно. Поэтому целью настоящего исследования было выделение живых ризобий
из клубеньков для изучения их таксономической принадлежности и особенностей
симбиотических генов.
Для 16 полученных штаммов на основе последовательностей 16S рРНК и ITS было
установлено, что 12 из них относятся к виду Rhizobium leguminosarum, когда как остальные
принадлежат к родам Bosea, Rhodopseudomonas, Bradyrhizobium и Phyllobacterium. Все ризобии
вида R. leguminosarum показали наличие симбиотического гена nodA, последовательность
которого соответствует гену nodA R. leguminosarum bv. viciae. Неожиданным результатом
оказалось, что все эти штаммы показали наличие гена nodX, характерного симбионтам гороха
«афганского» фенотипа, геном которого содержит аллель sym2, предположительно
кодирующую специфичный рецептор Nod-фактора. Нуклеотидная последовательность этого
гена ещё не известна, но секвенирование гена lykX, на данный момент считающимся
претендентом на роль этого рецептора, показало, что у вавиловии не наблюдаются
аминокислотные замены, характерные данному гену афганского гороха, но присутствуют иные,
не встречающиеся ни в европейских, ни афганских линиях.
Следующей ступенью исследования является постановка микровегетационного опыта с
полученными штаммами ризобий на растениях гороха с двумя целями: (1) проверить
симбиотическую активность штаммов, не относящихся к R. leguminosarum bv. viciae, (2)
установить, является ли присутствие гена nodX в геномах остальных штаммов необходимым
для установления эффективного бобово-ризобиального симбиоза.
ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ
ШТАММА MAGNETOSPIRILLUM SP. BB-1
Козяева В.В., Дзюба М.В.
ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, Россия
vkoziaieva@mail.ru
К магнитотактическим бактериям (МТБ) относятся разнообразные по морфологии,
физиологии и таксономии прокариоты, объединенные способностью синтезировать
внутриклеточные кристаллы магнетита (Fe3O4) или грейгита (Fe3S4), окруженные
липопротеиновой мембраной – магнетосомы. Наличие магнетосом определяет способность
МТБ к магнитотаксису – пассивному ориентированию и направленному движению вдоль
силовых линий геомагнитного поля. Накапливая большое количество железа, МТБ играют
важную роль в круговороте этого элемента в водных экосистемах. Кроме того МТБ имеют
большой биотехнологический потенциал, поскольку для магнетосом, как магнитных
наночастиц биологического происхождения, было предложено множество применений: в
качестве носителя для направленной доставки лекарств, в качестве контрастирующих агентов в
МРТ и др.
Цель данного исследования заключалась в физиологической характеристике нового
штамма магнитотактических спирилл Magnetospirillum sp. ВВ-1, выделенного из донных
осадков р. Москва.
Клетки штамма ВВ-1 имеют форму спирилл 0,4×1-2 мкм и синтезируют
кубооктаэдрические магнетосомы, диаметром 40-50 нм, до 20 шт. на клетку.
В результате проведенной работы было показано, что штамм ВВ-1 является мезофилом –
растет в диапазоне температур 20-37°С (оптимум – 25-32°С). Диапазон рН 5,5 - 8,5 (оптимум 6,5-7,5). Рост культуры прекращается при концентрации NaCl в среде выше 1%. По отношению
к кислороду штамм микроаэрофилен, оптимальная концентрация кислорода в газовой фазе для
роста и синтеза магнетосом – 1%. В качестве источников углерода и доноров электронов
штамм ВВ-1 может использовать глицерол, казаминовые кислоты, сукцинат, малат, ацетат,
тартрат, фумарат, пируват, пропионат, цитрат, бутират, лактат. Сахара (глюкоза, мальтоза,
сахароза, лактоза, маннит) и спирты (метанол, этанол) не использует. Комплексные добавки:
соетон, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, мясной пептон также поддерживали рост
штамма ВВ-1. В качестве акцепторов электронов могут выступать кислород и нитрат.
Основной тип метаболизма - хемоорганогетеротрофный.
213
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
Была также проверена способность штамма к автотрофному росту. Рост проявился на
средах, содержащих Fe2+ или S2O32- в качестве донора электронов и HCO3-/CO2 в качестве
источника углерода.
Полученные данные о физиологических особенностях Magnetospirillum sp. BB-1 могут
служить для рационального подбора питательных сред и условий роста, необходимых как для
эффективного синтеза бактериальных магнитных частиц, так и для планируемых дальнейших
генетических манипуляций со штаммом.
ИЗУЧЕНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
В ВОДНОЙ ТОЛЩЕ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ
Корнеева В.А.1,2, Брюханов А.Л.1,2, Пименов Н.В.2
1
Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, биологический
факультет; 2Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН,
Москва, Россия
busenica@yandex.ru
Балтийское море при средней глубине 51 м характеризуется сложным строением водной
толщи, в частности имеет место стратификация в районах впадин, где в результате застойных
явлений в придонных слоях накапливается сероводород. В Гданьской впадине зона хемоклина
формируется на глубине 80 м.
Предполагается, что основная часть H2S в подобных экосистемах образуется в результате
процессов жизнедеятельности сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), являющихся, наряду с
метаногенными археями, конечными деструкторами органического вещества в анаэробных
условиях. Известно, что СРБ, считавшиеся долгое время строгими анаэробами, на самом деле
обладают эффективными механизмами антиокислительной защиты и могут оставаться
физиологически активными в местообитаниях, подвергающихся постоянному или временному
воздействию кислорода.
Целью нашего исследования являлось обнаружение и изучение филогенетической
принадлежности СРБ в водной толще Гданьской впадины Балтийского моря с использованием
молекулярно-биологических методов.
С помощью ПЦР было показано наличие фрагментов гена dsrB (кодирующего βсубъединицу диссимиляторной сульфитредуктазы, характерной для всех СРБ) в образцах ДНК,
выделенных из водных проб со всех исследуемых глубин (0, 10, 30, 50, 80, 102 и 107 м)
Гданьской впадины Балтийского моря. ПЦР-анализ фрагментов гена 16S рРНК выявил
присутствие свободноживущих сульфатредукторов, относящихся к группе Desulfotomaculum,
на всех исследуемых глубинах, кроме 107 м. Ассоциированные представители данной группы
встречались только в верхних аэробных (0, 10 и 30 м) и анаэробных (102 и 107 м) слоях.
Свободноживущие Desulfobacter spp. были обнаружены только в верхних аэробных водах (0, 10
и 30 м), а ассоциированные – наоборот, только в анаэробных (102 и 107 м). Фрагменты 16S
рДНК
бактерий
групп
Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina
и
DesulfovibrioDesulfomicrobium (как свободноживущих, так и ассоциированных форм) были обнаружены на
всех исследуемых глубинах. Представителей Desulfobulbus и Desulfobacterium в водной толще
Гданьской впадины с помощью ПЦР выявлено не было.
Было проведено разделение продуктов амплификации фрагментов гена dsrB из водных
проб с различных глубин посредством ДГГЭ. Секвенирование фрагментов ДНК, выделенных
из отдельных ДГГЭ-полос, показало для водной толщи Гданьской впадины наибольшую
гомологию с представителями родов Desulfovibrio (70-82%), Desulfococcus (72-80%),
Desulfotomaculum (70-78%) и Desulfobacter (72-77%), что подтверждает данные ПЦР-анализа.
214
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ НА
ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И МОРФОЛОГИЮ ПОВЕРХНОСТИ
КЛЕТОК РОДОКОККОВ
Коршунова И.О.1, Куюкина М.С.1,2, Ившина И.Б.1,2
1
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН;
2
ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский
университет, Пермь, Россия
subunit2012@yandex.ru
Органические растворители оказывают разрушающее действие на бактериальные клетки,
вызывая их гибель. Механизм действия данных веществ обусловлен показателем их
гидрофобности, измеряемом как логарифм коэффициента распределения в системе октанолвода (logP). Актинобактерии рода Rhodococcus обладают высокой устойчивостью к
углеводородным соединениям.
Цель работы – изучение влияния органических растворителей на жизнеспособность и
поверхностную морфологию клеток родококков с помощью атомно-силовой микроскопии.
В работе использован штамм R. ruber ИЭГМ 231 из Региональной профилированной
коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, WDCM # 768;
www.iegm.ru/iegmcol/strains). Жизнеспособность бактерий определяли методом окрашивания
йодонитротетразолия хлоридом после инкубирования в системе растворитель-вода (1:1).
Сканирование клеток осуществляли с помощью атомно-силового микроскопа Asylum MFP-3D
в полуконтактном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера AC240TS.
Размер сканирования – 10 мкм.
Родококки сохраняли высокую жизнеспособность в присутствии декана (logP=5,6) и
циклогексана (logP=3,2). Число живых клеток составляло 73–85% после 1 ч инкубирования и
снижалось до 18-27% после 5 сут. При воздействии толуола (logP=2,5) жизнеспособность
бактерий составляла 45% после 1 ч и далее снижалась до 5%. Бутанол (logP=0,8) и ацетонитрил
(logP=-0,33) вызывали ≥ 96%-ную гибель клеток уже в первые минуты инкубации. Под
действием растворителей происходила деформация поверхности (повышение шероховатости на
6–19%) и уменьшение площади поверхности (на 19–44%) клеток в течение первых суток.
Выявлена прямая зависимость между коэффициентом шероховатости и показателем
жизнеспособности родококков. Так, при воздействии наиболее гидрофобного растворителя
(декана), наблюдался 10%-ный рост данного показателя при неизменных размерах клеток. В
присутствии циклогексана происходило увеличение площади поверхности (на 5%) и
шероховатости (на 3%). Однако длительный контакт с менее гидрофобными толуолом,
бутанолом и ацетонитрилом приводил к разглаживанию поверхности (снижению
шероховатости на 3–25%) и массовой гибели клеток. Таким образом, возрастание
шероховатости и, следовательно, площади клеточной поверхности может служить механизмом
адаптации родококков к воздействию гидрофобных органических растворителей.
Исследования выполнены при поддержке гранта президента РФ «Ведущие научные
школы» № НШ-4607.2014.4 и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная
биология».
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ
ARTHROBACTER SULFONIVORANS
Костеневич А.А.
Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
A.Kastsianevich@gmail.com
β-Галактозидаза (лактаза, β-галактозид-галактогидралаза, КФ 3.2.1.23) катализирует
гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы, а также синтез галактоолигосахаридов.
Катализируемые ферментом реакции обусловливают и сферы его применения – получение
безлактозных продуктов питания и кормов; лекарственных препаратов для больных с лактазной
недостаточностью;
глюкозо-галактозных
сиропов
из
молочной
сыворотки;
галактоолигосахаридов.
215
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
Ранее нами был отобран и идентифицирован как Arthrobacter sulfonivorans штаммпродуцент β-галактозидазы необычной для прокариотических организмов внеклеточной
локализации, определены его физиолого-биохимические особенности, охарактеризованы
основные физико-химические свойства продуцируемого бактериями ферментного белка. По βгалактозидазной активности A. sulfonivorans не уступает лучшим зарубежным аналогам, что
подтверждается положительным решением на выдачу нам патента РБ
На современном этапе развития индустрии биопрепаратов микробного происхождения или
продуктов на их основе уже недостаточно ограничиваться только потенциальными ресурсами
природных штаммов-продуцентов. Это обусловлено тем, что рекомбинантные штаммы по
продуктивности многократно их превосходят при экономии материальных и энергоресурсов в
процессе биотехнологического использования. Так, например, на долю ферментов,
продуцируемых генетически модифицированными микроорганизмами, может приходиться до
80% синтезируемого ими белка.
В результате проведенных исследований, нами из 10 позитивных по β-галактозидазной
активности клонов E. coli DH5α, были отобраны 3 рекомбинанта, наследующие гибридные
плазмиды pRSET B (p№4, p№6 и p№8) со вставками ДНК A. sulfonivorans различного размера и
проявляющие максимальную ферментативную активность. В результате молекулярногенетического анализа построены рестрикционные карты плазмид, несущих вставку с геном βгалактозидазы длиной 7750, 9800 и 5500 п.о. Дальнейшие исследования создадут предпосылки
для создания штамма-суперпродуцента с преобладанием в синтезируемом им комплексе бетагалактозидазы компонента гидролитического или трансгалактозилирующего действия.
Работа выполнена в рамках проекта № Б12М-102, финансируемого Белорусским
республиканским фондом фундаментальных исследований.
БИОДЕСТРУКТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ПОЧВЕННЫХ
НИТРИЛУТИЛИЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
Максимова А.В., Кузнецова М.В.
ФГБУН Институт экологии и генетики УрО РАН, Пермь, Россия
nuta-max@ya.ru
Почвы, несмотря на техногенные воздействия, способны поддерживать гомеостаз за счет
регуляторных механизмов, основанных на микробном пуле и пуле ферментов,
контролирующих синтетико-деструктивные биохимические процессы в почве. Ферменты
участвуют в процессах «самоочищения» почв от экзогенных веществ, трансформируя,
нейтрализуя, разрушая не свойственные почвам вещества, которые могут быть токсичными
изначально или в результате их накопления выше определенных пределов.
Ранее сотрудниками лаборатории было показано, что нитрилгидролизующие
микроорганизмы в основном составляют 1-2% от общего числа гетеротрофов в почвах
естественной среды. В почвах, отобранных с предприятий по производству акриламида,
микроорганизмы, способные к утилизации нитрилов, составляли не менее 20%, а в ряде проб –
более 40% от общего числа выделенных бактерий.
Нитрилгидратазная активность выделенных штаммов (n=139) по акрилонитрилу
варьировала от 0 до 95,5 ЕД, медиана (квартили) составили 0,84 (0,17-12,5). При сопоставлении
штаммов, выделенных из почв естественной среды (n=40) и химически измененных (n=99),
оказалось, что третья квартиль значений для первой группы была равна 3,26 ЕД, тогда как 75%
второй группы укладывались в диапазон активностей от 0 до 14,5 ЕД. Максимальная
активность достигала 33,5 ЕД в первой группе, и 95,5 ЕД во второй группе штаммов. При
исследовании способности штаммов конвертировать различные нитрилы и соответствующие
амиды оказалось, что суммарная амидазная активность была несколько ниже, чем
нитрилгидратазная (медианы равны 1,56 и 3,1 соответственно). Однако, скорость
трансформации двух- и трехуглеродных амидов (ацетамид, акриламид и пропионамид) была
выше, чем соответствующих нитрилов. Так, медиана значений активности по ацетонитрилу
составила 2,5 ЕД, а по ацетамиду – 9,4 ЕД. Корреляционный анализ в ряду субстратов показал,
что нитрилгидратазная и амидазная активности практически не зависят друг от друга у
большей части культур. Значимая связь была отмечена между значениями скорости
216
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
трансформации производных уксусной, пропионовой, масляной и изомасляной кислот в ряду
штаммов (R=0,492; 0,474; 0,600; 0,469 соответственно), однако она не всегда была достоверной.
Таким образом, сравнительный анализ почв естественной среды и антропогенноизмененных показал, что последние обладают большей деструктивной активностью в
отношении производных карбоновых кислот, а также являются источником промышленно
значимых штаммов.
Работа выполнена в рамках молодежного проекта УрО РАН 14-4-НП-218 и гранта РФФИ
13-04-96050.
ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ СВОЙСТВА АНТИФУНГАЛЬНЫХ
МЕТАБОЛИТОВ ЭНДОФИТНЫХ ШТАММОВ BACILLUS SUBTILIS
Нафикова А.Р.
ФГБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН,
Уфа, Россия
aigoul.nafikova@gmail.com
Эндофитные штаммы бактерии Bacillus subtilis Cohn, обладающие высокой
антагонистической активностью к широкому спектру патогенных грибов и относящиеся к
стимулирующим рост растений микроорганизмам, рассматриваются в качестве перспективной
основы новых полифункциональных препаратов для растениеводства. Известно, что одним из
наиболее вероятных механизмов антагонистического действия бактерий рода Bacillus на
мицелиальные грибы является продукция веществ антибиотической природы. Цель работы
заключалась в характеристике поверхностно-активных свойств антифунгальных метаболитов
эндофитных штаммов B. subtilis.
Объектами исследования стали штаммы B. subtilis 11ВМ, 11РН, 49РН, 161РН, 121РН,
выделенные из внутренних тканей растений пшеницы, а также штамм B. subtilis 26Д,
являющийся основой биофунгицида «Фитоспорин-М». Ранее было показано, что
перечисленные штаммы проявляют разную степень антагонистичности к грибам родов
Alternaria, Bipolaris, Botrytis, Cladosporum, Fusarium, Penicillum.
Бактериальные метаболиты получены путем осаждения соляной кислотой из
культуральной жидкости. С использованием бумажных дисков, пропитанных выделенными
метаболитами, показана их антифунгальная активность к возбудителям корневых гнилей
пшеницы - грибам рода Fusarium (F. graminearum, F. avenaceum, F. poae, F. culmorum, F.
tricinctum), а также Bipolaris sorokiniana.
Поверхностное натяжение водных растворов метаболитов концентрацией 1мг/мл, а также
взятых в качестве контроля растворов неионогенных (Tween 20, Triton X-100) и анионного
(додецилсульфат натрия) ПАВ измеряли с помощью оптического тензиометра Attension Theta
Lite. Анализ показал, что метаболиты всех штаммов бацилл снижают поверхностное натяжение
воды подобно коммерческим поверхностно-активным веществам. Так, если поверхностное
натяжение растворов составило для Tween 20, Triton X-100 и SDS 47,62±0,22, 32,62±0,22 и
54,92±0,15 мН/м, соответственно, то для растворов выделенных нами метаболитов, например,
из штаммов 11РН и 49РН соответственно от 27,77±0,94 до 51,65±0,22 мН/м.
Обнаружена определенная связь антигрибной активности испытанных штаммов со
свойством их метаболитов снижать поверхностное натяжение воды. Так, например, самый
сильный антагонист фитопатогенных грибов штамм 11РН продуцирует наиболее активные
поверхностно-активные вещества. Причем, количественный выход метаболитов 11РН с
единицы объема питательной среды в среднем в 2-3 раза превышает таковой у остальных
штаммов.
217
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
АНАЛИЗ ПОЛНОГО ГЕНОМА ШТАММА
XANTHOMONAS ARBORICOLA YA3004
Кырова Е.И.1, Виноградова С.В.1,2, Головешкина Е.Н.2, Игнатов А.Н.1,2,3
1
ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов;
2
ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН; 3ГНУ Всероссийский научно-исследовательский
институт фитопатологии РАСХН, Москва, Россия
an.ignatov@gmail.com
Xanthomonas arboricola – фитопатогенная, грамотрицательная палочка, представленная 7
патовариантами: X.arboricola pv. celebensis (растение-хозяин–банан), X. arboricola pv. corylina
(растение-хозяин–фундук), X. arboricola pv. fragariae (растение-хозяин–земляника), X.
arboricola pv. juglandis (растение-хозяин–грецкий орех), X. arboricola pv. poinsettiicola
(растение-хозяин–молочай), X. arboricola pv. populi (растение-хозяин–тополь), X. arboricola pv.
pruni (растение-хозяин–груша).
В 2006-2009 гг. в коллекциях штаммов рода Xanthomonas ВНИИ фитопатологии и Центра
«Биоинженерия» РАН были выявлены штаммы X. arboricola, поражающие нетипичные
растения-хозяева – злаки, овощные и масличные капустные, томат, подсолнечник
(вирулентность к грецкому ореху и груше сохраняется). При анализе фрагментов 7 генов: gyrB
(β-субьединица ДНК-гиразы), dnaK (70-кДа белок теплового шока (Hsp70)), purA (аденилсукцинат синтетаза), rpoD (σ-фактор РНК-полимеразы), prpC (цитрат синтетаза), fabB (ген
синтеза жирных кислот), nrdB (β-субъединица РНК-дифосфат редуктазы) коллекции штаммов с
помощью метода MLST/MLSA, согласно протоколам Young et al. (2008) и Ignatov et al. (2007)
было обнаружено, что ряд штаммов X. arboricola имеют аллели генов gyrB, dnaK и nrdB, prpC
более близкие к штаммам других видов (X. campestris, X. euvesicatoria, X. oryzae).
Мы предположили наличие горизонтального переноса генов. Для проверки гипотезы был
получена полная последовательность ДНК геном штамма X. arboricola 3004 (выделен из
ячменя). Полученная последовательность состоит из 132 контигов длиной от 198173 до 528 п.о.
Последовательность полного генома частично аннотирована сервером RAST (Rapid Annotation
using Subsistem Technology). Выявлена 4113 кодирующая последовательность и 55 RNA,
организованны 450 подсистем. Так же в геноме были обнаружены последовательности фага
Xantho Xp10 (X. oryzae). Упорядочивание контигов было выполнено в программе Mauve
Assembly Metrics 2.3.1. с использованием полного генома штамма X. axonopodis pv. citri 306.
Анализ генома показал, что гипотеза о горизонтальном переносе генов была неверна, и
штаммы, отнесенные к X. arboricola, представляют собой группу, близкую к последнему
общему предку видов рода Xanthomonas, вероятно, сохранившую аллели генов, близкие к
различным видам этого рода.
ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА АДАПТАЦИИ В СИСТЕМЕ ИММУННОСТИ
CRISPR/CAS ESCHERICHIA COLI
Ненарокова А.А.1,2, Строцкая А.В.3,4,5
1
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова;
2
ФГБУН Институт биологии гена РАН, Москва; 3Сколковский институт науки и
технологии, Московская область; 4ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский
государственный политехнический университет, Санкт-Петербург;
5
ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия
a.nenarokova@gmail.com, sandrynn5@gmail.com
CRISPR/Cas-система (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPRassociated proteins) – адаптивная защитная система прокариот от чужеродного генетического
материала. CRISPR-система состоит из CRISPR-кассет и CAS-генов, обеспечивающих её
функционирование. CRISPR-кассета представляет собой набор коротких повторов,
разделённых спейсерами. Новые спейсеры возникают в результате встраивания в CRISPRкассету участков чужеродной ДНК – протоспейсеров. Этот процесс называется CRISPRадаптацией. При проникновении в клетки ДНК, содержащей протоспейсер, соответствующий
218
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
одному из спейсеров в геноме, происходит распознавание и уничтожение этой ДНК – CRISPRинтерференция. При наличии в проникшей ДНК мутации в значимом районе протоспейсера
(эскейп-мутации), интерференция нарушается, однако такая ДНК стимулирует у клеток
ускоренное встраивание новых спейсеров. Многие детали процесса CRISPR-адаптации
остаются мало изученными.
Целью данной работы является изучение динамики процесса CRISPR-адаптации и его
связи с процессом CRISPR-интерференции на модельной системе, включающей клетки E. coli и
плазмиды.
Для осуществления поставленной цели использовался штамм E. coli с индуцибельной
CRISPR-системой, имеющий в CRISPR-кассете спейсер против участка гена G8 бактериофага
M13, и плазмида, имеющая соответствующий протоспейсер и обеспечивающая устойчивость к
ампициллину.
В серии экспериментов культуры клеток, содержащие плазмиды с протоспейсерами дикого
типа и протоспейсеры с эскейп-мутацией (эскейп-протоспейсеры), выращивали в среде,
содержащей индукторы CRISPR-системы. Эффективность интерференции определяли с
помощью измерения концентрации плазмид в культуре, а также по количеству выживших
ампициллин-устойчивых клеток. Эффективность CRISPR-адаптации – с помощью ПЦР-анализа
на удлинение CRISPR-кассеты, которое свидетельствует о приобретении новых спейсеров.
В настоящей работе впервые показано, что CRISPR-интерференция с низкой
эффективностью может происходить против плазмид с эскейп-протоспейсером, причём этот
процесс наблюдается и в штаммах с инактивированными CAS1/CAS2-генами, ответственными
за CRISPR-адаптацию. Также было продемонстрировано, что эффективность CRISPRинтерференции и адаптации растет при увеличении количества эскейп-протоспейсеров в
плазмиде. Получена количественная оценка скорости CRISPR-интерференции и эффективности
CRISPR-адаптации. Эти параметры в дальнейшем будут использованы для математического
моделирования динамики взаимодействия клеток E.coli с плазмидами в присутствии
CRISPR/Cas-системы.
БИОРАЗНООБРАЗИЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ
ЭНДОФИТОВ СЕМЯН ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.)
Новоселова Н.Н., Ахтемова Г.А., Борисов А.Ю., Жернаков А.И., Тихонович И.А.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург, Пушкин, Россия
nataniika@yandex.ru
В настоящее время во всем мире ведется активный поиск растительных эндофитов и
определение их функциональной значимости.
Целью работы являлось изучение биоразнообразия культивируемых прокариотических
эндофитов семян гороха (Pisum sativum L.) и создание модельной системы для изучения
генетического контроля растения над формированием и функционированием эндофитных
систем растения.
Были поставлены конкретные задачи: 1) отработать методы выделения прокариотических
эндофитов семян гороха; 2) проверить выделенные эндофиты на рост-стимулирующую и 3)
антифунгальную активность; 4) способность синтезировать ауксиноподобные биологические
активные вещества; 5) и наличие ферментативной активности; 6) провести таксономическую
идентификацию молекулярно-генетическими методами.
В работе использованы три генотипа гороха - JI 2822, VIR 8274 и сорт Триумф, из которых
было выделено 136 бактериальных эндофитов отличающихся по морфолого-культуральным
признакам и растущих на различных селективных средах – TSA, 1/20 TSA, R2A, среда Кинга,
МПА с глицерином. Рост-стимулирующую активность определяли по росту корней кресссалата (Lepidium sativum L.), всего проверено 64 штамма бактериальных эндофитов, из которых
17 дали положительный результат. На антифунгальную активность проверено 7 штаммов
эндофитов. Два штамма бактерий эндофитов на питательных средах показали способность
подавлять рост фитопатогенных грибов (F. sporotrichioides, A. alternata, F. graminearum).
Способность эндофитов выделять ауксиноподобные вещества определялась с помощью
219
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
реактива Сальковского. Из 70 проверенных культур можно выделить одну. Показано (а)
наличие в семенах гороха бактериальных эндофитов, (б) зависимость состава выделяемых
культивируемых прокариотических эндофитов семян гороха (Pisum sativum L.) от генотипа
растения, а также (в) варьирование этого состава при выделении эндофитов посемянно (отсемени-к-семени), причиной может быть как несовершенство методологии выделения (не
всегда выделяются минорные составляющие), так и реально существующее варьирование
необязательных компонентов состава семенных эндофитов.
В ходе дальнейших экспериментов предстоит дать физиолого-биохимическую
характеристику выделенных культур и определить их таксономическое положение
молекулярно-генетическими методами, а также оценить биоразноообразие некультивируемых
прокариотических форм эндофитов семян гороха.
Работа выполнена при поддержке Совета по грантам Президента РФ (НШ- 4603.2014.4), и
РФФИ (13-04-01702-а; 13-04-01703-а; 14-04-32289 мол_а и 14-04-01442 а).
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЕОГРАФИЧЕСКИ УДАЛЕННЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
ЦИАНОБАКТЕРИИ NOSTOC COMMUNE VAUCH. EX BORN. & FLAH.
ГОРНЫХ И АРКТИЧЕСКИХ МЕСТООБИТАНИЙ
Патова А.Д.1,2, Шадрин Д.М.2
1
ФГБОУ ВПО Сыктывкарский государственный университет;
2
ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, Россия
patova_anya@mail.ru
Цианобактерии на уровне близкородственных таксонов имеют очень сходные, трудно
различимые морфологические признаки, поэтому их точная идентификация в природном
материале и в культурах вызывает трудности. Изучение генетической дифференциации
популяций Nostoc commune - космополитного вида, имеет огромный научный интерес, так как
ему принадлежит особая роль в структурно-функциональной организации наземных экосистем
из-за способности фиксации N2. Данный вид имеет широкую экологическую амплитуду,
способен обитать при разных температурах и условиях увлажнения. Цель работы – изучение
генетического разнообразия популяций N. commune, произрастающих в экстремальных, горных
и арктических условиях с применением двух типов маркеров (AFLP, фрагмент гена 16S рРНК)
и выявление их морфологических и физиологических различий.
Колонии ностока различались по размеру, цвету, наличию слизи в зависимости от
доступности влаги. Самые маленькие колонии (до 3 см в диаметре) были обнаружены на
Шпицбергене, крупнейшие колонии (20-30 см) были отмечены для Полярного Урала. Хотя
клетки, гетероциты варьировали по размеру в зависимости от местообитания, но данные не
коррелировали с широтным градиентом.
Для выявления генетического разнообразия в исследовании были получены 17
последовательностей фрагмента гена 16S рРНК цианобактерий, принадлежащих
представителям родов Nostoc (шесть видов, включая N. commune разные популяции). На
филогенетического дереве штаммы из разных популяции Европейского Севера (Полярный,
Приполярный Урал и Пай-Хой) сгруппировались в один кластер. Южные популяции гор и
лесостепей (Кавказ, Байкальский регион) сформировали другой. Штамм с о. Щпицберген был
самым генетически отдаленным, что, вероятно, связано с его островной изоляцией.
Для детального исследования внутривидовых различий N. commune был проведен AFLPанализ семи популяций. В анализе использовали семь пар селективных праймеров EcoRI/MseI,
по которым и генотипировали изучаемые популяции N. commune. На основе частот фрагментов
проведен анализ главных координат, который показал, что популяция N. commune с архипелага
Шпицберген заметно отделяется от остальных, что сходно с наблюдаемым выше результатом
анализа последовательностей фрагмента гена 16S рРНК. Тест Мантеля для проверки гипотезы
"Isolation by distance" не выявил статистически значимой корреляции между географическими и
генетическими дистанциями. Схожие данные были получены другими авторами для других
территорий.
220
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ТЕРМОФИЛЬНЫЕ БАЦИЛЛЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ГЕОТЕРМАЛЬНЫХ
ИСТОЧНИКОВ АРМЕНИИ, КАК ПРОДУЦЕНТЫ
ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
Оганесян П.А., Варданян Г.Г., Маргарян А.А., Паносян О.А., Трчунян А.А.
Ереванский государственный университет, Ереван, Армения
pargev@yandex.ru
В последнее десятилетие в разных отраслях промышленности широкое применение нашли
термозимы–ферменты термофилов, которые проявляют высокую активность и стабильность
при жестких условиях биотехнологических процессов, что и делает их более выгодными по
сравнению с мезофильными аналогами. Одним из естественных природных местообитаний
термофилов являются наземные термальные источники. На территории Армении обнаружены
многочисленные геотермальные источники, которые служат природными банками уникальных
микроорганизмов и термозимов с широкими возможностями практического применения.
Целью исследования являлось выделение и изучение разнообразия аэробных
спорообразующих термофильных микроорганизмов (бацилл и термоактиномицетов) некоторых
горячих минеральных источников Армении и Нагорного Карабаха. Из образцов воды и ила
выделены 130 культур факультативных и облигатных термофильных бацилл. На основании
фенотипических свойств, а также анализа гена 16S рРНК (16S рДНК) установлена их
принадлежность к видам родов Bacillus, Geobacillus, Brevibacillus, Anoxybacillus, Ureibacillus,
Paenibacillus, Thermoactinomyces. Проведен скрининг изолятов для выявления перспективных
продуцентов ряда термостабильных амилолитических, липолитических и протеолитических
ферментов. Среди продуцентов гидролитических ферментов преобладали представители родов
Geobacillus, Anoxybacillus и Bacillus. Выделенные культуры термофильных бацилл сохраняются
в коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии и биотехнологии
микроорганизмов и растений Ереванского госуниверситета и послужат объектом дальнейших
исследований с целью изучения возможности их использования в биотехнологических
производствах.
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ (ДЕТЕКЦИЯ) И РОСТ
СТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM В
ПОЧВАХ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ
Попова И.А., Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,
Саратов, Россия
iridecol@mail.ru
При использовании различных подходов в агробиотехнологии и экологической
биотехнологии бактерии с «полезными» свойствами вносятся в природную среду. На
настоящий момент актуальной остаётся задача мониторинга численности внедрённых
микроорганизмов.
В данной работе были изучены рост-стимулирующая активность по отношению к
растениям, распространение и количественное содержание бактерий рода Azospirillum в почвах
Саратовской области: чернозём типичный, чернозём южный, тёмно-каштановая, аллювиальная,
серая лесная, солонец.
Методом ИФА с использованием родоспецифичных АТ азоспириллы обнаружены во всех
проанализированных почвенных образцах. Наибольшее содержание отмечено для
аллювиальной, наименьшее для темно-каштановой почв. Использование группоспецифичных
Ат показало преобладание АГ серогруппы I (для чернозёма типичного, чернозема южного и
темно-каштановой почвы). Солонец отличался присутствием антигенов серогруппы II.
Изучение рост-стимулирующей активности проводили сравнением морфометрических
показателей для пшеницы, кукурузы, подсолнечника и рапса, выращенных при инокуляции в
почву клеток штамма Azospirillum brasilense SR75 (серогруппа I). В темно-каштановой почве
наблюдалось увеличение длины корней для подсолнечника и кукурузы, длина побегов не
221
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
отличалась по сравнению с контрольными растениями. Сходные результаты получены в
лугово-чернозёмной почве. На солонце обнаружено увеличение надземной части.
На втором этапе с помощью фагового дисплея были получены миниАТ для Azospirillum
brasilense SR87 и A. irakense KBC1, способные к выявлению клеток азоспирилл методом ИФА в
почвенных суспензиях (до 2×106 кл/мл). При инокуляции проростков пшеницы данными
штаммами на 3-ьи сутки методом ИФА с использованием миниАТ было выявлено 6×106
бактериальных клеток на 1 см корня.
Фаговые частицы были использованы для выявления исследуемых штаммов на
поверхности корней пшеницы методом флюоресцентной микроскопии (клетки A. brasilense
SR87 выявлены в основании корневых волосков, A. irakense KBC1 - во внутренних тканях
корня).
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОСИНТЕЗА
ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА METHYLOBACTERIUM EXTORQUENS G10 И
METHYLOLIGELLA HALOTOLERANS С2 НА МЕТАНОЛЕ
Порошина М.Н.
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт;
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
poroshinam@rambler.ru
Полигидроксибутират – биоразлагаемый, биосовместимый и термопластичный
биополимер, синтезируемый многими микроорганизмами в лимите по азоту и избытке
источника углерода, цена которого составляет около 40% общей себестоимости пластика.
В связи с этим, важной задачей является подбор продуцентов, растущих на дешевом
источнике углерода, например, использование метилобактерий, потребляющих дешевый
непищевой субстрат – метанол. Продуцент Methylobacterium extorquens G10 синтезирует
хрупкий ПГБ с низкой молекулярной массой, однако недавно из почвы нами выделен
представитель нового рода облигатных метилотрофов – Methyloligella halotolerans С2,
синтезирующий достаточно прочный и эластичный ПГБ из метанола.
Цель работы – сравнительное изучение биосинтеза ПГБ из метанола аэробными
метилобактериями: Methylobacterium extorquens G10 и Methyloligella halotolerans С2, а также
характеристика основных физико–химических свойств синтезируемых биополимеров.
Показано, что лимитирование по азоту стимулировало обе культуры к синтезу
биополимера. Несмотря на сходство путей метаболизма метанола и биосинтеза ПГБ, M.
extorquens G10 и M. halotolerans С2 синтезировали полимеры с разной молекулярной массой
(до 250 и 3400 кДа, соответственно). Причем при увеличении остаточного азота в среде
молекулярная масса пластика M. extorquens G10 снижалась с 250 до 85 кДа, в то время как M.
halotolerans С2 синтезировал высокомолекулярный полимер (~3000 кДа) независимо от
остаточной концентрации источника азота.
ПГБ из M. halotolerans С2 обладал более высокой температурой плавления и степенью
кристалличности по сравнению с ПГБ, синтезируемым M. extorquens G10. Это позволяет
получить после специальной обработки высокую степень ориентации цепей полимера и, таким,
таким образом, очень прочные волокна, которые могут быть использованы в медицине для
биодеградабельных (шовных) нитей, а также в ортопедии в качестве компонента композитных
материалов.
Установлено, что исследуемые метилобактерии используют метанол-сырец аналогично
чистому
метанолу,
что
существенно
снижает
себестоимость
получаемого
полигидроксибутирата и повышает конкурентоспособность производимого биопластика.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных
исследований (проект 13-04-01520-а).
222
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ СТРУКТУР
КЛЕТОК НОВЫХ УЛЬТРАМЕЛКИХ БАКТЕРИЙ (ШТАММЫ Ф2 И FM3),
ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ
АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ
Росс Д.В., Поливцева В.Н.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
d_ross@ibpm.pushchino.ru
Изучение новых продуцентов биологически активных веществ, в том числе обладающих
антимикробной активностью, приобретает особое значение на фоне растущей резистентности
патогенных микроорганизмов к известным антибиотикам.
Нами выделены два новых штамма, обладающие антагонистической активностью по
отношению к широкому ряду грамположительных и грамотрицательных бактерий: штамм Ф2
(принадлежит к роду Microbacterium), выделен из многолетнего нефтешлама, и штамм FM3
(принадлежит к роду Stenotrophomonas), выделен с поверхности кожных покровов шпорцевой
лягушки Xenopus laevis. На клетках этих штаммов обнаружены особые поверхностные
ультраструктуры, возможно участвующие в процессе контактного взаимодействия с
бактериями-жертвами. Штамм FM3 формирует везикулы наружной мембраны, которые
экскретируются в межклеточное пространство в ассоциированном с S-слоем состоянии, S-слой
образует протяженные трубчатые структуры, которые выявляются в межклеточном
пространстве как в свободном, так и в прикрепленном к поверхности клеток тест-культур
состоянии. На поверхности клеток штамма Ф2 были выявлены электронно-плотные глобулы
размером до 40 нм, равномерно распределенные по всей поверхности клеточной стенки.
Анализ негативноокрашенных препаратов бактерий штамма Ф2 позволил выявить в
межклеточном
пространстве
множественные
глобулярные
cтруктуры
диаметром
преимущественно 25-35 нм. Численность глобулярных структур резко уменьшается в
препаратах клеток, взятых из глубокого стационара.
Полученные результаты позволяют считать, что выделенные штаммы являются
перспективными объектами для дальнейшего изучения межмикробных антагонистических
взаимодействий, а также роли в этих процессах поверхностных клеточных структур.
THERMUS SCOTODUCTUS ИЗОЛИРОВАННЫЙ ИЗ ГОРЯЧЕГО
ИСТОЧНИКА КАРВАЧАР
Сагателян А.Р., Маргарян А.А., Паносян О.А., Трчунян А.А.
Ереванский государственный университет, Ереван, Армения
ani.saghatelyan@gmail.com
Одними из естественных очагов обитания термофилов являются наземные геотермальные
источники. На территории Армении обнаружены многочисленные геотермальные источники,
микробиота которых представляет уникальный природный резервуар для получения новых
биотехнологических ресурсов. В настоящее время довольно детально изучено таксономическое
разнообразие термофильных аэробных эндоспорообразующих бактерий этих геотермальных
источников. Однако распространенность облигатно-термофильных спор необразующих
бактерий, в том числе представителей рода Thermus в этих источниках, остается
малоизученной.
Целью исследования являлось выделение и идентифицирование облигатно-термофильных
спор необразующих бактерий из горячих источников Армении и Нагорного Карабаха.
Из образца ила геотермального источника Карвачар (N 40.17417°, E 46.27500°, pH 7.3, T
70˚C) выделена культура облигатно-термофильной спор необразующей бактерии с оптимумом
роста 65°C. Выделенная культура охарактеризована на основании комплекса морфологокультуральных и физиолого-биохимических свойств. Грам-отрицательные клетки –
неподвижные нитевидные палочки, которые обычно образуют филаменты. Колонии
желтоокрашенные благодаря наличию каротиноидов. Культура обладает липолитической
активностью, а также способностью восстанавливать нитраты до нитритов. Сравнение
223
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
последовательностей 16S рРНК изолята с нуклеотидными последовательностями базы данных
GenBank’а указывает на их 99% сходство с Thermus scotoductus.
Выделенная культура обозначенная как Thermus scotoductus Karvachar-1 сохраняется в
коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии и биотехнологии
микроорганизмов и растений Ереванского государственного университета и послужит
объектом дальнейших исследований.
ВЛИЯНИЕ ПОЛИФЕНОЛОВ И ЭКСТРАКТОВ РАСТЕНИЙ НА ОБРАЗОВАНИЕ
БИОПЛЁНОК БАКТЕРИЯМИ ESCHERICHIA COLI
Самойлова З.Ю., Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Октябрьский О.Н.
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
samzu@mail.ru
Было изучено влияние 18 экстрактов растений на способность бактерий Escherichia coli к
образованию биоплёнок в присутствие/отсутствие антибиотиков. Была измерена экспрессия
антиоксидантных генов и стресс-регулонов как в планктонных бактериальных культурах, так и
в составе биоплёнок, обработанных экстрактами и антибиотиками. Определено общее
содержание полифенолов в экстрактах, проведена оценка их про- и антиоксидантных свойств in
vitro. Обнаружено, что из 18 испытанных экстрактов растений чёрный чай, A. uva-ursi, V. vitisidaea, T. cordata, B. pendula и Z. mays стимулировали биоплёнкообразование (БПО) бактериями.
Экстракты A. millefolium, U. dioica и L. japonica оказывали ингибирующее действие на
образование биоплёнок. Показано, что предобработка экстрактами оказывает стимулирующее
влияние на БПО даже в присутствие антибиотиков. Богатые полифенолами экстракты чёрного
чая, V. vitis-idaea, A. uva-ursi повышали БПО при действии ципрофлоксацина, стрептомицина и
цефотаксима.
Выявлена взаимосвязь между биоплёнкообразованием и прооксидантными свойствами
испытуемых экстрактов, а также содержанием в них полифенолов. Способность малых доз
экстрактов лекарственных растений стимулировать БПО следует принимать во внимание при
лечении хронических инфекционных заболеваний, ассоциирующихся с биоплёнками. В то же
время полученные данные указывают на то, что экстракты A. millefolium, U. dioica, и L. japonica
снижают БПО в присутствие антибиотиков и могут быть рассмотрены как перспективные
источники агентов, способствующих разрушению биоплёнок.
В ходе работы с помощью генно-инженерных штаммов бактерий E. coli были изучены
механизмы влияния полифенолов (ПФ) на БПО. Установлено, что среди изученных нами ПФ
только кверцетин и танниновая кислота оказывали достоверный стимулирующий эффект на
удельное БПО в диапазоне концентраций 1-50 мкМ (кверцетин) и 1-100 мкМ (танниновая
кислота). В совокупности, результаты указывают на неоднозначный характер влияния ПФ и
экстрактов растений на БПО, осуществляемого посредством RpoS-независимого пути.
Исследование выполнено при поддержке грантом РФФИ-Урал № 14-04-96031, а также
грантом №12-И-4-2072 по Программе интеграционных проектов Президиума УрО РАН и
грантом Президиума УрО РАН для молодых ученых 14-4-НП-126.
ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ШТАММОВ RHODOTORULA
MUCILAGINOSA ПО ПРОДУКЦИИ 3-ИНДОЛИЛУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ
Стрелецкий Р.А., Качалкин А.В.
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова,
Москва, Россия
kachalkin_a@mail.ru
Вид Rhodotorula mucilaginosa (Jörgensen) F.C. Harrison (1928) среди всех видов дрожжевых
грибов является одним из самых распространенных в природе (Sampaio, 2011). Основное его
местообитание ассоциировано с растительными субстратами, известны выделения из почвы,
пресной и морской воды. Широкая распространенность данного вида в природе позволяет
использовать его в качестве удобной модели изучения эволюции, современного и историко-
224
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
географического распространения популяций микроорганизмов, а также особенностей их
функционирования.
В лаборатории биологии дрожжей кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ
была создана обширная коллекция штаммов вида Rh. mucilaginosa, выделенных из различных
природных зон. Поскольку основное местообитание данного вида является ассоциированным с
растениями, то возник вопрос насколько подобная ассоциация может различаться в связи с
географической зональность, т.к. известно, что растения и микроорганизмы представляют
собой особую коэволюционную систему. Для оценки такой вариабельности нами был выбрано
изучение особенностей синтеза видом Rh. mucilaginosa фитогормонов, в частности продукции
3-индолилуксусной кислоты (ИУК). Для исследования были отобраны 28 штаммов.
Количественное определение синтеза штаммами ИУК проводили на жидкостном хроматографе
Agilent 1100 series с УФ детектором, длина волны 222 нм, колонка С-18. Методика
культивирования штаммов, экстракции ИУК и состав элюента указаны в предыдущей работе
(Стрелецкий и др., 2013).
Полученные результаты показали высокую вариабельность продукции ИУК для штаммов
вида Rh. mucilaginosa: минимальные значения составляли 35,3 мкг/л, максимальные – 4701,2
мкг/л. Сравнение средних значений для штаммов из каждой климатической группы показало
заметное увеличение продукции ИУК от субарктики к тропикам: 1339,7 мкг/л – субарктические
(бореальные), 1384,4 мкг/л – умеренные, 2259,6 мкг/л – субтропические и 3331,8 мкг/л –
тропические. Для арктических штаммов полученные значения продукции ИУК составляли
2342,3 мкг/л. На наш взгляд, полученные высокие значения продукции ИУК для
тропиков/субтропиков и Арктики при совершенно разных условиях обитания могут отражать
высокий уровень межвидовой конкуренции для растений данных регионов. Конкуренция
между растениями влияет и на ассоциированное с ним микробное сообщество, производя отбор
наиболее полезных растению штаммов.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ АКТИНОБАКТЕРИЙ РОДА CLAVIBACTER НА ОСНОВЕ
МАЛДИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ И АНАЛИЗА
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА GYRB
Стародумова И.П.1,2, Присяжная Н.В.1, Дорофеева Л.В.1
1
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН;
2
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт,
Пущино, Россия
iri-starodumova@yandex.ru
Актинобактерии рода Clavibacter Davis et al. 1984 (семейство Microbacteriaceae) –
аэробные, неспорообразующие, неправильные палочки, содержащие диаминомасляную
кислоту в составе пептидогликана клеточной стенки и преобладающий менахинон МХ-10 в
дыхательной цепочке. В настоящее время в составе рода описан единственный вид –
Clavibacter michiganensis, включающий пять подвидов, которые известны как возбудители
сосудистых заболеваний сельскохозяйственных культур (люцерны, томата, кукурузы,
картофеля и пшеницы). Подвиды Cl. michiganensis (insidiosus, michiganensis, sepedonicus)
являются карантинными объектами во многих странах мира.
Нами проведено таксономическое изучение 23 штаммов рода Clavibacter, в их числе
изоляты с розовой и розово-оранжевой окраской колоний, выделенные из дикорастущих
растений пустыни Узбекистана (Ammodendron sp. – песчаная акация, Ephedra sp. – хвойник,
Gagea sp. – гусиный лук и Salsola sp. – солянка) без видимых признаков заболеваний.
Штаммы отнесены к роду Clavibacter на основании хемотаксономических характеристик и
высокого сходства генов 16S рРНК (более 99,0%). Результаты изучения МАЛДИ масс-спектров
и нуклеотидных последовательностей фрагментов генов gyrB у представителей различных
МАЛДИ-кластеров показали принадлежность большинства изученных культур к известным
подвидам Cl. michiganensis. Выявлены общие для всех штаммов Clavibacter компоненты
МАЛДИ масс-спектров (новые хемотаксономические маркеры рода); обнаружены значения
масс, специфичные для каждого из подвидов. Уровни сходства двух «пустынных» культур
(ВКМ Ас-1370 и ВКМ Ас-1371) с типовыми штаммами подвидов Cl. michiganensis по
225
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
фрагментам генов gyrB (744 п.н.) равнялись 93,8–94,8% и 93,0–95,0% – что соответствует
показателям сходства между подвидами данного вида (94,0–97,3%).
Полученные данные позволяют заключить, что штаммы ВКМ Ас-1370 и ВКМ Ас-1371
относятся к новым подвидам вида Cl. michiganensis (согласно существующей системе
классификации бактерий). Однако экологические и таксономические исследования последних
лет, включая анализ полных геномов, свидетельствуют о том, что таксономический статус
известных подвидов Cl. michiganensis соответствует рангу видов. Соответственно, штаммы
ВКМ Ас-1370 и ВКМ Ас-1371 могут быть описаны в будущем в качестве новых видов рода
Clavibacter.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 14-04-31825.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОФИЛЕЙ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ
ДЕСТРУКТОРОВ ДИХЛОРМЕТАНА
Торгонская М.Л.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН,
Пущино, Россия
mltrmbh@rambler.ru
С использованием метода поверхностного биотинилирования и очистки с помощью
магнитных частиц, покрытых стрептавидином, выделены фракции поверхностных белков
аэробных метилотрофных деструкторов Methylobacterium dichloromethanicum DM4, Methylopila
helvetica DM6 и Albibacter methylovorans DM10, выращенных на дихлорметане (ДХМ),
метаноле и метаноле при повышенной солености среды (0,5-1,5% NaCl).
В результате сравнительного анализа фракций методом одномерного денатурирующего
гель-электрофореза и последующей масс-спектрометрической идентификации белков
установлено, что на поверхности клеток основным мажорным белком с молекулярной массой
мономеров 60-65 кДа при всех условиях культивирования является aльфа-субъединица
метанолдегидрогеназы (MxaF, MextDM4_METDI5145). Однако при росте на ДХМ на
мембранах клеток деструкторов помимо MxaF выявлены PQQ-зависимая метанол/этанол
дегидрогеназа (XoxF, MextDM4_METDI2492), 60 кДа молекулярный шаперонин (GroL,
MextDM4_METDI5839),
ДХМ-дегалогеназа
(DcmA,
MextDM4_METDI2656),
транскрипционный
репрессор
ДХМ-дегалогеназы
(DcmR,
MextDM4_METDI2655),
предполагаемый универсальный стрессовый белок (MextDM4_METDI0302) и субстратсвязывающий белок ABC транспортера аминокислот (MextDM4_METDI4014). Как при росте
на ДХМ, так и при повышенной солености среды во фракциях поверхностных белков Mb.
dichloromethanicum DM4 идентифицированы ферменты С1-метаболизма (серин-глиоксилат
аминотрансфераза SgaA, MextDM4_METDI2478, малил-КоА лиаза β-метилмалил-КоА лиаза
CitE, MextDM4_METDI2485, β-кетотиолаза PhaA, MextDM4_METDI4272), гистидинкиназы
(NtrB, MextDM4_METDI5463 и MextDM4_METDI2463), цАМФ-связывающий белок (EshA,
MextDM4_METDI1753), вероятная цистеиндесульфураза (CsdA, MextDM4_METDI1754),
предполагаемый белок холодового шока (MextDM4_METDI3744), ГТФ-связывающий фактор
элонгации белковой цепи EF-Tu (TufB, MextDM4_METDI2933, MextDM4_METDI5427), а
также консервативный вероятный экспортируемый белок (MextDM4_METDI3997).
Существенно большее число белков, выявленное у клеток деструкторов при росте на ДХМ и в
присутствии 0,5-1,5% NaCl, по сравнению с таковым у клеток, выращенных на метаноле при
обычной солености среды, свидетельствует о наличии адаптивного ответа на эти стрессоры.
Однако поскольку многие из обнаруженных нами белков были ранее описаны как
цитоплазматические, трудно сделать вывод о том, где именно они преимущественно
функционируют в клетках деструкторов при росте на ДХМ и какую роль могут играть на
поверхности клеток. Для ответа на эти вопросы необходимы дальнейшие исследования.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-04-00760-а.
226
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКИ В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛЬНОЙ
СИСТЕМЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ
МИКРОСПОРИДИЙ
Тимофеев С.А.1,2, Сендерский И.В.1, Долгих В.В.1
1
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений РАСХН;
2
Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
ts-bio@ya.ru
Микроспоридии - группа облигатных внутриклеточных эукариотических паразитов,
освоивших чрезвычайно широкий круг хозяев, от протистов до млекопитающих. Крайняя
степень специализации представителей этого таксона к внутриклеточному паразитизму,
экономическое и медицинское значение делает актуальным изучение их взаимоотношений с
хозяином. На сегодняшний день, молекулярные основы воздействия микроспоридий на своих
хозяев изучены крайне слабо. Во многом это связано с методическими трудностями работы с
данными паразитами, т.к. микроспоридии не культивируются вне клетки хозяина.
Одним из механизмов воздействия внутриклеточных паразитов на своих хозяев является
секреция белков, способных вмешиваться в регуляторные пути и сигнальные каскады
зараженной клетки. Такие белковые факторы патогенности были описаны у представителей
других групп внутриклеточных паразитов, таких как Apicomplexa и Kinetoplastida. Для
изучения подобных механизмов у микроспоридий мы предлагаем новый подход использование дрожжевой клетки в качестве модельной системы. Данный подход основывается
на филогенетической близости микроспоридий и дрожжей, из чего можно предположить, что
секреторный аппарат последних сможет правильно распознать N-концевой сигнальный пептид
в составе белков паразита, ответственный за секрецию данных молекул. Таким образом, если
встроить полноразмерные копии изучаемых генов в геном дрожжевых грибов и осуществить их
экспрессию, секреция соответствующих белков в культуральную жидкость будет означать, что
и в клетках паразита данный белок секретируется за пределы цитоплазматической мембраны.
В данной работе представлены результаты экспрессии шести потенциально секреторных
белков паразита перелетной саранчи - микроспоридии Paranosema locustae в дрожжах Pichia
pastoris. На основании данных о накоплении изучаемых белков в дрожжевых клетках и
культуральной среде, в которой осуществлялась экспрессия, продемонстрировано
распознавание четырех из них секреторной системой дрожжевой клетки, что позволяет сделать
вывод об участии данных белков в паразито-хозяинных отношениях микроспоридии и
насекомого-хозяина.
ИНГИБИТОРЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК КЛЕТКАМИ
СТАФИЛЛОКОККОВ НА ОСНОВЕ ФУРАНОНОВ
Тризна Е.Ю., Хакимуллина Э.Н., Курбангалиева А.Р., Каюмов А.Р.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
trizna91@mail.ru
В настоящее время многие патогены приобрели устойчивость к действию антибиотиков,
что объясняет необходимость поиска новых антибактериальных препаратов. Staphylococcus
epidermidis и Staphylococcus aureus являются одними из основных внутрибольничных
патогенов, вызывающих инфекции на медицинских имплантатах. Это обусловлено
образованием биопленок этими бактериями. В составе биопленок они обладают повышенной
устойчивостью к иммунной системе человека и антибиотикам. Поэтому актуальной проблемой
является поиск новых препаратов, подавляющих не только рост бактерий, но и образование
биопленок.
В последние годы было показано, что галогенизированные фураноны, обладают
антимикробными свойствами и подавляют микробную колонизацию на поверхности
водорослей. Эти фураноны, уничтожают до 90% болезнетворных бактерий.
Целью работы было идентифицировать производные фуранонов, эффективно
подавляющих рост и образование биопленок бактериями Staphylococcus.
227
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
В Химическом институте КФУ были синтезированы галоген-производные фуранонов.
Нами был проведен скриниг соединений эффективно подавляющих рост и образование
биопленок бактериями S. aureus и S. epidermidis более чем в 3 раза. Это фураноны с условными
номерами Ф1, Ф6, Ф8, Ф29, Ф35, Ф83.
Минимальная ингибирующая фуранонов Ф8, Ф29, Ф83 составила 25 мкг/мл, тогда как для
фуранонов Ф1, Ф6, Ф35 - 5 мкг/мл. Также исследовали цитотоксичность отобранных
соединений, в МТС-тесте на клетках линии MCF7 и клетках фибробластов человека. По
полученным данным подсчитывали коэффициент цитотоксичности СС50. Соединениями с
наименьшей цитотоксичностью для обеих линий клеток, были фураноны Ф29 и Ф35.
С помощью электронной микроскопии был установлен цитостатический эффект
соединений и их влияние на морфологию клеток. Практически все соединения изменяли
морфологию клеток и подавляли их деление при концентрации 10 мкг/мл. Но, фуранон Ф35 не
влиял на морфологию клеток и способность к делению даже при концентрации 50 мкг/мл.
Таким образом, можно сделать вывод, что Ф35 может быть эффективным агентом,
подавляющим образование биопленок бактериями Staphylococcus, при этом обладать более
слабым эффектом против других бактерий. Кроме того, Ф35 в рабочих концентрациях не
оказывает цитотоксического эффекта на клетки эукариот. Следовательно, Ф35 может быть
перспективным соединением в сфере медицины, используемым для обработки поверхностей и
медицинского оборудования для предотвращения образования биопленок.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 14-04-31635 мол_а.
ИНГИБИТОРЫ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ B. SUBTILIS НА
ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФУРАНОНОВ И ПИРРОЛИНОНОВ
Хакимуллина Э.Н., Тризна Е.Ю., Курбангалиева А.Р., Каюмов А.Р.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
elvina5555@mail.ru
Биопленки – очень тесно приросшее к субстрату сообщество дифференцированных
микробных клеток, заключенных в полисахаридный матрикс. Недавно было показано, что
бациллы способны образовывать смешанные биопленки с патогенными бактериями и тем
самым повышать их устойчивость к бактерицидным препаратам. В составе биопленок
устойчивость бактерий к лекарственным средствам и иммунной системе человека многократно
возрастает, что вызывает необходимость разработки средств их подавления. На роль таких
лекарственных средств претендуют галогенизированные фураноны, которые подавляют рост
бактерий, и действуют в концентрациях (5 мкг/мл) не токсичных для эукариот.
Целью работы явилось провести скрининг соединений на основе фуранона и пиррлинона,
способных подавлять образование биопленок клетками Bacillus subtilis. Нами были
протестированы 103 фуранона и 39 пирролина. В результате проведенного скрининга были
отобраны соединения, подавляющие рост и образование биопленок более чем на 20% соединения с условными номерами фураноны 12, 15, 29, 94, 101 и пирролиноны 21 и 22. Было
установлено, что эти соединения эффективно подавляют рост и образование биопленок B.
subtilis уже при концентрациях 5-10 мкг/мл.
Далее была исследована цитотоксичность этих соединений на клетках линии MCF7 (рак
молочной железы) и фибробластах человека. Был проведен МТС-тест и определены
концентрации соединений, снижающие активность митохондриальной дегидрогеназы на 50%.
Из исследованных 7 соединений фуранон 94 не оказывал токсического эффекта на клетки
MCF7 и фибробласты. Исследования цитостатического эффекта проводили путем
микроскопирования и подсчета количества клеток. Было установлено, что фураноны 94 и 101
не влияют на морфологию раковых клеток молочной железы при конц 10 мкг/мл, при которой
образование биопленок снижалось в 5 раз. В случае фибробластов они не оказывали влияния
при концентрациях до 10 мкг/ мл. Следовательно, фураноны 94 и 101 можно считать
перспективными соединениями для использования для подавления образования биопленок
клетками бацилл.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 14-04-31635 мол_а.
228
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ИЗМЕНЕНИЕ РЕДОКС-СТАТУСА СРЕДЫ И КЛЕТОК ПРИ СТРОГОМ
ОТВЕТЕ У БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI
Ушаков В.Ю.1,2, Тюленев А.В.1, Смирнова Г.В.1, Октябрьский О.Н.1
1
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН; 2ФГБОУ ВПО
Пермский государственный национальный исследовательский университет,
Пермь, Россия
ushakovvad@yandex.ru
Строгий ответ, опосредованный алармоном (p)ppGpp, является консервативной
адаптационной системой бактерий, контролирующей широкий круг метаболических реакций,
необходимых для выживания в различных стрессовых условиях. Аккумуляция (p)ppGpp
приводит к изменению транскрипции многих генов и аллостерическому ингибированию
активности ряда ферментов.
В данной работе исследовали влияние строгого ответа на изменение редокс-статуса среды
и клеток. В качестве объекта исследований использовали бактерии E. coli дикого типа и
делеционные мутанты по генам, кодирующим синтетазу (p)ppGpp (relA) и первый фермент
синтеза глутатиона (GSH) (gshA), а также двойной мутант relAgshA.
Бактерии выращивали в аэробных условиях на минимальной среде М9 с глюкозой. Строгий
ответ индуцировали добавлением валина, вызывающего голодание по аминокислоте
изолейцину. Внесение валина в среду приводило к резкому ингибированию роста всех
изученных штаммов. В клетках дикого типа и gshA мутантах замедление роста сопровождалось
торможением дыхания, которое отсутствовало у relA мутантов. В ответ на валин у всех
изученных бактерий наблюдалось преходящее усиление продукции супероксида в периплазме,
более продолжительное у мутантов по гену relA. Во всех случаях возрастала концентрация
Н2О2 в среде. В клетках дикого типа валин в 2,5 раза повышал уровень внутриклеточного
глутатиона, при этом концентрация внеклеточного GSH (GSHout) увеличивалась в 2 раза в
течение часа экспозиции. В relA мутанте наблюдался быстрый выход GSH из клеток в среду, и
через час GSHout превышал контрольный уровень в 13 раз. В клетках, лишенных gshA, при
действии валина происходило накопление цистеина в среде, которое было слабее выражено у
родителя и мутантов relA и relAgshA. Регистрация изменений редокс-потенциала среды (Eh)
платиновым электродом выявила наличие скачка Eh в область отрицательных значений в
момент добавления валина. Амплитуда скачка была максимальна у relA мутанта. Скачок Eh
снимался тиоловыми реагентами, что указывает на участие внеклеточных цистеина и GSH в его
генерации. В целом, полученные данные свидетельствуют о важной роли (p)ppGpp в регуляции
редокс-статуса бактерий в условиях, индуцирующих строгий ответ.
Исследования поддержаны грантом Программы МКБ Президиума РАН № 12-П-4-1013 и
грантом РФФИ № 13-04-00706.
ЭВОЛЮЦИОННЫЙ РЕЗОНАНС КАК ОСНОВА ФОРМИРОВАНИЯ
СТАБИЛЬНЫХ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ РАСТИТЕЛЬНО-МИКРОБНЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В АГРОЭКОСИСТЕМАХ
Хапчаева С.А.1, Зотов В.С.1, Пунина Н.В.1, Топунов А.Ф.1, Дидович С.В.2
1
ФГБУН Институ биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва, Россия;
2
Институт сельского хозяйства Крыма НААНУ, Симферополь, Украина
sakhapchaeva.1990@gmail.com
В настоящее время в мировой сельскохозяйственной практике существует целый ряд
решений, направленных на качественно новый уровень ведения сельскохозяйственного
производства, таких как: интенсивные системы земледелия, точное земледелие, малозатратное
и экологически безопасное земледелие, а также земледелие с минимальной обработкой почв.
Ориентируясь на высокую культуру ведения сельского хозяйства во всем мире, поддержание
стабильности агроэкосистем, экологичный режим природопользования, особый приоритет
имеют экологически безопасное и органическое земледелия (FAO reports, 2012).
229
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
Перспективной и единственно верной на сегодняшний день является ориентация сельского
хозяйства на экологическое земледелие, которая предусматривает энергосбережение,
обеспечение естественного круговорота веществ, сохранение, поддержание и увеличение
естественного плодородия почвы, повышение качества урожая и продуктов питания. Основой
такого подхода может стать сохранение или создание эффективно функционирующих
высокоэффективных интегрированных биосистем с участием природных ресурсов и энергии
экосистем (почвенно-климатический потенциала, генетического разнообразия микро- и
макробиологических объектов, растительно-микробного взаимодействия, функционирования
почвенной биоты и др.).
Современные молекулярно-генетические методы, на ряду с биохимическими, открывают
большие горизонты для идентификации и дифференциации штаммов микроорганизмов. ПЦРфингерпринтинг и AFLP, а также MLSA анализ дают оценку исследуемым изолятам до уровня
группы штаммов. Однако, наиболее интересным, после определения таксономического
положения штаммов, является описание эволюции отдельно взятого гена (участка ДНК), что
позволяет характеризовать сложное почвенное сообщество, являющееся одним из самых
больших генофондов функционального многообразия на нашей планете, как единое целое.
Также открываются возможности в конструировании высокопродуктивных растительномикробных систем, основываясь на использовании максимально удалённых друг от друга
полезных микроорганизмов для искусственного расширения «эволюционного потенциала»
почвенной микробиоты в отдельном конкретно взятом случае. Таким образом, именно
благодаря совмещению в одной системе таксономически удалённых по ряду факторов штаммов
микроорганизмов мы сможем расширить границы рекомбинационных событий между ними,
что приведёт к многократному увеличению уровня биоразнообразия и потенциала всех
участников растительно-микробного симбиоза, т.е. «эволюционному резонансу».
ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ КАК
ПЕРСПЕКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ХИТИНАЗЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С
ПАТОГЕНАМИ РАСТЕНИЙ
Цветкова Ю.Д.
УО «Могилевский государственный университет им. А.А.Кулешова»,
Могилев, Беларусь
Ulia.Tsviatkova@gmail.com
Целью данной работы была оценка перспективности использования бактерий рода Vibrio и
Photobacterium в качестве продуцентов внеклеточных литических ферментов. Основное
внимание было уделено ростовым характеристикам данных бактерий и оценке хитиназной
активности в различных условиях культивирования. В литературе имеется достаточно данных,
свидетельствующих о том, что данные бактерии являются продуцентами хитиназы.
Ранее нами были выделены и идентифицированны штаммы, относящиеся к роду Vibrio,
Photobacterium и Alteromonas. Данные микроорганизмы были выделены из внутренних органов
норвежской семги, камбалы. Для выделения рекомендуется погружать предметные стекла в
смывы из внутренних органов рыб и затем производить посев. Попытки выделения изучаемых
микроорганизмов из морской воды не дали результатов. Для определения видов бактерий
использовались бактериологические и серологические методы. Адаптированы среды для
культивирования светящихся бактерий. Рекомендуется среда следующего состава: H2O – 150
мл, рыбная вытяжка – 4 мл, молочная сыворотку – 4мл, агар-агар – 8гр, NaCl – 4 гр, NaNO3 – 1
гр, CaCl2 – 0,1 мл, KCl – 0,2, МgSO4 – 0,5 гр, KH2PO4 – 0,5 гр, NaHCO3 – 0,01 гр, глицерин – 0,2
гр.
Для изучения хитиназной активности экзоферментов светящихся бактерий по отношению к
организмам рода Fusarium использовалась двойная среда, включающая исходную (для
светящихся бактерий) и среду Чапека (для изучаемых патогенов растений). В ходе
культивирования зон лизиса не наблюдалось. Для стимуляции синтеза и внеклеточного
выделения хитиназы к данной среде добавляли: дрожжевой автолизат, измельченный панцирь
краба, эфирное масло цитрусовых; удаляли глицерин; уменьшали концентрацию соли;
готовили голодный агар с поочередным добавлением вышеуказанных компонентов. Величина
230
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
хитиназной активности при росте на этих субстратах существенно различалась. Максимальная
зона просветления вокруг растущей бактериальной колонии наблюдалось на агаризованной
среде с добавлением дрожжевого автолизата. При изучении влияния температурного режима на
эмиссию хитиназы отмечено, что максимальное фунгицидное действие экзоферментов
светящихся бактерий наблюдается при 10°С культивирования.
Таким образом, совместное культивирование грибных патогенов растений и бактерий
Vibrio и Photobacterium на комбинированной среде с добавлением дрожжевого автолизата при
температуре 10°С сопровождается максимальным выходом хитин-литических ферментов.
ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ ПОЧВ
КОЛЬЦЕВЫХ ЗАПАДИН ЛИПЕЦКОЙ И ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТЕЙ
Чакмазян К.В.
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова,
Москва, Россия
chakmazyan@gmail.com
В настоящее время огромные запасы микробной биомассы, содержащиеся в различных
типах почв, являются установленным фактом. Каждый тип почв характеризуется не только
определенным запасом микробной биомассы, но и спецификой ее распределения в
пространстве (по профилю) и во времени.
Динамика численности микроорганизмов является предметом саморегуляции. Знание
количества, состава, потенциальной и реальной активности почвенной микрофлоры
необходимо для понимания механизмов контролирования состава и функций микробного
сообщества, его популяционной динамики, для управления ростом и активностью
микроорганизмов, для использования их в разложении вредных веществ в почве (Кожевин,
1989). Микроорганизмы могут быть индикаторами различного рода воздействий: как
природного, так и антропогенного характера.
В последние годы почвоведы отмечают усиливающееся временное переувлажнение на
территории локальных понижений, и, в то же время, с 70-х годов геологи также отмечают
усиливающуюся водородную дегазацию из недр Земли (Суханова, 2010).
В исследованиях В.Н.Ларина (Ларин, 2005) было показано, что в местах выхода
глубинного водорода формируются кольцевые структуры проседания (западины). Они
проявляются в виде светлых колец и кругов и наиболее четко видны на пахотных почвах с
темной окраской гумусового горизонта (черноземы, серые). Верхний горизонт в таких
западинах осветляется от черного до серого, или светло-серого цвета.
Целью данной работы было изучить численность и структуру микроорганизмов, а также
размеры бактерий в почвах, подвергшихся влиянию временного избыточного переувлажнения
и эмиссии водорода.
Объектами исследования были серая лесная почва (Липецкая обл.) и обыкновенный
чернозем (Волгоградская обл.).
Общее количество микроорганизмов определяли с помощью метода люминесцентной
микроскопии. При определении размеров бактерий использовался метод «каскадной»
фильтрации.
В результате исследований было выявлено, что наиболее заметное воздействие было
оказано на численность бактерий, грибного мицелия и спор грибов. В тех образцах почв,
взятых их зон, где наблюдалось совместное воздействие эмиссии водорода и временного
избыточного переувлажнения, их численность была меньше, чем в образцах, не подвергшихся
влиянию этих факторов.
231
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ИНТЕГРАТИВНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ МНОЖЕСТВЕННОГО
МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ В КЛЕТКАХ BACILLUS SUBTILIS
Чеписюк Н.В.
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
Natalia_Chepisiuk@mail.ru
Одним из подходов, применяемых в настоящее время для получения рекомбинантных
штаммов на основе бактерий вида B. subtilis, является введение гетерологичного генетического
материала, предназначенного для экспрессии, в хромосому клетки хозяина.
Это обусловлено рядом преимуществ, которыми векторы интеграции обладают по
сравнению с автономно наследуемыми векторами. При этом в случае множественного
клонирования, то есть при совмещенном клонировании в одном штамме различных
генетических детерминант, нередко возникает необходимость их экспрессии под контролем
разных экспрессионных систем.
В результате проведенного исследования нами была создана интегративная система для
множественного молекулярного клонирования гетерологичных генов в бактериях B. subtilis,
состоящая из двух компонентов. Первым компонентом системы является вектор pW2. Данный
вектор автономно наследуется в клетках промежуточных хозяев – бактерий E. coli и является
вектором интеграции для бактерий B. subtilis. Интеграция вектора pW2 в хромосому B. subtilis
происходит за счет процесса одиночной гомологичной рекомбинации между фрагментом
Bio(W1-W4) вектора и соответствующего ему участком хромосомы, представленного
промоторно-операторной областью биотинового оперона. Данный вектор позволяет
интегрировать гетерологичный ген, клонированный в его составе, под контроль Pbio-промотора
биотинового оперона, который обеспечивает экспрессию клонированного гена. Селективным
маркером для отбора бактерий с интеграцией pW2 в хромосому является ген устойчивости к
эритромицину.
Вторым компонентом системы являются векторы pCSP и pBRS. Вектор pCSP получен на
основе многокопийной для клеток промежуточных хозяев – бактерий E. coli плазмиды
pMTL21C. Вектор pBRS сконструирован на основе малокопийной в клетках E. coli плазмиды
pBR322. Оба полученных нами вектора имеют в своем составе маркер
антибиотикорезистентности к хлорамфениколу, для отбора бактерий B. subtilis с интеграцией, а
также индуцируемый ИПТГ Pspac-промотор для экспрессии целевых генов. Встраивание
векторов pCSP и pBRS в хромосому бактерий-хозяев осуществляется за счет наличия областей
гомологии между ними и вектором-хелпером pW2, уже интегрировавшим в хромосому. Таким
образом, созданная нами система может применяться для множественного интеграционного
клонирования различных гетерологичных генов в клетках бактерий B. subtilis и их
последующей экспрессии под контролем Pbio и Pspac-промоторов.
АНАЛИЗ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ
ИСКОПАЕМОГО БИЗОНА BISON PRISCUS
Шавкунов К.С., Глазунова О.А., Озолинь О.Н.
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
shavkunovks@rambler.ru
С точки зрения современной геномики, особый интерес представляют микроорганизмы из
образцов мерзлотных почв, целостные геномы которых предоставляют возможность оценить
скорость бактериальной эволюции и расширить наши представления о жизненном потенциале
клетки. Вместе с тем, вероятность выявления среди этого многообразия микробов таких
разновидностей, которые преимущественно существуют в организме животных, относительно
невелика. Это объясняется неоптимальными для них условиями окружающей среды, а также
конкуренцией с более приспособленными к внешней среде видами.
В 2009 году в ходе палеонтологической экспедиции на берегу р. Малый Анюй, притока р.
Колыма, была обнаружена превосходно сохранившаяся мумия первобытного бизона (Bison
priscus), датируемая Четвертичным периодом. Примерный возраст бизона составляет около 2,53 лет, а оцененный возраст находки составляет около 50 000 лет. Был произведен отбор проб, в
232
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
результате которого нам удалось в условно стерильных условиях получить образцы
содержимого кишечника и одного из отделов желудка.
Целью данного исследования является определение и изучение бактерий, заселявших
просвет кишечника. В кишечнике крупного рогатого скота присутствуют сотни различных
микроорганизмов, и видовое разнообразие и состав у разных особей и популяций могут
значительно отличаться.
В ходе работы были опробованы различные условия культивирования и предпринята
попытка оценить видовой состав популяции бактерий одного из отделов тонкого кишечника.
Для этого фрагмент образца помещали в 10-кратно разбавленную питательную среду LB,
добиваясь разведения твердых компонентов. Полученной суспензией инокулировали свежую
среду (LB или R2A), и инкубировали при разной температуре. Через равные промежутки
времени высевали образцы на чашки и инкубировали при соответствующих температурах.
В общей сложности удалось выделить около 15 монокультур. Далее с использованием
стандартных праймеров была проведена ПЦР гена 16S РНК, и к настоящему времени ее
последовательность определена для 7 микроорганизмов. Четыре из них относятся к видам
Micrococcus luteus, Micrococcus flavus, Staphylococcus cohnii и Staphylococcus epidermidis, а для
трёх установлена родовая принадлежность (Acinetobacter, Paenibacillus sp. и Leucobacter).
Сейчас планируется полногеномный анализ одного из этих микроорганизмов в сравнении с
родственным ему современным видом.
Исследования проводятся в рамках проекта ANBIS и поддержаны грантом РФФИ 14-0432269.
СИНТЕЗ МИКРОБНОГО АУКСИНА АЗОТФИКСИРУЮЩИМИ И
МЕТИЛОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ ФИЛЛОСФЕРЫ
И РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙ ЗАСОЛЁННЫХ ПОЧВ
Шаравин Д.Ю.
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
dima-sharavin@yandex.ru
В районе солеотвалов на территории Верхнекамского месторождения калийных солей за
последние десятилетия сформировались участки почвы, где произрастают солеустойчивые
представители некоторых семейств растений, состоящие в симбиотических отношениях с
различными бактериями. Микроорганизмы ассоциированные с данными растениями могут
оказывать благоприятное влияние на растение-хозяина ускоряя адаптацию к солевому стрессу.
Целью настоящего исследования явилось изучение синтеза микробного ауксина у
галотолерантных азотфиксирующих и метилотрофных бактерий, выделенных из филлосферы и
ризосферы растений засолённых почв.
Были выделены чистые культуры метилотрофных бактерий активно растущие на среде
Гальченко с 3% NaCl и 1% CH3OH, изолированные с солеустойчивых видов Suaeda prostrata
Pall. (сведа простёртая) и Plantago maritima L. (подорожник морской). Накопительные
культуры азотфиксирующих бактерий были получены с образцов растений при
культивировании на солевой среде (3% NaCl) с глюкозой (1 г/л). Анализ микробного синтеза
индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) методом Сальковского (0,05М FeCl3 в 35% HClO4 на ФЭКе
при 540 нм) с L-триптофаном позволил выявить среди галотолерантных азотфиксирующих и
метилотрофных бактерий продуцентов ИУК. Концентрацию ауксина определяли по
калибровочной кривой, построенной используя стандартные растворы ИУК.
Установлено, что в растущей культуре при стартовой численности клеток 1×107 мл–1 синтез
ИУК начинается спустя двое суток с момента добавления в среду L-триптофана. Наибольшая
интенсивность синтеза ИУК наблюдалась в логарифмической фазе роста культур
азотфиксаторов и метилобактерий, а при выходе на плато, интенсивность синтеза резко падала.
Показано, что культуры галотолерантных азотфиксирующих бактерий синтезируют ИУК в два
раза больше (140 мкг/мл), чем метилотрофные бактерии (70 мкг/мл). Повышение содержания
ауксина в среде приводит к остановке роста культур азотфиксирующих бактерий (11 суток) и
метилобактерий (8 суток).
233
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ»
ОДНОВРЕМЕННАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ РАЗНЫХ АНТИГЕНОВ В СОСТАВЕ
ПОВЕРХНОСТИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE МЕТОДОМ
ИММУНОЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ЗОЛОТЫХ И ЗОЛОТО-СЕРЕБРЯНЫХ НАНОЧАСТИЦ
Широков А.А., Буданова А.А., Панфилова Е.В., Буров А.М.,
Щёголев С.Ю., Матора Л.Ю.
ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН,
Саратов, Россия
alex@ibppm.ru
Функционализированные
наночастицы
золота
широко
используются
в
микробиологических исследованиях. В частности, золотые наночастицы показали свою
эффективность в исследованиях антигенов бактерий рода Azospirillum, представляющих собой
широко используемый модельный объект в изучении растительно-микробных ассоциативных
взаимоотношений. Так, с помощью антител на липополисахарид (ЛПС), меченных коллоидным
золотом, было впервые показано, что полярный жгутик типового штамма A. brasilense Sp7
покрыт (липо) полисахаридным чехлом, изолирующим собственно детерминанты жгутика от
окружающей среды (Бурыгин с соавт., 2007). На основании этого факта было высказано
предположение, что флагеллин азоспирилл может участвовать в процессах микробнорастительного взаимодействия только в качестве носителя субстанции, обеспечивающей
адсорбцию данных бактерий на корнях растения. В работе (Буданова и Широков, 2012) удалось
подобрать условия деликатного отделения очехляющего материала от флагеллы (при
сохранении ее интактности), в результате чего была продемонстрирована картина
взаимодействия
анти-флагеллиновых
антител,
меченных
коллоидным
золотом,
непосредственно с поверхностью жгутика. В данных работах использовался только один тип
золотых наночастиц – имеющих сферическую форму. Вместе с тем, большие перспективы
может иметь подход, основанный на использовании наночастиц разной формы и позволяющий
одновременно выявлять два и более различных антигена на поверхности бактериальной клетки.
Целью настоящей работы являлась одновременная визуализация ЛПС (О-антигена) и
флагеллина (Н-антигена) в составе поверхности модельного штамма A. brasilense Sp245 с
использованием золотых и золото-серебряных наночастиц.
Для иммуномечения бактериальных клеток использовали родоспецифические
поликлональные кроличьи антитела к флагеллину A. brasilense Sp7, меченные коллоидным
золотом с размером сфер 15 нм., и поликлональные кроличьи антитела к ЛПС A. brasilense
Sp245, меченные золото-серебряными наноклетками.
В данной работе нам удалось впервые выполнить одновременную электронномикроскопическую визуализацию двух разных антигенов на поверхности бактерий с
использованием золотых наночастиц и золото-серебряных наноклеток. Полученные результаты
могут быть использованы при исследовании способов взаимодействия бактерий р. Azospirillum
с растениями.
234
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
СЕКЦИЯ «Молекулярная биология»
MOLECULAR AND STRUCTURAL BASIS FOR THE INHIBITION OF THE
BACTERIAL RNA POLYMERASE BY PHAGE TRANSCRIPTION FACTOR P7
Shadrin Andrey
MRC Centre for Molecular Microbiology and Infection, Imperial College London,
London SW7 2AZ, UK
andrey2010s@gmail.com
The multisubunit bacterial RNA polymerase enzyme, which catalyses DNA transcription, is
targeted by phage-encoded transcription regulators that selectively modulate its activity. Here, we
describe the structural and mechanistic basis for the inhibition of bacterial RNA polymerase by the
transcription regulator P7 encoded by Xanthomonas oryzae phage Xp10. We reveal that P7 uses a
two-step mechanism to simultaneously interact with the catalytic beta- and beta-prime subunits of the
bacterial RNA polymerase and inhibits transcription initiation by inducing the displacement of the
sigma70-factor on initial engagement of RNA polymerase with promoter DNA. The new mode of
interaction with and inhibition mechanism of bacterial RNA polymerase by P7 underscore the
remarkable variety of mechanisms evolved by phages to interfere with host transcription.
POLYMORPHISMS IN INFLAMMATORY RESPONSE GENES AND THEIR
ASSOCIATION WITH CHRONIC GASTRITIS IN KAZAKH POPULATION
Imanbekova M.1, Kulmambetova G.1, Logvinenko A.2, Sukashev A.2
1
National Center of Biotecnology; 2National Research Medical Center, Astana, Kazakhstan
deya.89@mail.ru
Background. Long persisters inflammation is one of the most important factors in the
development of chronic gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. Polymorphisms of inflammatory
cytokine genes are associated with individual differences in gastric mucosal cytokine mRNA level,
which result in differences in gastric mucosal inflammation, acid inhibition and gastroduodenal
disease risk. The aim of this study is to evaluate the associations between inflammatory cytokines
single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and chronic gastritis development in Kazakh population.
Methods. Genomic DNA was extracted from gastric biopsies from patients with chronic gastritis.
We genotyped six polymorphisms of IL-1B C511T (rs16944), IL-1B T31C (rs1143627), IL-1RN
(rs380092), TNF-A G308A (rs1800629), IL-10 G1082A (rs1800896) and IL-10 C819T (rs1800871) in
case-control study of 181 chronic gastritis patients and 260 sex- and age-matched healthy controls. For
data analysis we used SeqScape v.2.6 software package. The test for Hardy-Weinberg equilibrium was
performed using web program (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml) of genotype
frequencies in the selected allelic variants. All calculations were performed using DeFinetti online tool
(Institute of Human Genetics, Germany,http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwal.pl).
Results. We found a significant association between the IL-1RN *2/*2 (2 repeats of 86 bp) and
IL-1RN 2/L genotypes and increased risk of chronic gastritis [P= 8.418e-08, OR=5,39, 95%
confidence interval (CI)=2,783-10,436; P=0.007, OR=1.91, CI=1,133-3,221, respectively]. This
genotypes show enhanced suppression of gastric acid secretion, which results in more rapid
development of gastric atrophy, and a consequently greater risk of developing gastric cancer. Earlier
Furuta T. and colleagues found an association with the IL-1RN gene 2 allele in the Japanese
population. Also we found increasingly risk of gastritis development with IL-10-819 TT genotype
[P=0.0031, OR=2.83, CI=1,59-5,09].This SNP associated with reduced IL-10 mRNA expression and
influence the clinical course of gastric inflammation. Genotyping other genetic variants showed no
association with risk of chronic gastric.
Conclusion. Our results indicate that the IL-1RN 2/2, IL-1RN 2/L and IL-10-819 TT gene
polymorphisms are associated with chronic gastritis, may be served as a predictive factor for
gastroduodenal disease development within Kazakh population.
235
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
THE WAYS OF EFFICIENT APPLYING OF MOLECULAR MARKERS FOR
PLANT BREEDING AND VARIETY INVESTIGATION
Kolesnyk O.1, Chebotar S.1,2, Khokhlov A.1, Sivolap Y.1
1
Plant Breeding and Genetics Institute-National Center of Seed and Cultivar Investigation;
2
Odessa I. I. Mechnikov National University, Odessa, Ukraine
emerald-olga@ukr.net
The application of molecular markers has enabled breeders to select superior genotypes for traits
that are difficult to select based solely on phenotype or to pyramid desirable combinations of genes
into a single genetic background. Since the 1990s SSR markers have been extensively used in
constructing genetic linkage maps, QTL mapping, marker-assisted selection (MAS) and germplasm
analysis in plants. Most of the important agronomic traits are polygenic or controlled by multiple
QTLs. MAS for the improvement of such traits is a complex and difficult task because it is related to
many genes or QTLs involved, QTL x Environment interaction and epistasis. Usually, each of these
genes has a small effect on the phenotypic expression of the trait and expression is affected by
environmental conditions. As a model example there were selected results of our research of 49 lines
picked out under the "ear-row" scheme from soft winter wheat varieties breeded by the Plant Breeding
and Genetics Institute – National Center of Seed and Cultivar Investigation using 17 microsatellite
loci, the part of which was given in the guidelines on the differentiation and identification of wheat
varieties and was used in our previous researches. Each year the obtained grain material was analyzed
for a number of morphological and colorimetric characteristics (grain area projected on a plane,
perimeter, length, and width, circularity, grain color intensity by the optical methods using the digital
images of kernels. In addition important agronomical traits (heading time, plant height, 1000 kernel
weight, awn size, ear color, ear size were evaluated during three growing seasons (2010/11, 2011/12,
2012/13).
On the studied material there was confirmed the previously shown presence of statistically
significant associations of allelic state revealed by microsatellite loci with the expressiveness of a
number of parameters of agronomical and morphological traits. There was determined the hereditary
nature of some associations found in previous years. Development of research in this area is promising
in terms of a more complete disclosure of genetic predetermination of the key breeding traits (plant
height, photoperiod response, resistance to various diseases). Based on the experimental results of this
study, the practical cooperation with the department of wheat breeding has been started in order to
improve the variety control while breeding and primary seed production and to increase the
competitive ability of Ukrainian varieties on the global seed market.
ПОИСК И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДНЫХ БИОМАРКЕРОВ
КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Азаркин И.В.1, Зиганшин Р.Х.1, Ковальчук С.И.1,2, Арапиди Г.П.1, Шендер В.О.1,
Иванова О.М.1, Аниканов Н.А.1, Говорун В.М.1,2, Иванов В.Т.1
1
ФГБУН Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН; 2НИИ физико-химической медицины ФМБА, Москва, Россия
garik.igor.azar@gmail.com
Колоректальный рак одно из самых распространённых и смертельных онкологических
заболеваний в мире. Риск развития ненаследственного, случайного колоректального рака
составляет приблизительно 5%. Каждый год миллиону человек ставят диагноз колоректальный
рак и половину из них умирает от этого заболевания. Стадия заболевания является важным
прогностическим фактором, пятилетняя выживаемость больного при известном месте
локализации рака составляет более 90% при диагностировании заболевания на 1-ой стадии и
только около 10% при метастазировании в отдалённые органы (4 стадия). Целью данной
работы был поиск и идентификация пептидных маркёров колоректального рака в сыворотке
крови человека с использованием новейших масс-спектрометрических методов.
Кровь для выделения и идентификации пептидов была взята у 50 пациентов с
колоректальным раком и 50 здоровых доноров. Образцы сыворотки крови фракционировали на
магнитных микрочастицах со слабой катионообменной поверхностью, а полученные элюаты
236
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
обессоливали на обращенно-фазовых микроколонках. Для идентификации пептидов
обессоленные фракции дополнительно разделяли анионообменной хроматографией в
микроколоночном варианте, полученные в результате элюции ступенчатым градиентом соли
фракции дополнительно обессоливали и анализировали методом LC-MS/MS с использованием
масс-спектрометра ABSciexTripleTOF 5600+. Для сравнительной квантификации сывороточных
пептидов методом безметочной масс-спектрометрии SWATH(sequential windows acquisition of
all
theoretical
ion-fragments
spectra)
дополнительный
метод
предварительного
фракционирования анионообменной хроматографией не использовали. Полученные результаты
анализировали с использованием двух поисковых машин: Mascot и X!Tandem. Для
согласования результатов идентификаций и валидации полученных данных мы использовали
программный продукт Scaffold (Proteome Software).
Использованная схема выделения и идентификации пептидов позволила идентифицировать
более 6000 уникальных пептидов, являющихся фрагментами более 1000 белков. SWATH
анализ пептидных фракций образцов сыворотки крови, полученных от пациентов с
колоректальным раком и здоровых доноров, показал, что из 2761 выбранных для
квантификации пептидов, содержание 163 пептидов в образцах колоректального рака было
более чем в 3 раза выше, чем в контрольных образцах, и содержание 57 пептидов в
контрольных образцах было более чем в 3 раза выше, чем в образцах колоректального рака.
Полученные результаты представляют собой хорошую основу для дальнейших работ по поиску
новых биомаркеров колоректального рака.
ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ ОСНОВНЫХ ПРОИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ
НОВООБРАЗОВАНИЯХ (ЗНО) ЖЕНСКИХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ОРГАНОВ
Анохина Е.Н., Тугуз А.Р., Руденко К.А., Муженя Д.В.
ФГБОУ ВПО Адыгейский государственный университет,
Майкоп, Россия
monster882@rambler.ru
Медиаторы иммунной системы – иммунорегуляторные про- и противовоспалительные
цитокины вовлечены в патофизиологические процессы, включая неопластические.
Полиморфизмы генов цитокинов (single nucleotide polymorphisms, SNP) промоторных регионов
регулируют интенсивность экспрессии и биологические эффекты цитокинов. Выбор спектра
цитокинов обусловлен их возможной ролью в канцерогенезе: IL17 (A, F) - триггерный
медиатор воспаления; провоспалительный IL12 обуславливает противоопухолевую NKактивность; у IL2 все пути активации связаны с клеточными онкогенами,
противовоспалительные IL4 и IL10 могут снижать экспрессию молекул МНС-II.
Частотное распределение восьми SNP генов цитокинов: IL17А (G197А, rs2275913), IL17F
(His161Arg, rs763780), IL2 (T330G, rs2069762), IL4 (С589Т, rs2243250), IL10 (G1082А,
rs1800896; C819T, rs1800871; C592A, rs1800872), IL-12В (А1188С, rs3212227) в 279 образцах
ДНК женщин, в том числе доноров (n=148) и больных (n=131) со злокачественными
новообразованиями молочной железы (n=97), тела и шейки матки (n=32), яичников (n=2),
исследовано PCR-методом с использованием аллель-специфических праймеров НПФ «Литех»
и электрофоретической детекцией результатов (Терцик, ООО «ДНК-Технология»).
Результаты исследований. В группе русских женщин с неоплазиями по сравнению с
донорами статистически значимо повышены частоты полиморфизмов четырех из шести
исследованных генов цитокинов: G197 аллель IL17A (р=0,017), 819T – IL10 (р=0,04), А1188А
генотип и А1188 аллель IL12В (р=0,004 и 0,002). ЗНО у адыгов ассоциированы с аллельными
вариантами и генотипами других медиаторов: IL-17F (His161Arg генотипом, р=0,002; 161Arg
аллелью, р=0,003) и IL10 (592A аллелью, р=0,02). «Мутантная» 589Т аллель
противовоспалительного IL4 с высокой частотой (р=0,02) выявляется у женщин с
онкопатологией независимо от их этнической принадлежности.
Ассоциированность с низкодифференцированной аденокарциномой подтверждена для SNP
провоспалительного IL17A (G197 аллели, р=0,031) и противовоспалительного IL10 (G1082
аллели, р=0,02).
237
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
Метастазирование в регионарные лимфатические узлы сопряжено с повышением частот
полиморфных вариантов генов IL2 (T330 аллели, р=0,03), противовоспалительных IL4 (589Т
аллели, р=0,03) и IL10 (819T аллели, р=0,05), провоспалительного IL12В (А1188 аллели,
р=0,04), который обуславливает противоопухолевую цитотоксическую NK-активность
иммунокомпетентных клеток.
Вывод. SNP генов цитокинов имеют высокую прогностическую значимость при
неоплазиях женских репродуктивных органов.
ВЫЯСНЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ НИКУЮЩИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ В
БАКТЕРИЯХ РОДА BACILLUS
1,2
Бекбаев А.Ж. , Артюх Р.И.2, Перевязова Т.А.2, Юнусова А.К.2,
Антипова В.Н.2, Зырина Н.В.2, Железная Л.А.1,2
1
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт;
2
ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
Пущино, Россия
assyl_8@mail.ru
Никующие эндонуклеазы (далее, никазы) первоначально были описаны как
самостоятельные мономерные ферменты, которые узнают в двухцепочечной ДНК короткую
специфическую последовательность и вносят разрыв (nick) только в одну, предопределенную,
цепь ДНК на фиксированном расстоянии от узнаваемой последовательности. Позднее было
установлено, что никазы являются одной из субъединиц гетеродимерных рестриктаз, которые
расщепляют ДНК по двум цепям.
Однако тот факт, что никазы найдены пока только в бациллах, позволил нам высказать
предположение, что основная функция никаз состоит не в формировании гетеродимерных
рестриктаз, а в участии в клеточных процессах, связанных с внесением в ДНК одноцепочечных
разрывов, таких как рекомбинация и репарация. Косвенным указанием на наличие такой
функциии никаз может быть преимущественный синтез никазы по сравнению со второй
субъединицей.
Проверку выдвинутого предположения проводили с помощью метода Вестерн-блота на
клетках штамма Bacillus species D6, из которого ранее нами были выделены никаза Nt.BspD6I
(70.8 кДа) и малая субъединица (20 кДа), формирующая совместно с никазой гетеродимерную
рестриктазу. Нами были получены антитела к никазе и малой субъединице. Было показано, что
антитела гибридизуются с никазой и малой субъединицей, соответственно. Полученные
антитела были использованы для определения соотношения количества никазы и малой
субъединицы в лизате штамма Bacillus species D6. Разделение лизата клеток Bacillus species D6,
содержащих никазу, проводили с помощью электрофореза в 10% ПААГ. В качестве контроля
использовали очищенные препараты никазы и малой субъединицы. Белки из ПААГ переносили
на мембрану Immbilon -P (Millipore). Иммунодетекцию проводили согласно инструкции фирмы
Millipore c использованием в качестве вторичных антител конъюгата пероксидазы хрена с
антителами кролика. Хемилюминисценцию регистрировали с использованием растворов Clarity
Western (Bio-Rad).
Результаты показали, что никаза составляет примерно одну десятую часть от всех белков,
синтезируемых в клетках Bacillus species D6, тогда как наличие малой субъединицы в клетках
не регистрируется.
Таким образом, избыточное количество никазы по сравнению с малой субъединицей в
клетках Bacillus species D6 можно рассматривать как сильный аргумент в пользу выдвинутого
нами предположения о важной роли никаз в процессах рекомбинации (или репарации) ДНК.
238
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
БЫСТРАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ АКТИНОВЫХ
МИКРОФИЛАМЕНТОВ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ПОД ВЛИЯНИЕМ
ЛИЗОФОСФАТИДИЛОВОЙ КИСЛОТЫ
Бобков Д.Е.
ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
bobkovde@yandex.ru
Лизофосфатидиловая кислота (ЛФК) является биоактивным липидом, который действует
на клетки через специфические рецепторы, связанные с G-белками. При действии на
культивируемые немышечные клетки ЛФК активирует сигнальный путь Rho/ROCK, что
приводит к реорганизации системы актиновых микрофиламентов. Молекулярные механизмы,
лежащие в основе подобной реорганизации актинового цитоскелета, известны не полностью.
Ранее нами было обнаружено, что действие ЛФК на клетки вызывает, помимо реорганизации
структур актинового цитоскелета, изменения в составе мультимолекулярных белковых
комплексов, содержащих актин-связывающие белки, но не связанных со структурами
цитоскелета. Возникло предположение, что наблюдаемые изменения в составе таких
комплексов могут обеспечивать регуляцию образования структур актинового цитоскелета, в
частности, стресс-фибрилл.
В данной работе мы исследовали влияние ЛФК на состав цитоплазматических белковых
комплексов, содержащих миозин-9 (немышечный миозин IIA) и тропомиозин. Миозин-9
содержит в хвостовой части последовательность, гомологичную RhoGAP белку, и за счёт этого
является специфическим ингибитором малой ГТФ-азы Rho. Эксперименты проводились на
эмбриональных лёгочных фибробластах человека. Для выделения и очистки белковых
комплексов использовались методы гель-фильтрации, анион-обменной хроматографии и
иммунопреципитации.
С использованием поликлональных антител, выработанных против С-концевого пептида
миозина-9, методом вестерн-блот было обнаружено, что содержание миозина-9, входящего в
комплекс с тропомиозином, заметно снижается уже через 30 сек после добавления к клеткам
ЛФК. С помощью методов непрямой иммунофлюоресценции и анализа конфокальных
изображений было показано, что через 10 мин после действия ЛФК происходит уменьшение
колокализации миозина-9 с тропомиозином в цитоплазме. Также было обнаружено, что на
сроках, соответствующих завершению процесса реорганизации актинового цитоскелета (1 ч
после
добавления ЛФК), происходит протеолитическая деградация миозина-9,
ассоциированного со структурами цитоскелета. Совокупность полученных нами данных
подтверждает предположение об участии исследуемых цитоплазматических белковых
комплексов в процессе реорганизации актинового цитоскелета под действием ЛФК.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АЛЬБУМИНА И
РЕКОМБИНАНТНЫХ ДЕРИВАТОВ АЛЬБУМИН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА
СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ G
Бормотова Е.А., Гупалова Т.В.
ФГБУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины
СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия
bormotovae@rambler.ru
Патогенез стрептококковых инфекций является итогом взаимодействия биологических
систем организма хозяина и микроба. Вирулентность стрептококков коррелирует с их
способностью продуцировать на своей поверхности ряд белков. Одним из таких белков
является альбумин (ЧСА)-связывающий белок стрептококков группы G, Streptococcus canis,
выделенный из штаммов животного происхождения. Этот белок обладает только ЧСАсвязывающей активностью в отличие от G белка, выделенного из человеческого штамма
стрептококков группы G, связывающего как ЧСА, так и IgG.
Интерес авторов к этому белку определила его способность к высокоселективному
связыванию ЧСА. Ранее нами были сконструированы рекомбинантные полипептиды А2, А3 и
А4 на основе поверхностного ЧСА-связывающего белка путем амплификации в ПЦР
239
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
фрагментов хромосомной ДНК штамма DG 13 Streptococcus canis и их последовательного
клонирования в системе экспрессионных векторов pQE-30/31/32. Дериваты ЧСА-связывающего
белка, А2, А3 и А4 состоят из 346, 140 и 223 аминокислотных остатка, соответственно.
Рекомбинантные полипептиды А2, А3 и А4 предположительно должны обладать свойствами,
характерными для их прототипа и одно из них - селективное взаимодействие с молекулами
ЧСА. Изучение такого взаимодействия позволит определить перспективу применения
производных ЧСА-связывающего белка. Тем не менее, как показывает практика создания
рекомбинантных полипептидов и полипептидов на основе ЧСА-связывающего белка,
дифференциация производных по длине и положению ЧСА-связывающей области
относительно N-конца значительно влияет на их свойства.
Настоящее исследование посвящено анализу особенностей и структурных аспектов
взаимодействия ЧСА с полипептидами А2, А3 и А4. Все три полипептида обладали
способностью к селективному связыванию ЧСА в любом из использованных вариантов
постановки ИФА: прямом, непрямом и ингибиторном. Установлена способность полипептидов
А2, А3 и А4 вступать во взаимодействие с ЧСА как в растворе, так и в адсорбированном
состоянии. Однако, наибольшая способность связывать ЧСА принадлежит полипептиду А2,
обладающего самой длинной аминокислотной последовательностью.
Таким образом, особенности структуры каждого из трех полипептидов определяют
различия между ними по ЧСА-связывающей активности. Изученные особенности во
взаимодействии с ЧСА открывают широкие перспективы практического применения
рекомбинантных полипептидов А2, А3 и А4 при создании диагностикумов по определению
уровня ЧСА, а также в качестве ЧСА-связывающих реагентов для аффинного выделения ЧСА и
удаления ЧСА из сыворотки для последующего ее протеомного анализа.
ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ФИБРИНОГЕНА И
ФИБРИНСТАБИЛИЗИРУЮЩЕГО ФАКТОРА В ПРОЦЕССЕ
ОЗОН-ИНДУЦИРОВАННОГО ОКИСЛЕНИЯ
Бычкова А.В., Леонова В.Б., Бирюкова М.И., Костанова Е.А.,
Щеголихин А.Н., Колганова М.Н., Данилова Т.А., Розенфельд М.А.
ФГБУН Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН,
Москва, Россия
anna.v.bychkova@gmail.com
Авторы работы поднимают вопрос о наличии у белков плазмы крови структурных
элементов, обеспечивающих их способность к антиоксидантной самозащите. На примере озониндуцированного окисления фибриногена, являющегося ключевым белком системы
свертывания крови, и фибринстабилизирующего фактора, обеспечивающего ковалентное
сшивание фибринового сгустка, показано, что окислительная модификация сопровождается
изменениями в структуре и функции белков. Проведен анализ этих изменений.
Окислительная модификация фибриногена резко ускоряет процесс агрегации молекул
белка в растворе, однако механизмы самосборки кластеров из окисленных и неокисленных
молекул белка являются полностью идентичными – в обоих случаях образуются гибкоцепные
одноцепочечные полимеры, в которых мономерные молекулы взаимодействуют по типу «конец
к концу». Сравнение ИК-спектров, полученных для фрагментов D и E, выделенных из
окисленного
фибриногена,
обнаруживает
более
значительную
трансформацию
функциональных групп D фрагмента [1]. В случае окисления фибринстабилизирующего
фактора наблюдается зависимость его ферментативной активности от стадии активации
проэнзима, на которой осуществлялось озонирование; проведена оценка структурных
изменений белка в результате окислительной модификации. Совокупность результатов
указывает на то, что разрыхление белка и пространственное отстранение от каталитической
субъединицы регуляторной приводит к резкому увеличению чувствительности белка к
действию окислителя. По всей вероятности, это обусловлено потерей регуляторной
субъединицей B способностью служить в качестве перехватчика свободных радикалов [2].
Согласно нашей рабочей гипотезе, трехмерная структура и химический состав белков
свертывания крови предоставляет наиболее доступные и чувствительные области
240
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
полипептидных
цепей
в
качестве
перехватчиков
свободных
радикалов
при
свободнорадикальной атаке. Этот механизм защищает ключевые центры, ответственные за
основные функции белков.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №
14-04-31897 мол_а.
[1] Розенфельд М.А., Щеголихин А.Н., Бычкова А.В. и др. Биохимия, 2013, 78 (10), 14911501.
[2] Rosenfeld M.A., Bychkova A.V., Shchegolikhin A.N., et al. BBA, 2013, 1834 (12), 24702479.
АНАЛИЗ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К
БЕНЗО[А]ПИРЕНУ
Вавилов В.А.
ФГБУН Институт экологии человека СО РАН, Кемерово, Россия
vavilov_va@ihe.sbras.ru
Бензо[а]пирен (БП) является одним из наиболее распространенных канцерогенов в
антропогенных загрязнениях окружающей среды. Используя конъюгат БП с БСА,
проскринирована нативная комбинаторная фаговая библиотека одноцепочечных антител (scFv)
человека. Из 96 индивидуальных клонов 31 дал положительный ответ. Из них 11 с наиболее
сильным ответом отобраны, ДНК из них выделена и просеквенирована. Одинаковую
последовательность имели 4 и 2 ДНК из 11 образцов.
В дальнейшем использовали 7 последовательностей ДНК, кодирующих уникальные scFv к
БП. Анализ генов, кодирующих scFv, распределил их по генным семействам. Тяжелые цепи: Vсегменты принадлежали к пяти семействам – IGHV1-3, IGHV1-18, IGHV3-21, IGHV3-30 и
IGHV4-31; J-сегменты принадлежали к трем семействам – IGHJ1, IGHJ3 и IGHJ4. Легкие цепи
всех семи уникальных АТ относились к семейству каппа-цепей: V-сегменты принадлежали к
трем семействам – IGKV3-20, IGKV1-27, IGKV1-39; J-сегменты принадлежали к трем
семействам – IGKJ1, IGKJ2, IGKJ4.
Сравнение с генами зародышевой линии выявило невысокий консерватизм доменов scFv.
Процент гомологии варьировал от 80,2 до 97,6% для тяжелой цепи (93,9 ± 5,8%); и от 88, 9 до
98,6% для легкой цепи (94,6 ± 3,0%).
ДНК одного из клонов кодировала неполное антитело (отсутствовала бóльшая часть
тяжелой цепи), которое не использовалось в данной работе.
Были сравнены аминокислотные последовательности шести scFv между собой. Самая
высокая идентичность была между T62 и T77 – 89%, самая низкая между T62 и T89 – 63%.
Сфокусированным биноминальным тестом выявлена отрицательная антигенная селекция в
тяжелых и легких цепях во всех шести scFv.
Был проведен анализ образования CDR при созревании scFv и анализ аминокислотных
остатков CDR. При сравнении с зародышевыми линиями обнаружено количество
аминокислотных замен в CDR1 и CDR2 соответственно, в тяжелых цепях: T68 – 0 и 1; T72 – 1 и
4; T79 – 3 и 4; T89 – 2 и 1, в T62 и T77 аминокислотных замен обнаружено не было; в легких
цепях – T62 – 2 и 0; T68 – 1 и 0; T72 – 1 и 0; T77 – 1 и 0; T89 – 1 и 0, в T79 аминокислотных
замен обнаружено не было. При сравнении идентичных CDR всех шести scFv
консервативности не выявлено.
Молекулярные модели построены по алгоритму множественного выравнивания. Структура
связывающих центров шести scFv различалась.
Докинг БП с scFv выявил один участок во всех шести scFv, совпадающий с центром
связывания. Предсказанная энергия связывания scFv с БП (ккал/моль) была: T62 (–8,5), T68 (–
8,8), T72 (–8,8), T77 (–9,6), T79 (–8,6), T89 (–8,7).
241
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ РЕГУЛЯТОРНЫХ
ОБЛАСТЕЙ ГЕНОВ APPY И DPS ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЦР-МУТАГЕНЕЗА
Быков А.А.1, Покусаева В.О.2, Шавкунов К.С.2, Озолинь О.Н.2
1
ФГБОУ ВПО Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского,
Нижний Новгород; 2ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
forrozinho_cap@mail.ru
Несмотря на то, что экспрессия большинства бактериальных генов осуществляется с
одного промотора, ~25% генов имеют несколько сигналов транскрипции, контролируемых
разными регуляторными системами клеток. Продукты таких генов нужны клетке в разных
условиях роста, а сами гены, как правило, транскрибируются активнее. Однако это правило не
распространяется на промоторные островки, имеющие аномально высокую плотность мест
инициации транскрипции, но низкую эффективность синтеза РНК. Высказано предположение,
что их продуктивность подавляется молекулами РНК-полимеразы, связывающимися с
перекрывающимися промоторами и тем самым мешающими друг другу. Если это так, то
уменьшение промоторной плотности в островках должно активировать синтез РНК. Для
проверки этого был использован метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment), в котором 2 фрагмента, содержащие промоторный островок гена appY и обычную
промоторную область гена dps, подвергали ПЦР-мутагенезу. Полученные ампликоны
клонировали в плазмиду pET28b-eGFP перед геном gfp, а по флуоресценции
трансформированных ею клеток отбирали конструкции с изменённой активностью.
В ходе негативной селекции промоторная активность обеих областей оказалась полностью
подавленной 6 (dps) или 9 (appY) мутациями. В обоих случаях на ~30% уменьшилось число
потенциальных точек старта. Но островок гена appY всё ещё содержит 63 промотор-подобных
последовательности. В ходе позитивной селекции в промоторной области dps было накоплено 9
мутаций. Это повысило её активность в ~4 раза, увеличив число потенциальных точек старта с
10 до 12 (20%). Одна из мутаций приблизила контекст элемента -35 известного промотора Рdps
к консенсусу, а другая - улучшила модуль -10 у соседнего P2. Для 2,6-кратной активации
островка потребовалось 8 мутаций, но это сопровождалось снижением, а не увеличением числа
потенциальных точек инициации транскрипции с 89 до 61 (31.5%). Т.е. селекция в обоих
направлениях привела к уменьшению числа промоторов в островке. Подтверждая возможность
участия конкурирующих промоторов в подавлении транскрипции, это также может означать
нестабильность их высокой плотности в островках, для сохранения которой могут быть нужны
специальные регуляторные системы.
Исследования поддержаны грантом РФФИ 13-04-00997.
BROMODOMAIN ASSOCIATED FACTOR 180: ЛОКАЛИЗАЦИЯ И БЕЛКОВОЕ
ОКРУЖЕНИЕ
Валиева М.Е., Сошникова Н.В., Бречалов А.В., Георгиева С.Г.
ФГБУН Институт биологии гена РАН, Москва, Россия
Durnopeyko-maria@rambler.ru
Ремоделирующий хроматин комплекс PBAF, участвует в контроле пролиферации клеток
млекопитающих на ранних стадиях развития организма. PBAF комплекс состоит из коровой
части, в состав которой входит АТФ-аза, и четырех специфических белков PHF10, BRD7,
BAF180 и BAF200, образующих стабильный модуль, отвечающий за связывание с хроматином.
Интересно, что белковые комплексы, участвующие в регуляции экспрессии генов, часто не
имеют постоянного состава, и их субъединицы могут входить в состав нескольких комплексов.
Целью данной работы, во-первых, было определить локализацию специфической
субъединицы PBAF комплекса BAF180 в клетках человека линии HEK293. Во-вторых,
установить постоянство его белкового окружения. То есть, определить, включаются ли
специфические субъединицы PBAF в другие комплексы или являются характерными только
для данного ремоделирующего комплекса PBAF.
В результате данной работы были получены и очищены с помощью афинной
хроматографии поликлональные антитела к одной из субъединиц – BAF180, охарактеризована
242
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
специфичность данных антител, определена их рабочая концентрация. С помощью
иммуноцитохимического окрашивания клеток была показана ядерная локализация белка
BAF180 в клетках человека линии HEK293. А также, его присутствие в цитоплазме в
небольшом количестве.
В экспериментах по соосаждению соответствующими антителами белков, составляющих
специфический модуль, выяснилось, что как минимум три белка — BAF180, BAF200 и BRD7
полностью истощают себя и друг друга из экстрактов клеток HEK293, но не истощают
субъединицу PHF10. Также установлено, что из четырех специфических белков BAF180 лучше
всего взаимодействует с BRD7.
Таким образом, можно утверждать, что BAF180, BAF200 и BRD7 являются постоянными
субъединицами модуля комплекса PBAF и в HEK293 тесно взаимодействуют друг с другом.
Субъединица PHF10 тоже является неотъемлемым компонентом специфического модуля
PBAF, но также, вероятно, либо входит в состав другого комплекса, либо может существовать
самостоятельно. Полученные данные говорят о возможности наличия дополнительных
функций белка PHF10 в клетке, независимых от его работы в PBAF комплексе.
BASP1 И GAP-43 – НЕПАТОЛОГИЧЕСКИЕ БЕЛКИ АКСОННЫХ
ОКОНЧАНИЙ, ОБРАЗУЮЩИЕ АМИЛОИДОПОДОБНЫЕ ОЛИГОМЕРЫ
Витюк О.С., Захаров В.В.
ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова,
Санкт-Петербург, Россия
vit-oksana@yandex.ru
BASP1 и GAP-43 – белки нейронов, участвующие в направленном росте аксонов,
синаптической пластичности и нейрорегенерации. Ранее мы показали, что BASP1 и GAP-43
способны формировать in vitro олигомеры, сходные с олигомерами амилоидных белков,
образование которых связывают с развитием ряда нейродегенеративных болезней. Олигомеры
BASP1 и GAP-43 гетерогенны по размеру, взаимодействуют с конформационноспецифическими антителами к амилоидным олигомерам и образуют ионные каналы в
фосфолипидных бислоях. Миристилированный N-концевой пептид myr-BASP1(1-13),
определенный нами как участок, ответственный за агрегацию белка, легко образует фибриллы,
обладающие амилоидными свойствами. Учитывая сходство с амилоидными белками, мы
исследовали влияние BASP1 и GAP-43 на выживание нейрон-подобных клеток PC12. Однако,
как в мономерной, так и в олигомерной форме, эти белки не проявляли токсических свойств.
Предположив, что олигомеры BASP1 и GAP-43 являются функциональной формой данных
белков, мы решили исследовать вопрос об их присутствии на пресинаптической мембране
нейронов. Для этого нативные белковые комплексы нервных окончаний (интактных
синаптосом) или выделенных фрагментов пресинаптической мембраны (липидных рафтов)
мозга крысы фиксировали in situ с помощью сшивающих агентов (ДТСП или глутарового
альдегида) и анализировали с помощью электрофореза и иммуноблоттинга. Белки BASP1 и
GAP-43 обнаруживались в составе единого мембранного белкового комплекса. Состав
белковых комплексов липидных рафтов был исследован с помощью сшивки "ближайших
соседей" (при низкой концентрации сшивающего агента). Было показано, что основные
сшиваемые блоки этих комплексов представляют собой пары BASP1-GAP-43, BASP1-BASP1,
GAP-43-GAP-43 и GAP-43-кальмодулин. Таким образом, BASP1 и GAP-43 присутствуют на
мембране в виде ассоциированных с липидными рафтами гомо- и гетероолигомеров,
включающих также кальмодулин. Мы показали, что в системе in vitro белки BASP1 и GAP-43
также способны образовывать гетероолигомеры, причем при различных стехиометрических
соотношениях. Мы полагаем, что олигомеры BASP1 и GAP-43 являются примером
непатологических амилоидоподобных олигомеров и являются функциональной мембранной
формой данных белков.
243
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГОРМОНЗАВИСИМОГО ГЕНА ТРИПТОФАНДИОКСИГЕНАЗЫ КРЫСЫ
Вихнина М.В., Бобров Е.А., Романовская Е.В., Чихиржина Г.И.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
vikhnina@gmail.com
Ремоделирование структуры хроматина имеет принципиальное значение для регуляции
экспрессии генов, в частности, за счёт формирования предсобранной (preset) структуры
хроматина, обеспечивающей компетенцию гена к транскрипции. В формировании данной
структуры ключевую роль играют транскрипционные факторы–пионеры, связывающиеся со
своими специфическими сайтами ещё до активации транскрипции. Предполагается, что к таким
факторам относятся белки из семейства ядерных факторов NF1.
Нами проводится исследование структуры хроматина в регуляторной области гена
тканеспецифического фермента триптофандиоксигеназы крысы (tdo), экспрессия которого
находится под контролем глюкокортикоидных гормонов. В регуляторной области гена tdo в
транскрипционно активном состоянии было обнаружено несколько сайтов взаимодействия
ядерных факторов NF1 in vitro, а также идентифицированы два гиперчувствительных к ДНКазе
I участка, что указывает на то, что нуклеосомная структура хроматина в регуляторной области
гена tdo ремоделирована.
Принадлежность данных белков к семейству ядерных факторов NF1 показана с помощью
метода торможения электрофоретической подвижности в геле в присутствии конкурентной
ДНК. В результате связывания фрагментов регуляторной области гена tdo с частично
очищенными белковыми экстрактами из ядер печени крыс было выявлено три специфических
комплекса. В опытах с использованием специфического конкурента, содержащего
синтезированную
согласованную
нуклеотидную
последовательность,
специфически
взаимодействующую с фактором NF1, было показано присутствие белков, относящихся к
семейству ядерных факторов NF1. С помощью метода иммуноблоттинга было подтверждено,
что исследуемые частично отчищенные экстракты содержат белки семейства NF1.
Полученные нами экспериментальные данные указывают на то, что факторы семейства
NF1 могут участвовать в формировании компетентной к транскрипции структуры хроматина в
регуляторной области гена tdo. Для подтверждения этой гипотезы проводится изучение роли
факторов семейства NF1 в формировании компетентной к транскрипции структуры хроматина
в регуляторной области гена tdo на на трёх основных моделях: активной (хроматин,
выделенный из ткани печени крыс), репрессированной транскрипции (хроматин из ткани почек
крыс) и на модели компетенции гена к транскрипции (хроматин из клеток гепатомы линии
HTC). Сравнительный анализ моделей осуществляется с использованием метода
иммунопреципитации хроматина, сопряженного с ПЦР в режиме реального времени (ChIPqPCR).
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ PANTOEA VAGANS
Гилязева А.Г., Марданова А.М.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
adeliyagilyazeva@gmail.com
Роль внеклеточных протеаз в вирулентности многих патогенных и условно-патогенных
бактерий изучена достаточно хорошо. Однако мало данных об участии внутриклеточных
протеаз бактерий в патогенезе инфекционных заболеваний. Показано, например, что
цитоплазматическая Lon-протеаза грамотрицательных бактерий влияет на подвижность
бактерий, образование биопленок, регуляцию SOS-ответа и клеточного деления, а также вносит
вклад в цитотоксичность и поддержание бактерий in vivo. Металлопротеиназа гримелизин,
обнаруженная в клетках условно-патогенной бактерии Serratia grimesii A2, расщепляет
глобулярный актин в единственном сайте между Gly42 и Val43 с образованием двух
фрагментов в 36 и 8 кДа. В результате актин теряет способность к полимеризации.
Предполагают, что гримелизин участвует в инвазии бактерий в эукариотические клетки.
244
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
Изучение механизма действия гримелизина S. grimesii и подобных протеаз других
энтеробактерий важно для понимания молекулярно-биологической природы патогенеза
оппортунистических инфекций.
В ИФМиБ К(П)ФУ был секвенирован геном изолята P. vagans 3.2, в котором нами был
идентифицирован ген-ортолог гримелизина S. grimesii. Гомология генов равна 74%, а
кодируемых протеаз - 71%/84% (идентичность/сходство). Так же как гримелизин, ген
металлопротеиназы P. vagans входит в состав оперона вместе с геном гипотетического белка
длиной 342 п.н. BLAST-анализ геномов показал, что протеиназы типа гримелизин
присутствуют в клетках широкого круга энтеробактерий, что может свидетельствовать о
важной функции фермента в метаболизме бактерий. Проведен сравнительный анализ геномных
локусов, в которых расположены гены-ортологи гримелизина у разных видов р. Serratia и р.
Pantoea. Установлено сходство организации геномного локуса и консервативность в пределах
рода.
Были сконструированы праймеры для клонирования гена металлопротеиназы P.vagans 3.2
в плазмиды pBAD24 и pBAD-Myc/His. Были получены амплификаты с хромосомной ДНК P.
vagans 3.2, содержащие His-tag последовательности перед стоп-кодоном для последующего
выделения фермента с помощью аффинной хроматографии. Клетки Escherichia coli DH5α были
трансформированы полученными конструкциями кальциевым методом. Было отобрано 2 клона
с каждой плазмидой и проведено секвенирование клонированных генов. Была исследована
экспрессия гена металлопротеиназы в рекомбинантных клетках. Подобраны концентрация
индуктора (0,02% арабинозы) и оптимальное время индукции (4 часа). Экспрессия фермента
была подтверждена с помощью Western-блоттинга c использованием антител к гис-тагу.
Работа поддержана грантом РФФИ-рег № 13-04-97130.
ВОЗМОЖНОСТЬ АЛЬТЕРНАТИВНОГО КОДИРОВАНИЯ ГЕНА YEJO E. COLI
Глазунова О.А., Шавкунов К.С., Озолинь О.Н.
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
glazunova.olga.a@gmail.com
Ген yejO кишечной палочки предположительно кодирует белок-автотранспортер,
располагающийся во внешней мембране бактерий, который имеет структурное сходство с
ответственным за развитие коклюша белком пертактином у Bordetella pertussis. Наличие
потенциальных стартов транскрипции, предсказанных in silico в кодирующей части гена,
допускает необычную возможность кодирования изоформ белка. Таким образом, целью
исследования было охарактеризовать транскрипционный профиль гена yejO и оценить
возможность синтеза нескольких форм белка с его кодирующей последовательности.
Так как у E. coli K12 ген yejO прерывается транспозоном IS5, в то время как в
энтерогеморрагическом штамме O157:H7 EDL933 (EHEC) он находится в интактном
состоянии, мы анализировали транскрипцию в обоих штаммах, чтобы оценить возможное
влияние IS5. Руководствуясь in silico предсказаниями точек старта транскрипции (ТСТ), мы
зарегистрировали активный синтез внутригенной РНК в обоих штаммах и методом 5’-RACE
картировали две ТСТ в начале кодирующей последовательности yejO в геноме EHEC. Самая
длинная открытая рамка считывания (ОРС) была клонирована в вектор pBADb/Myc-His под
контроль арабиноза-индуцируемого промотора, и полученная конструкция была использована
для трансформации клеток штамма E. coli Top10. Наработку белка детектировали с помощью
Western-гибридизации, используя анти-Myc и анти-His антитела. При этом применение антител
к гистидиновому тэгу позволило обнаружить изоформы белка, соответствующие более
коротким ОРС.
Так или иначе, короткие и длинные мРНК транскрибирующиеся с кодирующей
последовательности yejO, были однозначно зарегистрированы in vivo. Их функциональную
взаимосвязь еще предстоит исследовать.
Исследования поддержаны грантом РФФИ 14-04-31940.
245
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ HDAC НА РЕПАРАЦИЮ ПОВРЕЖДЕННОЙ ДНК
Гнедина О.О.1,2, Иготти М.В.1, Светликова С.Б.1, Поспелов В.А.1
1
ФГБУН Институт цитологии РАН; 2ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский
государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
olga.o.gnedina@gmail.com
Как известно, ингибиторы гистоновых деацетилаз (HDAC) способны подавить
опухолеобразование, поскольку вызывают остановку клеточного цикла, преждевременное
клеточное старение или апоптоз. Малоизученным действием ингибиторов является их влияние
на способность трансформированных клеток репарировать двунитевые разрывы ДНК (DSBs).
Выбор механизма репарации DSBs во многом определяется фазой клеточного цикла. Механизм
по типу гомологичной рекомбинации (HR) восстанавливает ДНК в S или G2 фазах клеточного
цикла, когда сестринские хроматиды являются более доступными. В отличие от HR репарация
по типу негомологичного соединения концов (NHEJ) преобладает в фазе G1 клеточного цикла,
когда клетки растут, но еще не готовы к делению. Репарация этого типа используется реже вне
фазы G1, но сохраняет некоторую активность в течение всего клеточного цикла.
Ранее нами было показано, что ингибиторы HDAC вызывают в трансформированных
клетках E1A+Ras пролиферативный блок G1/S, а также накопление фокусов репарации ДНК,
маркированных фосфорилированным гистоном H2AX. Для того чтобы исследовать влияние
ингибиторов HDAC на репарацию поврежденной ДНК мы использовали плазмиду pGL3-basic,
несущую репортерный ген люциферазы, в которую разными способами вносились двунитевые
разрывы, приводящие к невозможности экспрессии гена люциферазы. Эффективность
репарации в присутствии и в отсутствие ингибитора HDAC бутирата натрия (NaB) оценивали
количественно методом восстановления транскрипции люциферазы (HCR, host cell reactivation
assay). Для изучения влияния ингибиторов HDAC на репарацию двунитевых разрывов ДНК по
механизму NHEJ разрывы в pGL3-basic вносили действием эндонуклеазы рестрикции по сайту
внутри репортерного гена. Поврежденной плазмидой и контрольной, интактной плазмидой,
трансфецировали клетки E1A+Ras, после чего определяли эффективность репарации в
присутствии и в отсутствие NaB. Для изучения влияния ингибиторов HDAC на репарацию по
механизму HR, трансфекцию проводили набором из двух плазмид pGL3-basic,
рестрицированных двумя наборами эндонуклеаз с образованием перекрывающихся
фрагментов.
Данные анализа HCR показали, что в трансформированных клетках E1A+Ras бутират
натрия подавляет репарацию DSBs, реализуемую по механизму NHEJ. Однако в клетках линии
NIH3T3, не являющихся трансформированными, а также в нормальных клетках REF52,
подобного эффекта подавления эффективности репарации при действии NaB не наблюдалось.
В свою очередь репарация по механизму HR в онкоген-трансформированных клетках E1A+Ras
не ингибируется бутиратом натрия.
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ПРЕСИНАПТИЧЕСКИХ ГЕНОВ В МОЗГЕ
DROSPHILA MELANOGASTER С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ
ГЕНА SNCA ЧЕЛОВЕКА
Голомидов И.М., Саранцева С.В.
ФГБУ Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова,
Санкт-Петербург, Россия
ilia_stv@mail.ru
Болезнь Паркинсона (БП) – хроническое заболевание, характерное для лиц старшей
возрастной группы. Для БП характерна гибель нейронов чёрного вещества среднего мозга (лат.
Substantia nigra) и других отделов центральной нервной системы, использующих в качестве
нейромедиатора дофамин. БП встречается у людей старше 60 лет с частотой 1-2%.. Альфасинуклеин - основной компонент телец Леви, наличие которых в цитоплазме
дофаминергических нейронов черной субстанции является ключевым гистопатологическим
маркером болезни Паркинсона. Образование телец Леви характерно, как для наследственных,
246
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
так и идиопатических случаев БП. Целью данной работ является исследование механизмов
ранних нейродегенеративных процессов при БП, на модели Drosophila melanogaster.
В работе проведен анализ уровня экспрессии генов, кодирующих синаптические белки:
синаптотагмин 1 (synaptotagmin 1, syt1) и нейронального синаптобревина (n-synaptobrevin, nsyb) при гиперэкспрессии в нервных клетках Drosophila melanogaster гена альфа-синуклеина
(SNCA) человека. Уровень мРНК синаптотагмина и синаптобревина измеряли методом ПЦР в
режиме реального времени. В качестве референс-генов были использованы гены RP-49
(ribosomal protein L32) и GAPDH2 (Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase 2).
Экспрессия SNCA дикого типа и его мутантных форм SNCA А30Р и SNCA А53Т, которые
вызывают семейные формы БП, была проведена с помощью системы ТАRGET, при которой
экспрессия генов запускается при 29 0С и останавливается при 18 0С. В работе показано, при
экспрессии SNCA дикого типа и его мутантных форм вызывала уменьшение уровня мРНК
синаптотагмина и синаптобревина.
Мы предполагаем, что уменьшение уровня мРНК синаптических генов является
результатом нарушения синаптических функций SNCA.
Работа поддержана грантом РФФИ № 12-04-00898.
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ СОНЬ ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЫ
Григорьева О.О.
ФГБУН Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН,
Москва, Россия
grig_forever@mail.ru
Мы исследовали филогенетичесике отношения четырех видов сонь семейства Gliridae:
Dryomys nitedula, Muscardinus avellanarius, Eliomys quercinus, Glis glis на основании данных
последовательностей участков генов cytb, 12S, IRBP.
29 образцов были получены из Саранской, Нижегородской, Ростовской областей и
Краснодарского края России, а также из Белоруссии. Были разработаны новые праймеры для
каждого гена. Филогенетический анализ проводился на основании методов NJ, MP, ML, BI.
Анализ филогении позволил отнести исследуемые образцы E. quercinus к
Западноевропейской кладе, M. avellanarius – к кладе Центральной и Северной Европы, G. glis –
к Европейской. Dryomys и Eliomys объединены в общую кладу по cytb и IRBP. Также эта клада
выделяется в топологии 12S без внешней группы. Данная топология 12S выявлялась в
предыдущих исследованиях. В одну кладу, сестринскую Dryomys+Eliomys, объединяются
Muscardinus и Glis в топологиях cytb и 12S при анализе последней без внешней группы. В
топологии IRBP Muscardinus является внешней родственной кладой по отношению
Dryomys+Eliomys с высокими уровнями поддержки. Внешней группой по отношению к кладе
Dryomys+Eliomys+Muscardinus в данной топологии гена IRBP является Glis. Стоит отметить,
что топология по ядерному гену находится в согласии с работами по другим ядерным генам, а
также с последней классификацией Холдена. Таким образом, отношения между подсемейства
остаются неоднозначными.
Граница эоцена и олигоцена (34 млн. л. н.) означает начало периода глобального изменения
климата и обширной реорганизации фауны млекопитающих во всем Северном. Наши расчеты
показывают, что диверсификация сохранившихся подсемейств, скорее всего, началась в это
время. К концу олигоцена (около 24 млн. л. н) температура мирового океана выросла на 4°С,
начался теплый период, который продлился до 16 млн. л. н. Моделирование глобального
климата в сочетании с прямыми ископаемых свидетельствами позволяют предположить, что в
Северной Евразии была субтропическая и умеренная растительность в этот теплый период. Это
была излюбленная среда сонь и мы можем заключить, что поздний олигоцен - начало миоцена
– самый оптимальный период в эволюционной истории семейства Gliridae. После теплого
периода Северная Евразия стала холоднее и суше и лесные массивы отступили, отчасти из-за
поднятия Тибетского нагорья. Разнообразие сонь также сократилось в этот период. Очевидно,
линия, включающая Eliomys и Dryomys, также ответвляется в этот период.
Работа проводилась при поддержке гранта РФФИ 12-04-32035-мол_а и гранта Президента
Российской Федерации МК-3755.2014.4.
247
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
REB1 УЧАСТВУЕТ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОТЕАСОМНЫХ ГЕНОВ У
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Даниленко Н.К., Карпов Д.С., Карпов В.Л.
ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Москва, Россия
nkdani@mail.ru
Экспрессия протеасомных генов осуществляется по механизму отрицательной обратной
связи. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae описана система координированной регуляции
протеасомных генов, состоящая из фактора транскрипции Rpn4 и его сайта связывания,
названного PACE (Proteasome-Associated Control Element). Однако Rpn4 не влияет на структуру
хроматина в промоторах протеасомных генов и в штамме с делецией гена RPN4 (rpn4-∆) в
условиях стресса ДНК-повреждающими соединениями активируется экспрессия протеасомных
генов и увеличивается количество протеасом. Эти данные указывают на существование других
транскрипционных регуляторов протеасомы.
С целью поиска других регуляторов протеасомы нами проведен биоинформатический
анализ баз данных по картированию сайтов связывания дрожжевых транскрипционных
факторов. Установлено, что, по крайней мере, 16 из 33 протеасомных генов могут
непосредственно регулироваться Reb1, который известен как регулятор экспрессии
рибосомных генов и способен влиять на структуру хроматина контролируемых генов.
Участие Reb1 в регуляции промоторов протеасомных генов подтверждено нами в
репортерной системе с бета-галактозидазой. Показано, что мутация предполагаемого сайта
связывания Reb1 в промоторных областях PRE2, RPN5 и RPT5 снижает активность бетагалактозидазы в 3-20 раз, как в нормальных условиях, так и при ДНК-повреждающем стрессе.
Установлено также, что Reb1 регулирует протеасомные гены преимущественно в нормальных
условиях, а Rpn4 – при действии стресса.
Способность Reb1 контролировать активность целого протеасомного комплекса,
подтверждена нами при помощи мутантного штамма, в котором нарушена Reb1-зависимая
регуляция протеасомы. В этом штамме за счет мутации сайта связывания Reb1 снижена
экспрессия гена PRE2, кодирующего каталитическую субъединицу протеасомы. Мутантный
штамм проявляет гиперчувствительность к действию теплового шока и аналогов аминокислот,
что характерно для штаммов с нарушенной функцией протеасомы.
Таким образом, нами показано, что Reb1 может участвовать также и в регуляции
экспрессии протеасомных генов.
ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РЕГУЛЯЦИИ ЦИРКАДНЫХ
РИТМОВ НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ И
СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТЬ ОСОБЕЙ DROSOPHILA MELANOGASTER
Добровольская Е.В.1, Плюснина Е.Н.1,2, Соловьев И.А.2, Москалев А.А.1,2,3
1
ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; 2ФГБОУ ВПО Сыктывкарский
государственный университет, Сыктывкар, Россия; 3ФГАОУ ВПО Московский физикотехнический институт (государственный университет), Долгопрудный, Россия
dobrovolskaya.evgenia@gmail.com
Большинство организмов, включая человека, подвергаются воздействию такого важного
фактора окружающей среды как свет. Циркадные (суточные, с периодом около 24 часов) ритмы
сформировались в процессе эволюции для синхронизации большинства важнейших функций
организма при адаптации к воздействию факторов внешней среды. Суточные и годовые
колебания светового режима влияют на сон, двигательную активность, рост, размножение,
линьку и многие другие процессы у животных. Изменение спектрального состава или режима
освещения, которые наблюдаются в высоких широтах или вызваны световым загрязнением от
искусственных источников освещения, могут приводить к дестабилизации функционирования
данных систем, проявлению патологических реакции и изменению скорости старения.
Большинство генов циркадных ритмов человека являются эволюционно консервативными и
имеют ортологи у плодовой мушки Drosophila melanogaster.
248
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
Установлено, что у старых особей дрозофил наблюдается снижение экспрессии гена
светочувствительного белка Cryptochrome, в то время как его сверхактивация у старых особей
приводит к замедлению скорости старения (Rakshit, Jadwiga, 2013). С другой стороны,
дрозофилы с мутациями в генах циркадных ритмов характеризуются сниженной
продолжительностью жизни (Kondratov, Antoch, 2007). Целью данной работы было исследовать
влияние сверхактивации генов циркадных ритмов (Period, Timeless, Doubletime,Clock, Cycle,
Cryptochrome) на продолжительность жизни и стрессоустойчивость особей Drosophila
melanogaster. Для этого производили кондиционную (мифепристон-индуцибельную)
активацию экспрессии исследуемых генов с помощью UAS/GAL4 системы в нервной системе
мух, после чего оценивали показатели продолжительности жизни и выживаемости в условиях
действия индуктора свободных радикалов параквата (20 мМ),гипертермии (35°С) и голодания.
Результаты проведенного исследования демонстрируют роль генов регуляции циркадных
ритмов в детерминации продолжительность жизни и стрессоустойчивости Drosophila
melanogaster.
Работа поддержана Грантом Президиума РАН 12-П-4-1005 «Экологическая генетика
продолжительности жизни модельных животных (Drosophila melanogaster, Mus musculus)»,
Грантом Президента Российской Федерации № МД-1090.2014.4 "Сравнение механизмов ответа
Drosophila melanogaster на оксидативный, тепловой, холодовой, и генотоксический стрессы с
использованием полногеномного анализа транскриптомов» и Молодежным Грантом № 14-4НП-103 «Изучение влияния активации генов стресс-ответа и циркадных ритмов на старение и
стрессоустойчивость Drosophila melanogaster».
ХАРАКТЕРИСТИКА СУБДОМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СЛИТОГО ЛОКУСА
α-β-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ DANIO RERIO
Долгушин К.В., Петрова Н.В.
ФГБУН Институт биологии гена РАН, Москва, Россия
dolgushin-molbiol@bk.ru
В рамках теории доменной организации генома структурно-функциональной единицей
генома является домен – ген и его регуляторные элементы. Домен слитых α-β-глобиновых
генов рыб является интересной моделью как для изучения регуляторных систем, так и с
эволюционной точки зрения. Домен слитых α-β-глобиновых генов danio rerio близок по своей
структуре к организации предкового локуса, в его составе четко выделяются два субдомена,
обладающих дифференцированным паттерном экспрессии. Основная задача работы –
продемонстрировать что эмбриональные и взрослые субдомены разнородны по своей природе,
а возможно изолированы не только функционально, но и структурно.
Для изучения структурно-функциональной организации слитого домена и субдоменов
использовали сопоставление ДНКазной чувствительности хроматина различных локусов в
составе домена, выделенного из хроматина фибробластов. Кроме того, с использованием
метода нативной иммунопреципитации изучали распределение активирующих и
репрессирующих модификаций гистонов на протяжении всего локуса, включая участок между
эмбриональным и взрослым субдоменами. В этих экспериментах использовали хроматин,
выделенный из взрослых и эмбриональных эритроцитов и фибробластов danio rerio.
По уровню чувствительности к ДНКазе I в клетках, не экспрессирующих глобины, слитый
локус гетерогенен. Распределение активирующих модификаций во взрослых и эмбриональных
эритроцитах носит альтернативный стадиеспецифичный характер. Во взрослых эритроцитах
маркирован локус взрослых генов, в эмбриональных – эмбриональный локус. Во взрослых
эритроцитах субдомен ацетилированных гистонов Н3 и Н4 выходит за границы локуса
взрослых генов, вероятно границы локуса и субдомена не совпадают; в эмбриональном локусе
накапливаются модификации H3K9me2, H3K27me3, обеспечивая репрессию субдомена. В
эмбриональных эритроцитах границы локуса эмбриональных генов совпадают с границами
субдомена ацетилированных гистонов Н3 и Н4; в хроматине взрослого локуса накапливается
модификация Н3К27me3, характерная для репрессии белками группы Polycomb. В
фибробластах остаточный уровень ацетилирования взрослого и эмбрионального локусов не
отличается.
249
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
Мы показали, что структура слитого домена α-β-глобиновых генов danio rerio является
неоднородной. Различие в ДНКазной чувствительности субдоменов в неэритроидных клетках
позволяет предполагать использование различных механизмов репрессии субдоменов.
Функциональная изоляция субдоменов сопровождается их структурным обособлением.
Полученные данные позволяют предполагать наличие геномных регуляторных элементов,
сегрегирующих субдомены.
ДИМЕРИЗАЦИЯ ZAD-ДОМЕНОВ И ИХ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ
ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
Золотарев Н.А., Федотова А.А., Максименко О.Г.
ФГБУН Институт биологии гена РАН, Москва, Россия
3kolya@mail.ru
ZAD-домен (домен, ассоциированный с цинковыми пальцами) входит в состав ста белков
D.melanogaster. Все эти белки содержат кластеры доменов цинковых пальцев C2H2 типа и
способны связывать специфичные сайты ДНК. Для двух ZAD-доменов показана способность
образовывать димеры.
Мы предполагаем участие белков с ZAD-доменами в организации хроматина и выполнении
функций инсуляторных белков. Ранее нами было показано, что два белка с ZAD-доменами (Pita
и CG7928) функционируют как инсуляторные белки и способны образовывать петли ДНК.
В этой работе мы рассматриваем возможный механизм реализации этой функции. Мы
показали образование димеров 9 ZAD-доменов . Для этого использовали различные методы in
vitro и исследование с помощью дрожжевой двугибридной системы.
С помощью некоторых in vitro методов мы также обнаружили взаимодействие между ZADдоменами разных белков.
Имеющиеся у нас данные позволяют предположить, что белки с ZAD-доменами участвуют
в организации хроматина, и димеризация ZAD-доменов важна для этого процесса.
ПОИСК ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ НА РОЛЬ ГЕНА SYM31 ГОРОХА ПОСЕВНОГО
(PISUM SATIVUM L.) НА ОСНОВАНИИ ТОЧНОГО КАРТИРОВАНИЯ С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЖВИДОВЫХ МАРКЕРОВ И ДАННЫХ
СЕКВЕНИРОВАНИЯ ТРАНСКРИПТОМА
Жуков В.А., Жернаков А.И., Федорина Я.В., Борисов А.Ю., Тихонович И.А.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург, Россия
zhukoff01@yahoo.com
Бобовые растения в симбиозе с клубеньковыми бактериями (ризобиями) способны к
биологической фиксации атмосферного азота. Мутации в генах растения могут нарушать
развитие азотфиксирующих клубеньков. Так, мутация в гене sym31 гороха посевного приводит
к образованию клубеньков, не фиксирующих азот. Для выявления его последовательности
используется подход, основанный на точном картировании и поиске генов-кандидатов в геноме
люцерны слабоусеченной (Medicago truncatula Gaertn.).
Ранее ген sym31 был локализован в пределах района в 2,7 сМ в группе сцепления III гороха
с использованием ген-специфичных молекулярных маркеров. Сопоставление генетической
карты гороха с физической картой секвенированного генома люцерны слабоусеченной
позволило выявить район хромосомы 3 люцерны, содержащий 70 генов, потенциально
являющихся кандидатами на роль гомолога Sym31 гороха.
Из клубеньков растений линии Sprint-2Fix-, мутантных по гену sym31, а также корней и
клубеньков растений исходной линии Sprint-2 была выделена РНК, секвенированная с
использованием протокола MACE (massive analysis of cDNA ends) на приборе Illumina
HiSeq2000 (компания GenXpro, Германия). Для каждого из генов-кандидатов был определен
уровень экспрессии на основании числа прочтений, приходящихся на каждый ген. Были
250
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
выявлены 4 гена, преимущественно экспрессирующиеся в клубеньках (уровень экспрессии в
клубеньках «дикого типа» достоверно превышал уровень экспрессии в корнях). Эти гены
кодируют нодулин-подобный белок N3, гидроксициннамоил-трансферазу, сульфуразу
молибденового кофактора и белок с неизвестной функцией. Последний ген также
демонстрировал снижение уровня экспрессии в мутантных клубеньках по сравнению с
клубеньками «дикого типа».
В настоящее время проводится секвенирование выявленных генов-кандидатов у растений
линии Sprint-2Fix- (sym31) и исходной линии Sprint-2. Обнаружение мутации в рамке
считывания станет основанием для присвоения симбиотической роли одному из этих геновкандидатов.
Исследование поддержано грантами Президента РФ (НШ-337.2012.4 и НШ-4603.2014.4) и
РФФИ (13-04-01702-а, 13-04-01703-а и 14-04-01442-а).
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ SSR МАРКЕРОВ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ПАСПОРТИЗАЦИИ ХЛОПЧАТНИКА
Закирова Д.В., Эгамбердиев Ш.Ш., Салахутдинов И.Б., Абдуллаев А.А.
Центр геномики и биоинформатики (ЦГБ) АН РУз, МСВХ Уз, ассоц. «Узпахтасаноат»,
Ташкент, Узбекистан
darya.zakirova@genomics.uz
Улучшение качества волокна и повышение урожайности – основная цель селекционных
программ по хлопчатнику во всем мире. Трудность данной задачи заключается в
ограниченности генетической базы современных сортов. Оба эти аспекта указывают на острую
необходимость оценить молекулярно-генетическое разнообразие сортов и линий хлопчатника.
Используя маркерные системы, можно создавать молекулярно-генетические паспорта для
каждого образца генетических коллекций.
Целью данной работы явилось создание молекулярно-генетических паспортов с помощью
SSR маркеров. Было проведено генотипирование 37 образцов хлопчатника из коллекции
Центра геномики и биоинформатики с использованием 185 праймерных пар, из которых 38
позволили получить полиморфные локусы, использованные для создания молекулярных
профилей исследуемых образцов. В общей сложности было идентифицировано 107 локусов,
количество которых варьировалось от 2 до 7 со средним значением 2,81 локусов на маркер.
Проведя оценку содержания полиморфной информативности (PIC) среди маркеров, мы
выявили, что наименьшее и наибольшее значение составило 0,051 и 0,609 соответственно со
средним значением 0,358. Наименьшее и наибольшее значение ожидаемой гетерозиготности
(Не) варьировало от 0,052 до 0,678 со средним значением 0,421.
Дальнейший филогенетический анализ микросателлитных данных с использованием
метода незвешенного папарного группирования со средним арефметическим UPGMA
(unweghted pair group method with arithmetic mean) позволил разделить образцы на 6 групп.
Наиболее отдаленными от других оказались сортообразцы 6, 12. Сорта Наманган 102,
Наманган 34, АN16 также образовывали отдельный кластер, а так же линия С8271 выделилась
как отдельная ветвь. Остальные 3 группы отличались друг от друга не существенно, как и
образцы располагающиеся внутри них. Принимая во внимание низкие средние значения PIC и
Не можно сделать вывод о их узкой генетической базе как результат направленной селекции.
Не исключено, что в перспективе для создания генетических паспортов хлопчатника
необходимо использовать микросателлитные индексы специфичных SSR локусов с низкой
частотой аллелей. Данная работа является исходной точкой для начала использования
баркодинга в изучении ресурсов гермплазмы хлопчатника.
251
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ ДНКПОЛИМЕРАЗЫ ЙОТА ЧЕЛОВЕКА НА ВКЛЮЧЕНИЕ ДЕЗОКСИ- И
РИБОНУКЛЕОТИДОВ
1,2
Игнатов А.В. , Миропольская Н.А.1, Макарова А.В.1, Кульбачинский А.В.1
1
ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН; 2ФГБОУ ВПО Московский
государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
ignatov.msu@gmail.com
ДНК-полимераза йота человека (Pol ι) принадлежит к Y-семейству ДНК-полимераз,
выполняющих в клетках специализированные функции. В отличие от репликативных
полимераз, Pol ι способна проходить множество повреждений ДНК in vitro, но при этом
обладает низкой точностью синтеза ДНК. Структурные исследования показали, что, в отличие
от всех известных полимераз, Pol ι использует неканонические Хугстиновские взаимодействия
при спаривании входящих нуклеотидов с матричными пуриновыми основаниями. Было
предположено, что это объясняется наличием в активном центре Pol ι объемных
аминокислотных остатков, в частности, остатка Q59, которые способствуют поворачиванию
матричных пуринов в syn-конформацию. Как было недавно показано, некоторые ДНКполимеразы способны включать в синтезируемую ДНК рибонуклеотиды, что имеет важное
регуляторное значение в репликации. Низкая точность синтеза ДНК Pol ι позволяет
предположить, что эта полимераза также могла бы включать рибонуклеотиды, однако, эта
способность Pol ι ранее не была исследована. Следует отметить, что у большинства известных
ДНК-полимераз за дискриминацию дезокси- и рибонуклеотидов отвечает ароматический
аминокислотный остаток, который контактирует с сахаром входящего нуклеотида; у Pol ι таким
остатком является Y39.
С целью уточнения механизмов включения нуклеотидов Pol ι в нашей работе были
исследованы Pol ι дикого типа и ее мутантные варианты с точечными заменами Q59A и Y39A.
Было показано, что обе замены значительно снижают общую активность, но при этом
повышают точность Pol ι. Для проверки роли Хугстиновских и Уотсон-Криковских
взаимодействий во включении нуклеотидов были использованы матрицы, содержащие аналоги
пуриновых нуклеотидов с модификациями, нарушающими каждый из типов взаимодействий
(7-деазапурины и 1,N6-этеноаденин). В результате было показано, что Pol ι дикого типа
способна включать нуклеотиды за счет Хугстиновских взаимодействий, а замена Q59A
стимулирует формирование Уотсон-Криковских взаимодействий. Таким образом, данный
остаток, вероятно, играет роль в позиционировании матричного нуклеотида при формировании
Хугстиновских взаимодействий. Мы также обнаружили, что Pol ι дикого типа способна
включать в ДНК рибонуклеотиды, при этом замена остатка Y39 значительно увеличивает
эффективность этой реакции. Таким образом, остаток Y39 играет роль в формировании
«стерических ворот» для дискриминации нуклеотидов в активном центре Pol ι.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-04-01697.
НЕКОТОРЫЕ МУТАЦИИ В С-КОНЦЕВОМ УЧАСТКЕ РИБОСОМНОГО
БЕЛКА L16 ESCHERICHIA COLI КРИТИЧНЫ ДЛЯ ВЫЖИВАНИЯ КЛЕТОК
Исаев А.Б., Коробейникова А.В., Гонгадзе Г.М., Гарбер М.Б.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
tcft18@gmail.com
Рибосомный белок L16 является неотъемлемым компонентом рибосом всех известных
организмов. Комплекс биохимических и структурных данных указывает на его контакты с
тРНК в А-сайте и 23S рРНК. Кроме того, только кристаллографические исследования
позволили выявить контакт L16 c белком L25. В этом взаимодействии участвует четыре
аминокислотных остатка C-конца белка L16: K127, K133, T134 и M136 (около 10% от всех
контактов белка в рибосоме). Однако, было установлено, что делеция гена белка L25 в клетках
E. coli приводит к появлению функционально-неактивных рибосомных субчастиц, в которых
также отсутствует и белок L16. Было предположено, что контакт L16 с L25 является важным
для удержания L16 в транслирующей рибосоме.
252
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
Целью настоящей работы является выяснение роли С-концевого участка белка L16 в его
удержании в бактериальной рибосоме in vivo. Для этого были созданы штаммы E. coli, несущие
в хромосоме мутантную форму гена белка L16.
При замене лизина-133 на массивный гидрофобный остаток (К133L) наблюдается
замедление скорости роста клеток, а также снижение трансляционной активности (до 20%). В
то же время, удаление 4 С-концевых остатков (∆133-136) не оказывает значительного влияния
на скорость роста и трансляционную активность клеток, при различных условиях
культивирования, по сравнению со штаммом дикого типа. Однако, удаление 10
аминокислотных остатков в исследуемой области (∆127-136) оказалось летальным для
бактериальных клеток. Было высказано предположение, что указанная делеция может привести
к изменениям в структуре белка. Поэтому были осуществлены замены лизина-127 в белке с
делецией 4 С-концевых остатков. Такие мутации не должны были отразиться на структуре, но
исключали бы все указанные контакты с белком L25. Эффект от внесенных в белок замен вновь
оказался летальным. Из структурных данных следует, что в контакте принимает участие 2
области белка L16: 4 аминокислотных остатка С-концевого «хвоста» и второй участок,
включающий лизин-127.
Совокупность полученных нами результатов позволяет предположить, что вклад этих
участков белка в стабилизацию межмолекулярного контакта не одинаков, и второй участок
играет в этом решающую роль. В настоящее время ведётся проверка данной гипотезы.
Работа поддержана грантами РФФИ №13-04-00587 и №14-04-31534, а также программой
«Молекулярная и клеточная биология» РАН.
ВЛИЯНИЕ EIF4G-СВЯЗЫВАЮЩЕГО УЧАСТКА КОДИРУЮЩЕЙ ОБЛАСТИ
мРНК YB-1 НА РЕГУЛЯЦИЮ ЕЕ ТРАНСЛЯЦИИ
Ишутинова А.Н.1,2, Елисеева И.А.1, Овчинников Л.П.1
1
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино; 2ГБОУ ВПО Волгоградский государственный
медицинский университет Министерства здравоохранения РФ,
Волгоград, Россия
an.ishutinova@gmail.com
YΒ-1 является многофункциональным PНК/ДНК-связывающим белком. Он участвует в
регуляции транскрипции, репликации и репарации ДНК, сплайсинга, стабилизации мРНК и
трансляции. Он играет важную роль в пролиферации, дифференцировке клеток, эмбриогенезе,
малигнизации, метастазировании опухолей, в воспалении и процессах, связанных с вирусной
инфекцией.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что в конце кодирующей области мРНК YΒ 1
располагается участок, специфически связывающий эукариотический фактор инициации
трансляции eIF4G. Однако роль данного связывания в регуляции трансляции мРНК YB 1 на
сегодняшний день не известна. Целью данной работы является проверка влияния eIF4Gсвязывающего участка (eIF4G-bs) на регуляцию трансляции мРНК YB 1. Для этого мы
получили конструкции, содержащие и несодержащие в кодирующей области люциферазы
светлячка eIF4G-bs, а также имеющие различные 5’нетранслируемые области (НТО) YB-1,
GAPDH и β глобина.
Мы показали, что в случае неполиаденилированных мРНК в бесклеточной системе
трансляции на основе ретикулоцитов кролика вне зависимости от типа 5’ НТО, наблюдается
ингибирование трансляции репортерной мРНК, содержащей eIF4G-bs в составе кодирующей
области люциферазы. Интересно, что для мРНК, несодержащих eIF4G-bs в кодирующей
области, ингибирующее действие данного участка не наблюдается. Можно предположить, что
для негативного эффекта eIF4G-bs на трансляцию неполиаденилированных мРНК важно его
расположение.
В случае контрольных 5’НТО мРНК GAPDH и β-глобина, eIF4G-bs не оказывает влияния
на трансляцию полиаденилированых мРНК. Для полиаденилированных мРНК с 5’НТО YB-1,
eIF4G-bs ингибирует трансляцию. Причем данные эффекты не зависят от расположения eIF4Gbs.
253
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
На основании полученных данных можно сделать вывод, что влияние eIF4G-bs различается
для полиаденилированных и неполиаденилированных мРНК, а также зависит от типа 5’НТО.
Можно предположить, что кроме трансляции eIF4G-bs влияет на стабильность мРНК. Так,
например, мРНК, содержащая поли(А) хвост гораздо более стабильна, поэтому мы не
наблюдаем ингибирующего действия для мРНК с 5’НТО GAPDH и β-глобина. Для мРНК с
5’НТО YB-1 возможно характерен несколько иной тип регуляции. Возможно 5’НТО и eIF4G-bs
сближены в пространстве и могут влиять на функции друг друга.
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОЛЯТОВ SBSHV
Калабекова Ф.С., Калабеков И.М., Колбасова О.Л.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и
микробиологии РАСХН, Покров, Россия
tima_k_88@mail.ru
Герпесвирус сибирского осетра (SbSHV) – особо опасная болезнь осетров, которая
характеризуется высокой контагиозностью, острым течением и массовой гибелью
разновозрастной
молоди
сибирского
осетра
Asipenser
baeri
с
признаками
некрогеморрагического сидрома. Возбудитель заболевания - герпесвирус, относящийся к роду
Ictalurivirus семейства Alloherpesviridae порядка Herpesvirales.
Впервые болезнь выявлена в 2006 году в Тверской области (г. Конаково, штамм SK1/0406).
В последующие годы вспышки болезни регистрировались в хозяйствах Псковской,
Вологодской, Смоленской, Ленинградской областей, республиках Бурятия и Удмуртия.
Нами была проведена работа по идентификации цитопатогенного агента выделенного при
вирусологическом обследовании рыбоводного хозяйства г. Ижевск, который по характеру ЦПД
отличался от штамма SK1/0406 и изолятов, выделенных в европейской части страны. Данный
изолят (SIz6/0311) был идентифицирован в реакции нейтрализации с референсной
гипериммунной антисывороткой как герпесвирус сибирского осетра (индекс нейтрализации
103,2 при разведении антисыворотки в реакционной смеси 1:100).
Для выяснения филогенетических взаимоотношений штамма SK1/0406 и выделенных
изолятов был определен их нуклеотидный состав, в результате которого было показано, что
изолят выделенный в Ижевске имеет 49 замен по нуклеотидному составу и 6 замен по
аминокислотному составу в сравнении со штаммом SK1/0406 и изолятами, выделенными на
территории Российской Федерации.
Таким
образом,
проведенный
филогенетический
анализ
нуклеотидных
последовательностей гена ДНК-полимеразы герпесвируса сибирского осетра показал, что все
изоляты герпесвируса сибирского осетра, выделенные на территории Российской Федерации,
на 98% гомологичны со штаммом SK1/0406 герпесвируса сибирского осетра, изолят SIz6/0311
герпесвируса сибирского осетра образует отдельный кластер и на данный момент является
единственным его представителем.
АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АМИЛОИДОВ В ДРОЖЖЕВОЙ МОДЕЛИ
Качкин Д.В.1, Антонец К.С.1, Галкин А.П.1,2, Рубель А.А.1,2
1
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет; 2СанктПетербургский филиал Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН,
Санкт-Петербург, Россия
pspdaniel@mail.ru
Многие неизлечимые заболевания млекопитающих, в том числе человека, связаны с
аномальной укладкой и агрегацией белков, в норме являющихся растворимыми. Такие
заболевания называют «болезнями неправильной укладки» или амилоидозами. К амилоидозам
относятся многие нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, хорея
Гентингтона, болезнь Паркинсона, диабет второго типа, а также прионные заболевания
(инфекционные амилоидозы): болезнь Крейтцфельда-Якоба, коровье бешенство, скрейпи, куру
и другие. В ходе ряда исследований, выполненных в последние годы, были получены данные о
254
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
том, что инфекционные и неинфекционные амилоиды могут взаимодействовать, при этом в
ряде случаев, наличие амилоидных полимеров одного белка может инициировать
амилоидогенез другого белка. В этой связи выяснение механизмов, контролирующих
взаимодействие амилоидов и поиск факторов, блокирующих этот процесс, является одной из
самых актуальных задач современной биомедицины.
В исследованиях, выполненных в нашей лаборатории, было показано, что дрожжи
сахаромицеты являются удобной моделью для анализа взаимодействия амилоидов in vivo.
Используя дрожжевую модель, было установлено, что полимеры белка PrP могут физически
связываться с пептидом амилоид бета (Ab), также были выявлены участки PrP, ответственные
за это связывание. В ходе данной работы была исследована специфичность взаимодействия PrP
с пептидом Ab. Для этого мы проанализировали возможность взаимодействия между
полимерами PrP и дрожжевым прионом [PSI+] (прионная форма белка Sup35). В ходе работы
были получены плазмиды, кодирующие различные участки PrP слитые с флуоресцентным
белком CFP, а также плазмида, кодирующая прионный домен белка Sup35 слитый с
флуоресцентным белком YFP. Используя методы конфокальной микроскопии были получены
данные о колокализации полимеров PrP-CFP с белком Sup35NM-YFP, а также
проанализирована возможность их физического взаимодействия в живых эукариотических
клетках.
Исследования по взаимодействию амилоидных белков были выполнены на базе РЦ
«Хромас».
Работа выполнена при поддержке гранта СПбГУ № 1.50.2218.2013.
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНОГО ЛОКУСА -149С>Т ГЕНА DNMT3B
СИСТЕМЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ С ШИЗОФРЕНИЕЙ В ПОПУЛЯЦИИ
ЖИТЕЛЕЙ БЕЛАРУСИ
1
Кондратенко А.С. , Нестерович А.Н.2, Голоенко И.М.1, Сивицкая Л.Н.1,
Шатарнова Т.М.1
1
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; 2Государственное учреждение
«Республиканский научно-практический центр психического здоровья»,
Минск, Беларусь
Cytoplasmic@mail.ru
Шизофрения является мультифакториальным нейропсихиатрическим заболеванием с
высоким уровнем наследуемости до 80%. В настоящее время около 1% населения планеты
страдают шизофренией.
В последние десятилетия интенсивно исследуются эпигенетические механизмы развития
шизофрении. Выявлено, что в клетках головного мозга больных шизофренией имеет место
локальное гиперметилирование промоторов отдельных генов на фоне снижения общего уровня
метилирования геномной ДНК. В связи с этим несомненный интерес вызывают исследования
особенностей структуры генов, кодирующих компоненты системы метилирования.
Ген DNMT3b (20q11.2) кодирует фермент ДНК-метилтрансферазу DNMT3b, которая
осуществляет метилирования ДНК de novo. Полиморфный локус -149С>T расположен в
промоторном регионе гена. Показано, что данная замена связана с увеличением промоторной
активности гена примерно на 30% и предрасположенностью к аномальному метилированию.
Цель работы: оценить связь полиморфизма -149С>T (rs242491) гена DNMT3b с развитием
шизофрении. В исследовании приняли участие лица страдающие шизофренией (195 чел.) и
здоровые люди (142 чел.). Также в задачи исследования входил анализ распределения частот
аллелей и генотипов по данному локусу в популяции коренных жителей Беларуси (222 чел).
Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфному
локусу -149С>T обнаружил статистически значимое увеличение гомозигот по
высокоэкспрессивному аллелю Т в группе пациентов по сравнению с контролем. Так у лиц,
страдающих шизофренией, генотип TT встречался в 23,1% случаев, что почти в 2 раза выше
(р=0,04) по сравнению с группой здоровых людей (12,7%). Согласно нашим данным,
носительство генотипа ТТ увеличивает риск развития шизофрении в среднем в 2 раза – OR 2,07
(95% Cl 1,14-3,75).
255
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
При проведении популяционного анализ по исследованному локусу выявлены следующие
частоты распределения генотипов (36,5% -СС, 47,7% -СТ, 15,8% -ТТ) и аллелей (60,4% – С
аллель, 39,6% – Т аллель). Характер распределения генотипов локуса -149С>T в популяции был
близок к таковому в исследованной контрольной выборке (р=0,99).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что полиморфизм -149С>T гена DNMT3b
может быть использован в качестве нового прогностического маркера развития шизофрении.
Более подробное изучение структуры и функций этого гена позволят расширить понимание
механизмов формирования шизофрении, а, значит, своевременно задействовать программы
профилактики и лечения данного заболевания.
ПОИСК АССОЦИАЦИИ ГЕНОВ ХОЛЕЦИСТОКИНИНЕРГИЧЕСКОЙ И
ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ С МИГРЕНЬЮ
Кондратьева Н.С.1, Азимова Ю.Э.2,3, Сергеев А.В.2,3, Скоробогатых К.В.2,3,
Табеева Г.Р.2,3, Кокаева З.Г.1, Климов Е.А.1,4
1
ФГБОУ ВПО Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова;
2
Научно-исследовательский центр Первого Московского государственного
медицинского университета им. И.М.Сеченова Министерства здравоохранения РФ;
3
Университетская клиника головной боли; 4Университетская диагностическая
лаборатория, Москва, Россия
natalia_kondratieva@mail.ru
Мигрень – одно из наиболее распространенных социально-значимых заболеваний. В
России распространенность мигрени среди взрослого населения составляет 14.03%.
Клинические проявления мигрени состоят из 4 различных фаз: продрома, аура, головная боль
(в течение которой проявляются ассоциированные симптомы) и восстановительная фаза.
В ходе нескольких исследований было показано, что дисфункция дофаминергической
системы оказывает влияние на продромальную фазу мигрени. Белок DBH, катализирующий
превращение дофамина (DA) в норэпинефрин (NE), регулирует соотношение дофамина и
норадреналина. Изменение этого соотношения может приводить к увеличению
чувствительности к мигрени. Холецистокинин (ХЦК) один из самых распространенных
нейропептидов в организме, в ЦНС его основной функцией является регуляция круговорота
дофамина. ХЦК посредством рецепторов 2-го типа (CCK2R), опосредует высвобождение
оксида азота (NO), который в свою очередь индуцирует вазодилатацию. Целью данного
исследования явилось изучение частот встречаемости полиморфных вариантов генов CCK(36C/T), CCK2R(1550G/A и 109 C/T), DBH(19-bp ins/del) на выборке пациентов из Москвы и
Московской области, страдающих мигренью (n=175) и контрольной выборке (n=372, образцы
предоставлены Институтом общей генетики им. Н.И.Вавилова). Работа проведена с
использованием стандартных молекулярно-биологических (ПЦР-ПДРФ) и статистических
методов.
В ходе исследования были получены следующие частоты аллелей у пациентов,
страдающих мигренью: -36C:0,452±0,027, -36T:0,548±0,027; 109C:0,842±0,02, 109T:0,158±0,02;
1550G:0,920±0,015, 1550A:0,080±0,015; 19-bp ins:0,575±0,026, 19-bp del:0,425±0,026; для
образцов контрольной выборки: -36C:0,446±0,018, -36T:0,554±0,018; 109C:0,949±0,008,
109T:0,051±0,008; 1550G:0,901±0,011, 1550A:0,099±0,011; 19-bp ins:0,579±0,018, 19-bp
del:0,421±0,018. В ходе нашего исследования было показано статистически достоверное
увеличение частоты аллеля 109T у пациентов, страдающих мигренью (p<0,0001). Частоты
аллелей и генотипов других полиморфных вариантов статистически не отличаются в наших
выборках. Нами получены результаты, позволяющие предположить, что аллель 109T гена
рецептора холецистокинина может оказывать влияние на патогенез мигрени.
256
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
ИССЛЕДОВАНИЕ ХЛОРНОГО КАНАЛА ВКУСОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ
Колесникова А.С., Тарасов М.В., Черкашин А.П., Рогачевская О.А.,
Быстрова М.Ф.
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
alisask@rambler.ru
Электрофизиологические доказательства существования во вкусовых клетках хлорных
каналов, управляемых ионами кальция (СGС-каналы), были получены еще в 2000 году, однако
до сих пор их молекулярная природа не установлена. Мы провели экспрессионный анализ во
вкусовой ткани мыши возможных кандидатов на роль СGС-канала и выявили наличие
транскриптов гена аnо2 из семейства аноктаминов. Мы клонировали полноразмерную кДНК
гена anо2 размером более 3000 п.н. и сконструировали рекомбинантную плазмиду
pQBI25/Ano2 для экспрессии в клетках HEK-293 химеры Аnо2-GFP. Электрическая активность
одиночных трансфицированных клеток HEK-293 регистрировалась методом patch clamp.
В отсутствии стимуляции трансфицированные клетки статистически не отличались от
контрольных клеток НЕК-293 по току покоя и вольт-амперным характеристикам. Активность
СGС-каналов инициировалась добавлением во внеклеточную среду кальциевого ионофораиономицина, встраивание которого в плазматическую мембрану клетки существенно
увеличивало ее проницаемость для Са2+. Это приводило к повышению внутриклеточного Са2+
до уровня, достаточного для активации СGС-каналов и генерации большого входящего тока.
Вольт-амперные характеристики, которые генерировались непосредственно перед аппликацией
иономицина и в момент пика входящего тока, свидетельствовали о драматическом изменении
ионной проницаемости мембраны. При замене ионов Cl- в наружном растворе на
непроникающие анионы потенциал реверсии иономицин-индуцированного тока сдвигался
влево, подтверждая его анионную природу.
Таким образом, гетерологическая экспрессия кДНК Аnо2 в клетках HEK-293 индуцирует
появление Са2+-активируемой анионной проводимости плазматической мембраны, во многом
сходной по биофизическим характеристикам с проводимостью мембран вкусовых клеток.
Наши данные указывают на то, что СGС-канал вкусовых клеток формируется при участии
Аnо2. Распределение транскриптов Аnо2 среди субпопуляций вкусовых клеток I, II и III типов,
изолированных из вкусовой почки мыши, было исследовано с помощью метода глобальной
амплификации РНК одиночной клетки и последующего анализа ко-экспрессии генов ряда
сигнальных, канальных и маркерных белков.
Работа поддержана грантом РФФИ 13-04-00913 и грантом от фонда «Династия» для
посещения школы «Single-cell analysis».
НОНСЕНС-СУПРЕССИЯ В ШТАММАХ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES
CEREVISIAE, НЕСУЩИХ ПРИОНОПОДОБНЫЙ ДЕТЕРМИНАНТ [NSI+],
ВЫЗВАНА СНИЖЕНИЕМ ОТНОСИТЕЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА БЕЛКА Sup45
Кондрашкина А.М., Антонец К.С., Галкин А.П., Нижников А.А.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
alex_sandra2502@mail.ru
Прионоподобный детерминант [NSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae вызывает
нонсенс-супрессию в штаммах, несущих мутации ade1-14 (стоп-кодон UGA) и trp1-289 (UAG).
Этот эффект проявляется в росте штаммов на среде без добавления аденина и триптофана.
Ранее нами было показано, что в присутствии детерминанта [NSI+] снижается относительное
количество мРНК гена SUP45, продукт которого, Sup45, выполняет функцию фактора
терминации трансляции eRF1. Мы проанализировали относительное количество белка Sup45 в
[NSI+] и [nsi-] штаммах при помощи вестерн-блот гибридизации. В результате статистически
достоверных отличий выявлено не было.
Мы предположили, что разницу в относительном количестве белка Sup45 можно
наблюдать только в клетках, находящихся в стационарной фазе роста. В пользу данного
предположения может служить тот факт, что мы можем наблюдать нонсенс-супрессию лишь на
257
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
3-4 сутки культивирования, то есть когда клетки дрожжей находятся в поздней стационарной
фазе роста. Мы провели выделение белка из [NSI+] и [nsi-] штаммов дрожжей, находящихся в
стационарной фазе роста, и вестерн-блот гибридизацию с использованием антител против
белка Sup45, а также против тубулина в качестве контроля. С помощью денситометрического
анализа полученные данные нормировали относительно количества тотального белка в пробах
(окрашивание кумасси бриллиантовым синим). Результаты вестерн-блот гибридизации
показали, что относительное количество белка Sup45 в штаммах [NSI+], находящихся в
стационарной фазе роста, статистически достоверно (p=0,009) снижено. Таким образом, в
настоящем исследовании показано, что нонсенс-супрессия, наблюдаемая в штаммах [NSI+],
опосредована снижением относительного количества белка Sup45.
УЧАСТИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ОНКОМАРКЕРА - БЕЛКА ЯДРЫШКА SURF6
ЧЕЛОВЕКА В БИОГЕНЕЗЕ РИБОСОМ И РЕГУЛЯЦИИ
КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
Кордюкова М.Ю., Самойлова Д.В., Ползиков М.А., Шишова К.В., Зацепина О.В.
ФГБУН Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова РАН, Москва, Россия
kordyukova.maria@yahoo.com
Белок SURF6 относится к эволюционно консервативным белкам ядрышка эукариот. У
человека SURF6 относят к белкам, ассоциированным с канцерогенезом и опухолевым ростом,
ген surf6 оверэкспрессирован также в эмбриональных и стволовых клетках млекопитающих.
Эти и другие наблюдения говорят о том, что SURF6 может быть связан с регуляцией
пролиферации у млекопитающих. Однако функции SURF6 млекопитающих и человека до сих
пор остаются неизвестными. Для ответа на этот вопрос мы проанализировали влияние
индуцированного нокдауна SURF6 человека на биогенез рибосом и динамику клеточного цикла
в клетках HeLa.
Анализ содержания различных участков 47S пре-рРНК, проведенный методом RT-qPCR,
показал, что нокдаун SURF6 увеличивает содержание внешнего и внутренних
транскрибируемых спейсеров пре-рРНК. Методом нозерн-блоттинга выявлено, что нокдаун
SURF6 изменяет содержание как мало процессированной рРНК (45S и 41S рРНК), так и
коротких предшественников 18S, 5.8S и 28S рРНК. В совокупности, эти наблюдения позволяют
сделать вывод о том, что SURF6 человека принимает участие в биогенезе рибосом и
процессинге рРНК. В пользу этого вывода говорят также результаты анализа белковых
партнеров SURF6, полученные методами ко-иммунопреципитации человека и аффинной
хроматографии c использованием белка GST-SURF6. Они показали, что в клетках HeLa SURF6
образует комплекс с белками процессинга рРНК нуклеолином, фибрилларином, NPM1, NOP52,
EBP2, а также кофактором РНК полимеразы I, UBF.
Показано, что нокдаун SURF6 приводит к двукратному уменьшению числа апоптотических
клеток по сравнению с контролем. Содержание клеток в G1/G0 периоде клеточного цикла
уменьшается на 20%, тогда как содержание клеток в S периоде увеличивается почти на 20%.
Мы наблюдали также увеличение митотического индекса в культуре клеток с нокдауном
SURF6. Эти наблюдения указывают на то, что нокдаун SURF6 не является токсичным для
клеток HeLa и оказывает влияние на их пролиферацию, либо стимулируя ее, либо удлиняя S и
М периоды клеточного цикла.
В целом, полученные результаты работы впервые показали, что SURF6 млекопитающих,
подобно дрожжевому гомологу белку Rrp14, участвует в процессинге пре-рРНК и сборке
рибосомных частиц и оказывает влияние на регуляцию пролиферации у млекопитающих через
фундаментальную роль в биогенезе рибосом, а также путем возможного непосредственного
влияния на прохождение клеточного цикла. Однако точные механизмы функционального
действия SURF6 нуждаются в дальнейшем изучении.
Работа финансировалась грантом Президента Российской Федерации (МК-6426.2013.4).
258
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
ФУНКЦИОНАЛЬНО ВАЖНЫЙ РИБОСОМНЫЙ БЕЛОК L16 В КЛЕТКАХ
ESCHERICHIA COLI МОЖЕТ БЫТЬ ЭФФЕКТИВНО ЗАМЕНЕН НА БЕЛОК ИЗ
ЭВОЛЮЦИОННО УДАЛЕННОЙ БАКТЕРИИ BACILLUS SUBTILIS
Коробейникова А.В., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
kav-20@rambler.ru
Эволюционно консервативный белок L16 является неотъемлемым компонентом рибосом.
По данным кристаллографических исследований в рибосоме более половины поверхности
белка L16 участвует в формировании многочисленных межмолекулярных контактов. В
частности, было показано, что белок L16 напрямую взаимодействует с тРНК в А-участке, со
спиралями H38 (A-site finger) и H89 (район пептидилтрансферазного центра) 23S рРНК. Однако
роль этих и других контактов белка L16 в функционировании рибосомы до сих пор не
исследована. Так, по структурным данным в рибосоме Escherichia coli белок L16 образует
прямой контакт с белком L25. При нокауте гена белка L25 в клетках этой бактерии обнаружены
рибосомные субчастицы, лишенные также и белка L16. Это указывает на важность контакта
указанных белков для формирования активной рибосомы in vivo. Однако известно, что в других
бактериях, например, рода Bacillus, рибосомный белок семейства L25 отсутствует или
синтезируется только в экстремальных ситуациях. Вероятно, эволюция разных бактерий могла
привести к изменениям межмолекулярных контактов белка L16 в рибосоме. Поэтому в рамках
темы по изучению роли белка L16 в функционировании рибосомы была поставлена задача:
проверить, способен ли белок L16 Bacillus subtilis функционально заменять соответствующий
белок в клетках E. coli. Мы провели замену хромосомного гена белка L16 в клетках E. coli на
ген белка L16 B. subtilis. Оказалось, что клетки мутантного штамма практически не отличаются
от контрольных клеток по ростовым характеристикам и синтезу природного полипептида (βгалактозидазы) in vivo. Таким образом, можно заключить, что белок L16 B. subtilis способен
эффективно заменять свой гомолог в клетках E. coli, и данные белки являются не только
структурными, но и функциональными гомологами.
Работа поддержана грантом РФФИ №14-04-31534 и Программой по «Молекулярной и
клеточной биологии» РАН.
ОСОБЕННОСТИ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ И НУКЛЕАЗНОЙ ФРАГМЕНТАЦИИ И
ЭКСТРАКЦИИ ХРОМАТИНА КОДИРУЮЩИХ ОБЛАСТИ
АКТИВНЫХ ГЕНОВ
Котряхва Е.Н., Прияткина Т.Н.
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
Санкт-Петербург, Россия
kotriakhova.elena@yandex.ru
В исследовании характера преобразования (ремоделирования) нуклеосом при активации
генов перспективным подходом остаётся анализ нуклеазной фрагментации ДНК в составе ядер,
позволяющий установить изменения в ДНК-гистоновых взаимодействях. Мы исследовали
фрагментацию микрококковой нуклеазой (МНазой) и ДНКазой I хроматина кодирующей
области гена trp-диоксигеназы (tdо) в дерепрессированном состоянии (в ядрах клеток печени
крыс). МНаза продуцирует симметричные двунитевые разрывы; ДНКаза I расщепляет ДНК при
совпадении позиций однонитевых разрывов на комплементарных цепях. Установлено, что в
ядрах печени на всём протяжении кодирующей области гена tdо не обнаруживается участков,
сохраняющих нуклеосомную организацию хроматина. Так, в условиях лимита реакции ДНКаза
I переваривает tdo-ДНК до кислоторастворимых продуктов. Под действием МНазы хроматин
его кодирующей области фрагментируется преимущественно на крупные фрагменты (от 2000
пар нуклеотидов, п.н.), значительная часть которых близка их полной длине (19000 п.н.). Эти
фрагменты гена tdо не выходят в среду инкубации и преимущественно удерживаются в
нерастворимом ядерном остатке при экстракции растворами низкой, а также средней ионной
силы. После мягкой ультразвуковой фрагментации (0,1 кДж, 20 кГц, 60 сек) в озвученной
ядерной суспензии клеток печени tdo-ДНК была представлена одним пиком протяжённых
259
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
фрагментов (15000-20000 п.н.). Методом селективной экстракции получены три субфракции
хроматина, многократно обогащённые ДНК гена tdo. Минорная фракция (менее 1% ДНК),
выходящая в раствор 0,005 М MgCl2 (ДНП-АI), содержала протяжённые фрагменты;
экстрагируемая 0,2 М NaCl (ДНП-АII) была представлена короткими фрагментами. В раствор,
содержащий MgCl2 и тетрапирофосфат натрия, переходила ДНК обоих пиков (ДНП-АIII). По
данным дот- и блот-гибридизации, низкомолекулярные фрагменты фракций ДНП-АII и АIII
многократно обогащены 5’-фланкирующей tdo-ДНК, в высокополимерных фрагментах
(фракции ДНП-АI и АIII) превалирует ДНК единиц транскрипции tdo. Особенностью
белкового состава полученных фракций является неэквимолярная представленность четырёх
коровых гистонов: сниженное содержание гистонов Н2А и Н2В и преобладание во фракциях
ДНП-АII и АIII одного из двух гистонов Н3Н4 димера (Н4 или Н3, соответственно).
Рассматривается возможность того, что активация генов сопровождается сопряжённой
линеаризацией ДНК и гистонового октамера, приводящей к диссоциацией гистоновых
комплексов.
ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ
ПАНКРЕАТИТОМ: РОЛЬ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК
Кравченко П.Н.1, Олейник Е.К.1, Жулай Г.А.1, Чуров А.В.1, Олейник В.М.1,
Островский К.А.2
1
ФГБУН Институт биологии КарНЦ РАН; 2НУЗ Отделенческая клиническая больница
на ст. Петрозаводск, Петрозаводск, Россия
K-polina13@mail.ru
Острый панкреатит (ОП) сопровождается возникновением системной воспалительной
реакции, в связи с чем становится возможным участие популяций лимфоидных клеток в
развитии заболевания. Целью работы являлась оценка состояния клеточного иммунитета у
больных ОП, в особенности популяции регуляторных Т-лимфоцитов (Treg). Определяли
содержание клеток с регуляторным фенотипом CD4+CD25hi и CD4+CD25+CD127lo, а также
количество CD3+CD4+, CD3+CD8+ Т-лимфоцитов, B-лимфоцитов и NK-клеток в
периферической крови.
Образцы крови больных ОП и здоровых доноров анализировались методом проточной
цитометрии. Достоверность различий между группами рассчитывали по критерию МаннаУитни при уровне значимости р<0,05.
В ходе исследования было показано, что у больных ОП относительное число CD3+ Тклеток (63,87±7,1%), а также отдельной субпопуляции CD3+CD4+ Т-хелперов (34,46±9,0%)
снижено по сравнению с контролем (70,94±3,2% и 44,56±7,0%, соответственно, р<0,05).
Таким образом, результаты показали, что у больных ОП отмечено снижение числа CD4+
клеток, в то время как содержание Treg возрастало, что позволяет предположить развитие
иммунной супрессии при ОП. Работа выполнена при поддержке РФФИ, проект № 13-04-98826.
РЕДАКТИРОВАНИЕ ДИФРАКЦИОННЫХ ДАННЫХ КАК СПОСОБ
УВЕЛИЧЕНИЯ ДОСТОВЕРНОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАЗ МЕТОДОМ
МОЛЕКУЛЯРНОГО ЗАМЕЩЕНИЯ ПРИ СОВЕРШЕННОМ ТВИННИНГЕ
Кравченко О.В., Никонов О.С., Никонов С.В.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
kravchenko.olesya@gmail.com
Твиннинг - это наиболее распространенный дефект роста кристаллов в белковой
кристаллографии. Он имеет место, когда несколько кристаллов с по-разному
ориентированными решетками срастаются вместе, повышая симметрию дифракционных
данных относительно истинной симметрии кристалла. Самым сложным видом твиннинга
считается совершенный мероэдрический твиннинг (доля твиннинга примерно 50%). В
260
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
настоящее время число решенных структур, для кристаллов которых характерен совершенный
твиннинг, крайне ограничено ввиду сложности и трудоемкости задачи.
Ранее в нашей лаборатории были определены пространственные структуры фактора
инициации трансляции 2 архей (aIF2) и его комплекса с тРНК, кристаллы которых подвержены
совершенному твиннингу. Для получения достоверного набора фаз методом молекулярного
замещения мы случайным образом генерировали большое число моделей (более 5000) с учетом
естественных колебаний в белках и тестировали их программами молекулярного замещения до
получения приемлемого решения. Такой подход потребовал значительных усилий и времени.
Увеличение достоверности фаз и ускорение процесса получения стартовой модели может
быть достигнуто также за счет редактирования наборов данных. Наши результаты показывают,
что отбраковка слабых отражений и ограничение по разрешению, практикуемые в стандартных
случаях, в случае комплекса aIF2 с тРНК слабо влияют на достоверность стартовой модели.
Значительно больший эффект оказывают связанные операцией твиннинга сильные отражения,
особенно такие, для которых измеренные амплитуды значительно различаются. В данный
момент мы отрабатываем методику получения наборов амплитуд, наиболее подходящих для
получения стартовой модели, с использованием дифракционных данных более высокого
разрешения от двух других кристаллов, в которых обнаружен совершенный твиннинг.
Работа поддержана грантом РФФИ 14-04-00571 А.
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ СИМБИОТИЧЕСКОГО
ГЕНА SYM32 У PISUM SATIVUM L.
Крюков А.А., Жуков В.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург, Россия
rainniar@rambler.ru
Горох посевной (Pisum sativum L.) является одной из старейших и наиболее ценных
сельскохозяйственных культур. Изучение генетического контроля сельскохозяйственнозначимых признаков является важной задачей современной биологии. Одним из таких
признаков является эффективное взаимодействие с полезными почвенными микроорганизмами,
что особенно важно для современного адаптивного растениеводства. Основой изучения
генетического контроля симбиотических отношений является картирование и секвенирование
генов, продукты которых участвуют в этих биологических процессах. Одним из таких генов
является sym32, контролирующий согласованную транскрипционную активность геномов
растения и клубеньковых бактерий гороха в ходе дифференцировки симбиотических
компартментов азотфиксирующих клубеньков.
Для генетического картирования sym32 необходимо найти маркеры с известной
локализацией в геноме («якорные маркеры»), с которыми ген sym32 наследуется сцепленно.
Ранее позиция sym32 в геноме гороха была неизвестна. В нашей лаборатории в 2012 году была
произведена попытка локализации гена sym32 на выборке F3 (NGB1238 x RisFixO) из 58
растений с использованием 12 ген - специфичных молекулярных маркеров, однако сцепления с
анализируемыми маркерами выявлено не было.
На текущем этапе работы нам удалось локализовать ген sym32. Ген-специфичный маркер
Pip1 из III группы сцепления показал достоверное (LOD>5.0) сцепление с исследуемым геном
на расстоянии 9,4 сМ. Согласно результатам анализа других ген-специфичных маркеров той же
группы сцепления, sym32 находится выше маркера Pip1 и таким образом локализуется в
верхней части III группы сцепления. В настоящее время проводится анализ других маркеров
того же района генома для более точного картирования sym32. На основании результатов
картирования будет произведен поиск генов-кандидатов у Medicago trunculata Gaertn, которая
является близким к Pisum sativum видом и для которой секвенирован полный геном. После чего
будет произведено секвенирование sym32 у мутантных линий гороха (RisFixO и RisFixL) и
исходной линии Finale для поиска точек мутаций в рамке считывания.
Работа выполнена при поддержке Совета по грантам Президента РФ (НШ-337.2012.4 и
НШ-4603.2014.4) и РФФИ (13-04-01703-а).
261
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
НАРУШЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТЫ
ГЛИКОЛИЗА ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Кудрявцева А.В.1, Снежкина А.В.1, Садритдинова А.Ф.1, Дмитриев А.А.1,
Мельникова А.В.1, Славнова Е.Н.2
1
ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН;
2
ФГБУН Московский научно-исследовательский онкологический институт
им. П.А.Герцена Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
rhizamoeba@mail.ru
Канцерогенез характеризуется многочисленными генетическими и эпигенетическими
нарушениями, которые приводят к активации или подавлению экспрессии многих генов,
условно разделяемых на онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста. Вследствие этого
происходит нарушение различных метаболических и сигнальных путей, например,
энергетического обмена. Изучение экспрессии генов, кодирующих ферменты основных путей
метаболизма, имеет важное практическое значение (новые онкомаркеры и мишени для
таргетной терапии), а также вносит важный вклад в понимание фундаментальных механизмов
канцерогенеза.
Рак молочной железы (РМЖ) является социально-значимым заболеванием, основную
группу риска составляют женщины в возрасте старше 40 лет. Ежегодно во всем мире
регистрируется более 1,2 млн. случаев рака молочной железы и более 500 тыс. человек умирает
по причине этого заболевания.
Нами проведен биоинформатический анализ транскриптомных баз данных EST, Oncomine
и «TCGA - cancer genome project» полученных из нормальных и опухолевых тканей молочной
железы. При этом были исключены данные, полученные из клеточных линий и из редких
специфических опухолей (тубулярный, медуллярный, и муцинозный рак молочной железы).
Эти результаты позволили провести предварительную оценку содержания мРНК генов,
кодирующих ферменты гликолиза и выбрать 13 потенциальных онко-ассоциированных генов:
HK1, HK2, HK3, ADPGK, GPI, PFKP, ALDOA, GAPDH, PGK1, PGAM1, BPGM, ENO1 и PKM2.
С помощью метода ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) проведена количественная
оценка экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза в 30-ти образцах рака молочной
железы. Для генов HK1, HK2 и HK3, кодирующих ферменты первой основной стадии
гликолиза (расщепление глюкозы до глюкозо-6-фосфата) выявлены частые изменения
относительного уровня мРНК, значительное повышение в большинстве образцов РМЖ.
Показана дерегуляция экспрессии генов ALDOA, PFKP, и PKM2 - наблюдались как случаи
повышения, так и снижения уровня мРНК. Выявлено сохранение экспрессии генов ADPGK,
PGK1, PGAM1, GAPDH, GPI, BPGM и ENO1 в более чем 50% исследуемых образцов.
Таким образом, при раке молочной железы происходит частое и значительное нарушение
экспрессии генов, кодирующих одни из ключевых ферментов гликолиза (гексокиназы 1, 2 и 3).
Полученные нами результаты о нарушение экспрессии генов PFKP и PKM2 согласуется с
данными литературы для других типов рака, что свидетельствует об их вовлеченности в
канцерогенез.
Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации МК-5666.2013.4.
ПОЛУЧЕНИЕ СЕКРЕТИРУЕМОЙ ФОРМЫ ОБРАТНОЙ
ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИЧ-1
Латанова А.А., Кузьменко Ю.В., Стародубова Е.С., Карпов В.Л.
ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Москва, Россия
aalatanova@gmail.com
Для борьбы с ВИЧ-инфекцией разрабатываваются вакцинные препараты на основе
обратной траскриптазы (ОТ). Однако в составе ДНК-вакцины ОТ как антиген показала низкую
иммуногенность. Одним из подходов для повышения иммуногенности антигена является
изменение его пути процессинга и презентации клеткам иммунной системы. Показано, что
презентация антигена в составе комплекса с MHC класса II приводит к формированию более
эффективного иммунного ответа. Поскольку источником антигенных пептидов для MHC
262
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
класса II являются экзогенные белки, нами было предложено получить секретируемую форму
обратной транскриптазы ВИЧ-1.
Для получения секретируемой формы антигена мы создали ДНК-конструкцию,
кодирующую обратную транскриптазу с добавленным на N-конце сигналом секреции. В
качестве такого сигнала были использованы 26 N-концевых а.к. неструктурного белка NS1
вируса клещевого энцефалита, которые ответственны за направление белка NS1 в ЭПР и
обеспечивают его секрецию из клетки. Полученная ДНК-конструкция была протестирована в
культуре клеток HeLa. Иммуноблоттинг клеток, трансфицированных полученной плазмидой,
показал увеличение содержания химерного белка по сравнению с исходной формой.
Способность ОТ к секреции из клеток подтвердили наличием химерного белка в культуральной
жидкости клеток. Методом иммуноокрашивания было установлено, что ОТ с сигналом
секреции локализуется в ЭПР и секреторных везикулах, а также экспонируется на клеточной
поверхности и/или секретируется. Эксперименты по определению времени полужизни белков
показали, что скорость деградации в клетке ОТ с сигналом секреции уменьшилась в 7 раз по
сравнению с белком без сигнала. Анализ влияния ингибиторов протеасомы и клеточных
протеаз выявил, что вклад протеасомных и лизосомных протеаз в деградацию ОТ с сигналом
секреции незначителен. Так, данные по деградации свидетельствуют о том, что ОТ в составе
химерного белка становится недоступной действию клеточных протеаз.
Таким образом, за счет добавления лидерной последовательности неструктурного белка
NS1 вируса клещевого энцефалита к обратной транскриптазе была получена ее секретируемая
форма, которая может более эффективно презентироваться в составе MHC класса II и быть
включена в состав ДНК-вакцин.
ВЫДЕЛЕНИЕ И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО РЕГУЛЯТОРА
ТРАНСКРИПЦИИ PROQ
Леконцева Н.В., Мурина В.Н., Гарбер М.Б., Никонов С.В., Никулин А.Д.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
natalja-lekontseva@rambler.ru
Взаимодействия белков и нуклеиновых кислот играют существенную роль во многих
важных процессах, происходящих в живых клетках, таких как регуляция транскрипции и
трансляции, сплайсинг, маскирование мРНК и т.п. Изучение РНК-белковых взаимодействий
позволяет определять механизмы реализации этих процессов на молекулярном уровне.
Объектом нашего исследования стал ProQ – белок-регулятор транскрипции Escherichia coli.
Предполагается, что ProQ, являясь РНК шапероном и взаимодействуя с целевой малой
регуляторной РНК, активирует экспрессию осморегулятора ProP при высоких ионных условиях
среды. Структура белка неизвестна, однако на основе анализа аминокислотной
последовательности была предложена модель, в которой N-концевой домен гомологичен белку
FinO, а C-концевой домен гомологичен Sm-подобному домену. Домены соединены между
собой подвижным линкером. Целевая малая регуляторная РНК ProQ также неизвестна, но было
показано на примере взаимодействия белка и малой регуляторной РНК FinP, что ProQ
способствует образованию специфических РНК-дуплексов между FinP и мРНК TraJ.
Нами были получены генетические конструкции, содержащие полноразмерный белок, а
также N- и С-концевые домены белка ProQ. Полноразмерный белок выделен с чистотой,
пригодной для кристаллизации. В настоящее время ведутся работы по поиску условий
кристаллизации белка ProQ и его комплексов с РНК.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы «Молекулярная и клеточная
биология» Президиума РАН и гранта РФФИ № 13-04-00783-a.
263
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
АДАПТАЦИЯ МУТАНТОВ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI ПО ТИОЛОВЫМ
РЕДОКС-СИСТЕМАМ К КОМБИНИРОВАННОМУ ДЕЙСТВИЮ
ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР И АНТИБИОТИКОВ
Лепехина Е.В., Смирнова Г.В.
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
alenshick@mail.ru
В настоящее время большое внимание уделяется исследованию условий,
модифицирующих действие антибактериальных веществ. В этой связи, представляют интерес
исследования комбинированного воздействия антибиотиков и температурных стрессов на
бактерии. Целью работы является изучение устойчивости бактерий Escherichia coli к
совместному действию температурных стрессов и антибиотиков и роли тиоловых редокссистем в этих условиях.
Показано, что при температурах, близких к оптимальной (37°С и 40°С), мутанты по генам
gor, trxA и trxB, кодирующих глутатионредуктазу, тиоредоксин I и тиоредоксинредуктазу,
соответственно, росли с более низкой скоростью, а мутант gshA, дефицитный по глутатиону, - с
более высокой скоростью, чем клетки дикого типа. При резком снижении (до 20°С) или
повышении температуры культивирования (до 46°С) скорость роста значительно
ингибировалась у всех изученных штаммов.
При изучении зависимости чувствительности бактерий дикого типа к антибиотикам разных
классов (ципрофлоксацин, ампициллин и стрептомицин) от температуры культивирования
была выявлена характерная V-образная кривая с максимумом чувствительности при 40°С.
Выживаемость бактерий была обратно пропорциональна их удельной скорости роста (µ),
максимум которой также достигался при 40°С. Коэффициент корреляции между µ и log CFU
(число колоний образующих единиц) составлял -0.97 для ципрофлоксацина, -0.93 для
ампициллина и -0.89 для стрептомицина. Общий V-образный вид зависимости
чувствительности бактерий к антибиотикам от температуры сохранялся у мутантов по
компонентам тиоловых редокс-систем, однако наблюдались изменения, связанные с видом
мутации и типом антибиотика. Так gshA, trxA, trxB и gshAtrxA мутанты проявляли
повышенную чувствительность к ципрофлоксацину, но не к ампициллину и стрептомицину,
при критических температурах 20°С и 46°С. Напротив, при оптимальных температурах мутант
gshAtrxA демонстрировал очень высокую чувствительность к ампициллину, но не к
стрептомицину и ципрофлоксацину, в то время как gor мутант был более устойчив, чем дикий
тип, при действии всех антибиотиков.
Полученные данные свидетельствуют, что температурные стрессы приводили к
повышению, а не снижению устойчивости к антибиотикам, что было связано, главным образом,
с замедлением роста бактерий.
Исследования поддержаны грантом Программы МКБ Президиума РАН №12-П-4-1013,
грантом РФФИ №13-04-96039.
НОВАЯ РЕГУЛЯТОРНАЯ РНК, ТРАНСКРИБИРУЕМАЯ В МЕЖГЕННОМ
УЧАСТКЕ YMJA/SAPA E. COLI
Маркелова Н.Ю., Озолинь О.Н., Масулис И.С.
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН; ФГБОУ ВПО Пущинский государственный
естественно-научный институт, Пущино, Россия
sacharunya@mail.ru
Нетранслируемые РНК являются обширным классом регуляторных молекул,
разнообразных с точки зрения их функции и размера. Малые РНК могут участвовать в
регуляции транскрипции, трансляции и модулировать стабильность матичной РНК.
Предметом нашего исследования является РНК SapZ, обнаруженная в ходе проверки
генетического локуса ymjA/sapA на предмет активности дивергентного ориентированных
промоторов, предсказанных компьютерным алгоритмом «PlatProm».
При клонировании данного участка в беспромоторный вектор, содержащий дивергентно
ориентированные гены флуоресцентных белков EGFP и mCherry, была обнаружена экспрессия
264
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
нового РНК-продукта в антисмысловом направлении относительно гена sapA. Старт инициации
транскрипции этого продукта соответствует положению -98 относительно стартового кодона
гена sapA по данным обратной транскрипции с РНК, выделенной из клеток E. coli K-12 MG
1655 дикого типа и, трансформированных плазмидой pET28-EGFP-mCherry, несущей участок
генома E. coli (1357304 ÷ 1537077 GenBank:U00096.3).
Результаты Northern гибридизации свидетельствуют о том, что новый РНК-продукт
терминируется на расстоянии 380 нуклеотидов от старта транскрипции.
Возможное влияние РНК-продукта SapZ на транскрипцию гена sapA, на основании
перекрываемости их промоторных областей не подтвердилось по данным RT-PCR. Так как
было установлено, что уровень экспрессии антисмысловой РНК не зависит от условий, которые
модулируют уровень транскрипции гена sapA. Поэтому можно охарактеризовать РНК SapZ как
кодируемую в транс – положении и предположить наличие удаленных генов-мишеней, на
экспрессию которых она может влиять.
С использованием программы «sTarPicker» базирующейся на прогнозировании мРНКмишеней на основе двухступенчатой модели гибридизации с регуляторной РНК, предсказаны
возможные гены, подверженные регуляции с участием РНК SapZ. Из полученного массива
данных были отобраны 396 генов с наибольшей вероятностью способные к взаимодействию c
SapZ. При анализе координат мишеней на хромосоме выяснилось, что распределение их
относительно равномерное, количество предполагаемых целей на минус-нити на 20% больше
чем на плюс-нити. Позиционирование участков вероятного взаимодействия с SapZ РНК
относительно инициирующего кодона гена-мишени указывает на возможность вовлеченности
данной РНК в регуляцию трансляции за счет взаимодействия с 5’-нетраслируемой областью.
На основании разнообразия представленных генов-мишеней можно предположить
многофункциональность данной РНК.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект No. 13-04-00997).
ПОЛУЧЕНИЕ И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ
ФАКТОРОВ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ eIF2бета•eIF5
Митрошин И.В., Архипова В.И., Столбоушкина Е.А., Гарбер М.Б.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
ivan-mitroshin@rambler.ru
Фактор инициации трансляции eIF2 в составе тройственного комплекса с инициаторной
метионил-тРНК и ГТФ доставляет Met-тРНКi в P участок 40S рибосомной субчастицы. Во
время (или после) присоединения мРНК к 43S пре-инициаторному комплексу (PIC) фактор eIF5
индуцирует гидролиз ГТФ на eIF2. Затем, в ходе сканирования мРНК происходит узнавание
стартового кодона, при этом eIF1 покидает рибосому, а неорганичекий фосфат (Pi)
освобождается из eIF2. После ухода Pi фактор eIF5, по всей видимости, более прочно
взаимодействует с eIF2, находящимся в ГДФ-связанной форме, и такой комплекс покидает
рибосому.
eIF2 состоит из трех субъединиц (альфа, бета и гамма). eIF2альфа – регуляторная
субъединица, фосфорилирование которой приводит к ингибированию биосинтеза белка.
eIF2бета имеет характерный для эукариот вариабельный по длине и аминокислотному составу
N-концевой домен (eIF2бета-NTD), в котором содержатся три полилизиновых блока. Показано,
что эти полилизиновые повторы необходимы для взаимодействия eIF2 с мРНК, eIF2B и eIF5.
Гамма-субъединица eIF2 является ГТФ/ГДФ связывающим белком и взаимодействует с
факторами eIF2B и eIF5 и с Met-тРНКi. На сегодняшний день пространственная структура
полного eIF2 отсутствует, но известна структура его альфа-субъединицы.
eIF5 – мономерный двухдоменный белок, который активирует гидролиз ГТФ на eIF2
посредством своего N-концевого домена. C-концевой домен eIF5 (eIF5-CTD) играет роль в
сборке PIC за счет стабилизации взаимодействий между eIF1, eIF2 и eIF3. На рибосоме eIF5CTD способствует диссоциации eIF1 при узнавании AUG кодона, благодаря своему
динамическому взаимодействию с eIF1 и eIF2бета.
В данной работе мы исследуем взаимодействие между eIF5-CTD и eIF2бета-NTD.
Выбранный комплекс является перспективным объектом для кристаллизации, поскольку
265
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
недавние физико-химические исследования показали, что N-концевой домен бета-субъединицы
eIF2 неупорядочен и структурируется при взаимодействии с eIF5. В рамках данной работы
были оптимизированы условия для наращивания биомассы штаммов-суперпродуцентов. Также
была разработана методика выделения эукариотического комплекса между белками eIF5-CTD
и eIF2бета-NTD в препаративных количествах с чистотой пригодной для кристаллизации. В
настоящее время идет поиск условий кристаллизации белкового комплекса eIF5-CTD•eIF2бетаNTD.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований
Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и грантом РФФИ (№ 14-04-31030
мол_а).
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСТРЕМАЛЬНОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ БЕЛКА Hfq
Мурина В.Н.1, Леконцева Н.В.1, Мельник Б.С.1, Филимонов В.В.1, Мюллер У.2,
Уляйн М.2, Вейс М.С.2, Гарбер М.Б.1, Никонов С.В.1, Никулин А.Д.1
1
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия; 2Institute for Soft Matter and Functional
Materials, Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie, Берлин, Германия
thyrada@rambler.ru
Исследование белковой термостабильности, особенно экстремальной термостабильности
белков с температурой плавления выше 100°C, представляет большой интерес как для
фундаментальных исследований, так и для индустрии. В процессе работы с белком Hfq из
мезофильной бактерии Pseudomonas aeruginosa мы обнаружили, что он начинает плавиться при
температуре выше 110°C.
В растворе белок Hfq существует в виде гомогексамеров, соответственно, экстремальную
термостабильность могут проявлять либо мономерная, либо гексамерная форма белка. Для
того, чтобы понять какая из пространственных единиц белка ответственна за проявление
экстремальной термостабильности, нами были произведены точечные замены (His57Ala [1],
Gln8Ala, Asn28Ala, Asp40Ala and Tyr55Ala) аминокислотных остатков в межсубъединичном
интерфейсе белка. Была определена структура и стабильность полученных мутантных белков.
Все мутантные белки формировали гексамеры в кристаллах, также как и белок Hfq дикого
типа, однако проявляли разную термостабильность. Используя методы микрокалориметрии,
кругового дихроизма, полу-нативного электрофореза и температурного сдвига флуоресценции
белка мы заключили, что мономер является наиболее вероятной единицей белка, ответственной
за его экстремальную термостабильность. Структура свободного мономера белка в растворе
еще неизвестна, получение и кристаллизация мономера белка Hfq является нашей следующей
задачей.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы «Молекулярная и клеточная
биология» Президиума РАН, гранта РФФИ № 14-04-31215.
[1] Moskaleva et al. (2010) Acta. Crystallogr. F. 66, 760-764.
ПОЛУЧЕНИЕ И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1 ИЗ
АРХЕИ HALOARCULA MARISMORTUI
Михайлина А.О., Балобанов В.А., Тищенко С.В., Гарбер М.Б., Никонов С.В.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
lisenok020388@mail.ru
Структура белка L1 из археи H. marismortui (HmaL1) представляет особый интерес с точки
зрения выяснения принципов РНК-белковых взаимодействий и регуляции трансляции. В
отличие от определенных нами ранее структур этого белка из бактерий и архей, которые
относятся к белкам, имеющим изоточку в щелочной области рН, около четверти
аминокислотной последовательности HmaL1 составляют остатки аспаргиновой и глутаминовой
аминокислот. В целом белок обладает значительным отрицательным зарядом, что должно
затруднить его взаимодействие с отрицательно заряженной рРНК в обычных условиях.
Особенно большой отрицательный заряд несет второй домен; доля аспаргиновой и
266
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
глутаминовой аминокислот в его последовательности превышает 30%. Мы полагаем, что
второй домен белка L1, роль которого предположительно состоит в увеличении сродства к
рРНК по сравнению с мРНК, в архее H. marismortui осуществляет свою регулирующую
функцию иначе, чем в археях Methanococcus janaschii, Sulfolobus acidocaldarius и бактерии
Thermus thermophilus.
В рамках исследования РНК-белковых взаимодействий рибосомного белка HmaL1 мы
получили генетическую конструкцию, несущую соответствующий ген и очистили белок c
помощью последовательных хроматографий на смолах Вutyl-Sepharose и Superdex75.
Гельфильтрация проводилась в буфере с 3 М КСl, в результате была получена мономерная
фракция белка, гомогенность препарата проверена методом гель-электрофореза в
неденатурирующих условиях. Методом кругового дихроизма определена вторичная структура
белка HmaL1. Проведён поиск условий кристаллизации белка методом диффузии паров в
висящей капле с использованием наборов для кристаллизации белков Molecular Dimensions и
Hampton Research. В настоящее время получены первые микрокристаллы белка, ведётся работа
по оптимизации условий кристаллизации.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных
исследований (грант № 14-04-00414_а) и Программы МКБ РАН.
PSIA: НОВЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ БЕЛКОВ,
ФОРМИРУЮЩИХ АМИЛОИДЫ И ДЕТЕРГЕНТ-УСТОЙЧИВЫЕ
КОМПЛЕКСЫ
1
Нижников А.А. , Рыжова Т.А.1,2, Александров А.И.3, Митькевич О.В.3,
Инге-Вечтомов С.Г.1,2, Галкин А.П.1,2
1
ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет;
2
Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН,
Санкт-Петербург; 3ФГБУН Институт биохимии им А.Н.Баха РАН, Москва, Россия
ant.nizhnikov@gmail.com
Амилоиды представляют собой фибриллярные упорядоченные белковые агрегаты, в
которых мономеры связаны за счет формирования упорядоченных межмолекулярных бетаслоев. Специфической подгруппой амилоидов являются прионы, представляющие собой
амилоиды, обладающие инфекционными свойствами. Феномен амилоидогенеза в настоящее
время приковывает внимание исследователей по всему миру не только из-за крайне высокой
биомедицинской значимости, вызванной тем, что около 40 неизлечимых заболеваний человека
ассоциированы с различными амилоидами, но также и потому, что в последнее время
накапливается все больше свидетельств в пользу важной функциональной роли этих белковых
агрегатов.
Наиболее существенной проблемой, с которой сталкиваются исследователи при изучении
амилоидов, является отсутствие универсальных методов их идентификации. Именно поэтому
идентификация каждого нового амилоида или приона является заметным событием в научном
мире. Нами разработан метод, названный PSIA (Proteomic Screening for Identification of
Amyloids), который впервые позволяет идентифицировать всю совокупность клеточных белков,
формирующих амилоиды. Он основан на необычной устойчивости амилоидов к ионным
детергентам, а так же, как показано нами, к хаотропным агентам, таким как мочевина и
тиомочевина. Данный метод обладает высокой разрешающей способностью, обусловленной
использованием двумерного разностного гель-электрофореза (2D-DIGE), а также
оригинального способа разделения полимерных белковых фракций по их устойчивости к
хаотропным агентам. Эффективность PSIA доказана путем идентификации целого ряда
контрольных амилоидов (PrP, Aβ, Htt, Bgl2p, а также прионных форм Sup35p и Rnq1). Также к
настоящему времени с его помощью удалось выявить целый ряд белков, которые, как и
охарактеризованные ранее амилоиды, формируют детергент-устойчивые полимеры в клетках
Saccharomyces cerevisiae. В целом, разработка PSIA открывает широкие перспективы для
описания нормальных и паталогических ландшафтов амилоидных белков у различных
организмов от прокариотов до человека.
267
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПРОТЕИНАЗЫ HTRA В КЛЕТКАХ B. SUBTILIS
Нуреева А.А., Шарафутдинов И.С., Каюмов А.Р.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
aliusha2306@mail.ru
HtrA – протеаза семейства сериновых протеаз. Она широко распространена как в
одноклеточных, так и в многоклеточных организмах. Основной функцией представителей
семейства HtrA является качественный белковый контроль и удаление денатурированных и
несфолдировавших белков. В отличие от других протеаз белкового качественного контроля,
некоторые протеиназы HtrA могут проявлять функции шаперонов, стабилизируя дефектные
белки. К тому же, HtrA способны вызывать или модулировать различные сигнальные пути,
расщепляя или изолируя регуляторные белки. Белки HtrA вовлечены в такие важные клеточные
процессы, как поддержание функциональности фотосинтетического аппарата, пролиферацию,
миграцию клеток и их гибель.
Задачей исследования было установить физиологическую роль протеазы HtrA в клетках B.
subtilis. Для этого была получена конструкция для нокаутирования гена в клетках B. subtilis,
которой трансформировали клетки бацилл. Также была получена конструкция на основе
вектора pDG148, обеспечивающая гиперпродукцию белка HtrA в клетках бацилл в условиях
индукции IPTG. Были исследованы ростовые характеристики полученных штаммов при
стрессах, таких как сублетальные температуры, рост в минимальной синтетической среде,
присутствие этанола, хлорида натрия и перекиси водорода. Результаты показали, что клетки с
гиперпродукцией белка HtrA значительно быстрее по сравнению с контрольными клетками
дикого типа при всех видах стресса. Клетки с нокаут мутацией гена htrA показывали
значительное замедление роста. Это позволяет сделать вывод, что белок HtrA у бацилл
вовлечен в общий ответ на стресс и позволяет повысить выживаемость клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 14-04-31635 мол_а.
ГРЕЧЕСКИЕ КОРНИ МУТАЦИИ 35DELG В БЕЛАРУСИ
Олейник О.А.1, Синявская М.Г.1, Меркулова Е.П.2, Даниленко Н.Г.1
1
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; 2Белорусская медицинская академия
последипломного образования, Минск, Беларусь
oleinik.olga@yahoo.co.uk
Делеция 35delG в ядерном гене GJB2 – основная причина врожденной генетически
обусловленной несиндромальной потери (НСТ) слуха во многих популяциях. Среди
европейского населения она составляет до 70%-90% всех патогенных мутаций в GJB2. 35delG
вызывает тугоухость/глухоту только в гомозиготном состоянии или в сочетании с другими
мутациями, приводящими к потере слуха. Частота носительства мутации 35delG варьирует
среди европейского населения, составляя в среднем по Европе 2%. Наибольший процент
носительства характерен для стран Средиземноморья. Исключениями является Эстония (4%) и
Беларусь (5,6%). Кроме того, частота носительства 35delG в Беларуси является самой высокой в
мире. Происхождение и распространение мутации 35delG среди жителей Европы связывают с
«эффектом основателя» и возможным преимуществом гетерозиготного носительства.
Считается, что мутация 35delG возникла около 10 000 лет назад на территории современной
Греции, а затем распространилась в Европу.
Целью исследования было: 1) установить предковый гаплотип, ассоциированный с
мутацией 35delG, среди белорусских пациентов; 2) сравнить полученный гаплотип с
общеевропейским, для выяснения «происхождения» мутации 35delG на территории Беларуси.
Был проведен анализ 4-х SNP и 2-х STR маркеров (D13S175 и D13S141), сцепленных с
мутацией 35delG среди 96 пациентов с генотипом (35delG/35delG) и 144 контрольных образцов
(жители шести регионов Беларуси с нормальным слухом).
В результате исследования в выборке пациентов с мутацией 35delG наиболее частыми
вариантами STR оказались: 105 (90%) для маркера D13S175, 127 (76%) для маркера D13S141, а
также один SNP (1) располагающийся в непосредственной близости к мутации 35delG. Доля
остальных вариантов среди белорусских пациентов незначительна (меньше 5%). Предковым
268
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
гаплотипом, ассоциированным с мутацией 35delG, среди белорусских пациентов
соответственно являются следующие сочетания STR и SNP маркеров:127–105–SNP1. Данный
гаплотип выявлен также с высокой частотой среди других европейских популяций, в том числе
и в Греции – на предполагаемой «родине» мутации 35delG. Полученные результаты указывают
на то, что мутация 35delG была занесена на территорию Беларуси, а не возникла de novo. Также
подтверждается предположение о существовании общеевропейского «основателя» мутации
35delG.
РИБОСОМНЫЙ БЕЛОК L33: РОЛЬ БЕЛКА В ВЫЖИВАНИИ КЛЕТОК
ESCHERICHIA COLI И ФОРМИРОВАНИИ ИХ РИБОСОМ
Пашина Л.С., Коробейникова А.В., Гарбер М.Б., Гонгадзе Г.М.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
kav-20@rambler.ru
Рибосомный белок L33 обнаружен во всех известных бактериях. Однако вопрос о
необходимости этого белка для выживания бактериальной клетки до сих пор не имеет
однозначного ответа. L33 является компонентом центрального протуберанца 50S субчастицы и
расположен на ее поверхности, обращенной к 30S субчастице. Согласно кристаллографическим
данным, он образует контакт с тРНК в Е-сайте рибосомы, что может указывать на его прямое
участие в функционировании аппарата трансляции.
Целью нашей работы является изучение роли белка L33 в сборке и функционировании
рибосомы. Для этого был осуществлен нокаут гена данного белка в хромосоме клеток
Escherichia coli. Поскольку такие клетки выживали, можно заключить, что исследуемый белок
не является жизненно важным.
Показано, что скорость роста клеток мутантного (∆L33) и контрольного штаммов
практически не отличается при культивации в диапазоне температур от 30 до 42°C на богатой и
минимальной питательных средах. Заметных различий в функциональной активности аппарата
трансляции в клетках указанных штаммов также не обнаружено. Также отсутствие белка L33
не влияет на степень ассоциации рибосомных субчастиц и включение других белков в
рибосому при ее сборке. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что
обнаруженный ранее контакт белка L33 с тРНК, по всей видимости, не является значимым для
эффективного функционирования бактериального аппарата трансляции. В то же время нами
было обнаружено, что при 46°C появляется небольшое, но заметное снижение скорости роста
∆L33 клеток в сравнении с контрольным штаммом. Можно предположить, что данный
мутантный штамм обладает термочувствительным фенотипом. Кроме того, после
температурного шока при 50°C количество выживших клеток ∆L33 штамма было значительно
меньше, чем в контрольном штамме.
Полученные данные свидетельствуют, что белок L33 не является необходимым для
эффективного функционирования аппарата трансляции и выживания клеток E. coli в
оптимальных условиях, однако эффект нокаута гена белка L33 проявляется под воздействием
экстремально высоких температур.
Работа поддержана грантом РФФИ № 13-04-00587 и Программой «Молекулярная и
клеточная биология» РАН.
РОЛЬ КОНТАКТОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ С
НЕМАТРИЧНОЙ ЦЕПЬЮ ДНК В ФОРМИРОВАНИИ ПАУЗ ТРАНСКРИПЦИИ
Петушков И.В.1,2, Пупов Д.В.1, Басс И.А.1, Кульбачинский А.В.1
1
ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН; 2ФГБОУ ВПО Московский
государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
telomer1@rambler.ru
Синтез РНК бактериальной РНК-полимеразой (РНКП) происходит неравномерно. В
процессе элонгации транскрипции РНКП способна узнавать специфические сигналы,
запрограммированные в ДНК, что приводит к временным остановкам синтеза –
269
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
транскрипционным паузам. Такие паузы могут играть регуляторную роль в экспрессии
клеточных генов и развитии инфекционного процесса бактериофагов и вирусов, имеющих
важное медицинское значение. Однако, молекулярные механизмы образования пауз до сих пор
остаются не ясными. Одним из самых хорошо изученных типов пауз являются паузы,
вызываемые формированием шпильки в РНК и играющие роль в аттенуации транскрипции, в
частности, his-паузы, сигналы которых находятся в опероне биосинтеза гистидина у
энтеробактерий.
В процессе транскрипции РНКП расплетает цепи ДНК, чтобы использовать одну из них в
качестве матрицы для синтеза РНК. Проведенные недавно структурные исследования
транскрипционного комплекса РНКП Thermus thermophilus также выявили специфические
взаимодействия РНКП с нематричной цепью ДНК в расплетённом участке. В частности, район
fork-loop2 (FL2) РНКП способен специфически связывать остаток гуанина нематричной цепи
спереди от активного центра. Чтобы установить возможную регуляторную роль таких
взаимодействий, в данной работе мы исследовали влияние аминокислотных замен в районе FL2
РНКП Escherichia coli на узнавание сигналов транскрипционных пауз и на другие стадии
транскрипции.
Нами было показано, что остаток гуанина в +1 положении сигнала his-паузы (то есть, в
положении, которое еще не было прочитано РНКП) важен для формирования паузы. Замены в
районе FL2 также влияют на формирование паузы, причем некоторые из замен нарушают
узнавание остатка гуанина в +1 положении. Это говорит о том, что узнавание данного остатка в
нематричной цепи ДНК районом FL2 вносит вклад в узнавание сигналов пауз, дополнительно к
узнаванию РНК-шпильки другими частями РНКП. Кроме того, мы показали, что некоторые
мутации в районе FL2 приводят к снижению стабильности промоторных комплексов РНКП,
влияют на эффективность ухода РНКП с промотора, изменяют скорость элонгации
транскрипции и эффективность терминации. Проведённые исследования in vivo
демонстрируют, что некоторые из исследованных мутантных РНКП не способы обеспечивать
нормальный рост клеток E. coli. Таким образом, наши данные позволяют полагать, что
контакты между нематричной цепью ДНК и районом FL2 имеют значение на всех стадиях
транскрипции.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 14-04-01696.
ВЛИЯНИЕ АКТИВНОСТИ ГЕНА D-GADD45 НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ
ЖИЗНИ И СТРЕССОУСТОЙЧИВОСТЬ ОСОБЕЙ
DROSOPHILA MELANOGASTER
1,2
Плюснина Е.Н. , Шосталь О.А.1, Шилова Л.А.1, Москалев А.А.1,2,3
1
ФГБУН Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; 2ФГБОУ ВПО Сыктывкарский
государственный университет, Сыктывкар; 3ФГАОУ ВПО Московский физикотехнический институт (государственный университет), Долгопрудный, Россия
ekaterina.plyusnina@gmail.com
Скорость старения организма зависит от эффективности работы механизмов
стрессоустойчивости. Белки семейства Gadd45 играют роль в ответе на экзогенный и
эндогенный стрессы. Они участвуют в контроле клеточного цикла, репарации ДНК, регуляции
апоптоза, эпигенетической активации генов и воспалительном ответе. Цель данного
исследования - изучить влияние сверхэкспрессии и мутации гена dGadd45 на
продолжительность жизни (ПЖ) особей Drosophila melanogaster и устойчивость к
генотоксическому, оксидативному, температурному стрессу, голоданию, а также на реакцию
организма на различные режимы освещения.
Мутация гена dGadd45 снизил ПЖ дрозофил на 3-53% (P<0.001). У самцов и самок с
мутацией dGadd45 выявлено ухудшение устойчивости к действию гамма-излучения в малой
дозе 40 сГр и острого облучения в дозе 30 Гр. В отличие от мух линии дикого типа Canton-S у
дрозофил с мутацией dGadd45 отсутствовали радиационный гормезис и адаптивный ответ.
Также у мух с мутацией dGadd45 при изменении длины светового дня с 12 ч до 24 ч
наблюдали более выраженное снижение ПЖ в условиях круглосуточного освещения на 14-27%
(P<0.05) по сравнению с особями дикого типа.
270
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
Конститутивная и кондиционная сверхэкспрессия гена dGadd45 в нервной системе
увеличила ПЖ самцов и самок на 3-102% (P<0.001) и повысила их выживаемость в условиях
действия прооксиданта параквата (20 мМ), гипертермии (35°С) и голодания в 1.3-8.2 раза
(P<0.05). После хронического воздействия гамма-излучения в дозе 40 сГр и острого облучения
в дозе 30 Гр ПЖ мух со сверхактивацией dGadd45 также была выше по сравнению с особями
без сверхэкспрессии на 20-77% (P<0.001). Однако повсеместная сверхактивация гена dGadd45,
напротив, снижала ПЖ на 71-73% (P<0.001) и выживаемость дрозофил в стрессовых условиях.
Полученные данные указывают на важную роль гена Gadd45 в детерминации ПЖ и
устойчивости организма к действию стресс-факторов различной природы.
Работа выполнена при поддержке совместного гранта УрО И СО РАН № 12-С-4-1007
«Структурно-функциональная организация хромосом в клеточном цикле», гранта Президента
РФ № МД-1090.2014.4 «Сравнение механизмов ответа Drosophila melanogaster на
оксидативный, тепловой, холодовой, и генотоксический стрессы с использованием
полногеномного анализа транскриптомов», гранта РФФИ № 14-04-01596 и молодежного гранта
УрО РАН № 14-4-НП-103 «Изучение влияния активации генов стресс-ответа и циркадных
ритмов на старение и стрессоустойчивость Drosophila melanogaster».
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЗАМЕН В СИГНАЛЕ ЯДЕРНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ YB-1
НА ЕГО ТРАНСПОРТ В ЯДРО IN VIVO
Поляков Д.Н.1,2, Елисеева И.А.1, Овчинников Л.П.1
1
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино; 2ГБОУ ВПО Волгоградский государственный
медицинский университет Министерства здравоохранения РФ, Волгоград, Россия
dmitry-polyakov@rambler.ru
YB-1 – многофункциональный ДНК- и РНК-связывающий белок эукариот. Он является
одним из главных упаковочных белков мРНП, определяет стабильность мРНК, ее локализацию
на цитоскелете, осуществляет глобальную и специфическую регуляцию трансляции. В ядре
YB-1 участвует в сплайсинге и репарации, регулирует транскрипцию генов факторов роста, а
так же генов, продукты которых участвуют в делении клеток, апоптозе, иммунном ответе, в
развитии множественной лекарственной устойчивости, в стрессовых ответах и регуляции
опухолевого роста. Распределение YB-1 между ядром и цитоплазмой регулируется сигналом
ядерной локализации (NLS, nuclear localization signal) между аминокислотными остатками 186
и 205 и сайтом удержания в цитоплазме (CRS, cytoplasmic retention site) между остатками 267 и
293. Эффект CRS превалирует над NLS, поэтому в нормальных условиях большая часть YB 1
находится в цитоплазме. Гомология между NLS YB-1 и PY-NLS, узнаваемыми импортином-β2,
и способность YB-1 связываться с импортином-β2 позволяют предположить импортин-β2зависимый механизм транспорта YB-1 в ядро. Однако эта гипотеза до сих пор не была
подтверждена in vivo.
NLS, узнаваемые импортином-β2, состоят из двух частей: N-концевых гидрофобных или
положительно заряженных аминокислотных остатков и находящегося на 2-5 аминокислотных
остатков ближе к С-концу дипептида ProTyr (PY). Замены ProTyr - AlaAla приводят к
нарушению импортин-β2-зависимого импорта.
Для проверки гипотезы импортин-β2-зависимого импорта YB-1 в ядро мы экспрессировали
в клетках линии MCF-7 YB-1 дикого типа и мутантные формы с заменами P195AY196А и
P201AY202А, а так же с делецией NLS (186-205). Для стимуляции перехода YB-1 в ядро
использовали Актиномицин Д. В случае импортин-β2-зависимого импорта замены PY на AA
должны были бы ингибировать переход YB-1 в ядро. Однако в наших экспериментах белки с
заменами PY на AA переходили в ядро так же хорошо, как и белок дикого типа, в то время как
белок с делецией 186-205 практически не переходил в ядро. Данный результат свидетельствует
о том, что на участке 186-205 содержится NLS, однако это не PY-NLS. В дальнейшем
планируется более точно локализовать NLS YB-1 и определить взаимодействующие с ним
белки, что поможет установить механизм импорта YB-1 в ядро.
271
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
АНТИВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ АЛЬФАИНТЕРФЕРОНОВ В ГОМО- И ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ СИСТЕМАХ
Потапович М.И., Желнова Л.В., Афанасьева М.М., Прокулевич В.А.
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
mpatapovich@mail.ru
Интерфероны (ИФН) – это большое семейство мультифункциональных секретируемых
белков, наиболее изученным свойством, которых является способность препятствовать
размножению вирусов.
Видовая специфичность ИФНов исследовалась на протяжении многих лет и в настоящее
время в литературе существуют противоречивые данные на этот счет.
Одно время полагали, что ИФНы не обладают видоспецифичностью, т.е. ИФНы,
синтезированные клетками животного определенного вида, проявляют противовирусное
действие и в клетках животных других видов.
В настоящее время имеются данные, что α-интерфероны не являются видоспецифичными,
тогда как β- и γ-интерфероны проявляют строгую видовую специфичность.
Существует мнение, что проявление биологической активности ИФН зависит от
генетической близости исследуемых видов животных и, как следствие, от степени гомологии
исследуемых интерферонов.
В ходе работы были получены штаммы-сверхпродуценты α-ИФН различных видов
животных и соответствующие рекомбинантные белки очищены из телец включения
бактериальных клеток. В дальнейшем провели определение антивирусной активности
рекомбинантных α-ИФНов (свиного, бычьего, куриного и собачьего) на культурах клеток
курицы (фибробласты куриных эмбрионов), свиньи (СПЭВ), быка (MDBK) и собаки (MDCK).
Результаты показали, что куриный α-ИФН обладает антивирусной активностью только в
клетках курицы, а собачий – в клетках собаки. В то же время свиной и бычий α-ИФНы
обладают перекрестной активностью, т. е., например, свиной ИФН действует как на свиные
клетки, так и на бычьи, однако антивирусная активность в гомологичной системе выше, чем в
гетерологичной. Свиной и бычий α-ИФНы не действуют на клетки курицы и собаки.
Полученные данные можно объяснить исходя из степени гомологии аминокислотных
последовательностей α-ИФНов. Так, куриный α-ИФН гомологичен интерферонам свиньи, быка
и собаки на 26-27%, а собачий α-ИФН гомологичен ИФН других млекопитающих на 50-52%.
При этом гомология бычьего и свиного α-ИФНов составляет примерно 80%.
Ранние сообщения об отсутствии видовой специфичности интерферонов были, повидимому, связаны с противовирусной активностью примесей в препаратах интерферона.
ИНДУКЦИЯ АПОПТОЗА КЛЕТОК ОПУХОЛЕЙ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
БИНАЗОЙ
Пуховская В.С., Зеленихин П.В.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
viktori540@gmail.com
Рак молочной железы является наиболее распространенным инвазивным раком у женщин
во всем мире. На его долю приходится 16% всех злокачественных новообразований и 22,9%
инвазивных раковых заболеваний. Одной из наиболее важных проблем современной медицины
является поиск щадящих средств в противоопухолевой терапии. Рибонуклеазы (РНКазы) –
важнейшие ферменты метаболизма РНК, функции которых заключаются в расщеплении мРНК,
превращении предшественников РНК в зрелые формы, продукции малых регуляторных РНК,
деградации определенных типов РНК. Интерес к РНКазам различного происхождения в
последнее время увеличился, благодаря возможности использования препаратов на их основе в
терапии злокачественных новообразований.
Целью исследования явилась оценка апоптозиндуцирующего действия биназы –
гуанилспецифичной РНКазы Bacillus pumilus 13-19 на линии клеток карциномы молочной
железы человека: HBL-100 и ZR-75-1.
272
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
Клетки HBL-100 и ZR-75-1 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10%
сыворотки и по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина в атмосфере 5% СО2. Внесение
биназы в концентрации 100 мкг/мл осуществляли после формирования монослоем 60%
конфлюэентности. Клетки культивировали в присутствии фермента в течение 48 часов, после
чего подсчитывали общее количество клеток и цитометрически оценивали долю клеток,
находящихся в состоянии апоптоза. В качестве позитивного контроля использовали вариант с
добавлением классического индуктора апоптоза - камптотецина в концентрации 25 мМ.
Индукцию апоптоза фиксировали на проточном цитофлуориметре BD FCSCanto II, с
использованием флуоресцентного красителя мероцианина 540.
Установлено, что биназа обладает апоптозиндуцирующим действием в отношении клеток
ZR-75-1. Доля клеток ZR-75-1, находящихся в состоянии апоптоза через 48 ч культивирования
в присутствии биназы в концентрации 100 мкг/мл составила 27%, в то время как данный
показатель у клеток HBL-100 и контрольном варианте составил всего 5,3%. Камптотецин
индуцировал апоптоз 79% клеток в обеих клеточных линиях. Перечень активированных
онкогенов клеточных линий HBL-100 и ZR-75-1 сходен, за исключением гена myc, который
амплифицирован в клетках HBL-100, что, возможно, объясняет неодинаковое действие биназы
на клетки.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии у биназы способности
индуцировать апоптоз малигнизированных клеток эпителия молочной железы, что
подтверждает возможность использования данного фермента и препаратов на его основе в
терапии злокачественных новообразований.
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ THP-1 КЛЕТОК НА
ЭКСПРЕССИЮ ПОВЕРХНОСТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Радзюкевич Я.В.1, Кабанов Д.С.2, Зубова С.В.2
1
ФГБОУ ВПО Ярославский государственный университет им. П.Г.Демидова,
Ярославль; 2ФГБУН Институт фундаментальных проблем биологии РАН,
Пущино, Россия
sibiryak93@mail.ru
Основным агентами, вызывающими септический шок, являются липополисахариды (ЛПС)
– компоненты клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Клетки иммунной системы
экспрессируют на своей поверхности специфические рецепторы для узнавания ЛПС.
Основными рецепторами, формирующими ответ на вторгшиеся патогены, являются TLR4,
CD14-, CD11b-рецепторы. Удобными объектами исследования влияния ЛПС на клетки
иммунной системы являются культуры клеток, в частности моноцитарная линия клеток THP-1.
Однако недифференцированные клетки THP-1 являются по своим характеристикам
промоноцитами и не обладают рецепторным составом для полноценного ответа на ЛПС.
Существует ряд агентов, способных дифференцировать THP-1 клетки в полноценные
моноциты или макрофаги.
Цель исследования: Подбор оптимальных условий дифференцировки THP-1 клеток в
моноцитоподобные клетки с максимальной экспрессией рецепторов TLR4, CD14 и CD11b.
Материалы и методы: Материалами исследования служили различные физиологические
дифференцирующие агенты (ретиноевая кислота, 1,25-дигидроксивитамин D3 и их
комбинация); моноклональные антитела к CD14-, CD11b-рецептору и TLR4, меченые
флуоресцентной меткой: Alexa Fluor 488 anti-human CD14, Alexa Fluor 488 anti-human CD11b
(BioLegend); Alexa Fluor 488 anti-human CD284 (TLR4) (eBioscience). Анализ образцов
проводили с помощью проточного цитофлуориметра EPICS XL-MCL (Beckman Coulter, США).
Уровень поверхностной рецепции THP-1 клеток оценивали по величине средней
интенсивности флуоресценции (MnI X) образца.
Результаты и обсуждение: Все исследованные агенты оказали дифференцирующее
действие на THP-1 клетки. Это наблюдалось как в приостановке пролиферации, так и в
экспрессии исследуемых поверхностных рецепторов. Ретиноевая кислота усиливала
экспрессию TLR4 по сравнению с контрольными недифференцированными клетками в 1,3 раза,
СD14 – в 4,3 раза, CD11b – в 1,4 раза. Витамин D3 увеличивал экспрессию TLR4 – в 1,6 раза,
273
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
СD14 – в 11 раз, CD11b – в 21 раз. При совместном действии этих двух агентов экспрессия
TLR4 возрастала – в 1,4 раза, СD14 – в 7 раз, CD11b – в 21 раз.
Выводы: Наилучшим агентом дифференцировки THP-1 клеток является 1,25дигидроксивитамин D3, поскольку именно он вызывает наибольшую экспрессию рецепторов,
обеспечивающих ответ клеток на ЛПС.
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ TNFα -308, XPD 312 и XRCC1 399 У ДЕТЕЙ С
ЮВЕНИЛЬНЫМ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
Романюк О.П., Гончарова Р.И.
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь
v.ramaniuk@igc.bas-net.by
Актуальность проблемы ювенильного ревматоидного артрита (ЮРА) связана с ростом
заболеваемости (распространенность данной патологии составляет 0,1-0,8% в различных
странах) и высокой степенью инвалидизации заболевших детей и подростков (35% в Беларуси).
Несмотря на значительные достижения в вопросах диагностики и лечения ЮРА, этиология и
патогенез этого заболевания во многом остаются неясными. Накоплены данные,
свидетельствующие о роли наследственности и факторов окружающей среды в развитии ЮРА.
Полиморфные варианты генов эксцизионной репарации XPD Asp312Asn (934G>A) и
XRCC1 Arg399Gln (1196G>A) были выбраны для данного исследования, так как известно о
нестабильности генома и снижении скорости репарации ДНК у пациентов, страдающих данной
патологией. TNFα является одним из наиболее важных цитокинов, участвующих в патогенезе
ЮРА. Замена гуанина на аденин в позиции 308 влияет на усиление активности промоторной
области. При этом происходит 6-7-кратное повышение индуцируемого уровня транскрипции
гена TNFα. В работе с помощью полимеразной цепной реакции с последующим
рестрикционным анализом проанализированы образцы ДНК от 40 детей с установленным
диагнозом ЮРА по сравнению с контрольной группой (99 детей без костно-суставной
патологии). Средний возраст больных детей составил 8,4 ± 4,9 лет, а в контрольной группе –
14,1 ± 2,6. Среди больных ЮРА преобладали девочки (75%), в контрольной группе было
больше мальчиков (52,5%). Распределение частот генотипов по изученным генам в
контрольной группе соответствовало равновесию Харди-Вайнберга.
В случае полиморфного маркера TNFα -308G>A результаты исследования показали
тенденцию к увеличению частоты аллеля G (OR95%CI = 4,38 [1,00 – 19,21] p=0,05 по критерию
χ2) и генотипа GG (OR95%CI = 4,81 [1,07 – 21,65] p=0,04) в группе больных ЮРА по
сравнению с контрольной группой. При анализе частоты встречаемости полиморфных
вариантов гена XPD Asp312Asn (934G>A) в группе детей с ЮРА и в контрольной группе не
было выявлено статистически значимых различий (p>0,05 по критерию χ2). При изучении
распределения генотипов и аллелей гена XRCC1 Arg399Gln (1196G>A) обнаружено
статистически значимое увеличение частоты встречаемости гетерозигот в контрольной группе
(53,5%) по сравнению с больными ЮРА (27,5%). Для подтверждения выявленных ассоциаций
необходимы дальнейшие исследования на большей выборке пациентов.
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА СБОРКИ ШАПЕРОННОЙ СИСТЕМЫ
GroEL/GroES IN VITRO
Рябова Н.А., Марченков В.В., Селиванова О.М., Семисотнов Г.В.
ФГБУН Институт белка РАН, Пущино, Россия
ryabova@phys.protres.ru
Белки теплового шока клеток Escherichia coli GroEL (Hsp 60, 850 кДа) и GroES (Hsp 10, 70
кДа) являются представителями семейства молекулярных шаперонов. Шапероны участвуют в
сворачивании многих клеточных белков, взаимодействуя с их ненативными
конформационными состояниями и предотвращая их неспецифическую агрегацию. Шапероны
GroEL/ES представляют собой сложные олигомерные белковые структуры. Изучение
274
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
механизма их самосборки необходимо для понимания процесса самоорганизации сложных
олигомерных белков в целом.
В данной работе исследовалась сборка in vitro олигомерной частицы GroEL, состоящей из
14-ти субъединиц с молекулярным весом 57 кДа каждая и олигомерного ко-шаперона GroES,
состоящего из 7-ми субъединиц с молекулярным весом по 10 кДа каждая.
По результатам предыдущих исследований нами была предложена модель
самоорганизации шаперонной системы GroEL/ES, согласно которой свернутые мономеры
GroEL сначала собираются в нестабильные кольца из семи субъединиц, которые в свою
очередь стабилизируются молекулами олигомерного GroES. Затем два комплекса
GroEL7/GroES образуют симметричный комплекс GroES/GroEL14/GroES, который может
распадаться до асимметричного комплекса GroEL14/GroES и свободный GroES или на
свободные частицы GroEL и GroES.
С помощью голубого нативного электрофореза и просвечивающей электронной
микроскопии по ходу процесса сборки шаперонной системы были экспериментально показаны
все кинетические комплексы шаперона и ко-шаперона согласно предложенной модели. Таким
образом, была проведена визуализация кинетики самосборки шаперонной системы GroEL/ES и
показаны все стадии модели данного процесса.
Работа поддержана программой «Молекулярная и клеточная биология».
ИДЕНТИФИКАЦИЯ РЕФЕРЕНСНЫХ ГЕНОВ В ПЕЧЕНОЧНЫХ ВЫРОСТАХ
МОРСКОЙ ЗВЕЗДЫ ASTERIAS RUBENS ПРИ ТЕПЛОВОМ СТРЕССЕ
Садритдинова А.Ф., Снежкина А.В., Дмитриев А.А., Мельникова Н.В.,
Кудрявцева А.В.
ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Москва, Россия
asiya.bun@gmail.com
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) один из основных
методов количественной оценки экспрессии генов. При определении уровня мРНК методом
ПЦР-РВ важное значение имеет нормализация данных по инвариантному внутреннему
контролю. В качестве такого контроля обычно используют референсные гены, в первую
очередь гены «домашнего хозяйства». Однако во многих работах показано, что даже
«традиционные» гены «домашнего хозяйства» могут дифференциально экспрессироваться у
разных организмов в зависимости от типа ткани и условий эксперимента. Идентификация
референсных генов является актуальной задачей, поскольку для большинства таксонов
подобные работы до сих пор отсутствуют, а применение «стандартных» контрольных генов без
оценки пригодности для конкретного эксперимента может привести к ошибочным результатам.
В качестве объекта исследований нами выбран модельный объект цитологических и
гистологических исследований – беломорская звезда Asterias rubens L. Морские звезды - одна
из наиболее древних групп животных, доживших до наших дней. Они являются основными
компонентами донного населения морей и океанов. Кроме того, морские звезды - хищники,
наносящие значительный ущерб естественным и искусственным поселениям промыслового
двустворчатого моллюска Mytilus edulis. Поэтому изучение экспрессии генов у данного вида
организмов представляет как фундаментальный, так и прикладной интерес. С помощью метода
высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina, нами проведен
предварительный анализ экспрессии ряда генов «домашнего хозяйства» (UBA52, Tuba, Tubb,
Ef1a, 28S, 18S, Actin, GAPDH) в печеночных выростах A. rubens в норме (взрослые особи, не
подвергавшиеся стрессовому воздействию) и при тепловом шоке (взрослые особи,
подвергавшиеся температурному воздействию при 23С°, 25С°, 27С°, 29С° и -1,5С° в течение 15
– 48 часов). Методом ПЦР-РВ оценили уровень мРНК этих генов в контрольных и опытных
образцах, что позволило сравнить вариабельность их экспрессии в норме и при стрессе. В
результате выбраны гены EF1a и UBA52, уровень экспрессии которых изменялся в пределах
допустимых значений (не более чем в +/- 2 раза). Полученные результаты позволяют
предложить данные гены в качестве контрольных для транскриптомных исследований методом
ПЦР-РВ морской звезды Asterias rubens,а так же, возможно, и других видов морских звезд и
иглокожих в целом.
275
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
СПЕЦИФИЧНОСТИ HLADR B1, ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ И
TLR, АССОЦИИРОВАННЫЕ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ (БА)
У ЖИТЕЛЕЙ РЕСПУБЛИКИ АДЫГЕЯ (РА)
Руденко К.А.1, Тугуз А.Р.1, Нихай М.М.2, Анохина Е.Н.1
1
Адыгейский государственный университет, НИИ комплексных проблем;
2
Адыгейская Республиканская клиническая больница, пульмонологическое отделение,
Майкоп, Россия
lab_genetic@mail.ru
Трансформация воспалительной реакции при БА может быть связана с мутациями в генах
Toll-подобных рецепторов (TLR), цитокинов и специфичностями HLA II.
Цель: типирование полиморфизмов генов TLR, специфичностей HLA DR B1 и основных
провоспалительных цитокинов, ассоциированных с риском развития БА у жителей РА.
Материалы и методы. Полиморфизмы генов TLR4, TLR9, IL-17A, TNF-α, IL-6 исследованы
SNP - методом на образцах геномной ДНК 112 жителей РА (49 доноров и 63 больных БА) с
использованием тест-систем НПФ «Литех» и электрофоретической детекцией результатов.
Специфичности HLADR B1 типированы ПЦР – Real-Time на тест-системах «ДНКТехнология». Качество и концентрация образцов ДНК определены на спектрофотометре
NanoDrop 2000c «Thermo Scientific» (США). Статистически значимые различия (р
Результаты исследования. Наследственные формы БА у жителей РА не ассоциированы ни с
одним из трех SNP TLR4 и TLR9 (rs4986790, rs4986790, rs352140). В группе больных БА без
наследственной отягощенности, в сравнении с донорами, статистически значимо (р<0,05)
повышены
частоты
«патологического»
гомозиготного
G2848/2848G
генотипа
внутриклеточного TLR9, участвующего в распознавании вирусных и бактериальных паттернов.
По SNP генов цитокинов достоверные различия (р<0,05) между больными и донорами
установлены для пускового провоспалительного IL-17А. У больных повышены частоты
«мутантной» 197А аллели (χ2=6,98; OR=2,51) и АА генотипа (χ2=8,45; OR=12,62),
ассоциированные с риском развития БА. G308/308A аллели гена TNF-α не связаны с БА, но
гетерозиготный GA генотип повышает риск развития БА (χ2=4,14; OR=2,68). Частоты
С174/174G полиморфизмов гена IL-6, завершающего «первую волну» медиаторов воспаления,
у больных и доноров достоверно не различаются.
Специфичности HLADR B1 антигенов, обуславливающие иммунные реакции, реализуются
с помощью цитокинов. Экспериментально установлено, что протективный DR B1*04*15
генотип HLA у доноров сочетается с определенными SNP генов провоспалительных
цитокинов: «нормальными» аллелями IL-17A (G197) и IL-6 (С174). У больных БА HLA DR
B1*04*15 генотип, в отличие от доноров, сопряжен с «мутантными» аллелями IL-17A (197А) и
IL-6 (174G). Т.о. для реализации протективных свойств HLADR B1*04*15 генотипа HLA,
необходимо наличие «нормальных» SNP промоторных регионов генов IL-17A и IL-6,
регулирующих продукцию основных провоспалительных цитокинов.
СОЗДАНИЕ ШТАММА L.PLANTARUM C НОКАУТИРОВАННЫМ
ГЕНОМ GLNR
Саетгараева А.А., Тарасов Н.В., Каюмов А.Р.
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
albi121993@mail.ru
Азот относится к основным макроэлементам, необходимым для построения многих
компонентов клетки – белков, нуклеиновых кислот, витаминов и т.д. Микроорганизмы
способны к ассимиляции различных форм азота, что обеспечивает выживание и пролиферацию
клеток в различных условиях природной среды. Наиболее предпочтительными источниками
азота для многих бактерий являются глутамин и ионы аммония.
На данный момент, азотный метаболизм лактобацилл практически не изучен. Тем не менее,
анализ генома Lactobacillus plantarum выявил высокую идентичность белков GlnR, AmtB и
глутаминсинтетазы с белками B.subtilis. Мы предполагаем, что факто транскрипции GlnR, так
же как у бацилл, участвует а азотном метаболизме лактобацилл. В клетках B.subtilis GlnR
276
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
активирует экспрессию оперона glnRA, содержащего ген глутаминсинтетазы glnА и
собственный ген glnR. Известно что, GlnR активен в условиях избытка азота. Целью работы
является провести нокаутирование GlnR в клетках L.plantarum и установить роль этого белка.
Для этого была создана генетическая конструкция, включающая 5’ и 3’ последоваельности гена
glnR и ген устойчивости к хлорамфениколу. ДНК вводилась в клетки путем электропорации.
Так как конструкция имеет гомологичные последовательности, к 5’ и 3’ участкам гена glnR
L.plantarum, ген устойчивости к хлорамфениколу встраивается в геномную ДНК взамен glnR.
Следующей задачей является оценить физиологические свойства, для чего необходимо
подобрать минимальную безазотную среду.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 14-04-32317 мол_а.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ СТАРЕНИЯ
СИМБИОТИЧЕСКОГО КЛУБЕНЬКА ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.)
Серова Т.А., Цыганов В.Е.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
микробиологии РАСХН, Пушкин, Санкт-Петербург, Россия
t_serova@rambler.ru
В последние годы интенсивно изучается процесс старения симбиотических клубеньков
бобовых, поскольку увеличение периода активной фиксации азота и, следовательно,
увеличение содержания симбиотрофного азота в растениях, могло бы оказать положительный
эффект на насыщение почвы биологическим азотом и повышение урожайности возделываемых
культур.
В работе была использована исходная линия Sparkle и полученный на ее основе мутант
E135f (sym13), характеризующийся преждевременной деградацией симбиотических структур,
т.е. фенотипом раннего старения клубеньков; родительская линия Sprint-2 и полученный на ее
основе мутант Sprint-2Fix- (sym31), характеризующийся недифференцированными
бактероидами и отсутствием морфологических признаков деградации симбиотических
структур; и двойной мутант RBT (sym13, sym31), характеризующийся сходным фенотипом с
линией Sprint-2Fix- (sym31). Для анализа уровня экспрессии маркерных «генов старения» был
проведен ПЦР анализ в режиме реального времени.
В качестве маркерных «генов старения» были выбраны гены цистеиновых протеаз (PsCyp1,
PsCyp15a) и тиоловой протеазы (PsTPP), продукты которых участвуют в масштабной
деградации белка; ген фактора транскрипции bZIP (PsATB2), экспрессия ортолога которого
повышается у Medicago truncatula в ходе старения клубенька; ген гиббереллин 2-β-оксидазы
(PsGAOx2), деактивирующей гиббереллиновую кислоту, гены 1-аминоциклопропан-1карбоксилат оксидазы (PsАСО1) и альдегид оксидазы 3 (PsАО3), кодирующие ферменты
синтеза этилена и абсцизовой кислоты, соответственно.
С увеличением возраста клубеньков наблюдалось повышение уровня мРНК анализируемых
маркерных «генов старения» как у родительских линий, так и у всех исследуемых
симбиотических мутантов гороха. При этом в случае мутанта E135f (sym13) наибольший пик
экспрессии всех выбранных генов значительно превосходил уровень экспрессии в клубеньках
исходной линии. У мутанта Sprint-2Fix- (sym31), характеризующегося отсутствием ярко
выраженных морфологических признаков деградации симбиотических структур, также было
показано повышение экспрессии маркерных «генов старения» с увеличением возраста
клубеньков, что свидетельствует о протекании процессов старения у данной мутантной линии.
Таким образом, показана позитивная регуляция процесса старения симбиотического клубенька
гороха этиленом, абсцизовой кислотой и транскрипционным фактором PsATB, негативная
регуляция гиббереллиновой кислотой, а также активная роль в старении цистеиновых и
тиоловой протеаз.
277
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
ЛИТОКОДИРОВАНИЕ: ГИПОТЕЗА ПРОИСХОЖДЕНИЯ
ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА
Скобликов Н.Э.1, Зимин А.А.2
1
ГНУ Северо-кавказский научно-исследовательский институт животноводства РАСХН,
Краснодар; 2ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино, Россия
skoblikow@yandex.ru
Предложена гипотеза древнейшего возникновения генетического кода, основывающаяся на
реализации прямого контакта комбинаций кодирующих молекул с аминокислотами в полых
ячейках поверхности минерала с регулярной кристаллической структурой, обладающих
определённой стереометрией. Кодирующие молекулы расположены в ячейке по принципу
частичного экранирования; остающееся свободное пространство ячейки определяет
стереохимические свойства заполняющего его аминокислотного радикала.
В качестве минералов, выполнявших основную роль в таком кодировании
(«литокодировании»), рассмотрены апатиты. Стенки ячеек такого минерала рассматриваются
как вероятный источник образования фосфатных мостиков в будущих молекулах РНК.
Стереометрические параметры минеральных ячеек рассматриваются как главный фактор
изомерической селекции для контактирующих молекул. Наличие у ячеек жёстких стенок не
допускает возможности сдвига кодирования. Регулярное упорядоченное расположение
множества соседних ячеек позволяет осуществлять последующую полимеризацию
аминокислот и кодирующих молекул в одном направлении (ко-полимеризацию).
Магматическая природа минерала, абиогенное образование всех органических молекулучастников процесса кодирования, условия и порядок заполнения ячеек, последующие
полимеризационные события могут быть оптимально рассмотрены в рамках «вулканического
сценария».
Имеющиеся различия стандартного и альтернативных кодов объясняются в рамках
гипотезы как результат позднейшей дивергентной биологической эволюции первичного
группового литокодирования одной комбинацией кодирующих молекул группы
стереохимически родственных аминокислот.
Гипотеза выдвинута при работе по проекту РФФИ № 13-04-00991-a.
ОЦЕНКА ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ГЕНОМА ШАХТЕРОВ
С РАЗЛИЧНЫМИ ВАРИАНТАМИ ГЕНОВ ADPRT И XRCC3 К КОМПЛЕКСУ
ВРЕДНЫХ ФАКТОРОВ
Синицкий М.Ю.1, Волобаев В.П.1, Ядыкина Т.К.2
1
ФГБОУ ВПО Кемеровский государственный университет, Кемерово; 2ФГБУ Научноисследовательский институт комплексных проблем гигиены и профессиональных
заболеваний СО РАМН, Новокузнецк, Россия
max-sinitsky@rambler.ru
Кемеровская область – регион с развитой угледобывающей промышленностью. В процессе
угледобычи в воздух шахт выделяется большое количество угольной пыли, полициклических
ароматических углеводородов, тяжелых металлов и радона. Все эти вещества являются
генотоксикантами, способными индуцировать цитогенетические повреждения. Таким образом,
проблема оценки индивидуальной геночувствительности шахтеров является одной из наиболее
актуальных в современной науке.
Известно, что эффективное функционирование систем репарации ДНК уменьшает
генотоксические риски. В условиях профессиональной экспозиции неблагоприятными
факторами угледобывающего производства и при наличии выраженных генотоксических
эффектов такого воздействия, дифференцированная чувствительность генома человека может
быть связана с наличием в генотипе различных вариантов полиморфных локусов генов,
кодирующих ключевые ферменты систем репарации ДНК.
278
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
Цель – оценить индивидуальную геночувствительность работников угледобывающих
предприятий, являющихся носителями различных вариантов генов репарации ДНК (ADPRT
Val462Ala и XRCC3 Gly271Arg).
Материалом исследований послужила кровь 80 шахтеров, проходящих обследование в
НИИ комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний СО РАМН (г.
Новокузнецк).
Для оценки степени повреждения ДНК были использованы цитогенетические методы –
учет хромосомных аберраций и микроядер в лимфоцитах. Для анализа полиморфизмов генов
использовали наборы НПФ «Литех» (г.Москва).
В результате проведенных исследования выявлено, что у носителей гетерозигот по гену
ADPRT частота аберраций хромосомного типа достоверно (p = 0,016) выше (1,53 ± 0,16%), чем
у носителей гомозигот по мажорному аллелю (1,05 ± 0,21%). Это может быть связано со
снижением активности белка ADPRT, являющегося одним из ключевых белков эксцизионной
репарации оснований, у носителей гетерозиготных вариантов соответствующего гена.
У носителей гетерозигот гена XRCC3 было отмечено незначительное повышение индекса
репликации (1,83 ± 0,02) по сравнению с носителями гомозигот по мажорному аллелю (1,75 ±
0,02). Это, вероятно, объяснятся тем, что ускорение пролиферативной активности является
компенсаторным механизмом в ответ на клеточный стресс.
Таким образом, установлено, что анализ полиморфных локусов данных генов может
служить биологической тест-системой для оценки индивидуальных генотоксических рисков у
людей, устраивающихся работниками на угледобывающие предприятия.
Работа выполнена в рамках государственного задания №2014/64.
ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ КОМПОНЕНТЫ
МЕТАБОЛИЗМА РЕТИНОЛА ПРИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ПОЧКИ
МЕТОДОМ ПЦР-РВ
Снежкина А.В., Садритдинова А.Ф., Дмитриев А.А., Мельникова Н.В.,
Кудрявцева А.В.
ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Москва, Россия
leftger@rambler.ru
Канцерогенез – сложный многоэтапный процесс перерождения нормальных клеток в
злокачественные. Опухолевая трансформация характеризуется комплексными генетическими
(соматические мутации, хромосомные аберрации, рекомбинации ДНК) и эпигенетическими
(метилирование ДНК, гистоновый код, некодирующие РНК) нарушениями, которые приводят к
изменению экспрессии онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста. Также характерной
особенностью канцерогенеза является изменение основных путей метаболизма. Например,
известно, что при карциномах, в том числе раке почки, происходит изменение метаболизма
ретинола. Ретинол регулирует процессы роста, деления и дефференцировки клеток.
Основной продукт метаболизма ретинола - ретиноевая кислота связывается с
транскрипционными факторами и регулирует экспрессию множества генов. Воздействие
ретиноевой кислотой in vitro вызывает многочисленные биохимические и метаболические
изменения в тканях. В настоящее время благодаря своему широкому спектру действия
ретиноевая кислота используется в клиниках для лечения кожных заболеваний и является
потенциальным кандидатом для профилактики рака и терапии клеток на стадии
дифференцировки.
Нами проведен комплексный биоинформатический анализ нескольких типов
транскриптомных данных нормальных и опухолевых тканей почки: нуклеотидных
последовательностей E-North и SAGE, данных гибридизации кДНК на микропанелях MAGE.
Эти данные позволили провести предварительную оценку содержания мРНК генов,
кодирующих
компоненты
основных
этапов
метаболизма
ретинола:
ферменты,
ретинолсвязывающие белки и рецепторы ретиноидов в опухолевых тканях почки и исключить
из экспериментального исследование гены с относительно низким уровнем экспрессии RPE65, LRAT, RDH8, RBP2, RXRG и RORB.
279
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
С помощью метода ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) нами проведена оценка
относительного уровня мРНК 23-х генов, кодирующих компоненты метаболизма ретинола при
светлоклеточном раке почки (СРП). Выявлено несколько потенциальных генов-супрессоров со
значительным снижением экспрессии: ADH1B, RDH12, ALDH1A2, RBP4, а также один ген со
значительным повышением экспрессии, потенциальный онкоген – RBP7. Для генов AKR1C1,
RDH14, RDH5, RDH13, ALDH1A3, RARB, RARG и RORC показана дерегуляция экспрессии.
Экспрессия остальных 10-ти генов не изменялась.
Таким образом, полученные данные о разнонаправленных значительных изменениях
экспрессии исследуемых генов при СРП свидетельствуют о нарушение метаболизма ретинола в
опухолевых клетках.
АЛЬТЕРНАТИВНОЕ КОДИРОВАНИЕ УКОРОЧЕННОГО БЕЛКОВОГО
ПРОДУКТА ВО ВНУТРЕННЕЙ ОБЛАСТИ ГЕНА
oppB ОПЕРОНА oppABCDEF E.COLI
Сухаричева Н.А.
ФГБОУ ВПО Пущинский государственный естественно-научный институт,
ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Россия
natasha-sukharicheva@yandex.ru
Феномен альтернативного кодирования внутри аннотированных последовательностей
генов, получивший название «оверпринтинга», является одним из путей эволюционного
становления новых генов, впервые был обнаружен у вирусов и до сих пор остается предметом
дискуссий для бактериальных геномов. Очевидно, что новые белковые продукты,
кодированные внутри известных открытых рамок считывания, могут транслироваться как с
полноразмерной мРНК, инициированной с промотора известного гена, так и с РНК, которая
может транскрибироваться из внутренней области кодирующей последовательности.
Значительное количество внутригенных промоторов, предсказанных методами компьютерного
анализа (PlatProm) и обнаруженных в тотальном транскриптоме с использованием методов
глубокого секвенирования, стимулирует исследование функциональной роли таких промоторов
и поиск возможных белковых продуктов, которые могут транслироваться с инициируемых на
них РНК.
В данной работе мы исследовали возможность альтернативной трансляции РНК-продукта,
транскрибируемого с промотора, обнаруженного нами на основании результатов обратной
транскрипции в начале гена oppB оперона oppABCDEF E.coli. Данный оперон принимает
участие в транспорте олигопептидов и может опосредовать ответ бактериальной клетки на
действие олигопептидных антибиотиков. Для детектирования возможных белковых продуктов
была создана конструкция по принципу «трансляционного слияния», содержащая
полноразмерный ген oppB, находящийся в одной рамке считывания с геном белка EGFP, и
межгенную область oppA/oppB, клонированные в плазмиду pET28b. При культивировании
клеток в отсутствие в среде катионных олигопептидов активирован промотор, находящийся в
кодирующей области oppB. Соответствующий РНК-продукт при этом не может обеспечить
синтез полноразмерного белка OppB. В клетках E.coli K12 MG1655, трансформированных
полученным вектором, зарегистрирован синтез флуоресцентного белка с молекулярной массой
~47 кДа, который может представлять собой гибрид укороченного продукта (положение его
потенциального инициирующего кодона соответствует позиции +519 в нуклеотидной
последовательности гена oppB относительно ATG-кодона) и белка EGFP. Свойства и
биологическая роль нового белкового продукта, составляющего 44% полноразмерного белка
OppB, являются предметом дальнейшего исследования.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 13-04-00997).
280
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
ГЕН РЕЦЕПТОРНОЙ КИНАЗЫ LYKX КАК МАРКЕР ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
ЭВОЛЮЦИИ ВИДА ГОРОХ ПОСЕВНОЙ (PISUM SATIVUM L.)
Сулима А.С., Жуков В.А., Борисов А.Ю., Тихонович И.А.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной
микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург, Россия
sulan555@mail.ru
Реконструкция эволюции вида горох посевной (Pisum sativum L.) и точное установление
центров происхождения культурного гороха затруднены из-за его раннего окультуривания (10
000 лет назад) и последующего «перемешивания» генетического материала в ходе скрещивания
различных подвидов вида P. sativum между собой. Изучение полиморфизма функционально
значимых генов (потенциально, определяющих ценные для «древнейших селекционеров»
признаки) может способствовать решению данной задачи.
Как и другие бобовые растения, горох образует симбиоз с клубеньковыми бактериями
(ризобиями), благодаря чему получает возможность фиксировать молекулярный азот
атмосферы. Некоторые формы гороха, произрастающие в ближневосточном регионе, (т.н.
«афганские»), проявляют повышенную избирательность к своему микросимбионту Rhizobium
leguminosarum bv. viciae и, в отличие от «европейских» форм, не способны формировать
клубеньки со штаммами ризобий из почв Европы. За проявление данного фенотипа отвечает
ген sym2, наиболее вероятным кандидатом на роль которого является обнаруженный нами ген
рецепторной киназы LykX, который локализуется в том же регионе генома, что и sym2,
кодирует белок с подходящей функцией и демонстрирует аллельное состояние, коррелирующее
с проявлением повышенной специфичности симбиоза.
У неродственных образцов из генетической коллекции ВИР выявлены два независимых
аллельных состояния гена lykX, ассоциированных со специфическим фенотипом
клубенькообразования. На уровне белка эти состояния выражаются в замене одной или трех
аминокислот по сравнению с последовательностью белка lykX, характерной для «европейских»
линий с низкой специфичностью взаимодействия с ризобиями. Данный факт может
свидетельствовать о независимом происхождении двух групп растений с повышенной
специфичностью симбиоза или о вторичном приобретении подобной специфичности одной из
этих групп.
Фрагмент генома, предшествующий промоторной области гена lykX, весьма вариабелен, и
также может рассматриваться как маркерная последовательность, по-видимому, не
испытывающая давления отбора.
Исследование поддержано грантами Президента РФ (НШ-337.2012.4 и НШ-4603.2014.4) и
РФФИ (13-04-01702-а, 13-04-01703-а, 14-04-01442-а и 14-04-32289-мол_а).
МУТАЦИИ ГЕНА FGFR3 У ПАЦИЕНТОВ С НЕМЫШЕЧНО-ИНВАЗИВНЫМ
РАКОМ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
1
Смаль М.П. , Ролевич А.И.2, Красный С.А.2, Поляков С.Л.2, Набебина Т.И.2,
Гончарова Р.И.1
1
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; 2Республиканский научнопрактический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова,
Минск, Беларусь
marharyta.smal@gmail.com
Рак мочевого пузыря (РМП) занимает девятое место среди всех злокачественных
новообразований. Для опухолей мочевого пузыря характерна морфологическая и клиническая
гетерогенность, обусловленная их генетической разнородностью. Предполагается
существование двух альтернативных генетических путей в патогенезе уротелиальной
карциномы, один из которых характеризуется высокой частотой активирующих мутаций гена
FGFR3. В ряде работ было показано, что мутации данного гена наблюдаются чаще в
папиллярных немышечно-инвазивных опухолях и коррелируют с благоприятным прогнозом.
281
18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века»
СЕКЦИЯ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»
Целью исследования явилось изучение частоты и спектра точечных мутаций гена FGFR3
при немышечно-инвазивном РМП и их связи с демографическими и клиникоморфологическими характеристиками.
В период с 2010 по 2013 гг. у всех пациентов с первичными и рецидивными опухолями
мочевого пузыря, подлежащих ТУР либо диагностической цистоскопии с биопсией,
производился забор опухолевого материала. Из свежего и парафинизированного материала
выделяли ДНК, мутационный статус гена FGFR3 определяли с помощью метода SNaPshot.
Всего в проспективное исследование включено 272 пациента (217 мужчин и 55 женщин),
средний возраст которых составил 66,5±11,0 лет.
Мутации гена FGFR3 обнаружены в 164 случаях (60,3%), причем двойные мутации
выявлены в 10 опухолях. Определены 9 различных однонуклеотидных миссенс-мутаций, среди
которых наиболее часто присутствовали мутации S249C (63,8%), R248C (13,2%) и Y375C
(16,1%), локализованные в 7 и 10 экзонах исследуемого гена. Мутации гена FGFR3
статистически значимо ассоциированы с высокой степенью дифференцировки опухоли. Так, в
G1 опухолях мутации встречались