СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ТКАНЕЙ ПЕЧЕНОЧНЫХ

Методические положения
СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ТКАНЕЙ ПЕЧЕНОЧНЫХ
СОСАЛЬЩИКОВ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПЦР
А.С. ГУЛЯЕВ
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
им. К.И.Скрябина, г. Москва, Б. Черемушкинская, 28,
e-mail: vigis@ncport.ru
С.К. СЕМЕНОВА
Институт биологии гена РАН
(одобрены секцией «Инвазионные болезни животных РАСХН
22 марта 2012 г., протокол № 1)
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) – основа всех исследований,
так или иначе касающихся молекулярной генетики. Для проведения ПЦР необходимо использовать высокоочищенную ДНК концентрацией не менее
0,05 мкг/мкл. Экстракцию и очистку ДНК проводят различными методами: с
помощью коммерческих наборов реагентов и стандартным фенолхлороформным методом.
Фенол-хлороформный метод (ФХ-метод) – это классический метод выделения нуклеиновых кислот (НК). Он включает в себя лизис биологического
материала детергентами в присутствии протеиназы К и экстракцию НК с помощью фенола и хлороформа. Достоинством этого метода является более высокий выход ДНК по сравнению с набором реагентов Diatom DNA Prep, а к
недостаткам можно отнести длительность, трудоемкость, использование агрессивных органических растворителей и недостаточную очистку ДНК как от
белков, так и от РНК.
Методика ФХ-экстракции НК из тканей фасциол состоит из следующих
этапов:
- от тела фасциолы отрезают кусочек ткани массой 0,05 г (желательно
ротовой присоски, чтобы не затронуть половую систему, необходимую для
морфологической идентификации);
- ткань фасциолы гомогенизируют с буферным раствором, содержащим
40 мМ трис-HCl (pH = 8,0), 0,5 мМ ЭДТА, 1 SSC (при соотношении ткани и
буфера 100 мкг/500 мкл);
- добавляют SDS до 0,5 % и протеиназу K до конечной концентрации 1
мг/мл, перемешивают и инкубируют при 37 ºC в течение ночи;
- в пробирку добавляют 5М ацетата натрия до конечной концентрации
0,1M и перемешивают. Затем добавляют фенол в соотношении 1 : 1, насыщенный трис-HCl, (pH = 8,0), перемешивают 10–15 мин;
- добавляют хлороформ в объемном соотношении 1 : 1 с последующим
перемешиванием в течение 5–10 мин;
- полученную смесь центрифугируют при 4 C 20 мин (4000 об/мин);
- верхнюю фракцию с растворенной ДНК (супернатант) отбирают пипеткой;
- ФХ депротеинизацию повторяют до полного удаления белка;
- к отобранному супернатанту добавляют хлороформ в объемном соотношении 2 : 1, перемешивают 10–15 мин, центрифугируют 15 мин
(4000 об/мин) и отбирают верхнюю фазу;
- к 1 мл растворенной ДНК добавляют 5М ацетат натрия до конечной
концентрации 0,2 M и перемешают;
- добавляют два объема 96%-ного этанола и плавно перемешивают до
выпадения ДНК в осадок;
128
- охлаждают в течение суток при температуре – 20 оС, затем центрифугируют 15 мин при 15 000 об/мин (с охлаждением до 0 оС);
- удаляют супернатант, осадок ДНК промывают 70%-ным этанолом;
- спирт сливают, ДНК высушивают на воздухе до окончательного испарения спирта и растворяют в деионизированной воде.
Концентрация экстрагированной ДНК составляет 2,0–2,3 мкг/мкл при
чистоте OD260/280 нм = 1,4–2,0.
Метод выделения ДНК с помощью набора реагентов Diatom DNA Prep
100 представляет собой один из методов экстракции НК с помощью коммерческих наборов реагентов, или китов. Этот набор позволяет выделять ДНК из
различных природных материалов, а также проводить быструю очистку ДНК
из клинических проб. От ФХ-метода данный способ отличается быстротой
(0,5–1,5 ч на одну пробу), отсутствием токсичных реагентов. Принцип действия основан на использовании лизирующего реагента (ЛР) с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии ЛР
ДНК активно сорбируется на поставляемом в наборе NucleoS-сорбенте, а затем легко отмывается от белков и солей спиртовым раствором. ДНК, элюированную из сорбента, можно напрямую использовать для ПЦР.
Состав набора: лизирующий реагент, солевой буфер, суспензия сорбента
NucleoS, суспензия смеси ионообменников «ЭкстраГен».
Методика экстракции ДНК из тканей фасциол с помощью Diatom DNA
Prep 100 состоит из следующих этапов:
- готовят рабочий раствор солевого буфера (СБ) согласно инструкции;
- от тела фасциолы отрезают кусочек ткани массой 0,05 г (желательно
ротовой присоски, чтобы не затронуть половую систему, необходимую для
видовой идентификации);
- растирают ткань фасциолы в 100 мкл ЛР, переносят смесь в чистую
пробирку;
- добавляют в нее 400 мкл ЛР, перемешивают переворачиванием 5–10
раз, термостатируют 5–7 мин при 65 °С;
- центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 с; супернатант переносят в чистую пробирку, добавляют к нему 20 мкл предварительно гомогенизированной суспензии NucleoS;
- перемешивают при 10–20 об/мин в течение 10 мин и центрифугируют
пробирку при 5000 об/мин в течение 10 с;
- к осадку добавляют 200 мкл ЛР и интенсивно перемешивают до гомогенного состояния;
- добавляют к смеси 1 мл рабочего раствора СБ, перемешивают 5–10 раз,
центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 с, а затем удаляют супернатант;
- повторяют предыдущий пункт;
- подсушивают осадок при температуре 65 °С в течение 4–5 мин;
- вносят 50–100 мкл суспензии «ЭкстарГен» и перемешивают до гомогенного состояния, затем термостатируют 5 мин при 65 °С и снова перемешивают;
- центрифугируют при 10000 об/мин в течение 1 мин;
- отбирают супернатант, хранят при – 20 °С.
Концентрация экстрагированной ДНК составляет 0,12–0,17 мкг/мкл при
чистоте OD260/280 нм = 1,6–2,0.
ДНК, выделенную «быстрым» ФХ-методом, зачастую необходимо доочищать от оставшихся белков и углеводов. Это можно эффективно сделать
суспензией NucleoS из набора реагентов Diatom, начиная работу с пункта 5
методики.
129