018875 B1 018875 B1 (11) 018875

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
018875
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2013.11.29
(21)
(51) Int. Cl. C12Q 1/68 (2006.01)
G06F 19/00 (2011.01)
Номер заявки
201071319
(22)
Дата подачи заявки
2009.05.15
(54)
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ КОНТРОЛИРОВАНИЯ МАССЫ И СПОСОБЫ ИХ
ПРИМЕНЕНИЯ
B1
018875
Изобретатель:
(74)
Представитель:
Кремпин Дэвид (умер), Дрейпер
Коллин, Уилкинс Леон, Бретон
Гэри, Перюсс Луи, Дебаск Рут,
Рамакришнан Шиам (US)
Медведев В.Н. (RU)
(56)
SORENSEN THORKILD I.A. ET AL.:
"Genetic polymorphisms and weight loss in obesity:
a randomised trial of hypo-energetic high-versus
low-fat diets". PLOS CLINICAL TRIALS, PUBLIC
LIBRARY OF SCIENCE, US, vol. 1, no. 2, 1 June,
2006 (2006-06-01), pages 1-14, XP002467235, ISSN:
1555-5887, page 8, right-hand column - page 13, lefthand column; tables 3-5
MARTI AMELIA ET AL.: "Interaction
between genes and lifestyle factors on obesity".
PROCEEDINGS OF THE NUTRITION SOCIETY,
vol. 67, February 2008 (2008-02), pages 1-8,
(57)
Изобретение относится к способам и тестам, которые предусматривают установление
персонализированных программ потери массы субъекта, основанных на метаболическом
генотипе субъекта по ключевым метаболическим генам. Раскрыты наборы и способы
определения метаболического генотипа субъекта, которые могут быть использованы для выбора
соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни,
основанные на вероятности восприимчивости субъекта к некоторым диетам и уровням активности.
Такая персонализированная программа потери массы будет очевидно полезной (например,
выход лучших результатов в терминах потери массы и поддержания массы) по сравнению с
традиционными программами потери массы, которые не учитывают генетическую информацию.
B1
(72)
XP002554347, ISSN: 0029-6651, pages 2, 4-7; figures
1-3; tables 2, 3
WO-A-2005079325
DE LUIS D.A. ET AL.: "Influence of
ALA54THR polymorphism of fatty acid binding
protein 2 on lifestyle modification response in
obese subjects". ANNALS OF NUTRITION &
METABOLISM, vol. 50, no. 4, 2006, pages
354-360, XP008114557, ISSN: 0250-6807, cited in the
application, the whole document
MEMISOGLU ASLI ET AL.: "Interaction
between a peroxisome proliferator-activated receptor
gamma gene polymorphism and dietary fat intake
in relation to body mass". HUMAN MOLECULAR
GENETICS, vol. 12, no. 22, 15 November, 2003
(2003-11-15), pages 2923-2929, XP002554348, ISSN:
0964-6906, cited in the application, the whole
document
MARTI
A.
ET
AL.:
"TRP64ARG
polymorphism of the beta 3-adrenergic receptor gene
and obesity risk: effect modification by a sedentary
lifestyle". DIABETES, OBESITY & METABOLISM.
NOV. 2002, vol. 4, no. 6, November 2002 (2002-11),
pages 428-430, XP002554349, ISSN: 1462-8902, the
whole document
UKKOLA O. ET AL.: "Beta-2 adrenergic
receptor variants are associated with subcutaneous fat
accumulation in response to long-term overfeeding".
INTERNATIONAL JOURNAL OF OBESITY AND
RELATED METABOLIC DISORDERS: JOURNAL
OF THE INTERNATIONAL ASSOCIATION FOR
THE STUDY OF OBESITY. NOV. 2001, vol.
25, no. 11, November 2001 (2001-11), pages
1604-1608, XP002554350, ISSN: 0307-0565, cited in
the application, the whole document
018875
(31) 61/053,888
(32) 2008.05.16
(33) US
(43) 2011.06.30
(86) PCT/US2009/044076
(87) WO 2009/140569 2009.11.19
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ИНТЕРЛЕЙКИН ДЖИНЕТИКС,
ИНК.; ЭКСЕСС БИЗНЕСС ГРУП
ИНТЕРНЭШНЛ ЭлЭлСи (US)
018875
Перекрестная ссылка на родственную заявку
Заявка на данное изобретение испрашивает приоритет даты подачи предварительной заявки на патент США № 61/053888, поданной 16 мая 2008 г, которая включена в данное описание посредством
ссылки во всей своей полноте.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к способам определения метаболического генотипа субъекта и способам
выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни, основанных на метаболическом профиле субъекта и чувствительности к нежелательным проблемам контролирования массы.
Предшествующий уровень техники
В соответствии с сообщением, опубликованным в 1998 г. Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ), ожирение достигло эпидемических размеров во всем мире: примерно 1,7 миллиарда людей во
всем мире имеют избыточную массу тела и 300 миллионов из них страдают ожирением. В США приблизительно 127 миллионов взрослых имеют избыточную массу тела и 69 миллионов страдают ожирением.
У субъектов с ожирением увеличен риск развития одного или нескольких тяжелых заболеваний, включая
диабет, болезнь сердца, высокое кровяное давление и высокий уровень холестерина крови. Распространение ожирения увеличилось более чем вдвое за последние 25 лет и сейчас достигает 31% среди взрослых американцев в возрасте 20 лет и старше. Повышенная частота ожирения наблюдается среди
афроамериканцев и американцев испанского происхождения, особенно среди женщин (30-50%).
Увеличение распространенности ожирения, наблюдаемое во всем мире, в последние десятилетия
происходит в изменяющейся окружающей среде, характеризующейся нарастающим снижением уровня
физической активности и изобилием очень вкусной пищи. Сообщение ВОЗ идентифицировало эти изменения как две принципиальные модифицируемые характеристики современного образа жизни, способствующего ожирению. Тем не менее, несмотря на то что население подвергается воздействию одной и той
же окружающей среды, не каждый становится тучным, что указывает на роль генетического профиля
субъекта в развитии проблем контролирования массы. Таким образом, генетика определяет чувствительность субъекта к развитию ожирения при воздействии неблагоприятных условий окружающей среды, а
также способ, которым он/она могут ответить на диету и физическую нагрузку.
В связи с этим необходимо средство для создания персонализированной программы потери массы,
которая учитывает генетическую чувствительность персоны к ожирению, для того чтобы улучшить результаты потери массы и контролирования массы относительно подобной программы, не учитывающей
генетическую информацию. Существует потребность в средстве для связывания метаболического генотипа субъекта с ответом на диету и/или физическую нагрузку.
Описание здесь недостатков и проблем, ассоциированных с известными способами, не предназначено для ограничения объема вариантов осуществления изобретения, описанных в этом документе для
их исключения.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение предоставляет способы и наборы для определения метаболического генотипа субъекта и выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций
образа жизни субъекта. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предоставляются способы определения метаболического генотипа субъекта, классификации субъекта по одной
или нескольким сериям категорий питания и категорий физической нагрузки, к которым субъект, вероятно, восприимчив, и разъяснение субъекту соответствующего терапевтического/диетического режима
или рекомендаций образа жизни субъекта. Таким путем может быть выбрана персонализированная программа потери массы, основанная на метаболическом генотипе субъекта. Такая персонализированная
программа потери массы будет, очевидно, полезной (например, выход лучших результатов в терминах
потери массы и поддержания массы) по сравнению с традиционными программами потери массы, которые не учитывают генетическую информацию.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта, включающие определение генотипа субъекта в отношении любых двух, любых трех или любых четырех полиморфных локусов, выбранных из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса,
где генотип субъекта в отношении указанных локусов предоставляет информацию об увеличенной чувствительности субъекта к нежелательным проблемам контролирования массы и обеспечивает выбор терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни, которые приемлемы для субъекта, чувствительного к нежелательным проблемам контролирования массы.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта, включающие а) определение генотипа субъекта в отношении FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG
(rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса или ADRB2
(rs1042714; C/G) локуса, где генотип субъекта в отношении указанных локусов предоставляет информа-1-
018875
цию об увеличении чувствительности субъекта к нежелательным проблемам контролирования массы и
обеспечивает выбор терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни, которые
приемлемы для субъекта, чувствительного к нежелательным проблемам контролирования массы.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта, включающие а) определение генотипа субъекта в отношении любых двух, любых трех или любых
четырех полиморфных локусов, выбранных из группы, состоящей из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса,
PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса или
ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса; и б) классификацию генотипа субъекта по категории восприимчивости
к питанию и/или категории восприимчивости к физической нагрузке. После того как генотип субъекта
классифицирован или распределен по категории восприимчивости к питанию и/или категории восприимчивости к физической нагрузке, терапевтический/диетический режим или рекомендации образа жизни
могут быть предложены субъекту, включая, но не ограничиваясь ими, путем выбора соответствующей
диеты и уровня активности, к которым субъект, вероятно, наиболее восприимчив.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта, включающие а) определение генотипа субъекта в отношении FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG
(rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса или ADRB2
(rs1042714; C/G) локуса; и б) классификацию генотипа субъекта по категории восприимчивости к питанию и/или категории восприимчивости к физической нагрузке.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта, включающие а) определение аллельного паттерна по меньшей мере двух, по меньшей мере трех, по
меньшей мере четырех, по меньшей мере пяти, по меньшей мере шести, по меньшей мере семи или по
меньшей мере восьми аллелей, выбранных из следующих: FABP2 SNP rs1799883, аллель 1 (генотип: G;
аминокислота: Ala); FABP2 SNP rs1799883, аллель 2 (генотип: А; аминокислота: Thr); PPARG SNP
rs1801282, аллель 1 (генотип: С; аминокислота: Pro); PPARG SNP rs1801282, аллель 2 (генотип: G; аминокислота: Ala); ADRB3 SNP rs4994, аллель 1 (генотип: Т; аминокислота: Trp); ADRB3 SNP rs4994, аллель 2 (генотип: С; аминокислота: Arg); ADRB2 SNP rs1042713, аллель 1 (генотип: G; аминокислота:
Gly); ADRB2 SNP rs1042713, аллель 2 (генотип: A; аминокислота: Arg); ADRB2 SNP rs1042714, аллель 1
(генотип: С; аминокислота: Gln) и ADRB2 SNP rs1042714, аллель 2 (генотип: G; аминокислота: Glu) локуса, где присутствие аллельного паттерна предсказывает ответ субъекта на диету и/или физическую
нагрузку; и б) выбор терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта,
которые приемлемы для предсказания ответа субъекта на диету и/или физическую нагрузку.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы идентификации метаболического генотипа субъекта, включающие идентификацию генотипа субъекта в отношении по меньшей мере двух, по меньшей мере трех или по меньшей мере четырех из FABP2
(rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2
(rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы идентификации метаболического генотипа субъекта, включающие идентификацию генотипа субъекта в отношении FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса,
ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются наборы, которые включают средство определения генотипа субъекта в отношении генотипа субъекта, в отношении
FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2
(rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса. Набор может также содержать средство
для взятия образцов. Набор может также содержать контрольный образец или положительный, или отрицательный, или стандартный и/или алгоритмическое устройство для оценки результатов и дополнительные реагенты и компоненты.
Наборы по настоящему изобретению могут быть в форме ДНК-теста, который будет использоваться для предоставления рекомендации по диете и физической нагрузке, основанной на генотипе субъекта
в отношении FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса. Информация, предоставляемая генотипом субъекта, может помочь работникам здравоохранения в разработке персонализированных воздействий в виде диеты и физической нагрузки, которые будут улучшать профилактику и лечение ожирения.
Другие варианты осуществления изобретения и преимущества по изобретению изложены в следующем детальном описании и формуле изобретения.
-2-
018875
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Наборы и способы по настоящему изобретению основаны, по меньшей мере частично, на данных,
которые представляют собой ассоциацию между паттернами аллелей некоторых метаболических генов и
восприимчивостью субъекта к конкретной диете и режиму физической нагрузки. То есть существует ассоциация между паттернами аллелей метаболических генов и связанными с контролированием массы
клиническими результатами и фенотипами. Некоторые гены воздействуют различными путями, которые
влияют на массу тела и будут ассоциированы с повышенным риском развития ожирения и их способностью различать ответ субъекта на воздействия на контролирование массы посредством генотипа. Для
целей этого изобретения такие гены будут называться "метаболические гены" или "гены контролирования массы". Эти гены включают, но не ограничиваясь ими, связывающий жирную кислоту белок 2
(FABP2); активируемый пролифератором пероксисом рецептор-гамма (PPARG); бета-2 адренергический
рецептор (ADRB2) и бета-3 адренергический рецептор (ADRB3).
Настоящее изобретение предоставляет Тесты Контролирования Массы для определения "метаболического генотипа" субъекта, которые включают определение генотипа субъекта для одного или нескольких (например, 2, 3, 4 и т.д.) метаболических генов. Результаты такого метаболического генотипирования
могут быть использованы для предсказания восприимчивости субъекта к относительным количествам
макронутриентов и ограничению калорий в диете с или без физической нагрузки для потери массы.
Идентификация генотипа субъекта может быть использована для сопряжения субъекта с изменением
терапии, или изменением диеты, или изменением образа жизни, или их комбинацией для разработки
стратегии достижения и/или поддержания потери массы. Таким образом, в соответствии с некоторыми
вариантами осуществления изобретения результаты генотипирования полиморфизмов (например, однонуклеотидных полиморфизмов или комбинаций) могут быть использованы для определения 1) генетического влияния на воздействия с целью контролирования массы/результатов и 2) восприимчивости к макронутриентам и ограничению энергии в диете с или без физической нагрузки для потери массы.
В совокупности определение генотипа субъекта для одного или нескольких метаболических генов
допускает интерпретации, которые обеспечивают быстродоступную информацию для выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта. Метаболический генотип субъекта определяется по Тесту Контролирования Массы, разработанному для определения паттерна генетического полиморфизма субъекта в отношении одного или нескольких метаболических генов. Путем идентификации соответствующих генных полиморфизмов и результатов генотипического паттерна с помощью теста можно оценивать риск развития наиболее вероятных результатов контролирования массы и предоставлять субъекту руководство по выбору воздействий на питание и образ
жизни, которые соответствуют его персональной генетической модели.
Метаболические гены.
Метаболические гены включают, но не ограничиваясь ими, связывающий жирную кислоту белок 2
(FABP2); активируемый пролифератором пероксисом рецептор-гамма (PPARG); бета-2 адренергический
рецептор (ADRB2) и бета-3 адренергический рецептор (ADRB3). Паттерн генетического полиморфизма
субъекта в отношении одного или нескольких этих генов выявляет метаболический генотип субъекта.
Более предпочтительно метаболический генотип субъекта может быть определен путем идентификации
этого паттерна генетического полиморфизма субъекта в отношении одного или нескольких (т.е. 2, 3, 4
или 5) FABP2 (rs1799883); G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса,
ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
FABP2 rs1799883 (Ala54Thr; G/A) полиморфизм.
Ген FABP2 кодирует тонкокишечную форму связывающего жирную кислоту белка семейства белков, которые регулируют липидный транспорт и метаболизм. Белок FABP2 найден в эпителиальных
клетках тонкой кишки, где он контролирует абсорбцию жира. In vitro форма Thr54 белка показывает в 2
раза большую связывающую аффинность для длинноцепочечных жирных кислот (Baier et al., J. Clin.
Invest. 95:1281-1287, 1995) и показала связь с увеличенной абсорбцией жира в тонкой кишке (Levy et al.
J. Biol. Chem. 276:39679-39684, 2001). Вариант Thr54, таким образом, увеличивает абсорбцию и/или процессинг жирных кислот диеты посредством тонкой кишки и тем самым повышает окисление жира. В
соответствии с самой последней генетической картой ожирения в общей сложности в 5 работах показали
ассоциацию между геном FABP2 и ожирением; в четырех из них с вовлечением полиморфизма Ala54Thr.
Вариант 54Thr был ассоциирован с повышенным BMI [индекс массы тела] и телесным жиром (Hegele et
al., Clin. Endocrinol. Metab. 81:4334-4337, 1996), повышенным уровнем абдоминального жира у японских
мужчин (Yamada et al., Diabetologia. 40:706-710, 1997) и ожирением, а также более высокими уровнями
лептина среди женщин (Albala et al., Obes Res. 12:340-345, 2004).
Множество исследований показало, что полиморфизм Ala54Thr влияет на ответ на изменения поступающего с пищей жира в пробных завтраках. Уровень неэтерифицированных жирных кислот (NEFA)
был на 20% более высоким через 7 ч после принятия пищи с высоким содержанием жира у 54Thr/Thr
гомозиготных субъектов по сравнению с 54Ala/Ala гомозиготами (Pratley et al., J. Lipid. Res. 41:20022008, 2000). После приема внутрь жира также обнаружили аллель 54Thr, ассоциированный с повышенными уровнями постпрандиальных триглицеридов (Agren et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1606-3-
018875
1610, 1998) и жирных кислот с 14-18 углеродной цепью (Agren et al., Am. J. Clin. Nutr. 73:31-35, 2001).
Постпрандиальные метаболические профили после пробных завтраков, обогащенных транс-жирными
кислотами, по сравнению с подобной пищей, обогащенной цис-жирными кислотами, показали, что
субъекты по меньшей мере с одной копией аллеля Thr54 проявляют большее увеличение постпрандиальных уровней глюкозы и липогенеза по сравнению с этими гомозиготами с аллелем Ala54 (Lefevre et al.,
Metabolism. 54:1652-1658, 2005). Анализ группы тучных недиабетических пациентов до и через 3 месяца
после применения программы модификации образа жизни, состоящей из гипокалорийной диеты (1520
ккал/день) и аэробной физической нагрузки три раза в неделю (de Luis D.A. et al., Ann. Nutr. Metab.
50:354-360, 2006) показал, что носители аллеля 54Thr (по сравнению с гомозиготами 54Ala/Ala дикого
типа) не имели значимого снижения жировой массы, уровней LDL-холестерина и уровней лептина. Другие исследования демонстрируют ассоциацию между FABP2 генотипом и потреблением жира диеты с
умеренным потреблением углеводов (Marin et al., Am. J. Clin. Nutr. 82:196-200, 2005; Takakura et al.,
Diabetes. Research and Clinical Practice. 67:36-42, 2005).
PPARG rs1801282 (C/G; Pro12Ala) полиморфизм.
Активируемые пролифератором пероксисом рецепторы (PPAR) являются членами субсемейства
ядерных рецепторов гормонов, относящихся к факторам транскрипции. PPAR-гамма (PPARG) избыточно
экспрессируется в жировых клетках и играет ключевую роль в образовании жировых клеток, в липидном
метаболизме и в развитии диабета типа 2. Мыши с нокаутом гена PPARG теряли способность к развитию
нормальной жировой ткани и при кормлении диетой с высоким содержанием жира показывали сниженный прирост массы и не обнаруживали резистентности к инсулину (Jones et al., PNAS. 102:6207-6212,
2005). Вариант 12Ala ассоциирован со снижением связывающей аффинности рецептора с элементом ответа на PPAR в своих мишенных генах и, таким образом, со снижением своей способности регулировать
экспрессию этих мишенных генов (Deeb et al., Nat. Genet. 20:284-287, 1998). В соответствии с генной
картой ожирения 2006 (Rankinen et al., Obesity. 14:529-644) в общей сложности в 30 работах показали
ассоциацию между геном PPARG и ожирением, и в большинство положительных заключений вовлечен
полиморфизм Pro12Ala.
Большое одномоментное поперечное углубленное исследование Квебекское семейное исследование
(QFS) (Robitaille et al., Clin. Genet. 63:109-116, 2003) показало, что субъекты, несущие аллель12Pro, проявляли большую восприимчивость к количеству жира в диете. Подобное исследование (Memisoglu et al.,
Human Molecular Genetics. 12:2923-2929, 2001) также показало, что 12Pro/Pro субъекты, потреблявшие
высокое количество жира, имели больший индекс массы тела (BMI), чем те, которые потребляли низкое
количество жира. Эта ассоциация между потреблением жира диеты и BMI не наблюдалась у 12Ala носителей, означая снова, что 12Pro/* субъекты являются более чувствительными к количеству жира в диете.
Убедительные данные генотипических различий в ответ на диетическое воздействие получили в финском исследовании профилактики диабета (Lindi et al., Diabetes. 51:2581-2586, 2002). В ответ на 3-летнее
воздействие с вовлечением диеты и физической нагрузки потеря массы была большей у 12Ala/Ala субъектов (-8,3 кг), чем у Pro12Ala субъектов (-4,0 кг), чем у 12Pro/Pro субъектов (-3,4 кг). Исследование
женщин с избыточной массой и ожирением не выявило различий в потере массы между 12Pro/Pro и
12Ala/* носителями в ответ на 6-месячную низкокалорийную диету, но масса, восстанавливаясь в последующий период (один год), становилась больше у женщин с аллелем Ala, чем у женщин, гомозиготных
по аллелю 12Pro. В ответ на это воздействие Ala носители проявляли большее увеличение чувствительности к инсулину и окисление углеводов при голодании и большее снижение окисления липидов при
голодании (Nicklas et al., Diabetes. 50:2172-2176, 2001).
12Pro/Pro субъекты (более часто встречающийся генотип) являются более чувствительными к количеству жира в диете, более резистентными к потере массы и имеют повышенный риск развития диабета.
Данные взаимодействия ген-диета являются убедительными для этого гена. Данные исследований по
воздействию диеты указывают на большую метаболическую гибкость в запасании и мобилизации жира у
12Ala носителей, что совпадает с исследованиями, показывающими увеличение BMI, большую потерю
массы в ответ на воздействие и большую чувствительность к инсулину, и сниженный риск развития диабета. Таким образом, исследования согласуются, показывая, что аллель 12Pro является аллелем высокого
риска.
ADRB2 rs1042713 (G/A; Arg16Gly) и ADRB2 rs1042714 (C/G: Gln27Glu) полиморфизм.
Бета-2 адренергический рецептор (ADRB2) является доминирующей формой рецептора, экспрессируемого в жировых клетках, который играет ключевую роль в разложении жира жировыми клетками для
образования энергии в ответ на катехоламины. Были идентифицированы некоторые полиморфизмы этого
гена, которые приводят к аминокислотным изменениям, с использованием полиморфизмов Arg16Gly и
Gln27Glu, наиболее распространенных у европейцев, и теми, которые были наиболее часто исследованы
в отношении ожирения. Два полиморфизма находятся в сильном неравновесном сцеплении (Meirhaeghe
et al., Int. J. Obesity. 24:382-87, 2000). In vitro исследование рекомбинантной экспрессии этих рецепторов
в фибробластах китайского хомячка показало функциональное воздействие двух полиморфизмов (Green
et al., Biochemistry. 33:9414-9419, 1994). По сравнению с их соответствующими нормальными аллелями
аллель 16Gly ассоциировался с увеличенной отрицательной регуляцией экспрессии ADRB2 в ответ на
-4-
018875
обработку агонистом (изопротеранол) и 27Glu ассоциировался с некоторым увеличением (т.е. резистентность к отрицательной регуляции) экспрессии ADRB2. Интересно, что комбинация обоих мутантных
аллелей (16Gly и 27Glu) приводит к увеличению отрицательной регуляции рецепторной продукции. В
соответствии с последней генной картой ожирения (Rankinen et al., The human obesity gene map: The 2005
update. Obesity 14:529-644), в общей сложности в 20 работах показали ассоциацию между геном ADRB2
и ожирением с большинством положительных заключений с вовлечением полиморфизмов Arg16Gly или
Gln27Glu и некоторыми указаниями на то, что существует сильная ассоциация с аллелем 27Glu. В некоторых исследованиях продемонстрировали половые различия при риске развития ожирения с этими полиморфизмами (Hellstrom et al., J. Intern. Med. 245:253-259, 1999; Garenc et al., Obes Res. 11:612-618,
2003), но подавляющее большинство данных не способствует получению пол-специфических интерпретаций генотипа в этой панели.
Множество исследований показали, что аллель 27Glu обнаружил положительную ассоциацию с абдоминальным ожирением (Lange et al., Int. J. Obes (Lond), 29:449-457, 2005; Gonzales et al., Clin. Endocrinol. (Oxf), 59:476-481, 2003), a также в исследованиях рассмотрели аллели 27Glu и 16Gly в отношении
риска развития ожирения и увеличения жировой массы (Masuo et al., Am. J. Hypertens, 19:1084-91, 2006).
Лонгитудинальное исследование показало, что прирост массы у детей и подростков (Ellsworth et al., Int.
J. Obes Relat. Metab. Disord. 26:928-937, 2002) и прирост массы в процессе полового созревания (Masuo et
al., Circulation. 111:3429-3434, 2005; van Rossum et al., Int. J. Obes Relat. Metab. Disord. 26:517-528, 2002)
были выше у субъектов, которые несли аллель 16Gly по сравнению с 16Arg/Arg субъектами.
Увеличение риска развития ожирения (OR=2,56) обнаружили у 27Gln/Glu женщин с высоким уровнем потребления углеводов (СНО >49% от общего потребления энергии), тогда как не наблюдали ассоциации у 27Gln/Gln женщин (Martinez et al., J. Nutr. 133:2549-2554, 2003). В некоторых случаях на основе
аллельных интерпретаций для определения наилучшего полиморфизма и аллеля делали выбор диеты,
исходя из исследований противоположного воздействия (избыточное питание) и выбора противоположного аллеля. Например, результаты исследования избыточного питания (свыше 1000 ккал/день в течение
100 дней), выполненные на парах однояйцевых близнецов-мужчин, показали, что 27Gln/Gln субъекты
набирали большую массу и подкожный жир, чем носители аллеля 27Glu (Ukkola et al., Int. J. Obes Relat.
Metab. Disord. 25:1604-1608, 2001). Исследования избыточного питания у японских мужчин, внесенных в
24-месячную программу потери массы (низкокалорийная диета, 1600 ккал/день и аэробная физическая
нагрузка 1 ч ежедневно), показали высокую частоту 1 аллеля 6Gly у мужчин, резистентных к потере массы (определяли как изменение BMI менее чем 10%; n81), и тех, кто восстанавливал массу тела после успешной первоначальной потери массы за 6 месяцев (Masuo et al., Circulation. 111:3429-3434, 2005). Женщины, которые были более активными во время своего досуга и являлись носителями аллеля 27Glu, имели повышенный BMI по сравнению с неносителями, что указывает на то, что эти женщины могут быть
более резистентными к потере массы (Corbalan et al., Clin. Genet. 61:305-307, 2002).
ADRB3 rs4994 (C/T; Arg64Trp) полиморфизм.
Адренергический бета-3 рецептор (ADRB3) вовлечен в регуляцию липолиза в белой жировой ткани
и экспрессируется в основном в висцеральной жировой ткани, жировом депо, которое тесно связано с
родственными ожирению метаболическими осложнениями. In vitro исследования на изолированных адипоцитах показали, что мутация приводит к ухудшению липолиза в ответ на специфический агонист в
клетках, несущих аллель 64Arg. (Umekawa et al., Diabetes. 48:117-120, 1999). Обнаружено, что гаплотип,
образованный тремя вариантами гена ADRB3, включая вариант 64Arg, ассоциируется с повышенным
BMI (n=208) и с 10-кратным уменьшением чувствительности (индуцированный липолиз) висцеральных
адипоцитов к селективному β3-рецепторному агонисту (Hoffstedt et al., Diabetes. 48:203-205, 1999). Три
варианта находятся в неравновесном сцеплении, которое указывает на то, что вариант 64Arg ассоциирован с пониженной рецепторной функцией. В общей сложности в 29 работах показали ассоциацию между
геном ADRB3 и ожирением. В одном мета-анализе, основанном на 31 исследовании с участием более
чем 9000 субъектов, показали повышенный BMI (0,30 кг/м2 выше среднего) у носителей варианта 64Arg
по сравнению с гомозиготными 64Trp/Trp субъектами (Fujisawa et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83:24412444, 1998). Во втором мета-анализе, основанном более чем на 6500 субъектах (главным образом японцев), 22 исследования также показали повышенные значения BMI у носителей варианта 64Arg (0,26 кг/м2
выше среднего) по сравнению с неносителями (Kurokawa et al., Obes Res. 9:741-745, 2001).
В исследовании методом случай-контроль (158 тучных, 154 с нормальной массой) показали повышенный риск развития ожирения (OR=2,98) у 64Arg носителей (повышенный BMI) только среди субъектов с малоподвижным образом жизни, но не у физически активных субъектов, у которых генотипических
различий по BMI не обнаружили (Marti et al., Diabetes. Obes Metab. 4:428-430, 2002). Исследования 61
тучной женщины с диабетом типа 2, которых подвергли 3-месячному воздействию комбинированной
низкокалорийной диеты и физической нагрузке, показали, что женщины с вариантом 64Arg теряли
меньше массы (4,6 кг против 8,3 кг) и массы тела (1,9 кг/м2 против 3,4 кг/м2), чем 64Trp/Trp женщины
(Sakane et al., Diabetes. Care. 20:1887-1890, 1997). Исследования, выполненные на 76 перименопаузных
женщинах, которых подвергли 3-месячному воздействию комбинированной физической нагрузки и диеты, показали, что 48% женщин с вариантом 64Arg теряли массу по сравнению с 69% женщин без этого
-5-
018875
варианта (Shiwaku et al., Int. J. Obes Relat. Metab. Disord. 27:1028-1036, 2003). Эти два исследования указывают на то, что вариант ассоциирован с трудностью потери массы посредством диеты и физической
нагрузки. Исследование (Phares et al., Obes Res. 12:807-815, 2004), выполненное на 29 мужчинах и 41
женщине, показало, что ADRB3 64Arg носители претерпели большую потерю жировой массы и жира
туловища после 24 недель контролируемой аэробной физической подготовки по сравнению с неносителями. Эти результаты, по-видимому, демонстрируют противоположный аллельный ответ на физическую
нагрузку, но уровень физической нагрузки в этом исследовании режима представлял собой более силовую контролируемую тренировку на выносливость. Интерпретация генотипических различий в ответ на
физическую нагрузку может быть далее осложнена во многих исследованиях, потому что состояние
ожирения может быть отягощающим фактором, маскирующим умеренные эффекты варианта потребления энергии (Tchernov et al., Diabetes. 48:1425-1428, 1999).
Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается
способ идентификации метаболического генотипа субъекта, включающий идентификацию генотипа
субъекта в отношении одного или нескольких (т.е. 2, 3 или 4) FABP2 локуса, PPARG локуса, ADRB3
локуса и/или ADRB2 локуса. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения
предлагается способ идентификации метаболического генотипа субъекта, включающий идентификацию
генотипа субъекта в отношении оценки генотипа субъекта с одним или несколькими (т.е. 2, 3, 4 или 5)
FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2
(rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ идентификации однонуклеотидного полиморфизма метаболического генотипа субъекта, включающий идентификацию генотипа в отношении аллеля метаболического гена, выбранного из группы, состоящей из
FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2
(rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ идентификации композитного метаболического генотипа субъекта, включающий идентификацию генотипа в
отношении по меньшей мере двух аллелей метаболического гена, выбранного из группы, состоящей из
FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2
(rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ идентификации метаболического генотипа субъекта, включающий идентификацию композитного полиморфного генотипа в отношении по меньшей мере трех аллелей метаболического гена, выбранного из группы,
состоящей из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ идентификации метаболического генотипа субъекта, включающий идентификацию композитного полиморфного генотипа в отношении по меньшей мере четырех аллелей метаболического гена, выбранного из
группы, состоящей из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994;
С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ идентификации метаболического генотипа субъекта, включающий идентификацию композитного полиморфного генотипа в отношении каждого из аллелей метаболического гена FABP2 (rs1799883; G/A) локуса,
PPARG (rs1801282; C/G) локуса, ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и/или
ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
Результаты по однонуклеотидному полиморфизму метаболического генотипа субъекта и/или композитного метаболического генотипа могут быть классифицированы в соответствии с 1) их связями с
риском контролирования массы, включая формирование результата "меньшая восприимчивость" или
"большая восприимчивость" к воздействиям диеты и/или физической нагрузки; 2) их результатами, ассоциированными с клиническим или связанным со здоровьем биомаркером; 3) их связям с выбором воздействия на контролирование массы и 4) распространенностью каждого генотипа. Табл. 1 и 2 определяют аллели некоторых метаболических генов и объясняют повышенный риск развития чувствительности
к некоторым метаболическим нарушениям/параметрам.
-6-
018875
Таблица 1
Метаболический ген/полиморфизм субъекта
*Pop. Freq = популяционная частота, определенная для европейцев с использованием базы данных Квебекского Семейного Исследования QFS.
-7-
018875
Таблица 2
Карта предрасположенности субъекта, основанная на метаболическом генотипе
-8-
018875
-9-
018875
**BMI = индекс массы тела, TG = триглицериды, Абд. жир = абдоминальный жир, BS = сахара крови, TNFα = фактор некроза опухоли альфа, RMR = метаболический темп покоя,
HDL = липопротеины высокой плотности.
***Метаболизм, питание и воздействия физической нагрузки.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы и наборы для измерения уровней липидов крови у субъекта для выбора или скрининга субъектов для соответствующего терапевтического или диетического воздействия или изменения образа жизни. Изобретение предлагается для измерения HDL, LDL и/или триглицеридов субъекта. Полагают, что субъект имеет
аномальный липидный профиль или дислипидемию, когда при скринировании имеет пониженный уровень HDL, примерно 40 мг/дл или ниже для мужчин и 50 мг/дл или ниже для женщин, или повышенный
уровень LDL, примерно 100 мг/дл или выше, или повышенный уровень триглицеридов, примерно
150 мг/дл или выше, или любую их комбинацию.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения пониженный уровень HDL
составляет 20-60, или 50-59, или 40-49, или 30-39, или <30 мг/дл; повышенный уровень LDL составляет
от 100 до >190, или 100-129, или 130-159, или 160-190, или >190 мг/дл; и повышенный уровень триглицерида составляет от 150 до >500, или 150-199, или 200-500, или >500 мг/дл.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекты могут быть скринированы в клинических исследованиях по ответу на стратегию контролирования массы или терапевтические воздействия, включающие идентификацию субъектов по их аллельному профилю и/или композитным генотипам по этому изобретению и предсказание их ответа на рекомендованные терапию/диету/образ жизни или их комбинацию с использованием их предсказанных уровней HDL или LDL,
или триглицеридов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы и наборы для скрининга субъектов в клинических исследованиях по контролированию массы, где субъект с
недостаточной массой имеет BMI <18,5; субъект с избыточной массой - в диапазоне 25-29,9, субъект с
ожирением - 30-39,9, BMI >40,0 считается крайней степенью ожирения. Идентификация метаболического генотипа у этих субъектов может предоставить работникам здравоохранения средства для рассмотрения затруднений субъекта с BMI 25 для достижения BMI 22 с использованием только низкокалорийной
диеты.
Табл. 3 предоставляет данные по этническому распространению некоторых метаболических генотипов.
- 10 -
018875
Распространение паттернов генотип/риск
Таблица 3
по этническому признаку
= указывает риск генотипа(ов).
Комбинации этих генных вариантов влияют на 1) ответ субъектов на специфические макронутриенты в их диете и 2) их различные тенденции в энергетическом метаболизме, которые, в конечном счете,
влияют на их способность к поддержанию или потере массы посредством физической нагрузки. Определение метаболического генотипа поможет здоровым субъектам идентифицировать генетический риск
развития неблагоприятных проблем контролирования массы, которые еще не проявляются. Знание связанных с генами рисков может содействовать своевременному принятию персонализированных решений
по здоровью (питание, образ жизни) для защиты здоровья в будущем, а также предоставляет направление
оптимального определения приоритетов субъекта с фокусированием внимания на выборе питания и образе жизни для контролирования оптимальной массы тела и состава тела.
Информация, полученная по метаболическому генотипу субъекта, может быть использована для
предсказания генетического риска субъекта в отношении неблагоприятных проблем контролирования
массы. Генотип субъекта может быть использован для оценки риска и предусматривает выбор соответствующих рекомендаций терапевтического/диетического режима или образа жизни. Идентификация генотипа субъекта может быть использована для сопряжения субъекта с изменением терапии, или изменением диеты, или изменением образа жизни, или комбинации из любых двух или трех для разработки стратегии достижения и/или поддержания потери массы. В общем, аллельный паттерн одного или нескольких метаболических генов субъекта может быть использован для классификации предсказанной восприимчивости субъекта к макронутриентам и ограничению энергии в диете с или без физической нагрузки в
программе контролирования потери массы. Соответственно персонализированная программа контролирования потери массы может быть выбрана для субъекта на основе предсказанного ответа субъекта. Например, программа контролирования потери массы может классифицировать метаболический генотип
субъекта в одну из серий категорий питания и одну из серий категорий физической нагрузки, основанные на предрасположенности субъекта к восприимчивости определенных макронутриентов и степени
физической нагрузки. Категория питания, категория физической нагрузки или их комбинация могут быть
выбраны для субъекта на основе генетических паттернов субъекта.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ выбора
соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта,
включающий определение генотипа субъекта в отношении любого из четырех полиморфных локусов,
- 11 -
018875
выбранных из группы, состоящей из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса,
ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса, где генотип субъекта в отношении указанных локусов предоставляет информацию о повышенной чувствительности субъекта к неблагоприятным проблемам контролирования массы и допускает выбор терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни, которая приемлема для чувствительности субъекта к неблагоприятным проблемам контролирования массы.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом FABP2 (rs1799883) 1.1, PPARG (rs1801282) 1.1, ADRB2 (rs1042714) 1.1 и ADRB2
(rs1042713) 2.2 и ADRB3 (rs4994) 1.1 предсказывается восприимчивость к низкожировой или низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 или 1.2 и PPARG (rs1801282) 1.1 и дополнительно одного из ADRB2 (rs1042714) 1.1, 1.2 или 2.2 в комбинации с ADRB2 (rs1042713) 2.2 и ADRB3 (rs4994) 1.1
предсказывается восприимчивость к низкожировой ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 или 2.2 и/или одного из ADRB2 (rs1042714) 1.2 или 2.2
в комбинации с ADRB2 (rs1042713) 2.2 и ADRB3 (rs4994) 1.1 предсказывается восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 или 2.2 и одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 или 1.2 в
комбинации с ADRB2 (rs1042713) 2.2 и ADRB3 (rs4994) 1.1 предсказывается восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом FABP2 (rs1799883) 1.1 и PPARG (rs1801282) 1.1 в комбинации с одним из ADRB2
(rs1042713) 1.2 или 1.1 или одним из ADRB3 (rs4994) 1.2 или 2.2 предсказывается восприимчивость к
низкожировой или низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете. В соответствии с некоторыми
вариантами осуществления изобретения субъекту далее предсказывается меньшая восприимчивость к
регулярной физической нагрузке.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 или 1.2 и PPARG (rs1801282) 1.1 в комбинации с одним
из ADRB2 (rs1042714) 1.1, 1.2 или 2.2 и любым одним из ADRB2 (rs1042713) 1.1 или 1.2 или одним из
ADRB3 (rs4994) 1.2 или 2.2 предсказывается восприимчивость к низкожировой ограниченной по калориям диете. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту далее предсказывается меньшая восприимчивость к регулярной физической нагрузке.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 или 2.2 и/или одного из ADRB2 (rs1042714) 1.2 или 2.2
в комбинации с одним из ADRB2 (rs1042713) 1.1 или 1.2 или одним из ADRB3 (rs4994) 1.2 или 2.2 предсказывается восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете. В соответствии с
некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту далее предсказывается меньшая восприимчивость к регулярной физической нагрузке.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 или 2.2 и одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 или 1.2 в
комбинации с одним из ADRB2 (rs1042713) 1.1 или 1.2 или одним из ADRB3 (rs4994) 1.2 или 2.2 предсказывается восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете. В соответствии с
некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту далее предсказывается меньшая восприимчивость к регулярной физической нагрузке.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения терапевтический/диетический режим включает введение нутрицевтика.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения способы, упомянутые выше,
далее включают классификацию субъекта в отношении вероятной пользы терапевтического/диетического режима или изменения образа жизни.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета по способам, описанным выше, предоставляет не более чем примерно 35% общих калорий за счет жира.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета по
способам, описанным выше, предоставляет не более чем примерно 50% общих калорий за счет углеводов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения ограниченная по калориям
диета по способам, описанным выше, предоставляет ограничение общих калорий до менее чем 95% от
уровня контролирования массы субъекта.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ идентификации метаболического генотипа субъекта, включающий идентификацию генотипа субъекта в от- 12 -
018875
ношении по меньшей мере трех из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса,
ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ идентификации метаболического генотипа субъекта, включающий идентификацию генотипа субъекта в отношении по меньшей мере четырех из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса, PPARG (rs1801282; C/G) локуса,
ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса, ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются способы выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта, включающие а) определение генотипа субъекта в отношении любого из четырех полиморфных локусов, выбранных из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса; PPARG (rs1801282; C/G) локуса; ADRB3 (rs4994;
С/Т) локуса; ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса; и б) классификацию
субъекта по категории питания и/или категории физической нагрузки, для которых субъекту предсказано
получение вероятной пользы, где категория питания выбрана из низкожировой диеты; низкоуглеводистой диеты; высокобелковой диеты и ограниченной по калориям диеты и где категория физической нагрузки выбрана из легкой физической нагрузки; нормальной физической нагрузки и силовой физической
нагрузки.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ выбора
соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта,
включающий а) определение аллельного паттерна по меньшей мере двух аллелей, выбранных из группы,
состоящей из FABP2 (rs1799883) аллель 1 (Ala или G), FABP2 (rs1799883) аллель 2 (Thr или A), PPARG
(rs1801282) аллель 1 (Pro или С), PPARG (rs1801282) аллель 2 (Ala или G), ADRB3 (rs4994) аллель 1 (Trp
или Т), ADRB3 (rs4994) аллель 2 (Arg или С), ADRB2 (rs1042713) аллель 1 (Gly или G), ADRB2
(rs1042713) аллель 2 (Arg или A), ADRB2 (rs1042714) аллель 1 (Gln или С) и ADRB2 (rs1042714) аллель 2
(Glu или G), где присутствие аллельного паттерна предсказывает ответ субъекта на диету и/или физическую нагрузку, и б) выбор терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни, которые приемлемы для предсказанного ответа субъекта на диету и/или физическую нагрузку.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом FABP2 (rs1799883) 1.1 (Ala/Ala или G/G), PPARG (rs1801282) 1.1 (Pro/Pro или С/С),
ADRB2 (rs1042714) 1.1 (Gln/Gln или С/С) и ADRB2 (rs1042713) 2.2 (Arg/Arg или А/А), и ADRB3 (rs4994)
1.1(Trp/Trp или Т/Т) предсказывается восприимчивость к низкожировой или низкоуглеводистой, ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 (Ala/Ala или G/G) или 1.2 (Ala/Thr или G/A) и PPARG
(rs1801282) 1.1 (Pro/Pro или С/С) и дополнительно одного из ADRB2 (rs1042714) 1.1 (Gln/Gln или С/С),
1.2 (Gln/Glu или C/G) или 2.2 (Glu/Glu или G/G) в комбинации с ADRB2 (rs1042713) 2.2 (Arg/Arg или
A/A) и ADRB3 (rs4994) 1.1 (Trp/Trp или Т/Т) предсказывается восприимчивость к низкожировой ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 (Pro/Ala C/G) или 2.2 (Ala/Ala или G/G) и/или одного из
ADRB2 (rs1042714) 1.2 (Gln/Glu или C/G) или 2.2 (Glu/Glu или G/G) в комбинации с ADRB2 (rs1042713)
2.2 (Arg/Arg или А/А) и ADRB3 (rs4994) 1.1 (Trp/Trp или Т/Т) предсказывается восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 (Pro/Ala или C/G) или 2.2 (Ala/Ala или G/G) и одного из
FABP2 (rs1799883) 1.1 (Ala/Ala или G/G) или 1.2 (Ala/Thr или G/A) в комбинации с ADRB2 (rs1042713)
2.2 (Arg/Arg или А/А) и ADRB3 (rs4994) 1.1 (Trp/Trp или Т/Т) предсказывается восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом FABP2 (rs1799883) 1.1 (Ala/Ala или G/G) и PPARG (rs1801282) 1.1 (Pro/Pro или С/С) в
комбинации с одним из ADRB2 (rs1042713) 1.2 (Glu/Arg или G/A) или 2.2 (Arg/Arg или А/А) или одним
из ADRB3 (rs4994) 1.2 (Arg/Trp или Т/С) или 2.2 (Arg/Arg или С/С) предсказывается восприимчивость к
низкожировой или низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете. В соответствии с некоторыми
вариантами осуществления изобретения субъекту далее предсказывается меньшая восприимчивость к
регулярной физической нагрузке.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 (Ala/Ala или G/G) или 1.2 (Ala/Thr или G/A) и PPARG
(rs1801282) 1.1 (Pro/Pro или С/С) в комбинации с ADRB2 (rs1042714) 1.1 (Gln/Gln или С/С), 1.2 (Gln/Glu
или C/G) или 2.2 (Glu/Glu или G/G) и любым одним из ADRB2 (rs1042713) 1.1 (Gly/Gly или G/G) или 1.2
(Gly/Arg или G/A) или одним из ADRB3 (rs4994) 1.2 (Trp/Arg или Т/С) или 2.2 (Arg/Arg или С/С) предсказывается восприимчивость к низкожировой ограниченной по калориям диете. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту далее предсказывается меньшая восприимчивость к регулярной физической нагрузке.
- 13 -
018875
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 (Pro/Ala или C/G) или 2.2 (Ala/Ala или G/G) и/или одного из ADRB2 (rs1042714) 1.2 (Gln/Gln или C/G) или 2.2 (Glu/Glu или G/G) в комбинации с одним из
ADRB2 (rs1042713) 1.1 (Gly/Gly или G/G) или 1.2 (Gly/Arg или G/A) или одним из ADRB3 (rs4994) 1.2
(Trp/Arg или Т/С) или 2.2 (Arg/Arg или С/С) предсказывается восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения
субъекту далее предсказывается меньшая восприимчивость к регулярной физической нагрузке.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 (Pro/Ala или C/G) или 2.2 (Ala/Ala или G/G) и одного из
FABP2 (rs1799883) 1.1 (Ala/Ala или G/G) или 1.2 (Ala/Thr или G/A) в комбинации с одним из ADRB2
(rs1042713) 1.1 (Gly/Gly или G/G) или 1.2 (Gly/Arg или G/A) или одним из ADRB3 (rs4994) 1.2 (Trp/Arg
или Т/С) или 2.2 (Arg/Arg или С/С) предсказывается восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъекту
далее предсказывается меньшая восприимчивость к регулярной физической нагрузке.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагается способ предсказания субъекту генетического риска развития нежелательных проблем контролирования массы,
включающий определение паттерна генетического полиморфизма, включающего по меньшей мере два
аллеля, выбранных из группы, состоящей из FABP2 (rs1799883) аллель 1 (Ala или G), FABP2 (rs1799883)
аллель 2 (Thr или А), PPARG (rs1801282) аллель 1 (Pro или С), PPARG (rs1801282) аллель 2 (Ala или G),
ADRB3 (rs4994) аллель 1 (Trp или Т), ADRB3 (rs4994) аллель 2 (Arg или С), ADRB2 (rs1042713) аллель 1
(Gly или G), ADRB2 (rs1042713) аллель 2 (Arg или A), ADRB2 (rs1042714) аллель 1 (Gln или С) и ADRB2
(rs1042714) аллель 2 (Glu или G), где присутствие паттерна генетического полиморфизма предсказывает
ответ субъекта на диету и/или физическую нагрузку.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения терапевтический/диетический режим включает введение нутрицевтика.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения способы, упомянутые выше,
далее включают классификацию субъекта в отношении вероятной пользы терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета по способам, описанным выше, предоставляет не более чем примерно 35% общих калорий за счет жира.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета по
способам, описанным выше, предоставляет не более чем примерно 50% общих калорий за счет углеводов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения ограниченная по калориям
диета по способам, описанным выше, предоставляет ограничение общих калорий до менее чем 95% от
уровня контролирования массы субъекта.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются наборы, включающие а) реагенты для определения генотипа субъекта в отношении любых четырех полиморфных локусов, выбранных из следующих: FABP2 (rs1799883; G/A) локуса; PPARG (rs1801282; C/G) локуса;
ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса; ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса; и б)
инструкции для определения метаболического генотипа субъекта и средство классификации субъекта по
категории питания и/или категории физической нагрузки, для которых субъекту предсказывается получение вероятной пользы, где категория питания выбрана из группы, состоящей из низкожировой диеты;
низкоуглеводистой диеты; высокобелковой диеты и ограниченной по калориям диеты, и где категория
физической нагрузки выбрана из группы, состоящей из легкой физической нагрузки; нормальной физической нагрузки и силовой физической нагрузки.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения набор далее классифицирует
субъекта в отношении вероятной пользы терапевтического/диетического режима или изменения образа
жизни.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения набор, включающий реагенты для генотипирования субъекта с комбинированным генотипом FABP2 (rs1799883) 1.1, PPARG
(rs1801282) 1.1, ADRB2 (rs1042714) 1.1 и ADRB2 (rs1042713) 2.2 и ADRB3 (rs4994) 1.1 предсказывает
восприимчивость к низкожировой или низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете; регулярной
физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения набор, включающий реагенты для генотипирования субъекта с комбинированным генотипом одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 или
1.2 и PPARG (rs1801282) 1.1 и дополнительно одного из ADRB2 (rs1042714) 1.1, 1.2 или 2.2 в комбинации с ADRB2 (rs1042713) 2.2 и ADRB3 (rs4994) 1.1, предсказывает восприимчивость к низкожировой
ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения набор, включающий реагенты для генотипирования субъекта с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 или
2.2 и/или одного из ADRB2 (rs1042714) 1.2 или 2.2 в комбинации с ADRB2 (rs1042713) 2.2 и ADRB3
- 14 -
018875
(rs4994) 1.1, предсказывает восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете; регулярной физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения набор, включающий реагенты для генотипирования субъекта с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 или
2.2 и одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 или 1.2 в комбинации с ADRB2 (rs1042713) 2.2 и ADRB3 (rs4994)
1.1, предсказывает восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете; регулярной
физической нагрузке или тому и другому.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения набор, включающий реагенты для генотипирования субъекта с комбинированным генотипом одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 и
PPARG (rs1801282) 1.1 в комбинации с одним из ADRB2 (rs1042713) 1.2 и/или 1.1 или одним из ADRB3
(rs4994) 1.2 или 2.2, предсказывает восприимчивость к низкожировой или низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения набор, включающий реагенты для генотипирования субъекта с комбинированным генотипом одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 или
1.2 и PPARG (rs1801282) 1.1 в комбинации с одним из ADRB2 (rs1042714) 1.1, 1.2 или 2.2 и любым одним из ADRB2 (rs1042713) 1.1 или 1.2 или одним из ADRB3 (rs4994) 1.2 или 2.2, предсказывает восприимчивость к низкожировой ограниченной по калориям диете.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения набор, включающий реагенты для генотипирования субъекта с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 или
2.2 и/или одного из ADRB2 (rs1042714) 1.2 или 2.2 в комбинации с одним из ADRB2 (rs1042713) 1.1 или
1.2 или одним из ADRB3 (rs4994) 1.2 или 2.2, предсказывает восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения набор, включающий реагенты для генотипирования субъекта с комбинированным генотипом одного из PPARG (rs1801282) 1.2 или
2.2 и одного из FABP2 (rs1799883) 1.1 или 1.2 в комбинации с одним из ADRB2 (rs1042713) 1.1 или 1.2
или одним из ADRB3 (rs4994) 1.2 или 2.2, предсказывает восприимчивость к низкоуглеводистой ограниченной по калориям диете.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются наборы, включающие реагенты и инструкции для определения метаболического генотипа субъекта, включающие
идентификацию генотипа субъекта в отношении по меньшей мере четырех из FABP2 (rs1799883; G/A)
локуса; PPARG (rs1801282; C/G) локуса; ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса; ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса
и/или ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются наборы, включающие реагенты и инструкции для определения метаболического генотипа субъекта, включающие
идентификацию генотипа субъекта в отношении по меньшей мере трех из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса; PPARG (rs1801282; C/G) локуса; ADRB3 (rs4994; С/Т) локуса; ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и/или
ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса.
Категории питания.
Категории питания, в общем, классифицируются на основе количества макронутриентов (т.е. жир,
углеводы, белок), рекомендованных субъекту на основании метаболического генотипа субъекта. Основная цель выбора соответствующего терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа
жизни субъекта состоит в сопряжении метаболического генотипа субъекта с категорией питания, такой,
к которой субъект вероятнее всего восприимчив. Категория питания, в общем, выражается в терминах
относительных количеств макронутриентов, предлагаемых для диеты субъекта, или в терминах ограничения калорий (например, ограничение общего числа калорий, получаемых субъектом, и/или ограничение числа калорий, получаемых субъектом от конкретного макронутриента). Например, категории питания могут включать, но не ограничиваясь ими, 1) низкожировые, низкоуглеводистые диеты, 2) низкожировые диеты или 3) низкоуглеводистые диеты. С другой стороны, категории питания могут быть классифицированы на основе ограничения некоторых макронутриентов, рекомендованных субъекту на основании метаболического генотипа субъекта. Например, категории питания могут быть выражены в виде
1) сбалансированных или ограниченных по калориям диет; 2) ограниченных по жиру диет или 3) ограниченных по углеводам диет.
Субъекты с метаболическим генотипом, которые восприимчивы к ограничению жира или низкожировой диете, проявляют тенденцию к абсорбции большего количества жира диеты в организме и имеют
замедленный метаболизм. Они проявляют большую тенденцию к приросту массы. Клинические исследования показали, что у этих субъектов более ранее время достижения массы здорового организма за счет
снижения общего жира диеты. Они могут с большим успехом терять массу под влиянием последующей
сниженной по жиру и/или сниженной по калориям диете. Кроме того, они получают пользу от замещения насыщенных жиров на мононенасыщенные жиры в сниженной по калориям диете. Клинические исследования также показали, что такие же диетические модификации улучшают способность организма
метаболизировать сахара и жиры.
- 15 -
018875
Субъекты с метаболическим генотипом, которые восприимчивы к углеводному ограничению или
низкоуглеводистой диете, проявляют тенденцию к большей чувствительности к приросту массы вследствие избыточного потребления углеводов. Они могут с большим успехом терять массу за счет снижения
углеводов в сниженной по калориям диете. Субъекты с этим генетическим паттерном склонны к ожирению и испытывают трудности с регуляцией сахара крови, если их суточное потребление углеводов является высоким, такое как суточное превышение потребления углеводов, в частности, например, 49% общих калорий. Было показано, что снижение углеводов оптимизирует регуляцию сахара крови и снижает
риск дальнейшего прироста массы. Если они содержат высокий уровень насыщенных и низкий уровень
мононенасыщенных жиров в своей диете, риск прироста массы и повышения сахара крови увеличивается. В то время как ограничение общих калорий для этих субъектов может быть полезным вследствие ограничения потребления общих углеводов и сдвига жирового состава их диеты к мононенасыщенным
жирам (например, диета с низким содержанием насыщенного жира и низким содержанием углевода).
Субъекты с метаболическим генотипом, которые восприимчивы к балансу жира и углевода, не проявляют согласованной потребности в низкожировой или низкоуглеводистой диете. У этих субъектов
ключевые биомаркеры, такие как масса тела, телесный жир и профиль липидов плазмы, хорошо отвечают на диету, сбалансированную по жиру и углеводу. Для субъектов с этим генетическим паттерном, которые заинтересованы в потере массы, установлено, что сбалансированная диета, ограниченная по калориям, стимулирует потерю массы и снижение телесного жира.
Низкожировая диета относится к диете, которая обеспечивает между примерно 10% и менее чем
примерно 40% общих калорий за счет жира. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления
изобретения низкожировая диета относится к диете, которая обеспечивает не более чем примерно 35%
(например, не более чем примерно 19, 21, 23, 22, 24, 26, 28, 33% и т.д.) общих калорий за счет жира. В
соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета относится к
диете, которая обеспечивает не более чем примерно 30% общих калорий за счет жира. В соответствии с
некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета относится к диете, которая
обеспечивает не более чем примерно 25% общих калорий за счет жира. В соответствии с некоторыми
вариантами осуществления изобретения низкожировая диета относится к диете, которая обеспечивает не
более чем примерно 20% общих калорий за счет жира. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета относится к диете, которая обеспечивает не более чем примерно 15% общих калорий за счет жира. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета относится к диете, которая обеспечивает не более чем примерно 10% общих калорий за счет жира.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета относится к диете, которая содержит между примерно 10 и примерно 60 г жира в день. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета относится к диете, которая содержит менее чем примерно 50 г (например, менее чем примерно 10, 25, 35, 45 г и т.д.) жира в день. В
соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета относится к
диете, которая содержит менее чем примерно 40 г жира в день. В соответствии с некоторыми вариантами
осуществления изобретения низкожировая диета относится к диете, которая содержит менее чем примерно 30 г жира в день. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета относится к диете, которая содержит менее чем примерно 20 г жира в день.
Жиры содержат как насыщенные, так и ненасыщенные (мононенасыщенные и полиненасыщенные)
жирные кислоты. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения снижение насыщенного жира менее чем на 10% калорий представляет собой диету, низкую по содержанию насыщенного жира. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения снижение насыщенного жира менее чем на 15% калорий представляет собой диету, низкую по содержанию насыщенного жира. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения снижение насыщенного
жира менее чем на 20% калорий представляет собой диету, низкую по содержанию насыщенного жира.
Низкоуглеводистая (СНО) диета относится к диете, которая обеспечивает между примерно 20% и
менее чем примерно 50% общих калорий за счет углеводов. В соответствии с некоторыми вариантами
осуществления изобретения низкоуглеводистая (СНО) диета относится к диете, которая обеспечивает не
более чем примерно 50% (например, не более чем примерно 20, 25, 30, 35, 40, 45% и т.д.) общих калорий
за счет углеводов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета относится к диете, которая обеспечивает не более чем примерно 45% общих калорий за счет
углеводов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая
диета относится к диете, которая обеспечивает не более чем примерно 40% общих калорий за счет углеводов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета
относится к диете, которая обеспечивает не более чем примерно 35% общих калорий за счет углеводов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета относится к диете, которая обеспечивает не более чем примерно 30% общих калорий за счет углеводов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета относится к
диете, которая обеспечивает не более чем примерно 25% общих калорий за счет углеводов. В соответст- 16 -
018875
вии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета относится к диете,
которая обеспечивает не более чем примерно 20% общих калорий за счет углеводов.
Низкоуглеводистая (СНО) диета может относиться к диете, которая ограничивает количество граммов углевода в диете, такой как диета от примерно 20 до примерно 250 г углеводов в день. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета включает не более
чем примерно 220 г (например, не более чем примерно 40, 70, 90, 110, 130, 180, 210 г и т.д.) углеводов в
день. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета
включает не более чем примерно 200 г углеводов в день. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета включает не более чем примерно 180 г углеводов в
день. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета
включает не более чем примерно 150 г углеводов в день. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета включает не более чем примерно 130 г углеводов в
день. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета
включает не более чем примерно 100 г углеводов в день. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета включает не более чем примерно 75 г углеводов в
день.
Ограниченная по калориям диета или сбалансированная диета относится к диете, которая ограничивает потребление общих калорий для снижения уровня поддержания массы (WML) субъекта, независимо от каких-либо предпочтений в отношении макронутриента. В сбалансированной диете или ограниченной по калориям диете пытаются снизить полное потребление калорий субъектом путем, например,
снижения потребления общих калорий субъектом для снижения WML субъекта без конкретного фокусирования внимания на ограничении потребления калорий за счет какого-либо конкретного макронутриента. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения сбалансированная диета может быть выражена как процент WML субъекта. Например, сбалансированная диета
представляет собой диету, которая включает потребление общих калорий между примерно 50% и примерно 100% WML. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения сбалансированная диета представляет собой диету, которая включает потребление общих калорий до менее чем
100% (например, до менее чем примерно 99, 97, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55%) WML. В этой рамке
сбалансированная диета достигает полезного для здоровья или желательного баланса макронутриентов в
диете и может быть низкожировой; с низким уровнем насыщенного жира; низкоуглеводистой; низкожировой и низкоуглеводистой или с низким уровнем насыщенного жира и низкоуглеводистой. Например,
диета может быть низкожировой ограниченной по калориям диетой (где низкожировая диета имеет значение, как представлено выше). Диета может быть низкоуглеводистой, ограниченной по калориям диетой (где низкоуглеводистая имеет значение, как представлено выше). Диета может быть сбалансированной ограниченной по калориям диетой (например, относительные части макронутриентов могут варьировать, когда потребление общих калорий становится ниже WML). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкоуглеводистая диета (углерод 45%, белок 20% и жир 35%) включает любую из диеты аткинса; влияющей на гликемию диеты; диеты Южного берега; сахарной бустерной диеты и/или зоновой диеты.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения низкожировая диета (углерод 65%, белок 15%, жир 20%) включает любую из диеты жизненного выбора (диета Орниша); диеты
Притикина и/или других диет здорового сердца, пригодных для рынка.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения сбалансированная диета (углерод 55%, белок 20%, жир 25%) включает любую из диеты лучшей жизни; средиземноморской диеты;
диета Сонома; диеты с расчетом параметров пищи; диеты с наблюдением массы.
Другая низкоуглеводистая низкожировая сбалансированная диета и ограниченные по калориям
диеты хорошо известны в данной области, поэтому могут быть рекомендованы субъекту в зависимости
от метаболического генотипа субъекта и предсказанного ответа на ограничение по калориям или другие
типы диеты.
Категории физической нагрузки.
Категории физической нагрузки обычно классифицируют на основе того, как субъект воспринимает
физическую нагрузку с учетом его метаболического генотипа. Например, субъект может быть восприимчив к легкой физической нагрузке, умеренной физической нагрузке, тяжелой физической нагрузке или
очень тяжелой физической нагрузке.
Субъекты с метаболическим генотипом, который восприимчив к физической нагрузке, способны
эффективно расщеплять телесный жир в ответ на физическую активность. Они проявляют тенденцию к
ответу на физическую нагрузку со значимой потерей массы и по всей вероятности поддерживают эту
потерю массы. Субъекты попадают в эту категорию, если они восприимчивы к легкой или умеренной
физической нагрузке.
Субъекты с метаболическим генотипом, который менее восприимчив к физической нагрузке, менее
способны расщеплять телесный жир для выработки энергии в ответ на физическую нагрузку, чем те, у
которых имеется альтернативный генетический паттерн. Они проявляют тенденцию к утрате меньшей
- 17 -
018875
массы и телесного жира, чем ожидалось при умеренной физической нагрузке. Этим субъектам требуется
большая физическая нагрузка для активизации расщепления телесного жира для выработки энергии и
потери массы. Они должны также выдерживать согласованную программу физической нагрузки для
поддержания потери массы.
Легкая активность обычно относится к субъекту, который тренируется (занятие активной тренировкой или спортом) 1-3 дня в неделю. Умеренная активность обычно относится к субъекту, который тренируется (занятие активной тренировкой или спортом) 3-5 дней в неделю. Высокая активность обычно относится к субъекту, который тренируется (занятие активной тренировкой или спортом) 6-7 дней в неделю. Очень высокая или экстремальная активность обычно относится к субъекту, который тренируется
(занятие активной тренировкой или спортом) в среднем более чем один раз в день (например, два раза в
день). Регулярная физическая нагрузка относится к активности, которая представляет собой, по меньшей
мере, легкую физическую нагрузку или, по меньшей мере, умеренную физическую нагрузку.
Вернее уровень активности может быть выражен в терминах процента свыше BMR. Например, коэффициенты формул Харриса-Бенедикта или Кетч-МакАрдл могут быть использованы как основа для
определения уровня активности. В связи с этим легкая физическая нагрузка относится к рекомендованному уровню активности, направленному на увеличение TDEE субъекта от примерно 125% BMR (т.е.
примерно 25% увеличения) до менее чем примерно 140% (в частности, например, 128, 130, 133, 135,
137,5% и т.д.) BMR. Умеренная физическая нагрузка относится к рекомендованному уровню активности,
направленному на увеличение TDEE субъекта от примерно 140% BMR до менее чем примерно 160% (в
частности, например, 142, 145, 150, 155, 158% и т.д.) BMR. Тяжелая физическая нагрузка относится к
рекомендованному уровню активности, направленному на увеличение TDEE субъекта от примерно 160%
BMR до менее чем примерно 180% (в частности, например, 162, 165, 170, 172,5, 178% и т.д.) BMR. Очень
тяжелая или экстремальная физическая нагрузка относится к рекомендованному уровню активности,
направленному на увеличение TDEE субъекта от примерно 180% BMR до более чем примерно 210% (в
частности, например, 182, 185, 190, 195, 200% и т.д.) BMR.
Альтернативно, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения "нормальная
физическая нагрузка" общепринято включает 2,5 ч (150 мин) умеренно интенсивной активности в неделю (умеренно интенсивные активности определяются как 3,0-5,9 МЕТ), "легкая физическая нагрузка"
общепринято включает менее чем 2,5 ч умеренно интенсивной активности в неделю и "силовая физическая нагрузка" общепринято включает более чем 13 МЕТ в неделю силовой интенсивной активности (силовые интенсивные активности определяются как 6 МЕТ или более). 1 МЕТ равен 1 калория/кг массы
тела/ч. Общее число ккал, затраченных субъектом = значение активности МЕТ × масса тела в кг × время
в часах.
Прирост или потеря массы зависит от баланса между потребленными калориями и израсходованными калориями. Когда количество потребленных калорий больше, чем число израсходованных калорий, может происходить прирост массы. С другой стороны, если потребленных калорий меньше, чем
число израсходованных калорий, может происходить потеря массы. WML субъекта относится к потреблению общих калорий субъектом, нуждающимся в потреблении, для того, чтобы поддерживать имеющуюся массу тела. WML субъекта может быть определен или рассчитан с использованием любого метода, известного в данной области. WML часто выражают как общее ежесуточное количество калорий, необходимое для поддержания массы тела с учетом уровня физической активности (TDEE) или оцененной
энергетической потребности (EER). В то время как значение TDEE и EER, как использовано в данной
области, может иметь технические различия, отражающие способ, посредством которого рассчитывают
уровень поддержания массы тела субъекта, эти термины могут быть использованы взаимозаменяемо в их
общем смысле в то же время с поддержанием их технических различий. WML может быть рассчитан с
использованием любого метода, используемого в данной области (например, TDEE или EER) для определения WML субъекта.
В среднем для женщин в США WML находится между 2000-2100 калорий в день. Для мужчин
средняя величина WML выше и составляет 2700-2900 калорий в день. Предпочтительным способом расчета TDEE является использование расчета Харриса-Бенедикта или формулы Кетч-МакАрдл, которые
хорошо известны специалистам в данной области. Вкратце, сначала определяется формула ХаррисаБенедикта и скорость базального метаболизма субъекта (BMR), которые представляют затем скорректированную основу для уровня активности TDEE субъекта. Например, BMR для женщин может быть рассчитан в соответствии со следующей формулой:
BMRf = 65,51 + (9,563×кг) + (1,850×см) - (4,676×возраст).
BMR для мужчин может быть рассчитан в соответствии со следующей формулой:
BMRm = 66,5 + (13,75×кг) + (5,003×см) - (6,775×возраст).
BMR затем корректируют путем умножения BMR на коэффициент, отнесенный к практическому
уровню активности. Табл. 4 предоставляет примеры таких коэффициентов. Результаты представляют
собой TDEE субъекта.
- 18 -
018875
Таблица 4
Категории физической нагрузки
Формула Кетч-МакАрдл основана на безжировой массе тела (LBM). Например, BMR рассчитывается в соответствии со следующей формулой:
BMR (мужчины и женщины) = 370 + (21,6 × безжировая масса тела в кг).
Так как формула Кетч-МакАрдл рассчитана для LBM, это единственная формула, используемая
одинаково как для мужчин, так и для женщин. TDEE затем определяется с использованием активности
коэффициентов, как использовано в расчете Харриса-Бенедикта (в табл. 4).
Классификация.
Обычно метаболический генотип субъекта будет попадать в единственную категорию питания и
единственную категорию физической нагрузки. Так, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения субъект будет классифицирован по категории питания и категории физической нагрузки на основе своего метаболического генотипа. Например, субъект может быть классифицирован по
одной из следующих шести категорий:
1) восприимчивость к ограничению жира и восприимчивость к физической нагрузке;
2) восприимчивость к ограничению жира и меньшая восприимчивость к физической нагрузке;
3) восприимчивость к ограничению углеводов и восприимчивость к физической нагрузке;
4) восприимчивость к ограничению углеводов и меньшая восприимчивость к физической нагрузке;
5) баланс жира и углеводов и восприимчивость к физической нагрузке;
6) баланс жира и углеводов и меньшая восприимчивость к физической нагрузке.
1) Восприимчивость к ограничению жира и восприимчивость к физической нагрузке.
Субъекты с этим генетическим паттерном абсорбируют больше жира диеты в организме и имеют
замедленный метаболизм. Они характеризуются повышенной тенденцией к приросту массы. Клинические исследования показали, что эти субъекты более легко достигают здоровой массы тела путем снижения общего жира диеты. Они могут с большим успехом терять массу за счет последующей диеты со
сниженным количеством жира, сниженным количеством калорий. Кроме того, для них полезно замещение насыщенных жиров на мононенасыщенные жиры в сниженной по калориям диете. Клинические исследования также показали, что эти вышеупомянутые диетические модификации улучшают способность
организма метаболизировать сахара и жиры.
Субъекты с этим генетическим паттерном способны эффективно расщеплять телесный жир в ответ
на физическую активность. Они проявляют тенденцию к ответу на физическую нагрузку со значимой
потерей массы и более вероятно к поддержанию этой потери массы. Таким субъектам может быть полезен любой уровень повышенной активности, такой как, по меньшей мере, легкая физическая нагрузка
или, по меньшей мере, умеренная физическая нагрузка.
2) Восприимчивость к ограничению жира и меньшая восприимчивость к физической нагрузке.
Субъекты с этим генетическим паттерном абсорбируют больше жира диеты в организме и имеют
замедленный метаболизм. Они характеризуются повышенной тенденцией к приросту массы. Клинические исследования показали, что эти субъекты более легко достигают здоровой массы тела путем снижения общего жира диеты. Они могут с большим успехом терять массу за счет последующей диеты со
сниженным количеством жира, сниженным количеством калорий. Кроме того, для них полезно замещение насыщенных жиров на мононенасыщенные жиры в сниженной по калориям диете. Клинические исследования также показали, что эти вышеупомянутые диетические модификации улучшают способность
организма метаболизировать сахара и жиры.
Субъекты с этим генетическим паттерном менее способны расщеплять телесный жир для выработки энергии в ответ на физическую нагрузку, чем субъекты с альтернативным генетическим паттерном.
- 19 -
018875
Они проявляют тенденцию к меньшей потере массы и телесного жира, чем ожидалось при умеренной
физической нагрузке. Этим субъектам необходима большая физическая нагрузка для активации расщепления жира тела для выработки энергии и потери массы. Они должны также соблюдать согласованную
программу физической нагрузки для сохранения потери массы.
3) Восприимчивость к ограничению углеводов и восприимчивость к физической нагрузке.
Субъекты с этим генетическим паттерном более чувствительны к приросту массы за счет избыточного поглощения углеводов. Они могут с большим успехом терять массу путем снижения углеводов в
сниженной по количеству калорий диете. Субъекты с этим генетическим паттерном предрасположены к
ожирению и испытывают трудности с регуляцией сахара крови, если их суточное потребление углеводов
превышает 49% общих калорий. Было показано, что снижение углеводов оптимизирует регуляцию сахара крови и снижает риск дальнейшего прироста массы. Если они используют высокий уровень насыщенных и низкий уровень мононенасыщенных жиров в своей диете, риск прироста массы и повышения сахара крови увеличивается. В то же время ограничение общих калорий для этих субъектов может быть полезным по причине ограничения потребления общих углеводов и сдвига жировой композиции их диеты в
сторону мононенасыщенных жиров.
Субъекты с этим генетическим паттерном способны эффективно расщеплять телесный жир в ответ
на физическую активность. Они проявляют тенденцию к ответу на физическую нагрузку со значимой
потерей массы и более вероятного поддержания этой потери массы.
4) Восприимчивость к ограничению углеводов и меньшая восприимчивость к физической нагрузке.
Субъекты с этим генетическим паттерном более чувствительны к приросту массы за счет избыточного потребления углеводов. Они могут с большим успехом терять массу путем снижения углеводов в
сниженной по калориям диете. Субъекты с этим генетическим паттерном предрасположены к ожирению
и испытывают трудности с регуляцией сахара крови, если их суточное потребление углеводов превышает 49% общих калорий. Было показано, что снижение углеводов оптимизирует регуляцию сахара крови и
снижает риск дальнейшего прироста массы. Если они используют высокий уровень насыщенных и низкий уровень мононенасыщенных жиров в своей диете, риск прироста массы и повышения сахара крови
увеличивается. В то же время ограничение общих калорий для этих субъектов может быть полезным по
причине ограничения потребления общих углеводов и сдвига жировой композиции их диеты в сторону
мононенасыщенных жиров.
Субъекты с этим генетическим паттерном менее способны расщеплять телесный жир для выработки энергии в ответ на физическую нагрузку, чем субъекты с альтернативным генетическим паттерном.
Они проявляют тенденцию к меньшей потере массы и телесного жира, чем ожидалось при умеренной
физической нагрузке. Этим субъектам необходима большая физическая нагрузка для активации расщепления жира тела для выработки энергии и потери массы. Они должны также соблюдать согласованную
программу физической нагрузки для сохранения потери массы.
5) Баланс жира и углеводов и восприимчивость к физической нагрузке.
Субъекты с этим генетическим паттерном не проявляют согласованной потребности в низкожировой или низкоуглеводистой диете. У этих субъектов ключевые биомаркеры, такие как масса тела, телесный жир и профиль липидов плазмы, хорошо отвечают на диету, сбалансированную по жиру и углеводу.
Было найдено, что для субъектов с этим генетическим паттерном, которые заинтересованы в потере массы, сбалансированная диета, ограниченная по калориям, стимулирует потерю массы и снижение телесного жира.
Субъекты с этим генетическим паттерном способны эффективно расщеплять телесный жир в ответ
на физическую активность. Они проявляют тенденцию к ответу на физическую нагрузку со значимой
потерей массы и более вероятно поддерживают эту потерю массы.
6) Баланс жира и углеводов и меньшая восприимчивость к физической нагрузке.
Субъекты с этим генетическим паттерном не проявляют согласованной потребности в низкожировой или низкоуглеводистой диете. У этих субъектов ключевые биомаркеры, такие как масса тела, телесный жир и профиль липидов плазмы, хорошо отвечают на диету, сбалансированную по жиру и углеводам. Было найдено, что для субъектов с этим генетическим паттерном, которые заинтересованы в потере
массы, сбалансированная диета, ограниченная по калориям, стимулирует потерю массы и снижение телесного жира.
Субъекты с этим генетическим паттерном менее способны эффективно расщеплять телесный жир
для выработки энергии в ответ на физическую нагрузку, чем субъекты с альтернативным генетическим
паттерном. Они проявляют тенденцию к меньшей потере массы и телесного жира, чем ожидалось при
умеренной физической нагрузке. Этим субъектам необходима большая физическая нагрузка для активации расщепления телесного жира для выработки энергии и потери массы. Они должны также соблюдать
согласованную программу физической нагрузки для сохранения потери массы.
Кроме того, рекомендации по питанию и рекомендации по физической нагрузке, персонализированный терапевтический/диетический режим могут также включать рекомендации по диетическим добавкам, пищевым добавкам или нутрицевтикам. "Нутрицевтик" представляет собой любой функциональный продукт питания, который приносит дополнительную пользу, помимо его пищевой пользы. Эта
- 20 -
018875
категория может включать пищевые напитки, диетические напитки (например, Slimfast и т.п.), а также
настои трав для спорта и другие обогащенные напитки.
Наборы.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения предлагаются наборы для
определения метаболического генотипа субъекта, включающие реагенты (олигонуклеотиды, соли, ферменты, буферы и т.д.) и инструкции для использования набора.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения наборы включают средство
для сбора образцов, включая, но не ограничиваясь ими, тампон на стержне для сбора слюны, средство
для хранения собранного образца и для транспортировки. Набор далее включает CD или CD-ROM с инструкциями по сбору образца, транспортировки образца и средство интерпретации генотипической информации, извлеченной из образца ДНК, и трансляцию информации по рекомендациям по терапевтическому/диетическому режиму или образу жизни. Паттерны генотипа могут быть сохранены, переданы в
электронном виде и выведены на экран через компьютерные сети и Интернет.
Рекомендации по терапевтическому/диетическому режиму и образу жизни включают, но не ограничиваясь ими, рекомендации, описанные в настоящем изобретении.
Определение аллелей.
Аллельные паттерны, паттерны полиморфизмов или паттерны гаплотипов могут быть идентифицированы путем определения любого компонента аллелей с использованием любой из множества пригодных методик, включая:
1) выполнение реакции гибридизации между образцом нуклеиновой кислоты и зондом, который
способен гибридизироваться с аллелем;
2) секвенирование по меньшей мере части аллеля или
3) определение электрофоретической подвижности аллеля или его фрагмента (например, фрагментов, полученных в результате эндонуклеазного переваривания).
Аллель может быть при необходимости подвержен стадии амплификации до выполнения стадии
определения. Предпочтительные методы амплификации выбраны из группы, состоящей из полимеразной
цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной реакции (LCR), амплификации со смещением нити (SDA), клонирования и вариаций вышеупомянутых методов (например, ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с
обратной транскрипцией) и аллель-специфичная амплификация). Олигонуклеотиды, необходимые для
амплификации, могут быть выбраны из, например, локусов метаболических генов или фланкирующих
маркеров, представляющих интерес (что требуется для ПЦР-амплификации) или прямого перекрывания
маркера (как в аллель-специфичной олигонуклеотидной (ASO) гибридизации). В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения образец гибридизируется с набором праймеров, которые
гибридизируют 5'- и 3'-концы последовательности в смысловой или антисмысловой последовательности
аллеля, ассоциированного с сосудистым заболеванием, и подвергается ПЦР-амплификации.
Аллель может быть также определен опосредовано, например, путем анализа белкового продукта,
кодируемого ДНК. Например, если рассматриваемый маркер приводит к трансляции мутантного белка,
белок может быть определен с помощью любого из множества методов определения белка. Такие методы включают иммуноопределение и биохимические тесты, такие как фракционирование по размеру, где
белок содержит изменение ожидаемой молекулярной массы через укорочение, удлинение, измененную
укладку или измененные посттрансляционные модификации.
Общее направление конструирования праймеров для амплификации уникальных хромосомных геномных последовательностей человека состоит в том, что они обладают температурой плавления по
меньшей мере примерно 50°С, где приблизительная температура плавления может быть оценена с использованием формулы
Tmelt=[2× (#А или Т)+4× (# G или С)].
Многие методы пригодны для определения специфических аллелей полимфорфных локусов человека. Предпочтительный метод определения специфического полимфорфного аллеля будет зависеть, в
частности, от молекулярной природы полиморфизма. Например, различные аллельные формы полиморфного локуса могут различаться единственной парой основания ДНК. Такие однонуклеотидные полиморфизмы (или SNP) являются главными участниками генетической вариации, включающей приблизительно 80% всех известных полиморфизмов, и их плотность в геноме человека оценивается в среднем
1 на 1000 пар оснований. SNP чаще встречаются в биаллельном состоянии только в двух различных
формах (хотя теоретически возможны четыре различные формы SNP, соответствующие четырем различным нуклеотидным основаниям в ДНК). Тем не менее SNP мутационно более стабильны, чем другие
полиморфизмы, что делает их приемлемыми для ассоциативных исследований, в которых неравновесность сцепления между маркерами и неизвестным вариантом используется для картирования вызывающих болезнь мутаций. Кроме того, SNP обычно имеют только два аллеля, они могут быть генотипированы посредством простого анализа на основе плюс-минус нити, скорее, чем путем измерения длины, что
делает их более поддающимися автоматизации.
- 21 -
018875
Ряд методов является пригодным для определения присутствия конкретного однонуклеотидного
полиморфного аллеля у субъекта. Прогресс в этой области предоставляет точный, легкий и экономичный
метод крупномасштабного генотипирования SNP. Совсем недавно, например, были описаны несколько
новых методик, включая динамическую аллель-специфичную гибридизацию (DASH), диагональный
гель-электрофорез на микропланшетном чипе (MADGE), пиросеквенирование, олигонуклеотидспецифичное лигирование, TaqMan систему, а также различные технологии ДНК-"чип", такие как
SNP-чипы Аффиметрикс. Эти методы требуют амплификации мишенной генетической области, обычно
посредством ПЦР. Тем не менее другие, вновь разработанные методы, основанные на генерации малых
сигнальных молекул путем инвазивного расщепления с последующей масс-спектрометрией или иммобилизацией висячих зондов и амплификации по типу катящегося кольца, могут, в конечном счете, устранить необходимость в ПЦР. Некоторые методы, известные в данной области, для определения специфических однонуклеотидных полиморфизмов суммированы ниже. Подразумевается, что способ по настоящему изобретению включает все пригодные методы.
Были разработаны некоторые способы облегчения анализа однонуклеотидных полиморфизмов. В
соответствии с одним вариантом осуществления изобретения однонуклеотидный полиморфизм может
быть определен путем использования специализированного, резистентного к экзонуклеазе нуклеотида,
как раскрыто, например, у Mundy, С.R. (патент США № 4656127). В соответствии со способом праймер,
комплементарный аллельной последовательности непосредственно с 3'-стороны полиморфного сайта,
допускает гибридизацию с мишенной молекулой, полученной от конкретного животного или человека.
Если полиморфный сайт на мишенной молекуле содержит нуклеотид, который комплементарен присутствующему конкретному, резистентному к экзонуклеазе нуклеотидному производному, тогда это производное будет включено в конец гибридизированного праймера. Такое включение приводит праймер в
состояние резистентности к экзонуклеазе и тем самым обеспечивает его определение. Так как идентичность резистентного к экзонуклеазе производного образца известна, данные о том, что праймер становится резистентным к экзонуклеазе, показывают, что нуклеотид, который присутствует в полиморфном
сайте мишенной молекулы, комплементарен таковому нуклеотидного производного, использованного в
реакции. Этот метод обладает тем преимуществом, что он не требует определения больших объемов
данных посторонних последовательностей.
В другом варианте осуществления изобретения используется основанный на растворе метод определения идентичности нуклеотида полиморфного сайта. Cohen D. et al. (патент Франции 2650840; РСТ
публикация № WO 91/02087). Как и в способе Mundy патент США № 4656127, применяется праймер,
который комплементарен аллельным последовательностям непосредственно с 3'-стороны полиморфного
сайта. Метод определяет идентичность нуклеотида этого сайта с использованием меченых олигонуклеотидных производных, которые в случае комплементарности с нуклеотидом полиморфного сайта включаются в один конец праймера.
Альтернативный метод, известный как Генетический Бит-анализ или GBA, описан Goelet, P. et al.,
(РСТ публикация № WO 92/15712). В методе Goelet, P. et al. используются смеси меченых терминаторов
и праймера, который комплементарен 3'-последовательности полиморфного сайта. Таким образом, определяется меченый терминатор, который встраивается и который комплементарен нуклеотиду, присутствующему в полиморфном сайте мишенной молекулы, которую оценивают. В отличие от метода Cohen et
al. (патент Франции 2650840; РСТ публикация № WO 91/02087), метод Goelet, P. et al. предпочтителен
для гетерогенного фазового анализа, в котором праймер или мишенная молекула иммобилизованы в
твердой фазе.
Недавно было описано несколько управляемых праймером методик нуклеотидного включения для
анализа полиморфных сайтов в ДНК (Komher, J.S. et al. Nucl. Acids Res. 17:7779-7784 (1989);
Sokolov, B.P. Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A.-C., et al., Genomics. 8:684-692 (1990);
Kuppuswamy, M.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A), 88:1143-1147 (1991); Presant, T.R. et al., Hum.
Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA. 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem.
208:171-175 (1993)). Эти методы отличаются от GBA тем, что все они основаны на включении меченых
дезоксинуклеотидов для различения оснований в полиморфном сайте. В таком формате, так как сигнал
пропорционален числу включенных дезоксинуклеотидов, полиморфизмы, которые встречаются при пробеге сходного нуклеотида, могут давать в результате сигналы, величина которых пропорциональна длине
пробега, Syvanen, А.-С., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).
Для мутаций, которые являются причиной преждевременной терминации белковой трансляции,
предлагается тест на укорочение белка (РТТ) как эффективный диагностический подход (Roest, et al.,
(1993), Hum. Mol. Genet. 2:1719-21; van der Luijt, et al. (1994), Genomics. 20:1-4). Для РТТ РНК сначала
изолируют из пригодной ткани и проводят обратную транскрипцию,и сегмент, представляющий интерес,
амплифицируют с помощью ПЦР. Продукты обратной транскрипции-ПЦР затем используются в качестве матрицы для гнездовой ПЦР-амплификации с праймером, который содержит промотор РНКполимеразы и последовательность инициации эукариотической трансляции. После амплификации области, представляющей интерес, уникальные мотивы, включенные в праймер, обеспечивают последователь- 22 -
018875
ную in vitro транскрипцию и трансляцию ПЦР-продуктов. После электрофореза в полиакриламидном
геле с додецилсульфатом натрия продуктов трансляции появление сигналов укороченных полипептидов
указывает на присутствие мутации, которая вызывает преждевременную терминацию трансляции. В вариации этой методики ДНК (по сравнению с РНК) используется как ПЦР-матрица, когда мишенная область, представляющая интерес, получена из единственного экзона.
Любой тип клетки или ткань могут быть использованы для получения образцов нуклеиновой кислоты для использования в диагностике, описанной в данном изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения образец ДНК получают из жидкости тела, например крови, полученной с
помощью известных методик (например, венопункция), или слюны. Альтернативно, нуклеиновокислотные тесты могут быть выполнены на сухих образцах (например, волос или кожа). При использовании РНК или белка клетки или ткани, которые могут быть использованы, должны экспрессировать
метаболический ген, представляющий интерес.
Диагностические методики могут быть также выполнены in situ прямо на тканевых срезах (фиксированные и/или замороженные) ткани пациента, полученной посредством биопсий или резекций, так что
отсутствует необходимость в очистке нуклеиновой кислоты. Нуклеино-вокислотные реагенты могут
быть использованы в качестве зондов и/или праймеров для in situ методик (см., например, Nuovo, G. J.,
1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY).
В дополнение к методам, которые фокусируют внимание в основном на определении последовательности одной нуклеиновой кислоты, профили также могут быть оценены в этих схемах определения.
Фингерпринтные профили могут быть получены, например, посредством использования методики дифференциального дисплея, Нозерн-анализа и/или ОТ-ПЦР.
Предпочтительный способ определения представляет собой аллель-специфичную гибридизацию с
использованием зондов, перекрывающих область по меньшей мере одного аллеля метаболического гена
или гаплотипа и содержащих примерно 5, 10, 20, 25 или 30 нуклеотидов вокруг мутации или полиморфной области. В предпочтительном варианте осуществления изобретения несколько зондов, способных
специфически гибридизироваться с другими аллельными вариантами ключевых метаболических генов,
прикрепляются к твердофазной подложке, например "чипу" (который может содержать вплоть до примерно 250000 олигонуклеотидов). Олигонуклеотиды могут быть связаны с твердой подложкой с помощью различных способов, включая литографию. Анализ определения мутации с использованием этих
чипов, включающий олигонуклеотиды, также обозначенные как "чипы ДНК-зонда", описан, например, у
Cronin et al. (1996), Human Mutation. 7:244. В одном варианте осуществления изобретения чип включает
все аллельные варианты по меньшей мере одной полиморфной области гена. Твердофазная подложка
затем контактирует с тестируемой нуклеиновой кислотой, и определяется гибридизация со специфическими зондами. Таким образом, идентичность многочисленных аллельных вариантов одного или нескольких генов может быть идентифицирована в простом эксперименте по гибридизации.
Эти методики могут также включать стадию амплификации нуклеиновой кислоты до анализа. Методики амплификации известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваясь ими,
клонирование, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), полимеразную цепную реакцию специфических
аллелей (ASA), лигазную цепную реакцию (LCR), гнездовую полимеразную цепную реакцию, самоподдерживающуюся репликацию последовательности (Guatelli, J.С. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
87:1874-1878), систему транскрипционной амплификации (Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 86:1173-1177) и Q-бета репликазу (Lizardi P.M. et al., 1988, Bio/Technology. 6:1197).
Продукты амплификации могут быть проанализированы различными путями, включая анализ размера, рестрикционное переваривание с последующим анализом размера, определение специфических
меченых олигонуклеотидных праймеров в реакционных продуктах, аллель-специфичную олигонуклеотидную (ASO) гибридизацию, аллель-специфичное 5'-экзонуклеазное определение, секвенирование, гибридизацию и т.п.
Основанное на ПЦР средство определения может включать мультиплексную амплификацию множества маркеров одновременно. Например, хорошо известен в данной области выбор ПЦР-праймеров
для генерации ПЦР-продуктов, которые не перекрываются по размеру и могут быть проанализированы
одновременно. С другой стороны, возможна амплификация различных маркеров с праймерми, которые
дифференциально мечены, и, таким образом, каждый из них может быть дифференциально определен.
Конечно средство, основанное на определении гибридизации, позволяет дифференциально определять
множество ПЦР-продуктов в образце. Другие методики, известные в данной области, предусматривают
мультиплексные анализы множества маркеров.
В просто иллюстративном варианте осуществления изобретения способ включает следующие стадии:
i) получение образца клеток от пациента;
ii) изолирование нуклеиновой кислоты (например, геномная, мРНК или то и другое) из клеток образца;
iii) контактирование образца нуклеиновой кислоты с одним или несколькими праймерами, которые
специфически гибридизируются с 5'- и 3'-концами по меньшей мере одного аллеля метаболического гена
- 23 -
018875
или гаплотипа в условиях, обеспечивающих осуществление гибридизации и амплификации аллеля; и
iv) определение продукта амплификации.
Эти схемы определения особенно полезны для определения молекул нуклеиновой кислоты, если
такие молекулы присутствуют в очень небольшом количестве.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения по рассматриваемому анализу аллель
метаболического гена или гаплотипа идентифицируется посредством изменений паттернов расщепления
рестрикционным ферментом. Например, образец или контрольная ДНК изолируются, амплифицируются
(при необходимости), перевариваются с использованием одной или нескольких рестрикционных эндонуклеаз и определяется длина фрагментов с помощью гель-электрофореза.
В еще другом варианте осуществления изобретения любая из ряда реакций секвенирования, известная в данной области, может быть использована для прямого секвенирования аллеля. Типичные реакции
секвенирования включают реакции, основанные на методиках, разработанных Maxim и Gilbert ((1977),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:560) или Sanger (Sanger et al. (1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 74:5463).
Также предполагается, что любая из ряда методик автоматического секвенирования может быть использована для осуществления рассматриваемых анализов (см., например, Biotechniques (1995), 19:448),
включая секвенирование посредством масс-спектрометрии (см., например, РСТ публикацию
WO 94/16101; Cohen et al. (1996), Adv. Chromatogr. 36:127-162 и Griffin et al. (1993), Appl. Biochem.
Biotechnol. 38:147-159). Становится очевидным для специалиста в данной области, что в некоторых вариантах осуществления изобретения наличие только одного, двух или трех оснований нуклеиновой кислоты необходимо для определения в реакции секвенирования. Например, А-трек или подобный, например, где определяется только одна нуклеиновая кислота, может быть выполнен.
В другом варианте осуществления изобретения может быть использована защита от расщепляющих
агентов (таких как нуклеаза, гидроксиламин или осмия тетроксид и пиперидин) для определения ошибочно спариванных оснований в РНК/РНК, или РНК/ДНК, или ДНК/ДНК гетеродуплексах. (Myers et al.
(1985), Science. 230:1242). В общем, методика данной области "расщепления ошибочного спаривания"
начинается путем предоставления гетеродуплексов, образованных посредством гибридизации (меченой)
РНК или ДНК, содержащей аллель дикого типа в образце. Двунитевые дуплексы обрабатываются агентом, который расщепляет однонитевые области дуплекса, такие как области, которые существуют вследствие ошибочного спаривания оснований между нитями контроля и образца. Например, РНК/ДНК дуплексы могут быть обработаны РНКазой и гибриды ДНК/ДНК обработаны нукзеазой S1 для ферментативного переваривания ошибочно спаренных областей. В других вариантах осуществления изобретения
ДНК/ДНК или РНК/ДНК дуплексы могут быть обработаны гидроксиламином или осмия тетроксидом и
пиперидином для того, чтобы переварить ошибочно спаренные области. После переваривания ошибочно
спаренных областей полученный материал затем разделяют по размеру в денатурирующих полиакриламидных гелях для определения сайта мутации. См., например, Cotton et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 85:4397 и Saleeba et al. (1992), Methods Enzymol. 217:286-295. В предпочтительном варианте осуществления изобретения контрольная ДНК или РНК могут быть мечены для определения.
Еще в другом варианте осуществления изобретения в реакции расщепления ошибочного спаривания применяются один или несколько белков для распознавания ошибочно спаренных пар оснований в
двунитевой ДНК (так называемые ферменты "репарации ошибочного спаривания ДНК). Например, фермент mutY E.coli расщепляет А в ошибочных спариваниях G/A и тимидин-ДНК-гликозилаза из клеток
HeLa расщепляет Т в ошибочных спариваниях G/T (Hsu et al. (1994), Carcinogenesis. 15:1657-1662). В
соответствии с типичным вариантом осуществления изобретения зонд, основанный на аллеле гаплотипа
метаболического генного локуса, гибридизируется с кДНК или другим ДНК-продуктом тестируемой
клетки (клеток). Дуплекс обрабатывается ферментом ошибочной репарации ДНК, и продукты расщепления, если они имеются, могут быть определены с помощью протоколов электрофореза или т.п. См., например, патент США № 5459039.
В других вариантах осуществления изобретения изменения электрофоретической подвижности будут использоваться для идентификации аллеля метаболического генного локуса. Например, конформационный полиморфизм однонитевой ДНК (SSCP) может быть использован для определения различий в
электрофоретической подвижности между мутантной нуклеиновой кислотой и нуклеиновой кислотой
дикого типа (Orita et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:2766; см. также Cotton (1993), Mutat Res.
285:125-144 и Hayashi (1992), Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). Однонитевые фрагменты ДНК образца и
аллели контрольного метаболического локуса денатурируют и обеспечивают ренатурацию. Вторичная
структура однонитевых нуклеиновых кислот варьируется в соответствии с последовательностью, полученные изменения электрофоретической подвижности дают возможность определять даже изменение
единственного основания. Фрагменты ДНК могут быть мечены или определены с использованием меченых зондов. Чувствительность анализа может быть повышена путем использования РНК (вместо ДНК), у
которой вторичная структура более чувствительна к изменению последовательности. В предпочтительном варианте осуществления изобретения в рассматриваемом методе используется гетеродуплексный
анализ для разделения двунитевых гетеродуплексных молекул на основе изменений электрофоретической подвижности (Keen et al. (1991), Trends Genet. 7-5).
- 24 -
018875
В еще другом варианте осуществления изобретения движение аллелей в полиакриламидных гелях,
содержащих градиент денатурирующего агента, анализируется с использованием гель-электрофореза с
денатурирующим градиентом (DGGE) (Myers et al. (1985), Nature. 313:495). При использовании DGGE в
качестве метода анализа ДНК будет модифицирована для обеспечения того, что она не полностью денатурируется, например, путем добавления GC-зажима приблизительно из 40 п.о. GC-обогащенной ДНК с
высокой температурой плавления посредством ПЦР. В другом варианте осуществления изобретения
температурный градиент используется вместо градиента денатурирующего агента для идентификации
различий в подвижности контрольной ДНК и ДНК образца. (Rosenbaum and Reissner (1987), Biophys
Chem. 265:12753).
Примеры других методик определения аллелей включают, но не ограничиваясь ими, селективную
олигонуклеотидную гибридизацию, селективную амплификацию или селективную достройку праймера.
Например, могут быть получены олигонуклеотидные праймеры, в которых известная мутация или нуклеотидное различие (например, в аллельных вариантах) размещены по центру, и затем гибридизируются
с мишенной ДНК в условиях, которые обеспечивают гибридизацию, только если обнаружено точное
спаривание (Saiki et al. (1986), Nature 324:163); Saiki et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:6230). Такая методика аллель-специфичной олигонуклеотидной гибридизации может быть использована для тестирования одной мутации или полиморфной области на реакцию, когда олигонуклеотиды гибридизируются с ПЦР-амплифицированной мишенной ДНК или с рядом различных мутаций или полиморфных
областей, где олигонуклеотиды прикрепляются к гибридизирующей мембране и гибридизируются с меченой мишенной ДНК.
С другой стороны, технология аллель-специфичной амплификации, которая зависит от селективной
ПЦР-амплификации, может быть использована совместно с рассматриваемым изобретением. Олигонуклеотиды, используемые как праймеры для специфичной амплификации, могут нести мутацию или полиморфную область, представляющую интерес, в центре молекулы (так что амплификация зависит от дифференциальной гибридизации) (Gibbs et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) или от крайнего
3'-конца одного праймера, где при соответствующих условиях ошибочное спаривание можно предотвратить или уменьшить достройку посредством полимеразы (Prossner (1993), Tibtech. 11:238). Кроме того,
может быть желательно введение нового рестрикционного сайта в область мутации для создания основанного на расщеплении определения (Gasparini et al. (1992), Mol. Cell Probes. 6:1). Предполагается, что в
некоторых вариантах осуществления изобретения амплификация может быть также выполнена с использованием лигазы Taq для амплификации (Barany (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:189). В таких случаях лигирование будет происходить, только если осуществляется спаривание в 3'-конце
5'-последовательности, что делает возможным определение присутствия известной мутации в специфическом сайте путем просматривания присутствия или отсутствия амплификации.
В другом варианте осуществления изобретения идентификация аллельного варианта выполняется с
использованием анализа олигонуклеотидного лигирования (OLA), как описано, например, в патенте
США № 4998617 и у Landegren, U. et al. (1988), Science. 241:1077-1080). В протоколе OLA используется
два олигонуклеотида, которые сконструированы для гибридизации со смежными последовательностями
единственной нити мишени. Один из олигонуклеотидов связан с маркером сепарации, например биотинилирован, и другой содержит регистрируемую метку. Если точная комплементарная последовательность обнаружена в мишенной молекуле, олигонуклеотиды будут гибридизироваться так, что их концы
соприкасаются и создают лигирующий субстрат. Лигирование затем обеспечивает извлечение меченого
олигонуклеотида с использованием авидина или другого биотинового лиганда. Nickerson, D.A. et al. описывает метод определения нуклеиновой кислоты, в котором скомбинированы характерные признаки
ПЦР и OLA (Nickerson, D.A. et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:8923-27). В этом методе ПЦР используется для достижения экспоненциальной амплификации мишенной ДНК, которая затем определяется с использованием OLA.
Были разработаны некоторые методики, основанные на этом методе OLA, и они могут быть использованы для определения аллелей гаплотипа метаболического генного локуса. Например, патент
США № 5593826 раскрывает OLA с использованием олигонуклеотида, содержащего 3'-аминогруппу и
5'-фосфорилированный олигонуклеотид с образованием конъюгата, имеющего фосфоамидатную связь. В
другом варианте OLA, описанном Tobe et al. ((1996), Nucleic Acids Res. 24:3728), OLA, скомбинированный с ПЦР, обеспечивает типирование двух аллелей в единственной ячейке для микротитрования. Путем
маркировки каждого из аллель-специфичных праймеров уникальным гаптеном, т.е. дигоксигенином и
флуоресцеином, каждая реакция OLA может быть определена посредством использования гаптенспецифических антител, которые мечены различными ферментными репортерами, щелочной фосфатазой
или пероксидазой хрена. Эта система обеспечивает определение двух аллелей с использованием высокопроизводительного формата, который приводит к получению двух различных окрасок.
В другом аспекте изобретение представляет наборы для осуществления вышеупомянутых анализов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения наборы по настоящему изобретению могут включать средство для определения генотипа субъекта в отношении одного или нескольких
метаболических генов. Набор может также содержать средство для взятия образца нуклеиновой кислоты.
- 25 -
018875
Набор может также содержать контрольный образец или положительный, или отрицательный, или стандартный и/или алгоритмическое устройство для оценки результатов и дополнительные реагенты и компоненты, включающие реагенты для амплификации ДНК, ДНК-полимеразу, реагенты для амплификации
нуклеиновой кислоты, рестрикционные ферменты, буферы, устройство для взятия образца нуклеиновой
кислоты, устройство для очистки ДНК, дезоксинуклеотиды, олигонуклеотиды (например, зонды и праймеры) и т.д.
Для использования в наборе олигонуклеотиды могут быть любыми из ряда природных и/или синтетических композиций, таких как синтетические олигонуклеотиды, рестрикционные фрагменты, кДНК,
синтетические пептидно-нуклеиновые кислоты (PNA) и т.п. В наборе для анализа и методе могут также
применяться меченые олигонуклеотиды, обеспечивающие легкость идентификации в анализах. Примеры
меток, которые могут быть применены, включают радиометки, ферменты, флуоресцентные соединения,
стрептавидин, авидин, биотин, магнитные частицы, металл-связывающие частицы, антигенные или антительные фрагменты и т.п.
Как описано выше, контроль может быть положительным или отрицательным. Далее контрольный
образец может содержать положительные (или отрицательные) продукты, применяемые в методике определения аллеля. Например, там, где методика определения аллеля представляет собой ПЦРамплификацию с последующим определением размера фракции, контрольный образец может включать
фрагменты ДНК соответствующего размера. Аналогично, там, где методика определения аллеля включает определение мутантного белка, контрольный образец может включать образец мутантного белка. Однако предпочтительно, чтобы контрольный образец включал тестируемый материал. Например, контролями могут быть образец геномной ДНК или клонированная часть метаболического гена. Предпочтительно, однако, что контрольный образец является высокоочищенным образцом геномной ДНК, а образец для тестирования является геномной ДНК.
Олигонуклеотиды, представленные в указанном наборе, могут быть использованы для амплификации области, представляющей интерес, или в прямой аллель-специфичной олигонуклеотидной (ASO)
гибридизации с соответствующими маркерами. Таким образом, олигонуклеотиды могут или фланкировать маркер, представляющий интерес (как требуется для ПЦР-амплификации), или прямо перекрывать
маркер (как в ASO гибридизации).
Информация, полученная с использованием анализов и наборов, описанных в данном изобретении
(индивидуально или в связи с информацией по другому генетическому дефекту или фактору окружающей среды, который приводит к остеоартриту), полезна для определения того, имеется ли у бессимптомного субъекта вероятность развития конкретного заболевания или патологического состояния. Кроме
того, информация может обеспечить более индивидуализированный подход для предотвращения начала
или прогрессирования заболевания или патологического состояния. Например, эта информация может
дать возможность клиницистам более эффективно назначать лечение, которое будет соответствовать молекулярной основе заболевания или патологического состояния.
Набор может, при необходимости, также включать средство для взятия образца ДНК. Средство для
взятия образца ДНК хорошо известно специалистам в данной области и может включать, но не ограничиваясь ими, субстраты, такие как фильтровальные бумаги, AmpliCard (University of Sheffield,
Sheffield, England S10 2JF; Tarlow, J.W., et al., J. of Invest. Dermatol. 103:387-389 (1994)) и т.п.; реагенты
для очистки ДНК, такие как наборы Nucleon, лизирующие буферы, протеиназные растворы и т.п.;
ПЦР-реагенты, такие как 10Х реакционные буферы, термостабильная полимераза, дНТФ и т.п.; и средство для определения аллелей, такое как рестрикционный фермент HinfI, аллель-специфичные олигонуклеотиды, вырожденные олигонуклеотидные праймеры для гнездовой ПЦР из высушенной крови.
Другой вариант осуществления изобретения относится к наборам для определения предрасположенности к восприимчивости некоторых диет и/или уровней активности. Этот набор может содержать
один или несколько олигонуклеотидов, включая 5'- и 3'-олигонуклеотиды, которые гибридизируются с
5'- и 3'-концом по меньшей мере одного аллеля метаболического генного локуса или гаплотипа. ПЦРамплификация олигонуклеотидов должна обеспечить гибридизацию между 25 и 2500 пар оснований раздельно, предпочтительно между примерно 100 и примерно 500 пар оснований раздельно для получения
ПЦР-продукта удобного размера для последующего анализа.
- 26 -
018875
Таблица 5
Особенно предпочтительные праймеры для использования в диагностическом
способе изобретения, включая перечисленные
Конструирование дополнительных олигонуклеотидов для использования в амплификации и определении полиморфных аллелей метаболического гена посредством способа изобретения облегчается посредством пригодности как последней информации по последовательности области q28-q31 хромосомы 4
человека, которая содержит локус FABP2 человека, так и последней информации по полиморфизму человека, доступной для этого локуса. Приемлемые праймеры для определения полиморфизма человека в
метаболических генах могут быть легко сконструированы с использованием этой информации по последовательности и стандартных методик, известных в данной области, для конструирования и оптимизации
праймерных последовательностей. Оптимальное конструирование таких праймерных последовательностей может быть достигнуто, например, путем использования коммерчески пригодных программ селекции праймеров, таких как Primer 2.1, Primer 3 или GeneFisher (см. также Nicklin M.H.J., Weith A.
Duff G.W., "A Physical Map of the Region Encompassing the Human Interleukin-1α, interleukin-1β and
Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes". Genomics. 19:382 (1995); Nothwang H.G., et al. "Molecular Cloning
of the Interleukin-1 gene Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional
Map in the Region of Chromosome 2ql3". Genomics 41:370 (1997); Clark, et al. (1986), Nucl. Acids. Res.,
14:7897-7914 [published erratum appears in Nucleic Acids Res., 15:868 (1987) and the Genome Database
(GDB) project]).
В другом аспекте изобретение представляет наборы для осуществления вышеописанных анализов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения наборы по настоящему изобретению могут включать средство для определения генотипа субъекта в отношении одного или нескольких
метаболических генов. Набор может также содержать средство для взятия образца нуклеиновой кислоты.
Набор может также содержать контрольный образец или положительный, или отрицательный, или стандартный и/или алгоритмическое устройство для оценки результатов и дополнительные реагенты и ком- 27 -
018875
поненты, включающие реагенты для ДНК-амплификации, ДНК-полимеразу, реагенты для амплификации
нуклеиновой кислоты, рестрикционные ферменты, буферы, устройство для взятия образца нуклеиновой
кислоты, устройство для очистки ДНК, дезоксинуклеотиды, олигонуклеотиды (например, зонды и праймеры) и т.д.
Для использования в наборе олигонуклеотиды могут быть любыми из ряда природных и/или синтетических композиций, таких как синтетические олигонуклеотиды, рестрикционные фрагменты, кДНК,
синтетические пептидно-нуклеиновые кислоты (PNA) и т.п. В наборе для анализа и методе могут также
применяться меченые олигонуклеотиды для обеспечения легкости идентификации в анализах. Примеры
меток, которые могут быть применены, включают радиометки, ферменты, флуоресцентные соединения,
стрептавидин, авидин, биотин, магнитные частицы, металл-связывающие частицы, антигенные или антительные фрагменты и т.п.
Как описано выше, контроль может быть положительным или отрицательным. Далее контрольный
образец может содержать положительные (или отрицательные) продукты, применяемые в методике определения аллеля. Например, там, где методика определения аллеля представляет собой ПЦРамплификацию с последующим определением размера фракции, контрольный образец может включать
фрагменты ДНК соответствующего размера. Аналогично, там, где методика определения аллеля включает определение мутантного белка, контрольный образец может включать образец мутантного белка. Однако предпочтительно, чтобы контрольный образец включал тестируемый материал. Например, контроли могут быть образцом геномной ДНК или клонированной частью метаболического гена. Предпочтительно, однако, что контрольный образец является высокоочищенным образцом геномной ДНК, а образец для тестирования является геномной ДНК.
Олигонуклеотиды, представленные в указанном наборе, могут быть использованы для амплификации области, представляющей интерес, или в прямой аллель-специфичной олигонуклеотидной (ASO)
гибридизации с соответствующими маркерами. Таким образом, олигонуклеотиды могут или фланкировать маркер, представляющий интерес (как требуется для ПЦР-амплификации), или прямо перекрывать
маркер (как в ASO гибридизации).
Информация, полученная с использованием анализов и наборов, описанных в данном изобретении
(индивидуально или в связи с информацией по другому генетическому дефекту или фактору окружающей среды, который приводит к остеоартриту), полезна для определения того, имеется ли у бессимптомного субъекта вероятность развития конкретного заболевания или патологического состояния. Кроме
того, информация может обеспечить более индивидуализированный подход для предотвращения начала
или прогрессирования заболевания или патологического состояния. Например, эта информация может
дать возможность клиницистам более эффективно назначать лечение, которое будет соответствовать молекулярной основе заболевания или патологического состояния.
Набор может, при необходимости, также включать средство для взятия образца ДНК. Средство для
взятия образца ДНК хорошо известно специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь
ими, субстраты, такие как фильтровальные бумаги, AmpliCard (University of Sheffield, Sheffield,
England S10 2JF; Tarlow, J.W, et al., J. of Invest. Dermatol. 103:387-389 (1994)) и т.п.; реагенты для очистки
ДНК, такие как наборы Nucleon, лизирующие буферы, протеиназные растворы и т.п.; ПЦР-реагенты,
такие как 10Х реакционные буферы, термостабильная полимераза, дНТФ и т.п.; и средство для определения аллелей, такое как рестрикционный фермент HinfI, аллель-специфичные олигонуклеотиды, вырожденные олигонуклеотидные праймеры для гнездовой ПЦР из высушенной крови.
Определения.
Если не определено иное, все технические и научные термины, использованные в данном описании,
имеют такое же значение, как обычно понимаемое специалистом в данной области, к которой это изобретение относится. Хотя способы и материалы сходны или эквивалентны таковым, описанным в данном
изобретении, могут быть использованы в практике или тестировании по настоящему изобретению, приемлемые способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие
ссылки, упомянутые в данном описании, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае
противоречия настоящее описание, включающее определения, будет иметь преимущественную силу.
Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для
ограничения. Другие особенности и преимущества изобретения будут очевидны из следующего детального описания и формулы изобретения.
Для целей лучшего понимания вариантов осуществления изобретения, описанных в данном изобретении, будет сделана ссылка на предпочтительные варианты осуществления изобретения и специфический язык, который будет использоваться для описания того же. Терминология, использованная в данном описании, служит для цели описания только конкретных вариантов осуществления изобретения и не
предназначена для ограничения объема настоящего изобретения. Как использовано на всем протяжении
этого раскрытия, термины в единственном числе включают и множественное число, если контекст явно
не диктует иное. Так, например, ссылка на термин "композиция" включает множество таких композиций,
а также единственную композицию, и ссылка на термин "терапевтический агент" является ссылкой на
- 28 -
018875
один или несколько терапевтических и/или фармацевтических агентов и их эквиваленты, известных специалистам в данной области, и т.д.
Термин "аллель" относится к различным вариантам последовательности, обнаруженной в различных полиморфных областях. Варианты последовательности могут представлять собой изменения единственного основания или множества оснований, включая без ограничения инсерции, делеции или замены, или может представлять собой вариабельное число повторов последовательности.
Термин "аллельный паттерн" относится к идентичности аллеля или аллелей в одной или нескольких
полиморфных областях. Например, аллельный паттерн может состоять из единственного аллеля в полиморфном сайте, как в случае PPARG (rs1801282) аллель 1. С другой стороны, аллельный паттерн может
состоять из гомозиготного или гетерозиготного состояния в единственном полиморфном сайте. Например, PPARG (rs1801282) аллель 2.2 представляет собой аллельный паттерн, в котором имеются две копии
второго аллеля, и соответствует гомозиготному состоянию PPARG (rs1801282) аллель 2. С другой стороны, аллельный паттерн может состоять из идентичных аллелей более чем в одном полиморфном сайте.
Термины "контроль" или "контрольный образец" относятся к любому образцу, соответствующему
применяемой методике определения. Контрольный образец может содержать продукты применяемой
методики для определения аллеля или материал для тестирования. Далее контроли могут быть положительными или отрицательными контролями. На примере, когда методика определения аллеля представляет собой ПЦР-амплификацию с последующим фракционированием по размеру, контрольный образец
может включать фрагменты ДНК соответствующего размера. Аналогично, когда методика определения
аллеля включает определение мутантного белка, контрольный образец может включать образец мутантного белка. Однако предпочтительно, чтобы контрольный образец включал материал для тестирования.
Например, контроли могут быть образцом геномной ДНК или клонированной частью, содержащей один
или несколько метаболических генов. Однако, когда образец для тестирования представляет собой геномную ДНК, контрольный образец предпочтительно является высокоочищенным образцом геномной
ДНК.
Фраза "разрушение гена" и "направленное разрушение" или любая подобная фраза относится к
сайт-специфическому нарушению нативной последовательности ДНК с тем, чтобы предотвратить экспрессию этого гена в клетке по сравнению с копией дикого типа гена. Нарушение может быть вызвано
делециями, инсерциями или модификациями гена или любой его комбинации.
Термин "гаплотип", как использовано в данном описании, относится к набору аллелей, которые наследуются вместе как группа (находятся в неравновесном сцеплении) со статистически значимыми уровнями (Pcorr<0,05). Как использовано в данном описании, фраза "метаболический гаплотип" относится к
гаплотипу метаболических генных локусов.
"Повышенный риск" относится к статистически повышенной частоте встречаемости заболевания
или патологического состояния у субъекта, несущего конкретный полиморфный аллель по сравнению с
частотой встречаемости заболевания или патологического состояния у члена популяции, который не несет конкретный полиморфный аллель.
Термин "изолированный", как использовано в данном описании в отношении нуклеиновых кислот,
таких как ДНК или РНК, относится к молекулам, выделенным из других ДНК или РНК соответственно,
которые присутствуют в природном источнике макромолекулы. Термин "изолированный", как использовано в данном описании, также относится к нуклеиновой кислоте или пептиду, который существенно
освобожден от клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды, когда продуцируется с помощью методики рекомбинантной ДНК, или химических предшественников, или других химических веществ, когда химически синтезируется. Кроме того, термин "изолированная нуклеиновая кислота" предназначен для включения фрагментов нуклеиновой кислоты, которые не встречаются в природе в виде фрагментов и не обнаружены в природном состоянии. Термин "изолированный", как использовано в данном описании, относится к полипептидам, которые изолированы из других клеточных белков,
и предназначается для включения очищенных и рекомбинантных полипептидов.
"Неравновесное сцепление" относится к совместному наследованию двух аллелей с частотой,
большей, чем ожидалось по отдельным частотам встречаемости каждого аллеля в данной контрольной
популяции. Ожидаемая частота встречаемости двух аллелей, которые наследуются независимо, представляет собой частоту первого аллеля, умноженную на частоту второго аллеля. Говорят, что аллели,
которые встречаются с ожидаемой частотой, находятся в "неравновесном сцеплении". Причина неравновесного сцепления часто остается неясной. Оно может происходить вследствие селекции конкретных
аллельных комбинаций или недавнего перемешивания генетически гетерогенных популяций. Кроме того, в случае маркеров, которые очень прочно сцеплены с геном заболевания, ассоциация аллеля (или
группы сцепленных аллелей) в гене заболевания ожидается, если мутация, вызывающая заболевание,
произошла в недавнем прошлом, так что не прошло достаточно времени для достижения равновесия через события рекомбинации в специфической хромосомной области. В отношении аллельных паттернов,
которые включают более чем один аллель, первый аллельный паттерн находится в неравновесном сцеплении со вторым аллельным паттерном, если все аллели, которые включают первый аллельный паттерн,
находятся в неравновесном сцеплении по меньшей мере с одним из аллелей второго аллельного паттерна.
- 29 -
018875
Термин "маркер" относится к последовательности в геноме, которая, как известно, варьирует среди
субъектов.
"Мутантный ген", или "мутация", или "функциональная мутация" относятся к аллельным формам
гена, который способен изменять фенотип субъекта, имеющего мутантный ген, относительно субъекта,
не имеющего мутантного гена. Измененный фенотип, вызванный мутацией, может быть скорректирован
или скомпенсирован некоторыми агентами. Если субъект, будучи гомозиготным по этой мутации, имеет
измененный фенотип, мутация считается рецессивной. Если одной копии мутантного гена достаточно
для изменения фенотипа субъекта, мутация считается доминантной. Если субъект имеет одну копию мутантного гена и имеет фенотип, который является промежуточным между фенотипом гомозиготного и
фенотипом гетерозиготного субъекта (для этого гена), мутация считается кодоминантной.
Как использовано в данном описании, термин "нуклеиновая кислота" относится к полинуклеотидам
или олигонуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и, при необходимости, рибонуклеиновая кислота (РНК). Понятно, что термин также включает эквиваленты, аналоги РНК или ДНК,
полученные из нуклеотидных аналогов (например, пептидно-нуклеиновые кислоты) и, в зависимости от
описанного варианта осуществления изобретения, единичные (смысловые или антисмысловые) и двунитевые полинуклеотиды.
Термин "полиморфизм" относится к совместному существованию более чем одной формы гена или
его части (например, аллельный вариант). Часть гена, которая существует по меньшей мере в двух различных формах, т.е. двух различных нуклеотидных последовательностях, относится к "полиморфной
области гена". Специфическая генетическая последовательность в полиморфной области гена представляет собой аллель. Полиморфная область может состоять из единственного нуклеотида, идентичность
которого различается в разных аллелях. Полиморфная область может также быть длиной в нескольких
нуклеотидов.
Термин "склонность к заболеванию", а также "предрасположенность к заболеванию", или "чувствительность" к заболеванию, или любая аналогичная фраза означает, что конкретные аллели, таким образом обнаруженные, ассоциируются с или предсказывают частоту возникновения у субъекта конкретного
заболевания (например, сосудистое заболевание). Аллели, тем самым, избыточно представлены по частоте у субъектов с заболеванием по сравнению со здоровыми субъектами. Таким образом, эти аллели
могут быть использованы для предсказания заболевания даже у субъектов без симптомов и без наличия
заболевания.
Как использовано в данном описании, термин "специфически гибридизируется" или "специфически
определяется" относится к способности молекулы нуклеиновой кислоты гибридизироваться по меньшей
мере приблизительно с 6 смежными нуклеотидами образца нуклеиновой кислоты.
"Транскрипционная регуляторная последовательность" представляет собой общий термин, используемый на всем протяжении описания, который относится к последовательностям ДНК, таким как сигналы инициации, энхансеры и промоторы, которые индуцируют или контролируют транскрипцию белоккодирующих последовательностей, с которыми они функционально сцеплены.
Термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая способна переносить другую
нуклеиновую кислоту, с которой она сцеплена. Один тип предпочтительного вектора является эписомой,
т.е. нуклеиновой кислотой, способной к внехромосомной репликации. Предпочтительные векторы являются теми векторами, которые способны к автомномной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они сцеплены. Векторы, способные направлять экспрессию генов, с которыми они
функционально сцеплены, называются в данном описании как "экспрессионные векторы". В общем, полезные экспрессионные векторы в методике рекомбинантной ДНК часто находятся в форме "плазмид",
которые относятся обычно к кольцевым двунитевым петлям ДНК, которые в своей векторной форме не
связаны с хромосомой. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" используются на равных основаниях, так как плазмида является обычно используемой формой вектора. Однако изобретение намеревается
включить такие другие формы экспрессионных векторов, которые выполняют эквивалентные функции и
которые стали известными в данной области впоследствии.
Термин "аллель дикого типа" относится к аллелю гена, который, когда присутствует в двух копиях
у субъекта, приводит к развитию фенотипа дикого типа. Может существовать несколько различных аллелей дикого типа специфического гена, так как некоторые нуклеотидные изменения в гене могут не
влиять на фенотип субъекта, имеющего две копии гена с нуклеотидными изменениями.
Следующие примеры являются иллюстративными, но не ограничивающими способы и композиции
настоящего изобретения. Другие приемлемые модификации и приспособления различных состояний и
параметров, стандартно встречающиеся в терапии и которые очевидны для специалистов в данной области, находятся в пределах сущности и объема вариантов осуществления изобретения.
Пример 1.
Тест контролирования массы, который был разработан на основе исчерпывающего обзора клинических исследований, идентифицирует корреляции между генами и вариациями связанного с контролированием массы метаболизма; формирование приемлемых критериев для идентификации тех генетических
вариаций, которые влияют на метаболические пути, которые потенциально могут быть модифицированы
- 30 -
018875
путем изменений в диете и образе жизни; определение того, какой из генотипов показывал повышенный
риск и что наводит на мысль о том, что риск может быть модифицирован путем воздействия на диету
и/или образ жизни; и компилирует данные по поддержанию выбранной конфигурации теста, интерпретаций результатов теста, воздействий на диету/образ жизни и анализа польза/риск.
Критерии выбора ген/полиморфизм требуют данных о том, что полиморфизм имеет значимую ассоциацию с фенотипом контролирования массы (например, масса, телесный жир, индекс массы тела), как
видно из данных по трем или более независимым сходным исследованиям, которые показали такие же
генотипические ассоциации; ген обладает биологически правдоподобной ролью в контролировании массы; полиморфизм ассоциирован с функциональным воздействием или на молекулярно-генетическом
уровне, или, что установлено, путем измерения биомаркеров, известных по влиянию на массу и/или общее состояние здоровья; и было показано, что ответ на воздействие (например, диета или физическая
нагрузка) отличается под влиянием генотипа, как видно из данных по двум или более независимым
сходным исследованиям полиморфизма генотипа, приводящих к специфической категории рекомендации.
Научное обоснование теста панели.
Научная основа этого теста основана на обширном обзоре научной литературы, доступной включительно по апрель 2007 г. Опубликованные данные оценили по проспективно связанному набору приемлемых критериев. Эти данные скомплектовали в иерархии ген > полиморфизм > композитный генотип
для определения и обоснования интерпретаций результата тестирования панели.
Процесс оценки включает:
1) установление кандидатных генов путем идентификации значимого вовлечения в метаболические
пути, связанные с гомеостазом массы;
2) установление приемлемых критериев для принятия решения, какие генетические вариации влияют на метаболические пути, которые потенциально могут быть модифицированы путем изменений в
диете и паттернах физической нагрузки. Они включают данные о том, что:
а) полиморфизм имеет значимую ассоциацию с соответствующим фенотипом (масса, телесный жир
или индекс массы тела), что продемонстрировано посредством трех или более независимых исследований, которые показали сходную ассоциацию генотип-фенотип,
б) ген играет биологически правдоподобную роль в контролировании массы,
в) полиморфизм ассоциирован с функциональным воздействием или на уровне ДНК, или, как установлено, путем измерения биомаркеров, известных своей ассоциацией с физиологическими путями, которые влияют на гомеостаз массы,
г) ответ субъекта на воздействия, такие как диета или физическая нагрузка, может быть стратифицирован посредством генотипа. Такие данные должны быть представлены по меньшей мере в двух независимых исследованиях;
3) проведение всеобъемлющего поиска научной литературы для оценки влияния генетических вариаций на а) метаболические механизмы; б) ассоциации с ожирением/контролированием массы и общим
состоянием здоровья и в) ответами на воздействие, что определено путем изменения массы или ожирения, или изменениями биомаркеров;
4) определение, какой из генотипов показывал предрасположенность субъекта к приросту массы и
того, что прирост может быть модифицирован путем конкретной диетологической стратегии или стратегии физической нагрузки;
5) компиляция данных для поддержания выбранной конфигурации теста, интерпретаций результатов теста, воздействий на диету/образ жизни и анализа польза/риск.
Следующие гены соответствуют изложенным выше критериям. Они были выбраны по их действию
на различные пути, которые влияют на массу тела и были ассоциированы с повышенным риском развития ожирения. Они также были выбраны в силу того, что они могут быть использованы для дифференциального ответа на воздействия по контролированию массы посредством генотипа. К ним относятся:
связывающий жирную кислоту белок 2 (FABP2);
активируемый пролифератором пероксисом рецептор-гамма (PPARG);
бета-2 адренергический рецептор (ADRB2) и
бета-3 адренергический рецептор (ADRB3).
Обоснование для композитных генотипов.
После идентификации ген/полиморфизмы, которые соответствуют или выходят за пределы проспективно разработанных критериев для включения в тест панель, комбинации анализировали для определения того, могут ли композитные генотипы, обнаруженные для всех пяти полиморфизмов, разделены
на различные категории, которые будут поддерживать специфические интерпретации. Результаты разделили на три категории, основанные на данных ответа на макронутриенты диеты (восприимчивость к ограничению жира, восприимчивость к ограничению углеводов и баланс жира и углеводов). Их также разделили на две отдельные категории, основанные на данных ответа на физическую нагрузку (восприимчивость к физической нагрузке и меньшая восприимчивость к физической нагрузке). Полученная в результате три на два (шесть ячеек) матрица категорий или генотипических паттернов показана в табл. 7.
- 31 -
018875
Восприимчивость к ограниченной по жиру диете.
Эта категория составлена из персон с композитными генотипами: FABP2 Ala54Thr и PPARG
Pro12Ala. Персоны с генотипом PPARG 12Pro/Pro, которые также являются носителями аллеля FABP2
Thr54, также относятся к этой категории. Эти субъекты демонстрируют трудности контролирования массы без ограничения специфического потребления жира. Вариант FABP2 Thr54 имеет в два раза большую
аффинность связывания длинноцепочечных жирных (1) кислот и повышенную абсорбцию жира и/или
процессинг жирных кислот диеты тонкой кишкой (2). Вариант Thr54 увеличивает абсорбцию и/или процессинг жирных кислот диеты тонкой кишкой. PPARG играет ключевую роль в образовании жировых
клеток (жировое депо) и в липидном метаболизме (жировая мобилизация). PPARG является рецептором,
локализованным в ядре жировых клеток. При активации посредством жира диеты PPARG рецептор связывается со специфическими последовательностями ДНК, которые затем "возбуждают" некоторые гены,
которые стимулируют запасание жира диеты в жировых клетках. У людей увеличенная активность
PPARG ассоциирована с повышенным ожирением. Вариант Ala12 ассоциирован с пониженной активностью PPARG (43, 44). Персоны, которые имеют 12Pro/Pro, вероятно более восприимчивы к количеству
жира диеты, чем носители 12Ala. Носители варианта Ala12 имеют большую метаболическую гибкость в
запасании и мобилизации жира в ответ на воздействие. Таким образом, субъекты, которые имеют
12Pro/Pro, более эффективно накапливают жир из диеты. По сравнению с носителями Ala12 носители
генотипа 12Pro/Pro имеют увеличенное связывание PPARG с ДНК, что ведет к более эффективной активации рецептора и стимуляции запасания жира.
Восприимчивость к ограничению углеводов.
Эта категория включает персоны с одной из двух различных генетических комбинаций: PPARG
Pro12Ala и ADRB2 Gln27Glu. Персоны, которые имеют генотип PPARG 12Ala/* (носители Ala аллеля)
и/или несут аллель ADRB2 Glu27, имеют трудности контролирования массы, если только они не ограничивают потребление углеводов диеты. В двух отдельных исследованиях, где каждое сфокусировано
только на одном из двух генов/SNP, исследователи обнаружили сниженную тенденцию к приросту массы/ожирению у субъектов, несущих вариант аллеля, когда их потребление углеводов ограничивали до
менее чем 50% общих калорий при сравнении с субъектами со сходными генотипами, потребление которых было выше 50% (30, 38). Это означает, что каждый из этих вариантов показывает различия в риске
развития ожирения при ограничении углеводов. Кроме того, одно из этих исследований демонстрирует
сниженный риск резистентности к инсулину у субъектов, несущих вариант аллеля, когда их потребление
углеводов было меньше чем примерно 50% общих калорий (30). Результаты исследований воздействия
на носителей Ala12 указывает на то, что они теряют больше массы (18) и на большее улучшение чувствительности к инсулину в ответ на низкокалорийную диету (19) и физическую подготовку (45-47), чем у
неносителей. Эти результаты могут быть объяснены сниженной активностью PPARG, ассоциированной с
вариантом Ala12, которая приводит к менее эффективной стимуляции мишенных для PPARG генов, вызывая меньшее ожирение (сниженная способность к запасанию жира) и, в свою очередь, увеличение чувствительности к инсулину. Это соответствует рекомендованной ограниченной по углеводам диете для
носителей аллелей Ala12 или Glu27 в связи с тем, что эти носители имеют увеличенный риск развития
ожирения на высокоуглеводистой диете, и эти генотипы ассоциированы с улучшением чувствительности
к инсулину в соответствии с воздействиями диеты/физической нагрузки.
Результаты исследований воздействий, в которых используются изменение массы и чувствительности к инсулину, являются убедительными для PPARG 12Ala/* и ADRB2 27Glu/* (18, 30, 38, 45-47). Однако отсутствуют исследования по оценке эффектов обоих полиморфизмов в одной популяции. Поэтому
более подходящим является включение субъектов генотипа PPARG 12Ala/* "и/или" ADRB2 27Glu/* в
этот паттерн, чем требование комбинации обоих SNP генотипов.
Только существует противоречие среди 5 паттернов SNP генотипа, когда субъекты, несущие
ADRB2 27Glu аллель, также имеют комбинацию PPARG 12Pro/Pro и FABP2 54Thr/*, которая будет квалифицировать их для паттерна "Восприимчивость к Ограничению Жира". Тест причисляет таких субъектов к паттерну "Восприимчивость к Ограничению Жира" в связи с тем, что в подавляющем большинстве
научных данных по взаимодействию ген-диета полиморфизмов PPARG и FABP2 ассоциированных с
массой тела и/или телесным жиром фенотипов (1, 2, 9, 10, 16, 18) имеется больше, чем это найдено для
ген-генных взаимодействий ADRB2 для ответов организма на углеводную модуляцию (21, 30, 31).
Множество исследований демонстрируют, что субъекты, которые несут FABP2 Thr54 аллель, имеют риск развития метаболического синдрома (48-50). Другие демонстрируют улучшение связанных с
метаболизмом глюкозы факторов риска (инсулин, сахар крови, триглицериды) через снижение потребления насыщенного жира (10, 11, 12). Исследование изобретения, которое сфокусировано на типе жира в
диете, также включает, в большинстве случаев, умеренное количество углеводов диеты. Другое исследование, которое не прямо связано с генотипом FABP2, демонстрирует улучшение контролирования уровней инсулина и глюкозы крови путем модуляции углеводного поглощения (51-53). Вместо фокусирования внимания на снижении жира в их диете субъектам с комбинированным PPARG 12Ala/* и FABP2
54Thr/* генотипом будет, вероятно, больше пользы от снижения поглощения ими углеводов.
- 32 -
018875
Меньшая восприимчивость к физической нагрузке.
Персоны, которые имеют специфический генотип по гену ADRB3 или гену ADRB2, имеют генетическую предрасположенность, которая проявляет тенденцию к меньшей восприимчивости к физической
нагрузке как стратегии контролирования массы. Оба этих полиморфизма играют ключевую роль в мобилизации жира из жировой ткани (липолиз) путем опосредования ответа на катехоламины. ADRB2 Gly16
вариант (даже когда комбинировали с Glu27 вариантом во время in vitro исследований) ассоциирован с
пониженной восприимчивостью к адренергическому рецептору (21). Эти два полиморфизма находятся в
тесном неравновесном сцеплении. Таким образом, тестирование Gly16 варианта также идентифицирует
большинство субъектов, несущих Glu27 вариант, который был ассоциирован с такой же предрасположенностью. ADRB3 Arg64 вариант ассоциирован с пониженной рецепторной функцией и сниженным
липолизом. В процессе физической нагрузки носители варианта, вероятно, имеют сниженный липолиз и
поэтому сниженную способность к сжиганию жира, что будет приводить к меньшей потере массы в ответ на физическую нагрузку. Множество исследований по воздействию согласовано показали, что персоны с Arg64 вариантом испытывают больше трудностей с потерей массы в ответ на диету/физическую
нагрузку, чем неносители. Носители Gly16 варианта ADRB2 имеют меньшую вероятность, чем неносители, потери массы посредством физической нагрузки (23) или комбинации диеты и физической нагрузки (28). Учитывая, что оба адренергических рецептора влияют на ответ на катехоламины в процессе физической нагрузки и что оба ADRB2 Gly16 и ADRB3 Arg64 имеют пониженную рецепторную функцию,
субъекты с любым из этих полиморфизмов должны быть включены в композитный паттерн меньшей
восприимчивости к физической нагрузке.
Результаты разделили на три отдельные категории, основанные на данных ответа на макронутриенты диеты, и на две отдельные категории, основанные на данных ответа на физическую нагрузку. Полученная в результате три на два матрица категорий или генотипических паттернов показана в табл. 6.
Таблица 6
Паттерны риска композитных генотипов
Примечание: проценты в каждой категории композитного генотипа представляют ожидаемые частоты европейской популяции в Квебекском семейном исследовании (QFS).
Все эти полиморфизмы в этой панели обозначены в соответствии с аминокислотным изменением в белке, которое является следствием нуклеотидного изменения в ДНК (например,
"54Thr" указывает, что нуклеотидная вариация в ДНК приводит к замене аминокислоты треонин в 54-м положении аминокислотной последовательности белка FABP2). Звездочка указывает, что любой аллель может быть представлен (например, 54Thr/* указывает, что второй
аллель может быть Ala или Thr).
Паттерн #1 композитного генотипа - "Восприимчивость к балансу жира и углеводов", "Восприимчивость к физической нагрузке": субъекты с комбинированным генотипом FABP2 rs1799883, 1.1 или G/G
(54Ala/Ala), PPARG rs1801282, 1.1 или С/С (12Pro/Pro) и ADRB2 rs1042714, 1.1 или С/С (27Gln/Gln) и
ADRB2 rs1042713 2.2 или А/А (16Arg/Arg), и ADRB3 rs4994 1.1 или (64Trp/Trp). Эта категория включает
- 33 -
018875
генотипы субъектов, известные восприимчивостью с различиями массы в результате низкожировой или
низкоуглеводистой ограниченной по калориям диеты. Из вариантов, тестированных в этой панели, эти
субъекты не показали согласованной генетической тенденции в отношении ослабления ответа, выделенного по жирам или углеводам в их диете. Они показывают нормальный энергетический метаболический
ответ на регулярную физическую нагрузку для достижения своих целей контролирования массы. Этот
композитный генотип представлен у 2% европейской популяции.
Паттерн #2 композитного генотипа - "Восприимчивость к ограничению жира", "Восприимчивость к
физической нагрузке": субъекты с комбинированным генотипом FABP2 rs1799883, 2.2 или 1.2 (А/А или
G/A) (54Thr/*) и PPARG rs1801282, 1.1 или С/С (12Pro/Pro) и/или ADRB2 rs1042714, 1.2 или 2.2 (C/G или
G/G) (27Glu*) или ADRB2 rs1042714 1.1 (С/С) (27Gln/Gln) в комбинации с ADRB2 rs1042713, 2.2 (А/А)
(16Arg/Arg) и ADRB3 rs4994 1.1 (Т/Т) (64Trp/Trp). Эти субъекты абсорбируют больше жира своей диеты
и проявляют тенденцию к запасанию жира в жировых клетках скорее, чем мобилизацию в процессе метаболизма. Они проявляют нормальный ответ энергетического метаболизма на регулярную физическую
нагрузку для достижения своих целей контролирования массы. Этот композитный генотип предполагается у примерно 5% европейской популяции.
Паттерн #3 композитного генотипа - "Восприимчивость к ограничению углеводов", "Восприимчивость к физической нагрузке": субъекты, генотип которых включает PPARG rs1801282 (12Ala/*) 1.2 или
2.2 (С/С или G/G) и/или ADRB2 rs1042714 (27Glu/*) 1.2 или 2.2 (C/G или G/G), а также субъекты с комбинированным генотипом PPARG rs1801282 (12Ala/*) 1.2 или 2.2 (С/С или G/G) и FABP2 rs1799883
(54Thr/*) 2.2 или 1.2 (А/А или G/A). Все вышеупомянутые установленные генотипы будут находиться в
комбинации с ADRB2 rs1042713 (16Arg/Arg) 2.2 (А/А) и ADRB3 rs4994 (64Trp/Trp) 1.1 (Т/Т), соответствуя восприимчивости к требованию категории физической нагрузки. Эти субъекты проявляют тенденцию к приросту или сохранению массы вследствие высокого поглощения углеводов диеты и демонстрируют признаки ухудшенного метаболизма глюкозы и инсулина. Они проявляют нормальный ответ энергетического метаболизма на регулярную физическую нагрузку для достижения своих целей контролирования массы. Этот композитный генотип предполагается у примерно 5% европейской популяции.
Паттерн #4 композитного генотипа - "Восприимчивость к балансу жира и углеводов", "Меньшая
восприимчивость к физической нагрузке": субъекты с комбинированным генотипом FABP2 rs1799883
(54Ala/Ala) 1.1 (G/G) и PPARG rs1801282 (12Pro/Pro) 1.1 (С/С) и ADRB2 rs1042713 (16Gly*) 1.2 или 1.1
(G/G или G/A) или ADRB3 rs4994 (64Arg*) 1.2 или 2.2 (С/Т или С/С). Эта категория включает генотипы
субъектов, известные восприимчивостью с различиями массы в результате низкожировой или низкоуглеводистой ограниченной по калориям диеты. Из вариантов, тестированных в этой панели, эти субъекты
не показали согласованной генетической тенденции в отношении ухудшения ответа, выделенного по
жирам или углеводам в их диете. Они проявляют тенденцию к ухудшенному энергетическому метаболизму и меньшей восприимчивости к регулярной физической нагрузке для достижения своих целей контролирования массы. Этот композитный генотип представлен у 14% европейской популяции.
Паттерн #5 композитного генотипа - "Восприимчивость к ограничению жира", "Меньшая восприимчивость к физической нагрузке": субъекты с комбинированным генотипом FABP2 rs1799883 (54Thr/*)
2.2 или 2.1 (А/А или A/G) и PPARG rs1801282 (12Pro/Pro) 1.1 (С/С) и/или ADRB2 rs1042714 (27Glu*) 1.2
или 2.2 (C/G или G/G) или ADRB2 rs1042714 (27Gln/Gln) 1.1 (С/С) в комбинации с ADRB2 rs1042713
(16Gly*) 1.2 или 1.1 (G/A или G/G) или ADRB3 rs4994 (64Arg*) 2.1 или 2.2 (С/Т или С/С). Эти субъекты
абсорбируют больше жира своей диеты и проявляют тенденцию к запасанию его в жировых клетках скорее, чем к мобилизации в процессе метаболизма. Они проявляют тенденцию к ухудшенному энергетическому метаболизму и меньшей восприимчивости к регулярной физической нагрузке для достижения своих целей контролирования массы. Этот композитный генотип ожидается у примерно 34% европейской
популяции.
Паттерн #6 композитного генотипа - "Восприимчивость к ограничению углеводов", "Меньшая восприимчивость к физической нагрузке": субъекты, генотип которых включает PPARG rs1801282 (12Ala/*)
1.2 или 2.2 (C/G или G/G) и/или ADRB2 rs1042714 (27Glu/*) 1.2 или 2.2 (C/G или G/G), а также субъекты
с комбинированным генотипом PPARG rs1801282 (12Ala/*) 1.2 или 2.2 (C/G или G/G) и FABP2 rs1799883
(54Thr/*) 2.2 или 2.1 (А/А или A/G). Все вышеупомянутые установленные генотипы будут также находиться в комбинации с ADRB2 rs1042713 (16Gly*) 1.2 или 1.1 (G/A или G/G) или ADRB3 rs4994 (64Arg*)
2.1 или 2.2 (С/Т или С/С), соответствуя меньшей восприимчивости к требованию физической нагрузки.
Эти субъекты проявляют тенденцию к приросту или сохранению массы вследствие высокого поглощения углеводов диеты и демонстрируют признаки ухудшенного метаболизма глюкозы и инсулина. Они
проявляют тенденцию к ухудшенному энергетическому метаболизму и менее восприимчивы к регулярной физической нагрузке для достижения своих целей контролирования массы. Этот композитный генотип ожидается примерно у 40% европейской популяции.
- 34 -
018875
Таблица 7
Композитные генотипы субъектов и риск паттернов
Указывает, что PPARG и FABP2 являются композитным генотипом, который будет приводить к категории "Восприимчивость к ограничению жира"
для достижения целей контролирования массы.
Указывает генотип, который приводит к определению "Меньшая восприимчивость к физической нагрузке".
Указывает композитные генотипы PPARG, ADRB2 или PPARG + FABP2,
которые будут приводить к категории "Восприимчивость к ограничению углеводов" для достижения целей контролирования массы.
- 35 -
018875
Пример 2. Метод клинического генотипирования.
ДНК экстрагировали из буккальных мазков (SOP#12, версия 1.3) или приобретали у Coriell Cell
Repositories. Изолированную ДНК использовали для ПЦР-амплификации областей последовательности,
окружающей пять SNP (SOP#29, версия 1.0). Полученные в результате четыре ампликона из каждого
образца обрабатывали экзонуклеазой I (Ехо) и щелочной фосфатазой креветки (SAP) для удаления избытка праймеров и нуклеотидов (SOP#29, версия 1.0). Очищенные ампликоны использовали в реакции
достройки единственного основания (SBE) с праймерами, специфичными для своей SNP-мишени
(SOP#30, версия 1.0). После того как завершали SBE, снова добавляли SAP для удаления невключенных
нуклеотидов (SOP#30, версия 1.0). SBE-продукт затем анализировали на Beckman Coulter CEQ8800 с использованием стандарта, известного по величине миграции (SOP#15, версия 1.4 и SOP#16, версия 1.3).
Все генотипы, за исключением PPARG (rs1801282), анализировали на прямой нити ДНК. PPARG
(rs1801282) анализировали на обратной нити ДНК с последующим отображением как комплементарного
основания на CEQ8800 следах. Полученные в результате генотипы регистрировали и затем сравнивали с
генотипами, полученными в результате секвенирования ДНК в Agentcourt Bioscience Corporation или с
известными генотипами, зарегистрированными в NCBI. Одноплексный формат: исследуемые ПЦРпродукты амплифицировали раздельно и подвергали генотипированию с помощью соответствующего
SBE-праймера. Пулплексный формат: исследуемые ПЦР-продукты амплифицировали раздельно и затем
объединяли в пул. Объединенную ДНК генотипировали для всех пяти SNP в одной реакции с использованием смеси SBE-праймеров. Мультиплексный формат: все четыре ПЦР-продукта генерировали в одной реакции.
Мультиплексные ПЦР-продукты генотипировали для всех пяти SNP в одной реакции с использованием смеси SBE-праймеров.
Стандартизация.
Коммерчески пригодные стандартные размеры (Beckman Coulter part # 608395) прогоняли с образцами как внутренний эталон для генотипирования.
Точность и специфичность.
Для обеспечения того, что нужные гены были намечены и точно генотипированы, ПЦР-продукты
отправили в независимую лабораторию (Agentcourt Bioscience Corporation) для секвенирования и генотипирования. В Agentcourt последовательности сравнивали с геномной последовательностью, фланкирующей SNP, после этого генотипы каждого образца передали в Interleukin Genetics. Результаты Agentcourt и
Interleukin затем сравнили для согласования.
Названия SNP и сокращения.
Следующие названия SNP и сокращения использовали в этом анализе валидизации: ADRB2 (R16G),
rs1042713 = Al; ADRB2 (Q27E), rs1042714 = А2; ADRB3 (R64W), rs4994 = A3; FABP2 (А54Т), rs1799883
= FA; PPARG (P12A), rs1801282 = PP.
Результаты.
Результаты ПЦР.
Изолированную ДНК ПЦР-амплифицировали с использованием наборов праймеров, перечисленных в приложении В. ADRB2 (rs1042713) и ADRB2 (rs1042714) содержат 33 нуклеотида в отдельности и
амплифицировались в единичный ПЦР-продукт. ПЦР-продукты прогоняли на агарозных гелях для верификации ожидаемых размеров продуктов: А1/А2=422 п.о., А3=569 п.о., FA=311 п.о., РР=367 п.о.
Результаты генотипирования.
Пик миграции.
Каждый SNP-специфичный праймер для достройки единственного основания сконструировали с
уникальной длиной для образования пика (пиков) в специфическом положении в отношении известных
стандартных размеров при пробеге на приборе для капиллярного электрофореза CEQ8800. Положения
пиков могут не точно соответствовать размерам праймеров вследствие эффектов подвижности красителя, праймерной последовательности и анализа программного обеспечения, но они мигрируют согласовано. Праймеры для достройки единственного основания перечислены в Приложении С наряду с их ожидаемым пиком миграций.
Алгоритм BASE CALLING (запрос оснований).
В реакцию достройки единственного основания добавляют флуоресцентно меченое основание к
3'-концу SNP-специфического праймера. Этот продукт регистрируют двумя лазерами в CEQ8800. Результаты анализируют с помощью программного обеспечения CEQ8800 и выявляют в виде окрашенных
пиков - каждый цвет представляет различное основание. Присутствие одного отдельно окрашенного пика в специфическом локусе указывает на гомозиготу, тогда как два пика разного цвета указывают на гетерозиготу. В 39 образцах, которые были генотипированы для валидизации, репрезентативными являются почти все гомозиготные и все гетерозиготные генотипы для всех пяти SNP. Одно исключение представляет собой гомозиготный генотип С для SNP PPARG. Это не являлось неожиданным, так как частота
С аллеля в общей популяции составляет лишь 0,1 (на что указывает база данных dbSNP для rs#1801282).
Однако гомозиготный генотип С был встречен в других образцах вне объема этой валидизации.
- 36 -
018875
Программное обеспечение CEQ8800 показывает для пользователя специфичность меток SNP локуса. Пользователь указывает размер полосы миграции (в нуклеотидах), основанный на ожидаемой миграции SNP-специфического праймера. Это дает возможность компьютеру идентифицировать SNP по признаку его миграции в зависимости от пробега стандартизированных маркеров вместе с образцом. Компьютер будет также идентифицировать основание(я) в SNP на основе определения окрашивающего индикатора(ов). Для такой валидизации в компьютере предусмотрено составление первичного запроса для
каждого SNP. Данные затем независимо повторно анализируются двумя методиками для подтверждения.
Во всех случаях компьютерные запросы и два независимых (ручных) запроса являлись согласованными.
CORIELL образцы.
После того как генотипирование было проведено в одноплексном формате на 15 образцах ДНК
Coriell, результаты сравнивали с известными генотипами и получили 100% согласование (см. табл. 8).
Таблица 8
Результаты генотипирования образцов Coriell
Таблица 8: Сравнение известных генотипов (Coriell) против генотипов, полученных в Interleukin
Genetics (ILI) с использованием одноплексного формата с ДНК из Coriell Cell Repositories. Праймер для
достройки единственного основания PPARG отжигается на обратной нити ДНК. Поэтому основания ILI
PPARG (rs1801282) перечислены как комплементарные генотипу прямой нити. na = генотип не доступен
для Coriell Cell Repositories.
Так как изобретение было описано со ссылкой на конкретные предпочтительные варианты осуществления изобретения и примеры, специалисты в данной области признают, что различные модификации
могут быть сделаны в изобретении без выхода за пределы сущности и объема изобретения.
Все вышеупомянутые патенты США, опубликованные заявки на патент США, заявки на патент
США, иностранные патенты, заявки на иностранные патенты и непатентные публикации, относящиеся к
этому описанию и/или перечисленные в Перечне технических характеристик, включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
Ссылки
1. Baier L.J., Sacchettini J.C., Knowler W.C., Eads J., Paolisso G., Tataranni P.A., Mochizuki H., Bennett
P.H., Bogardus C., and Prochazka M. An amino acid substitution in the human intestinal fatty acid binding
protein is associated with increased fatty acid binding, increased fat oxidation, and insulin resistance. J. Clin.
Invest. 95:1281-1287, 1995.
2. Levy E., Menard D., Delvin E., Stan S., Mitchell G., Lambert M., Ziv E., Feoli-Fonseca J.C., and
Seidman E. The polymorphism at codon 54 of the FABP2 gene increases fat absorption in human intestinal explants. J. Biol. Chem. 276:39679-39684, 2001.
3. Hegele R.A., Harris S.B., Hanley A.J., Sadikian S., Connelly P.W., and Zinman B. Genetic variation of
intestinal fatty acid-binding protein associated with variation in body mass in aboriginal Canadians. J. Clin.
Endocrinol. Metab. 81:4334-4337, 1996.
4. Yamada K., Yuan X., Ishiyama S., Koyama K., Ichikawa F., Koyanagi A., Koyama W., and Nonaka K.
Association between Ala54Thr substitution of the fatty acid-binding protein 2 gene with insulin resistance and
intra-abdominal fat thickness in Japanese men. Diabetologia 40:706-710, 1997.
5. Albala C., Santos J.L., Cifuentes M., Villarroel A.C., Lera L., Liberman C., Angel B., and
Perez-Bravo F. Intestinal FABP2 A54T polymorphism: association with insulin resistance and obesity in
women. Obes Res. 12:340-345, 2004.
- 37 -
018875
6. Pratley R.E., Baier L., Pan D.A., Salbe A.D., Storlien L., Ravussin E., and Bogardus C. Effects of an
Ala54Thr polymorphism in the intestinal fatty acid-binding protein on responses to dietary fat in humans. J.
Lipid Res. 41:2002-2008, 2000.
7. Agren J.J., Valve R., Vidgren H., Laakso M., and Uusitupa M. Postprandial lipemic response is modified
by the polymorphism at codon 54 of the fatty acid-binding protein 2 gene. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.
18:1606-1610, 1998.
8. Agren J.J., Vidgren H.M., Valve R.S., Laakso M., and Uusitupa M.I. Postprandial responses of subject
fatty acids in subjects homozygous for the threonine- or alanine-encoding allele in codon 54 of the intestinal
fatty acid binding protein 2 gene. Am. J. Clin. Nutr. 73:31-35, 2001.
9. Lefevre M., Lovejoy J.C., Smith S.R., Delany J.P., Champagne C., Most M.M., Denkins Y., de Jonge L.,
Rood J., and Bray G.A. Comparison of the acute response to meals enriched with cis- or trans-fatty acids on
glucose and lipids in overweight subjects with differing FABP2 genotypes. Metabolism. 54:1652-1658, 2005.
10. de Luis D.A., Aller R., Izaola O., Gonzalez Sagrado M., and Conde R. Influence of ALA54THR
Polymorphism of Fatty Acid Binding Protein 2 on Lifestyle Modification Response in Obese Subjects. Ann.
Nutr. Metab. 50:354-360, 2006.
11. Marin C., Perez-Jimenz F., Gomez P., Delgado J., Paniagua A., Lozano A., Cortes B.,
Jimenez-Gomez Y., Gomez M., Lopez-Miranda J. The ala54 polymorphism of the fatty acid-binding protein 2
gene is associated with a change in insulin sensitivity after a change in the type of dietary fat. Am. J. Clin. Nutr.
82:196-200, 2005.
12. Takakura Y., Yohsioka K., Umekawa T., Kogure A., Toda H., Yoshikawa T., Yoshida T. Thr54 allele
of the FABP2 gene affects resting metabolic rate and visceral obesity. Diabetes. Research and Clinical Practice.
67:36-42, 2005.
13. Jones J.R, Barrick C., Kim K.-A., Linder J., Blondeau B., et al., Deletion of PPARγ in adipose tissues
of mice protects against high fat diet-induced obesity and insulin resistance. PNAS. 102:6207-6212, 2005.
14. Deeb S.S., Fajas L., Nemoto M., Pihlajamaki J., Mykkanen L., Kuusisto J., Laakso M., Fujimoto W.,
and Auwerx J. A Pro12Ala substitution in PPARgamma2 associated with decreased receptor activity, lower
body mass index and improved insulin sensitivity. Nat Genet. 20:284-287, 1998.
15. Rankincn T., Zuberi A., Chagnon Y.C., Weisnagel J., Argyropoulos G., et al. The human obesity gene
map: The 2005 update. Obesity. 14:529-644.
16. Robitaille J., Despres J.P., Perusse L., and Vohl M.C. The PPAR-gamma P12A polymorphism
modulates the relationship between dietary fat intake and components of the metabolic syndrome: results from
the Quebec Family Study. Clin. Genet. 63:109-116, 2003.
17. Memisoglu A., Hu P.J., Hankinson S.E., Manson J.E., De Vivo I., Willet W.C., and Hunter D.J.
Interaction between a peroxisome proliferator-activated receptor gamma gene polymorphism and dietary fat
intake in relation to body mass. Human Molecular Genetics. 12:2923-2929, 2001.
18. Lindi V.I., Uusitupa M.I., Lindstrom J., Louheranta A., Eriksson J.G., Valle T.T., Hamalainen H.,
Ilanne-Parikka P., Keinanen-Kiukaanniemi S., Laakso M., and Tuomilehto J. Association of the Pro12Ala
polymorphism in the PPAR-gamma2 gene with 3-year incidence of type 2 diabetes and body weight change in
the Finnish Diabetes. Prevention Study. Diabetes. 51:2581-2586, 2002.
19. Nicklas B.J., van Rossum E.F., Berman D.M., Ryan A.S., Dennis K.E., and Shuldiner A.R. Genetic
variation in the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma2 gene (Pro12Ala) affects metabolic responses
to weight loss and subsequent weight regain. Diabetes. 50:2172-2176, 2001.
20. Meirhaeghe A., Helbecque N., Cottel D., Amouyel P. Impact of polymorphisms of the human
p2-adrenoreceptor gene on obesity in a French population. Int. J. Obesity. 24:382-87, 2000.
21. Green S.A., Turki J., Innis M., and Liggett S.B. Amino-terminal polymorphisms of the human beta
2-adrenergic receptor impart distinct agonist-promoted regulatory properties. Biochemistry. 33:9414-9419, 1994.
22. Hellstrom L., Large V., Reynisdottir S., Wahrenberg H., Arner P. The different effects of a Gln27Glu
B2-adrenoreceptor gene polymorphism on obesity in males and females. J. Intern Med 245:253-259, 1999.
23. Garenc C., Perusse L., Chagnon Y.C., Rankinen T., Gagnon J., Borecki I.B., Leon A.S., Skinner J.S.,
Wilmore J.H., Rao D.C., and Bouchard С. Effects of beta2-adrenergic receptor gene variants on adiposity: the
HERITAGE Family Study. Obes Res. 11:612-618, 2003.
24. Lange L.A., Norris J.M., Langefeld C.D., Nicklas B.J., Wagenknecht L.E., Saad M.F., and Bowden
D.W. Association of adipose tissue deposition and beta-2 adrenergic receptor variants: the IRAS family study.
Int. J. Obes (Lond). 29:449-457, 2005.
25. Gonzalez Sanchez J.L., Proenza A.M., Martinez Larrad M.T., Ramis J.M., Fernandez Perez C.,
Palou A., and Serrano Rios M. The glutamine 27 glutamic acid polymorphism of the beta2-adrenoceptor gene is
associated with abdominal obesity and greater risk of impaired glucose tolerance in men but not in women: a
population-based study in Spain. Clin. Endocrinol. (Oxf). 59:476-481, 2003.
26. Masuo K., Katsuya T., Kawaguchi H., Fu Y., Rakuga H., et al. B2-adrenoreceptor polymorphisms
relate to obesity through blunted leptin-mediated sympathetic activation. Am. J. Hypertens, 19:1084-91, 2006.
27. Ellsworth D.L., Coady S.A., Chen W., Srinivasan S.R., Elkasabany A., Gustat J., Boerwinkle E., and
Berenson G.S. Influence of the beta2-adrenergic receptor Arg16Gly polymorphism on longitudinal changes in
- 38 -
018875
obesity from childhood through young adulthood in a biracial cohort: the Bogalusa Heart Study. Int. J. Obes
Relat. Metab. Disord. 26:928-937, 2002.
28. Masuo K., Katsuya T., Fu Y., Rakugi H., Ogihara T., and Tuck M.L. Beta2- and beta3-adrenergic
receptor polymorphisms are related to the onset of weight gain and blood pressure elevation over 5 years.
Circulation. 111:3429-3434, 2005.
29. van Rossum C.T., Hoebee B., Seidell J.C., Bouchard C., van Baak M.A., de Groot C.P., Chagnon M.,
de Graaf C., and Saris W.H. Genetic factors as predictors of weight gain in young adult Dutch men and women.
Int. J. Obes Relat. Metab. Disord. 26:517-528, 2002.
30. Martinez J.A., Corbalan M.S., Sanchez-Villegas A., Forga L., Marti A., and Martinez-Gonzalez M.A.
Obesity risk is associated with carbohydrate intake in women carrying the Gln27Glu beta2-adrenoceptor
polymorphism. J. Nutr. 133:2549-2554, 2003.
31. Ukkola O., Tremblay A., and Bouchard C. Beta-2 adrenergic receptor variants are associated with
subcutaneous fat accumulation in response to long-term overfeeding. Int. J. Obes Relat. Metab. Disord. 25:16041608, 2001.
32. Corbalan M.S. The 27Glu polymorphism of the beta2- adrenergic receptor gene interacts with physical
activity influencing obesity risk among female subjects. Clin. Genet. 61:305-307, 2002.
33. Umekawa T., Yoshida T., Sakane N., Kogure A., Kondo M., and Honjyo H. Arg64Trp mutation of
beta3-adrenoceptor gene deteriorates lipolysis induced by beta3-adrenoceptor agonist in human omental
adipocytes. Diabetes. 48:117-120, 1999.
34. Hoffstedt J., Poirier O., Thorne A., Lonnqvist F., Herrmann S.M., Cambien F., and Arner P.
Polymorphism of the human beta3-adrenoceptor gene forms a well-conserved haplotype that is associated with
moderate obesity and altered receptor function. Diabetes. 48:203-205, 1999.
35. Allison D.B., Heo M., Faith M.S., and Pietrobelli A. Meta-analysis of the association of the Arg64Trp
polymorphism in the beta3 adrenergic receptor with body mass index. Int. J. Obes Relat. Metab. Disord. 22:559566, 1998.
36. Fujisawa T., Ikegami H., Kawaguchi Y., and Ogihara T. Meta-analysis of the association of Arg64Trp
polymorphism of beta 3-adrenergic receptor gene with body mass index. J. Clin. Endocrinol. Metab. 83:24412444, 1998.
37. Kurokawa N., Nakai K., Kameo S., Liu Z.M., and Satoh H. Association of BMI with the beta3adrenergic receptor gene polymorphism in Japanese: meta-analysis. Obes Res 9:741-745, 2001.
38. Marti A., Corbalan M.S., Martinez-Gonzalez M.A., and Martinez J.A. ARG64TRP polymorphism of
the beta 3-adrenergic receptor gene and obesity risk: effect modification by a sedentary lifestyle. Diabetes. Obes
Metab. 4:428-430, 2002.
39. Sakane N., Yoshida T., Umekawa T., Kogure A., Takakura Y., and Kondo M. Effects of Arg64Trp
mutation in the beta 3-adrenergic receptor gene on weight loss, body fat distribution, glycemic control, and
insulin resistance in obese type 2 diabetic patients. Diabetes. Care. 20:1887-1890, 1997.
40. Shiwaku K., Nogi A., Anuurad E., Kitajima K., Enkhmaa B., Shimono K., and Yamane Y. Difficulty in
losing weight by behavioral intervention for women with Arg64Trp polymorphism of the beta3-adrenergic
receptor gene. Int. J. Obes Relat. Metab. Disord. 27:1028-1036, 2003.
41. Phares D.A., Halverstadt A.A., Shuldiner A.R., Ferrell R.E., Douglass L.W., Ryan A.S.,
Goldberg A.P., and Hagberg J.M. Association between body fat response to exercise training and multilocus
ADR genotypes. Obes Res. 12:807-815, 2004.
42. Tchernof A., Starling R.D., Walston J.D., Shuldiner A.R., et al. Obesity-related phenotypes and the
β3-adrenoreceptor gene variant in postmenopausal women. Diabetes. 48:1425-1428, 1999.
43. Deeb S.S., Fajas L., Nemoto M., Pihlajamaki J., Mykkanen L., Kuusisto J., Laakso M., Fujimoto W.,
and Auwerx J. A Pro12Ala substitution in PPARgamma2 associated with decreased receptor activity, lower
body mass index and improved insulin sensitivity. Nat. Genet. 20:284-287, 1998.
44. Masugi J., Tamori Y., Mori H., Koike T., and Kasuga M. Inhibitory effect of a proline-to-alanine
substitution at codon 12 of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma 2 on thiazolidinedione-induced
adipogenesis. Biochem Biophys Res Commun. 268:178-182, 2000.
45. Kahara T., Takamura T., Hayakawa T., Nagai Y., Yamaguchi H., Katsuki T., Katsuki K., Katsuki M.,
and Kobayashi K. PPARgamma gene polymorphism is associated with exercise-mediated changes of insulin
resistance in healthy men. Metabolism. 52:209-212, 2003.
46. Adamo K.B., Sigal R.J., Williams K., Kenny G., Prud'homme D., and Tesson F. Influence of Pro12Ala
peroxisome proliferator-activated receptor gamma2 polymorphism on glucose response to exercise training in
type 2 diabetes. Diabetologia. 48:1503-1509, 2005.
47. Weiss E.P., Kulaputana O., Ghiu I.A., Brandauer J., Wohn C.R., Phares D.A., Shuldiner A.R., and
Hagberg J.M. Endurance training-induced changes in the insulin response to oral glucose are associated with the
peroxisome proliferator-activated receptor-gamma2 Pro12Ala genotype in men but not in women. Metabolism.
54:97-102, 2005.
48. Guettier J., Georgopoulos A., Tsai M., Radha V., Shanthrani S., Deepa R., Gross M., Rao G.,
Mohan V. Polymorphisms in the fatty acid-binding protein 2 and apolipoprotein c-III genes are associated with
- 39 -
018875
the metabolic syndrome and dyslipidemia in a south Indian population. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90:17051711, 2004.
49. Pollex R., Hanley A., Zinman B., Harris S., Khan H., Hegele R. Metabolic syndrome in aboriginal
Canadians: prevalence and genetic associations. Atherosclerosis. 184:121-129, 2006.
50. Karani S., Radha V., Mohan V. Thr54 allele carriers of the Ala54Thr variant of FABP2 gene have
associations with metabolic syndrome and hypertriglyceridemia in urban South Indians. Metabolism. Clinical
and Experimental. 55:1222-1226, 2006.
51. Pereira M., Swain J., Goldfine A., Rifai N., Ludwig D. Effects of a low-glycemic load diet on resting
energy expenditure and heart disease risk factors during weight loss. JAMA. 292(20):2482-2490, 2004.
52. Hallikainen M., Toppinen L., Mykkanen H., Agren J., Laaksonen D., Miettinen T., Niskanen L.,
Poutanen K., Gylling H. Interaction between cholesterol and glucose metabolism during dietary carbohydrate
modification in subjects with the metabolic syndrome. Am. J. Clin. Nutr. 84:1385-1392, 2006.
53. Kallio P., Kolehmainen M., Laaksonen D., Kekalainen J., Salopuro T., Sivenius K., Pulkkinen L.,
Mykkanen H., Niskanen L., Uusitupa M., Poutanen K. Dietary carbohydrate modification induces alterations in
gene expression in abdominal subcutaneous adipose tissue in persons with the metabolic syndrome: the
FUNGENUT study. Am. J. Clin. Nutr. 85:1417-1427, 2007.
54. Paradis A.-M., Fontaine-Bisson B., Bosse Y., Robitaille J., Lemieux S., Jaques H., Lamarche B.,
Tchernof A., Couture P., Vohl M.-C., The peroxisome proliferator-activated receptor α Leu162Val
polymorphism influences the metabolic response to a dietary intervention altering fatty acid proportions in
healthy men. Am. J. Clin. Nutr. 81:523-30, 2005.
55. Macho-Azcarate T., Marti A., Gonzalez A., Martinez J.A., Ibanez J. Gln27Glu polymorphism in the
beta2 adrenergic receptor gene and lipid metabolism during exercise in obese women. Int. J. Obesity. 26:143441, 2002.
56. Kahara T., Hayakawa T., Nagai Y., Shimizu A., Takamura T. Gln27Glu polymorphism of the β2
adrenergic receptor gene in healthy Japanese men is associated with the change of fructosamine level caused by
exercise. Diabet. Res. Clin. Practice. 64:207-12, 2004.
57. Marti A., Corbalan M.S., Martinez-Gonzalez M.A. CHO intake alters obesity risk associated with
Pro12Ala polymorphism of PPARG gene. J. Physiol. Biochem., 58(4):219-220, 2002.
58.
Centers
for
Disease
Control
and
Prevention,
available
at
http://www.cdc.gov/nccdphp/dnpa/obesity/trend/maps/index.htm. Accessed 10/21/07.
59. National Center for Health Statistics, available at http://www.cdc.gov/nchs/fastats/overwt.htm.
Accessed 10/21/07.
60. Flegal K.M., Carroll M.D, Ogden C.L., Johnson C.L. Prevalence and trends in obesity among US
adults, 1999-2000. JAMA, 288:1723-1727, 2002.
61. Ogden C.L., Carroll M.D., Curtin L.R., McDowell M.A., Tabak C.J., Flegal KM. Prevalence of
overweight and obesity in the United States, 1999-2004. JAMA, 295:1549-155, 2006.
62. Ogden C.L., Flegal K.M., Carroll M.D., Johnson C.L. Prevalence and trends in overweight among US
children and adolescents, 1999-2000. JAMA, 288:1728-1732, 2002.
63.
Centers
for
Disease
Control
and
Prevention,
available
at
http:/www.cdc.gov/nccdphp/dnpa/obesity/consequences.htm. Accessed 10/21/07.
64.
Centers
for
Disease
Control
and
Prevention,
available
at
http://www.cdc.gov/nccdphp/dnpa/obesity/economic_consequences.htm. Accessed 10/21/07.
65. Wolf A.M., Colditz G.A. Current estimates of the economic cost of obesity in the United States. Obes
Res. 6:97-106, 1998.
66. Finkelstein, E.A., Fiebelkorn, I.C., Wang, G. National medical spending attributable to overweight and
obesity: How much, and who's paying? Health Affairs Suppl. W3; 219-226, 2003.
67. U.S. Department of Health and Human Services. The Surgeon General's Call to Action to Prevent and
Decrease Overweight and Obesity. Rockville, MD: U.S. Department of Health and Human Services, Public
Health Service, Office of the Surgeon General; 2001.
68. Johnson R., Williams S., Spruill I. Genomics, nutrition, obesity and diabetes. J. Nurs Scholarsh. 38:1118, 2006.
69. Frosch D., Mello P., Lerman C. Behavioral consequences of testing for obesity risk. Cancer Epidemiol.
Biomarkers Prev. 14:1485-1489, 2005.
70. World Health Organization. BMI Classification.
- 40 -
018875
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ выбора терапевтического/диетического режима или рекомендаций образа жизни субъекта,
включающий:
а) определение генотипа субъекта в отношении любого из трех полиморфных локусов, выбранных
из группы, состоящей из FABP2 (rs1799883; G/A) локуса; PPARG (rs1801282; C/G) локуса; ADRB3
(rs4994; С/Т) локуса; ADRB2 (rs1042713; A/G) локуса и ADRB2 (rs1042714; C/G) локуса; и
б) классификацию субъекта по категории питания, основанной на генотипе субъекта, где категория
питания выбрана из группы, состоящей из низкожировой диеты, низкоуглеводной диеты, высокобелковой диеты и ограниченной по калориям диеты.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 41 -