№ 14.607.21.0060 <Номер постера> Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014—2020 годы» Науки о жизни Тема: Получение бифункциональных терапевтических антител для профилактики вирусных заболеваний при мукозальном применении Соглашение № 14.607.21.0060 на период 2014 - 2016 гг. Руководитель проекта: Кирпичников М.П., декан биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова Получатель субсидии: Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Цели и задачи проекта Цель проекта - Основные задачи проекта создание эффективного, доступного и безопасного средства профилактики инфекции различными серотипами вируса гриппа А на основе бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител к гемагглютинину, обеспечивающих направленную активацию системы врожденного иммунитета слизистых оболочек человека 1) конструирование системы экспрессии бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител различного биоинженерного формата; 2) получение клеточных линий-продуцентов и экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител ; 3) проведение иммунохимического анализа и биологических испытаний IgG/IgA-гибридных антител на клеточных и животных моделях Ожидаемые результаты проекта 1. Будут разработаны генетические конструкции для экспрессии бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител различного биоинженерного формата (мономерные и 2. 3. 4. 5. 6. димерные формы человеческого иммуноглобулина А). Будут созданы клеточные линии СНО - продуценты бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител различного биоинженерного формата. Будет проведена оптимизация биосинтеза, разработаны эффективные методы выделения и очистки бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител. Будут получены 4 экспериментальных образца бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител, проведен их биохимический и иммунохимический анализ. Будут проведены биологические испытания эффективности и безопасности экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител на модельных животных, летально инфицированных различными коллекционными штаммами вируса гриппа А.; Будет проведен отбор наиболее эффективного биоинженерного формата терапевтического антитела для мукозальной профилактики и лечения. Штаммы H3N2 Перспективы практического использования • Иммунопрепарат на основе бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител широкой специфичности в отношении серотипов вируса гриппа А может быть рекомендован для специфической профилактики пациентов групп риска (дети, пожилые люди, беременные женщины, люди с ослабленной иммунной системой), а также для профилактики и лечения населения в целом. • Разработка препарата уменьшит затраты системы здравоохранения на получение сезонных вакцин и борьбу с возможными пандемиями. • В 2017 г. планируется проведение ОТР по масштабированию процесса биосинтеза бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител, будет получен опытный образец для проведения доклинических исследований. Доклинические исследования препарата будут осуществляться с учетом особенностей его мукозального использования. Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г. Осуществлен биосинтез и клонирование константных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина А IgA1 и IgA2m1-изотипов, а также J-цепи Для получения IgG/IgA-гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов получены двухвекторная (pOpti-L и pcDNA3.3-H) и бипромоторная (легкая и тяжелая цепи антитела в одной плазмиде) система экспрессии Получение клеточных линий – продуцентов IgG/IgA-гибридных антител Получены 4 линии СНО – продуценты мономеров и Экспериментальные образцы бифункциональных димеров IgA1 и IgA2, а также продуцент контрольных антител IgG-изотипа Для повышения продуктивности использовали DHFR/MTX селекцию и автоматический отбор клонов на оборудовании ClonePix FL IgG/IgA-гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов, а также контрольный образец IgG-изотипа эффективно взаимодействуют со штаммами H1N1 и H3N2 вируса гриппа А Профиль взаимодействия IgG/IgA-гибридных антител не отличается от контрольных антител. Сродство к H1N1 выше, чем к H3N2 Наномолярная аффинность всех антител pIgA1 pIgA2 DHFR/MTX селекция 2 ОD Сравнительный анализ уровня продукции антител после трансфекции и проведения первичной селекции продемонстрировал преимущество бипромоторной системы экспрессии [Ат], мкг/мл Иммунохимический анализ IgG/IgAгибридных антител 450 Разработка системы экспрессии IgG/IgA-гибридных антител 1.5 СНО - IgА1 1 СНО - IgА2 pJ H1N1 H3N2 20 0.5 15 0 2 вектора 10 ClonePix FL Бипромотор 5 0 10 14 СНО - IgА1 СНО - IgА1 СНО - IgА2 СНО - IgА2 мономер димер димер мономер Клеточные линии - продуценты Дни Рисунок 1 – Сравнительный анализ уровня продукции рекомбинантных контрольных антител IgG-изотипа в 2-х векторной и бипромоторной системе экспрессии после культивирования в селективной среде ClonePix FL Рисунок 2 – Схема получения клеточных линийпродуцентов 4-х бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител. pIgA1, pIgA2, pJ – экспрессионные вектора. Рисунок 3 – Диаграмма кросс-реактивности IgG/IgAгибридного антитела IgA2m1-изотипа при концентрации 0,3 мкг/мл по отношению к штаммам вируса гриппа А H1N1 и H3N2 серотипов Партнеры проекта Индустриальный партнер ФГУП НПО «МИКРОГЕН» Минздрава РФ • Крупнейший национальный производитель иммунобиологических препаратов: вакцин, сывороток, специфических иммуноглобулинов. • Осуществляет внебюджетное финансирование в размере 16,5 млн. руб. (разработка и валидация аналитических методов контроля качества, маркетинговые исследования, разработка технических требований и по производству и эксплуатации продукции и др.) № 14.607.21.0060 Соисполнители Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения • Современное научно-производственное учреждение, специализирующееся на разработке новых молекулярных методов диагностики и терапии. • В проекте проводит работы по выделению и иммунохимическому анализу IgG/IgA – гибридных антител. НИИ гриппа РАМН • Обладает многолетним уникальным опытом и совершенной методологией в области испытания средств профилактики и лечения гриппа. • В проекте проводит работы по исследованию биологической активности и безопасности IgG/IgA – гибридных антител на клеточных моделях и животных. <Номер постера>