АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ПРОТЕИНУРИИ ТРЕБОВАНИЯ К ТОЧНОСТИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА В МОЧЕ Смещение В < + 20%; Аналитическая вариация CV < 25% Приказ МЗ РФ №45 от 07.02.2000 г. Приказ МЗ РФ №220 от 26 мая 2003 г. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ПРОТЕИНУРИИ ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД Метод Брандберга-Робертса-Стольникова (азотная кислота), полуколичественный Метод сульфосалициловой кислоты, количественный (1827г., Брайт; 1912г., Кобер; 1926г., Кингсбери; 1973г., Катсенельсон) Метод трихлоруксусной кислоты, количественный (1827г., Брайт; 1918г., Гринвальд; 1943г., Бекман) ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД Белки в глобулярной форме имеют малые размеры и не рассеивают свет Денатурация белков в кислой среде В результате реакции преципитации образуются крупные белковые частицы, хорошо рассеивающие свет ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОСНОВНЫЕ НЕДОСТАТКИ МЕТОДА РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ ЗАВИСИТ ОТ рН СРЕДЫ И СОЛЕВОГО СОСТАВА РАЗМЕРЫ ПРЕЦИПИТАТОВ ЗАВИСЯТ ОТ ХАРАКТЕРА ПЕРЕМЕШИВАНИЯ ПРОБЫ ПРИ БОЛЬШИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ БЕЛКА ВОЗМОЖНО ВЫПАДЕНИЕ ПРЕЦИПИТАТОВ В ОСАДОК ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ХАРАКТЕРИЗУЮТСЯ БОЛЬШИМИ ПОГРЕШНОСТЯМИ, КОТОРЫЕ ЗАВИСЯТ ОТ СОСТАВА МОЧИ И ТЕХНОЛОГИИ ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ Светодиоды Фотоприемник Реакционная зона на белок с бромфеноловым синим Тестовые зоны с комплексом реактивов Пластиковая полоска Измеряется коэффициент светорассеяния на разных длинах волн МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ АНАЛИЗАТОР МОЧИ НА ПОЛОСКАХ «УРИСКАН» МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ 100,00 Коэффициент отражения, % 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 0г/л 0,05г/л 0,1г/л 0,3г/л 1,0г/л 3г/л 10г/л 30,00 20,00 10,00 0,00 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 Длина волны, нм Коэффициент отражения света реакционной зоной зависит от концентрации белка в моче и от длины волны света Анализатор мочи UriСкан-strip Отражательный фотометр с оптимальной схемой измерения КАЛИБРОВКА ЗОНЫ «БЕЛОК» К(С)измер. 1 0,9 С аттест., г/л К(С)инт. 0,8 Ст. откл. CV 0,7 0,013 0,051 0,011 22% 0,120 0,026 22% 0,3 0,360 0,061 17% 0,2 1,199 0,310 26% 3,596 1,108 31% Коэф.Отр. 0,000 0,6 0,5 0,4 0,1 0 0 2 4 6 8 С(измер.), г/л 10 12 14 МЕТОД СУХОЙ ХИМИИ Альбумин 100% Калибровочные зависимости для белковой зоны с А и Г рН=5 80 Глобулин 100% Коэффициент отражения, % 70 60 50 40 30 20 10 0 0,01 0,1 1 Концентрация белка, г/л Коэффициент отражения света реакционной зоной для разных концентраций альбумина и глобулина. Тест-полоски чувствительны к альбумину. 10 ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД Фотометрическое измерение продукта реакции λ=600 нм Моча Раствор красителя пирогаллоловый красный в буфере Специфическая реакция с образованием комплекса молекул красителя с белком ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕАКЦИЯ Молекулы белка в моче Молекулы белка, помеченные молекулами красителя ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД 0,6 Спектр реагента Спектр пробы с концентрацией белка 0,6 г/л Оптическая плотность, Б 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 300 350 400 450 500 550 600 650 700 Длина волны , нм Зависимость оптической плотности реакции (600 нм) от концентрации альбумина (проба мочи – 20 мкл, реагент - 1 мл). В присутствии белка возрастает оптическая плотность в области 600 нм. ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД 1,0 0,9 Оптическая плотность, Б 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Установленная концентрация альбумина, г/л Зависимость оптической плотности реакции (600 нм) от концентрации альбумина (проба мочи – 20 мкл, реагент 1 мл) ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД АНАЛИЗАТОР БЕЛКА В МОЧЕ «МИКРОЛАБ 600» АНАЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА 1. Анализатор белка и креатинина «URiСКАН- БК» (опытный образец), производства ООО «Эйлитон» 2. Фотометрические пробирки 13х75 мм из боросиликатного стекла (Corning Inc., США). Автоматический пипеточный дозатор, объем дозирования 100 мкл, производства BIOHIT, Финляндия; дата поверки – 10.04.2012 Автоматический пипеточный дозатор, объем дозирования 1,0 мл, производства BIOHIT, Финляндия; дата поверки – 10.04.2012 Набор реагентов для определения белка в моче и спинномозговой жидкости "ЮНИ-ТЕСТ-БМ" .( ТУ 9398-001-59879815-2009), производства ООО "ЭЙЛИТОН", г. Москва; Набор реагентов для определения креатинина «Креатинин-UTS» производства ООО "ЭЙЛИТОН", г. Москва. 3. 4. 5. 6. Liquichek КОНТРОЛЬ АНАЛИТИЧЕСКИХ СЕРИЙ БЕЛОК 0,224 г/л БЕЛОК г/л Ст. откл. СV 25.06.2012 0,236 0,0157 6,7% 26.06.2012 0,233 0,0095 4,1% 27.06.2012 0,226 0,0132 5,8% 28.06.2012 0,237 0,0252 10,6% 29.06.2012 0,230 0,0073 3,2% 02.07.2012 0,224 0,0111 5,0% Белок 0,250 0,200 0,150 С , г /л Дата Среднее (20) 1,2% 03.07.2012 0,223 0,0091 4,1% 04.07.2012 0,235 0,0218 9,3% 05.07.2012 0,229 0,0129 5,6% 0,050 06.07.2012 0,227 0,0128 5,7% 0,000 30.07.2012 0,227 0,0109 4,8% 31.07.2012 0,230 0,0066 2,9% 01.08.2012 0,226 0,0084 3,7% 02.08.2012 0,225 0,0061 2,7% 03.08.2012 0,225 0,0051 2,3% Среднее 0,227 1,2% Ст. откл. 0,002024 CV 0,89% 0,100 0 2 4 6 8 10 Номер аналитической серии 12 14 16 Liquichek КОНТРОЛЬ АНАЛИТИЧЕСКИХ СЕРИЙ БЕЛОК 0,647 г/л КРЕАТИНИН Дата Среднее (20) Ст. откл. СV 25.06.2012 0,686 0,0351 5,1% 26.06.2012 0,695 0,0413 5,9% 27.06.2012 0,678 0,0216 3,2% 28.06.2012 0,675 0,0273 4,0% 29.06.2012 0,673 0,0168 2,5% 02.07.2012 0,666 0,0355 5,3% 03.07.2012 0,675 0,0178 2,6% 04.07.2012 0,678 0,0185 2,7% 05.07.2012 0,667 0,0305 4,6% 0,200 06.07.2012 0,672 0,0201 3,0% 0,000 30.07.2012 0,671 0,0199 3,0% 31.07.2012 0,669 0,0246 3,7% 01.08.2012 0,656 0,0261 4,0% 02.08.2012 0,666 0,0248 3,7% 03.08.2012 0,652 0,0186 2,9% Среднее 0,663 2,5% Ст. откл. 0,008366 CV 1,26% Креатинин 0,800 С , г /л 0,600 0,400 0 2 4 6 8 10 Номер аналитической серии 12 14 16 Liquichek КОНТРОЛЬ АНАЛИТИЧЕСКИХ СЕРИЙ БЕЛОК / КРЕАТИНИН 0,346 БЕЛОК/КРЕАТИНИН Ст. откл. СV 25.06.2012 0,345 0,0322 9,3% 26.06.2012 0,336 0,0219 6,5% 27.06.2012 0,333 0,0207 6,2% 28.06.2012 0,351 0,0383 10,9% 29.06.2012 0,342 0,0158 4,6% 02.07.2012 0,337 0,0274 8,1% 03.07.2012 0,331 0,0144 4,3% 04.07.2012 0,347 0,0334 9,6% 05.07.2012 0,344 0,0233 6,8% 06.07.2012 0,337 0,0218 6,5% 30.07.2012 0,338 0,0156 4,6% 31.07.2012 0,344 0,0166 4,8% 01.08.2012 0,345 0,0186 5,4% 02.08.2012 0,338 0,0133 3,9% 03.08.2012 0,345 0,0136 3,9% Среднее 0,342 -1,1% Ст. откл. 0,004 CV 1,11% Белок / Креатинин 0,4000 0,3000 R , г /г Дата Среднее (20) 0,2000 0,1000 0,0000 0 2 4 6 8 10 Номер аналитической серии 12 14 16 ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ВАРИАЦИИ Date Protein g/l Creatinine g/l Protein / Creati nine 12.09.2012 0,123 1,926 0,065 13.09.2012 0,013 0,298 0,045 14.09.2012 0,148 1,513 0,098 17.09.2012 0,090 1,195 0,076 18.09.2012 0,079 1,791 0,044 19.09.2012 0,166 1,927 0,086 20.09.2012 0,083 1,195 0,069 y = 9,3835x + 0,4656 2,500 R2 = 0,6748 Креа тинин, г/л 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 0,000 0,050 0,100 Белок, г/л 0,150 0,200 Сравнение результатов определения концентрации белка в моче двумя методами. сульфосалициловый метод, г/л 0,25 0,2 0,15 R2 = 0,1721 0,1 0,05 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 пирогаллоловый метод, г/л Разброс точек обусловлен большими погрешностями метода сульфосалициловой кислоты. 0,8