Киян В.С., Серикова Ш.С., Булашев А.К. Печеночный сосальщик

«Сейфуллин оқулары–11: Жастар және ғылым» атты Республикалықалық ғылыми-теориялық
конференциясының материалдары = Материалы
Республиканской научно-теоретической
конференции «Сейфуллинские чтения–11: Молодежь и наука». – 2015. – Т.І, ч.1. – С. 152-155
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ
В СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
ОПИСТОРХОЗА
Киян В.С., Серикова Ш.С., Булашев А.К.
Печеночный сосальщик Opisthorchis felineus относится к представителям
семейства Opisthorchiidae класса Trematoda. Высокий уровень заболеваемости
людей описторхозом, вызываемым трематодами семейства Opisthorchiidae, является
важной социальной проблемой населения стран Азии и Восточной Европы.
Наиболее мощный очаг описторхоза расположен в Обь-Иртышском бассейне, к
которому относятся реки северных и восточных областей Казахстана [1]. Заражение
описторхидами оказывает существенное влияние на здоровье людей, так как
печеночные паразиты вызывают такие серьезные заболевания, как холангит,
холецистит, дискинезию желчных протоков, панкреатит, цирроз печени и
холангиокарциному [2].
Важную роль в борьбе с этой инвазией играют методы диагностики болезни.
Достоверным методом диагностики является обнаружение яиц трематод в фекалиях
или желчи, однако отрицательный результат не свидетельствует об отсутствии
инвазии. В этой связи, в последнее время совершенствуются серологические
методы диагностики, основанные на обнаружении антител к паразитам в сыворотке
крови. Для этой цели используются антигенные препараты, полученные из
гельминтов. Так, в качестве антигена для серодиагностики находят применение
соматические антигены гельминта или его экскреторно-секреторные антигены
(ЭС-Аг), вырабатываемые при культивировании паразита в условиях in vitro [3].
Однако, подготовка антигенов трематоды весьма трудоемкая работа в связи с
малым выходом ЭС-Аг. Кроме того, качество образцов метацеркариев,
необходимых для заражения
лабораторных животных,
непредсказуемы и
разнообразны, так как
зависит от состояния природных источников инвазированных рыб и от сезона года [4]. Изменчивость антигенов от партии к
партии отрицательно сказывается на результатах серологической диагностики.
Для решения обозначенной проблемы нами была изучена возможность
использования антиидиотипических антител (АИАТ) вместо природных антигенов
паразита в ИФА. Данный подход основан на общеизвестной
теории
идиотипических сетей, согласно которой сами антитела могут, в свою очередь,
выступать как антигены.
Для получения АИАТ были использованы
моноклональные антитела (МКА) с авторским названием 4B3D9, имеющие
специфичность к эпитопу белка ЭС-Аг с молекулярной массой 28 кД. Методом
гибридомной техники были получены АИАТ к паратопу МКА, и как «внутренний
образ» антигена описторхиса были испытаны в ИФА для обнаружения
специфических антител. Антиидиотипы, имитируя детерминанты антигена
гельминта, в непрямом варианте ИФА распознавались антителами сыворотки
крови мышей, иммунизированных ЭС-Аг O. felineus. Кроме того, антиидиотипы
обладали
иммуногенными свойствами, т.е. вызывали образование антител,
вступающих в реакцию с гомологичным антигеном паразита.
Диагностическая ценность антиидиотипов была апробирована в непрямом
ИФА с использованием образцов сывороток крови собак, экспериментально
зараженных метацеркариями паразита, и сывороток крови людей, подозреваемых в
заражении описторхозом.
Результаты показали, что
антитела больных
описторхозом собак взаимодействуют как с ЭС-Аг взрослого паразита, так и
антиидиотипами. Причем, в лунках, сенсибилизированных АИАТ антитела
детектировались в более высоких титрах. При серологических исследованиях
крови 60 человек на описторхоз в непрямом ИФА с использованием ЭС-Аг
положительные результаты были получены у 60% пациентов. Следует отметить,
что чувствительность теста в случае применения в нем АИАТ вместо ЭС-Аг была
выше на 16,7%. Это, видимо, объясняется лучшей адсорбцией гомогенных
антиидиотипов твердой фазой по сравнению со сложным белковым комплексом
ЭС-Аг.
Использование непрямого ИФА для обнаружения антител, специфичных к
описторхису, требует наличия различных конъюгатов в зависимости от вида
исследуемого индивидуума. В этой связи, нами испытан конкурентный ИФА,
основанный на применении одного лишь конъюгата - меченных МКА 4B3D9,
имеющих специфичность к ЭС-Аг описторхиса. При этом конъюгат вступал в
конкуренцию с антителами исследуемой сыворотки крови за связывание с
иммуносорбентом АИАТ. Результатты иммунанализа образцов крови
экспериментально зараженных собак показали возможность замены антигена
паразита на антиидиотипы, что, несомненно, позволит повысить специфичность
тест-системы и стандартизировать основные реагенты диагностикума.
Другим подходом, имеющим большую научную и практическую значимость,
является использование рекомбинантного антигена в серологической диагностике
описторхоза. Описаны несколько рекомбинантных белков описторхид O.viverrini и
Clonorchis sinensis, полученных в прокариотической системе [5-6]. Наибольший
интерес представляют работы, где авторы, используя протеомные данные и
результаты скрининга библиотек кДНК,
выявили гены возможных
белков-иммуногенов O. viverrini и C. sinensis и провели конструирование и
клонирование плазмид, несущих эти гены. Далее, были получены рекомбинантные
аналоги этих белков, и методами иммуноблотта и ИФА было проведено
тестирование взаимодействия позитивных сывороток от пациентов больных
описторхозом с этими рекомбинантными белками. Полученные результаты
указывают на возможность использования данных рекомбинантных аналогов
белков этих трематод в иммунодиагностике [7]. Laha T et al. (2008) получили
рекомбинантную
аспарагинил эндопептидазу О. viverrini.
Однако,
широкомасштабное использование этого антигена для серодиагностики затруднено
трудностями в рефолдинга рекомбинантный протеазы к естественной, растворимой
конформации [5]. Jittiyawadee S et al. (2012) получили рекомбинантную форму
протеазы катепсина В1 О. viverrini и доказали возможность использования его в
ИФА для серодиагностики описторхоза [8]. Известно, что катепсин B1 O. viverrini
присутствует в экскреторно-секреторном продукте,
выделяемом паразитом
культивируемых в условиях in vitro. Eursitthichaia V. Et al. (2010) получен
рекомбинантный аналог другого белка также присутствующего в метаболите
O.viverrini - рекомбинантного глутатионтрансфераза [9].
К сожалению, в
литературе нет сведений о получении и использовании рекомбинантных белков
O.felineus в разработке серологических методов диагностики болезни, за
исключением работы Разумова И.А. и соавт.(2012) [10]. Им определена
возможность использования в иммунодиагностике описторхоза рекомбинантного
аналога белка легумаин. Рекомбинантный белок, клонированный и
экспрессированный в E. coli, в ИФА продемонстрировал различие в
иммунореактивности между сыворотками больных и здоровых индивидуумов.
Авторы считают, что этот рекомбинантный аналог может быть использован для
совершенствования иммунодиагностики описторхоза, вызываемого O. felineus, а
также для получения специфических антител к этому паразиту и генно-инженерных
вакцин. Ген легумаин C. sinensis был экспрессирован с использованием системы
экспрессии QIAExpress фирмы QIAGEN [11]. При использовании в
иммунодиагностике рекомбинантного аналога белка C. sinensis, полученного с
помощью прокариотической системы экспрессии, была показана высокая
чувствительность и специфичность взаимодействия человеческих сывороток с
указанным белком: 71,4 и 100% соответственно.
К настоящему времени
практически нет данных об иммунном ответе организма-хозяина на отдельные
белки-антигены O.felineus. Известны мажорные антигены O.viverrini и других
трематод семейства Opisthorchiidae, вызывающие сильный гуморальный иммунный
ответ у человека. К ним относятся вителлин [12] и катепсин F [13]. А.А.Носов и
соавт. (2012) исследовали антигенные и функциональные свойства мажорных
белков вителлина и катепсина F O.felineus. Авторами установлено антигенность
рекомбинантных белков в отношении сывороток, полученных от людей, больных
описторхозом
[14].Таким
образом,
современные
данные
в
области
совершенствования диагностики описторхоза свидетельствуют о перспективности
изучения иммуногенности отдельных белков, имеющихся в составе ЭС-Аг O.
felineus, и создания высокоспецифичных и эффективных иммунологических
тест-систем на основе рекомбинантных антигенов описторхиса.
Список литературы
1. Государственный доклад «О санитарно-эпидемиологической обстановке в
Российской Федерации в 2008 году».- М.: Федеральный центр гигиены и
эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009.- C. 349–350.
2. Sripa B., Kaewkes S., Sithithaworn P. et al. Liver Fluke Induces
Cholangiocarcinoma // PLoS Medicine. 2007. -Vol. 4.-P.1148-1155.
3. Nockler K., Dell K., Schuster R., Voigt W. P. Indirect ELISA for the detection of
anti-bodies against Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) and Metorchis bilis (Braun,
1790) in foxes // Veterinary parasitology.- 2003.-Vol.110.- P.207-215;
4. Wongratanacheewin S, Sermswan RW, Sirisinha S. Immunology and molecular
biology of Opisthorchis viverrini infection// Acta. Trop.- 2003.-Vol.88.-P.195–207.
5. Laha T., Sripa J., Sripa B. et al. Asparaginal endopeptidase from carcinogenetic
liver fluke O.viverrini and its potential for serodiagnosis // Int. J. Infect. Dis.- 2008.- Vol.
12 (6).- P.49-59.
6.Li S., Shin J.G., Cho P.Y. et al. Multiple recombinant antigens of C.sinensis for
serodiagnosis of human clonorchiasis // Parasitol. Res.- 2011.- V.108.- P.1295-1302.
7. Zhao Q.P., Moon S.U. et al. Evaluation of Clonorchis sinensis recombinant
7-kilodalton antigen for serodiagnosis of clonorchiasis // Clin. Diagn. Lab.
Immunol.-2004.-Vol.11(4).- P. 814—821.
8. Jittiyawadee S., Brindley P., Sripa B., et al. Evaluation of liver fluke recombinant
cathepsin B-1 protease as a serodiagnostic antigen for human opisthorchiasis//
Parasitology International.- 2012.-Vol.61.-P. 191–195.
9. Eursitthichaia V., Viyananta V., Tesanab S. et al. Opisthorchis viverrini:
Evaluation of 28 kDa glutathione S-transferase as diagnostic tool in human opisthorchiasis
//Acta Tropica.-2010.-Vol.114.-P.76–80.
10. Разумов И.А., Львова М.Н., Пономарева Е.П. и др. Антигенные свойства
рекомбинантного аналога белка легумаин трематоды Opisthorchis felineus,
вызывающей описторхоз у человека//Бюллетень сибирской медицины-2012.- №
6.-С.166-172.
11. Ju J.W., Joo H.N. et al. Identification of a serodiagnostic an-tigen, legumain, by
immunoproteomic analysis of excretory-secretory products of Clonorchis sinensis adult
worms // Proteomics.- Vol. 9 (11).- P.3066-3144.
12. Homwutthiwong K., Meepol A., Grams R. Cloning, characterization, and
expression of vitelline protein BI and its encoding gene in the liver fluke F. gigantica //
Southest Asian J. Trop. Med. Public Health.- 2009.- Vol.40.- № 2.- P.199-210.
13. Pinlaor P., Kaewpitoon N., Laha T., Sripa B. et al. Cathepsin F cysteine protease
of the human liver fluke, O. viverrini // PLoS Negl. Trop. Dis.- 2009.- Vol. 3.- P.398.
14. Носова А. А., Белавин П. А., Афонников Д. А. Компьютерный и
экспериментальный анализ антигенных свойств вителлина и катепсина F O. felineus
//Медицинский академический журнал.- 2012 г.- Т.12.- № 4.- С.33-35.