Основы полимеразной цепной реакции
advertisement
Основы полимеразной цепной реакции Национальная научная лаборатория биотехнологии коллективного пользования Шевцов А.Б. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 ЧтоЧто служит основой ПЦР реакции? ция ДНК — процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Открытию ПЦР послужило Основные принципы использования праймеров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) и состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь для получения копий ДНК впервые были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году [K., Ohtsuka E., Kleepe R, Molineux R., Khorona R.. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replication of short synthetic DNA’s as catalysed by DNA polymerases // J. Mol. Biol. - 1971. – Vol. 56. – P. 341-346.]. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Kleppe K., Ohtsuka E., Kleepe R, Molineux R., Khorona R.. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replication of s Кто это сделал Полимеразная цепная реакция была открыта в 1983 году Кэри Маллисом (Kary Mullis). Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Определение • Полимеразная цепная реакция – это экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК, РНК) в биологическом материале (пробе). Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Год Число публикаций 1985 1 1986 3 1987 8 1988 139 1989 698 1990 2 668 1995 11 890 2000 16 430 2004 20 075 Компоненты ПЦР реакции ДНК-матрица, Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза),Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 ДНК - линейный сополимер ортофосфорной кислоты и дезоксирибозы, связанный с нерегулярно-повторяющимися нуклеиновыми основаниями, выделенный Ф. Мишером в 1869 из ядер лейкоцитов Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 5’конец 3’конец 5’конец 3’конец Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Tимин Пиримидины Aденин T Пурины Гуанин Цитозин Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Цитозин Гуанидин Тимиин - Аденин Пурины Пиримидины Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Длина праймеров 18-30 нуклеотидов GC-состав 45-55%, близок к GCсоставу матрицы Разница в температурах отжига не более 5оС Не должны формировать шпилек на 3-конце Не должны формировать димеры по 3-концам Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Некоторые характеристики ДНК-полимераз Полимеразы Время полужизни при 95С (min) Экзонуклеазная Экзонуклеазна активность 5'-3' я активность (+/-) 3'-5' (+/-) Достройка 3'-концов Taq 40 + - А-он Tth 20 + - A-он Pfu 120 - + blunt ends Vent 400 - + blunt ends 1300 - + blunt ends 50 - + blunt ends 120 при 100С - + blunt ends Deep Vent UlTma Pwo Стадии ПЦР Цикличность реакции: Существует 3 больших ступени в пцр, которые повторяются 20-40 раз. Эти циклы проходят в аппарате – термоциклере , который может повышать и снижать температуру в реакционной смеси за очень короткое время. Денатурация – около 94°C : Во время денатурации двойная цепь ДНК плавится и образуются одноцепочечные ДНК (все энзиматические реакции останавливаются). Аннеалинг (отжиг) – около 54°C : Водородные связи постоянно формируются и разрушаются между одиночными праймерами и одноцепочечной ДНК. Если праймер садится на комплементарный участок ДНК, водородные связи настолько сильны, что праймер остается на матрице. Удлинение (элонгация) – около 72°C : Полимераза присоединяет dNTP‘s начиная с 3‘-конца праймера строго комплементарно матрице и двигается по матрице от 5‘конца к 3‘концу. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Стадии ПЦР Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Стадии ПЦР Экспоненциальное увеличение количества копий в течение ПЦР Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Старый добрый ПЦР амплификатор Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Taq полимераза Taq-полимераза была впервые охарактеризована русским биохимиком Алексеем Калединым в 1980 году. Стоит отметить что Taq-полимераза самый дорогой компонент пцр смеси. Важно знать, что любая полимераза работает только с комплексом элонгации, который состоит из праймера и матрицы. Йеллоустоун (национальный парк) Thermus aquaticus Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные ПЦР амплификаторы Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Детекция пцр продуктов Варианты детекции: 1.Гель – электрофорез 2.Гибридизация Гель-электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Оптимизация ПЦР Оптимизация по температуре ПЦР очень сильная техника, если нет результатов имеет смысл оптимизировать состав реакционной смеси Основные изменяемые параметры ПЦР: -Концентрация матрицы, нуклеотидов, ионов Mg2+ и полимеразы, смена используемой полимеразы (Taq, Vent , Pfu) Оптимизация по ионам Mg2+ -Добавление ДМСО, бетаина, формамида -Подбор температуры отжига праймеров -Использование HotStart -Дизайн праймеров Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Дизайн и подбор праймеров Основные правила подбора праймеров для ПЦР Возможно наиболее важным для успешной амплификации является Правильный подбор праймеров Выбор праймеров: - Длина праймера - Температура плавления (Tm) - Специфичность - Cостав G/C оснований - Последовательность 3’-конца Длина праймеров - Специфичность и температура отжига напрямую зависят от длины праймера - Праймеры с длиной 20-30 оснований обладают высокой специфичностью - Праймер не должен быть коротким – это снижает специфичность Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Дизайн и подбор праймеров Комплементарность - 4 или более 3´-концевых нуклеотида не должны быть комплементарны самому себе или другому праймеру в пробе - С 5´конца праймера может быть присоединена некомплементарная матрице последовательность. G/C состав - в идеале праймер должен иметь случайную смесь нуклеотидов с 50% GC содержанием - не должно быть на концах поли-G или поли-C чтобы предотвратить образование непецифичных продуктов Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Дизайн и подбор праймеров Температура плавления (Tm) -Температура плавления праймера – это температура при которой половина молекул свободна, а другая половина молекул гибридизована с матрицей -Для расчета температуры плавления наиболее проста и популярна формула Уоллеса : Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C - a general rule-of-thumb is to use an annealing temperature that is 5°C lower than the melting temperature Температура отжига (Ta) -Температура отжига праймера – это характеристика реакционной смеси, она рассчитывается следующим образом: Tа ≈ Tm -5 °C -Оба праймера должны быть подобраны так, чтобы иметь сходные температуры плавления. -Праймеры с низкой Tm не будут работать при высоких температурах отжига Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Дизайн и подбор праймеров программное обеспечение для дизайна праймеров: •OLiGO (Molecular Biology Insight Inc.) •GeneRunner (Hustings Software) •Primer Select/DNASTAR (DNASTAR Inc.) Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Hot start ПЦР •Добавление одного из компонентов пцр смеси позже , при высоких температурах •Разделение барьером •Ингибирование активности полимеразы антителами •Химическая модификация полимеразы термо- или рН лабильными химическими группами Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Преимущества ПЦР •Специфичность • Воспроизводимость •Чувствительность •Достоверность Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Разновидности ПЦР •Nested PCR (гнездная – пцр со вложенными праймерами. •RT-PCR – пцр , где в качестве матрицы используется РНК, реакция идет с обратной транскрипцией •Real time PCR – пцр в режиме реального времени Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Вещества улучшающие специфичность и выход пцр продукта •Влияющие на Tа ДНК и праймеров – формамид, диметилсульфоксид (ДМСО), сперимидин. •Влияющие на конформацию ДНК (белок SSB, белок 34 фага Т4) •Вляющие на свойства полимеразы (бетаин, БСА, желатин, глицерин) Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Вещества улучшающие специфичность и выход пцр продукта Вещество Используемая концентрация Механизм действия Acetamide ~5% Повышение растворимости Betaine Na 0,5-2М Стабилизация фермента, выравнивание Tm AT- и GCбогатых последовательностей DMSO 2-15% Повышение растворимости Formamide 1-5% Glycerol 5-20% Стабилизация фермента Twin 20, Triton X-100 0,1-0,5% Стабилизация фермента BSA 0,1 Стабилизация фермента TMA chloride 0,01-0,1 Повышение специфичности Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Вещества ингибирующие ПЦР •Гепарин •Ацетилированный БСА • NaCl •Изопропанол •РНК •Гемоглобин •Ацетат натрия при>5mM. Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Стадии ПЦР анализа Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012 СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ! Ваши вопросы??? Современные проблемы биологии, ЕНУ, Астана, 2012
