На правах рукописи - Российский кардиологический научно
advertisement
Российский кардиологический научно-производственный комплекс Институт клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова На правах рукописи Домбровский Андрей Леонидович Влияние терапии статинами в разных дозах на эндотелиальные прогениторные клетки и факторы ангиогенеза у больных ИБС 14.01.05 – Кардиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: д.м.н. Сергиенко Игорь Владимирович Научныйконсультант: к.м.н. Рвачева Анна Валерьевна Москва 2015 г. Оглавление СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................................................................................................... 3 ВВЕДЕНИЕ: АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ ................................................................................................... 4 ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ .................................................................................................................. 7 ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................................................ 10 МЕХАНИЗМЫ НЕОАНГИОГЕНЕЗА ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА..................................................... 10 ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ: ИСТОЧНИКИ И ФЕНОТИПЫ .................................................. 22 ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ И ВАСКУЛОГЕНЕЗ ................................................................. 23 РОЛЬ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК В ВОССТАНОВЛЕНИИ ФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ ............. 24 ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ РИСКА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ НА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ ....................................................................................................................................... 26 1.6 ВЛИЯНИЕ СОПУТСТВУЮЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ ................. 31 1.7 ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ В ТЕРАПЕВТИЧЕСКОМ АНГИОГЕНЕЗЕ ................................... 34 1.8 ВЛИЯНИЕ СТАТИНОВ НА ФАКТОРЫ АНГИОГЕНЕЗА И ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ ........... 38 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .............................................................................. 43 2.1 2.2 2.3 МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ ......................................................................................................................... 43 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................................................................................................. 46 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ..................................................................................................................... 52 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................................................................ 53 3.1 СОДЕРЖАНИЕ ЭПК, СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА (VEGF), ЭНДОСТАТИНА И MCP-1 В КРОВИ У БОЛЬНЫХ ИБС И ЗДОРОВЫХ ДОБРОВОЛЬЦЕВ ........................................................................... 53 3.2 СВЯЗЬ ЭПК, VEGF, ЭНДОСТАТИНА И MCP-1 С ФАКТОРАМИ РИСКА У БОЛЬНЫХ ИБС .............................. 58 3.3 СОПОСТАВЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЭПК, ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЛИПИДНОГО ПРОФИЛЯ И КОНЦЕНТРАЦИИ VEGF, ЭНДОСТАТИНА, MCP-1 И СРБ В КРОВИ У БОЛЬНЫХ ИБС ......................................................................... 61 3.4 ВЛИЯНИЕ ТЕРАПИИ АТОРВАСТАТИНОМ В ДОЗЕ 10 МГ И 40 МГ НА УРОВЕНЬ ЭПК, ФАКТОРОВ АНГИОГЕНЕЗА И ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЛИПИДНОГО ПРОФИЛЯ. ........................................................................................ 63 3.5 СОПОСТАВЛЕНИЕ ДИНАМИКИ ЭПК С ДИНАМИКОЙ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЛИПИДНОГО ПРОФИЛЯ У БОЛЬНЫХ ИБС НА ФОНЕ ТЕРАПИИ АТОРВАСТАТИНОМ В РАЗЛИЧНЫХ ДОЗАХ ....................................................................... 67 ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................................................................................. 69 ВЫВОДЫ .................................................................................................................................................................. 78 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................................................................... 79 2 Список сокращений NYHA – Нью-Йоркская Ассоциация сердца MCP-1 – моноцитарный хемотаксический протеин-1 VEGF – фактор роста сосудистого эндотелия АГ – артериальная гипертония ДАД – диастолическое артериальное давление ИБС – ишемическая болезнь сердца ИМ – инфаркт миокарда ИМТ – индекс массы тела ЛВП – липопротеиды низкой плотности ЛНП – липопротеиды высокой плотности ОХС – общий холестерин ОКС – острый коронарный синдром ПИКС – постинфарктный кардиосклероз САД – систолическое артериальное давление СД – сахарный диабет СОЭ – скорость оседания эритроцитов СРБ – C-реактивный белок ТГ – триглицериды ЧСС – частота сердечных сокращений ЭПК – эндотелиальные прогениторные клетки 3 Введение: актуальность проблемы За последние годы усилиями российской медицинской науки удалось наметить тенденцию к снижению смертности от сердечно-сосудистых заболеваний. По данным Росстата, смертность от ССЗ в 2003 году составляла 927, а в 2013 году – уже 698 человек на 100 тыс. населения Российской Федерации [1]. Однако эти цифры все еще в 4-5 раз превышают показатели развитых стран мирового сообщества [1]. При этом в структуре смертности от ССЗ по-прежнему более 50% приходится на ишемическую болезнь сердца – заболевание, основу которого составляет атеросклеротическое поражение коронарных артерий. Одним из основных механизмов патофизиологии атеросклероза является нарушение структуры и функции сосудистого эндотелия, выполняющего важнейшие задачи по поддержанию и управлению сосудистым тонусом и эластичностью. В норме функция эндотелия находится в сложном балансе между апоптозом и обновлением эндотелиоцитов, и этот процесс является уязвимым для негативного воздействия различных факторов риска. В настоящее время значительная роль в восстановлении сосудистого эндотелия отводится эндотелиальным прогениторным клеткам (ЭПК) – одной из популяций стволовых клеток иммунной системы, способных дифференцироваться исключительно в эндотелиоциты [2]. Считается, что в процессе дифференцировки ЭПК в зрелые эндотелиальные клетки, они участвуют в процессах восстановления эндотелия и неоангиогенезе не только на этапе эмбрионального развития, но и во взрослом организме [3, 4]. Кроме того, ЭПК эффективно помогают поддерживать целостность сосудистого эндотелия, что тормозит развитие атеросклероза. В 1997 году в работе Asahara et al было показано, что некоторые клетки, выделенные из костного мозга, могут быть использованы для репарации эндотелия сосудов и восстановления кровоснабжения в 4 ишемизированных тканях [5]. С этого момента было выполнено множество экспериментальных работ, доказавших, что эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК) оказывают влияние на ишемические процессы [6, 7]. Тем не менее, эти многообещающие данные не вполне подтвердились дальнейшими клиническими исследованиями. Несмотря на то, что низкий уровень циркулирующих ЭПК признается независимым фактором риска сердечно-сосудистых осложнений, что может отражать недостаточность репарации эндотелия [8], механизмы участия ростовых факторов и ЭПК в восстановлении поврежденных тканей и формировании новых сосудов не вполне изучены до сих пор. Кроме того, прогениторные клетки могут оказывать и деструктивные эффекты – потенцировать атеросклеротические процессы, оказывать влияние на дестабилизацию бляшки и ремоделирование артерий. Несмотря на выявление множества различных классов ЭПК, из них не вполне определены терапевтически пригодные фенотипы, способные дифференцироваться исключительно в эндотелиальные клетки [9]. Так, все гематопоэтические стволовые клетки являются носителями маркеров CD34+ и CD133+, при этом на поверхности ЭПК экспрессируются и эндотелиальные маркеры, такие как рецептор-2 сосудистого эндотелиального фактора роста VEGFR-2 (CD309), а также СD31, эндотелиальная синтаза оксида азота (NO) и сосудистый эндотелиальный кадгерин [10-12]. В эндотелиальные клетки могут дифференцироваться как менее зрелые предшественники (фенотипа CD133+/CD34+/CD309+), так и более зрелые. Все же многие авторы сходятся во мнении, что к ЭПК следует относить разные субпопуляции клеток-предшественников, в основном коэкспрессирующие указанные три маркера в различных сочетаниях: CD133+/CD34+, CD133+/CD309+, CD34+/CD309+, CD133+/CD34+/CD309+ [13-15]. Ввиду такого разнообразия классов ЭПК, в настоящее время имеется несколько наборов 5 для выявления различных их фенотипов, что приводит к ситуации, когда культуры в разных условиях продуцируют разные сочетания фенотипов ЭПК, в частности, “ранних” (недифференцированных) и “поздних” клеток. Среди факторов, способствующих повышению плазменного титра ЭПК и привлечению их в область повреждения, следует упомянуть оксид азота, эстрогены, липопротеины высокой плотности (ЛВП), эритропоэтин, а также группу сосудистых эндотелиальных факторов роста (VEGF) [16, 17]. VEGF оказывают множество эффектов на эндотелиальные клетки, связанные с ангиогенезом: выживаемости клеток, повышенную продукцию миграцию, активаторов увеличение плазминогена и интерстициальных коллагеназ [18, 19]. Важным направляющим сигналом для ЭПК, при мобилизации в зону повреждения, является стромальный хемокин SDF-1. Другой хемокин – моноцитарный хемотаксический протеин-1 (MCP-1), повышает приток мононуклеарных клеток, также стимулируя артериогенез. MCP-1, из-за его направленной клеточной специфичности, играет патогенную роль при множестве различных заболеваний, характеризующихся инфильтрацией мононуклеарных клеток, включая атеросклероз и ревматоидный артрит. Повышенные уровни MCP-1 были выявлены в связи с ишемией миокарда [20-22]. К факторам, ингибирующим ангиогенез, относятся тромбоспондин, ангиостатин и эндостатин. В частности, эндостатин ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток, соответственно подавляя ангиогенез и рост опухолей [23]. Помимо собственно терапии с помощью ЭПК, существует и другой подход, связанный с попыткой активации пролиферации собственных ЭПК, увеличения их выживаемости и активности в зоне повреждения с помощью медикаментозной терапии, в том числе статинами. Так, в некоторых исследованиях показано, что статины оказывают положительные эффекты 6 на стволовые клетки, снижая уровень их апоптоза и увеличивая способность к регенерации ишемизированных тканей [24, 25]. В связи с этим, представляется актуальным изучить влияние терапии разными дозами статина на содержание эндотелиальных прогениторных клеток, и соотнести полученные изменения с динамикой факторов ангиогенеза и показателями липидного профиля. Цель и задачи исследования Цель исследования: Определить содержание эндотелиальных прогениторных клеток (endothelialprogenitorcells - ЭПК) и ростовых факторов у больных ИБС и оценить влияние на них терапии аторвастатином в дозе 10 и 40 мг Задачи исследования: 1. Сопоставить содержание ЭПК, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), эндостатина и MCP-1 в крови у больных ИБС и здоровых добровольцев 2. Оценить связь ЭПК, VEGF, эндостатина и MCP-1с факторами риска у больных ИБС 3. Сопоставить содержание ЭПК с показателями липидного профиля, концентрацией VEGF, эндостатина, MCP-1 и СРБ в крови у больных ИБС 4. Оценить влияние терапии аторвастатином в дозе 10 мг/сут. и 40 мг/сут. на уровень ЭПК 5. Оценить влияние терапии аторвастатином в дозе 10 мг/сут. и 40 мг/сут на уровень факторов ангиогенеза 6. Сопоставить динамику ЭПК с динамикой показателей липидного профиля у больных ИБС на фоне терапии аторвастатином 7 Научная новизна В настоящей работе впервые в мире изучено влияние различных доз статинов на концентрацию ЭПК, фенотипа CD34+/CD133+/CD309+. Анализ распределения количества ЭПК продемонстрировал большие значения дисперсий. Выполнено сопоставление уровня ЭПК у здоровых лиц и у больных ИБС. Показано, что у больных ИБС количество ЭПК значительно снижается. Также в работе изучены особенности уровня факторов ангиогенеза в крови больных ИБС и здоровых добровольцев. Показано, что у больных ИБС по сравнению с добровольцами отмечено достоверное снижение концентрации эндостатина, а также достоверное повышение уровня VEGF. Уровень MCP-1 у здоровых лиц и больных ИБС не различался. При сравнении уровней ЭПК, VEGF, эндостатина и MCP-1 у мужчин и женщин достоверных различий не выявлено. Также не выявлена связь этих факторов с возрастом, индексом массы тела, наличием отягощенного анамнеза, наличием артериальной гипертонии, с перенесенным ранее инфарктом миокарда. У некурящих больных ИБС уровень эндостатина был достоверно выше, чем у курящих. Выявлена положительная корреляция между ЭПК и ОХС, корреляция уровня ЭПК и ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ, VEGF, эндостатина, MCP-1, СРБ отсутствовала. На фоне терапии аторвастатином было выявлено достоверное увеличение числа ЭПК. Такая достоверность прослеживалась как в группе аторвастатина 10 мг/сут, так и в группе аторвастатина 40 мг в сутки. То есть, доза статина не оказывала влияние на выраженность прироста количества ЭПК. Показано, что чем ниже были исходные значения ЭПК у пациентов перед началом терапии статином, тем более значительный их прирост наблюдался на фоне терапии. 8 Научно-практическая значимость Продемонстрированное в работе дозонезависимое влияние терапии аторвастатином на уровень ЭПК открывает еще один механизм действия данных препаратов, что может быть использовано для дальнейших исследований в области плейотропного действия статинов. Это имеет важное практическое значение в вопросах выбора моно- или комбинированной гиполипидемической терапии. Поскольку восстановление количества ЭПК у больных с ИБС реализуется вне зависимости от дозы статина, то при выборе терапевтической тактики не имеет смысла отдавать предпочтение использованию высоких доз статинов перед умеренными дозами в комбинации с блокаторами всасывания холестерина или в комбинации с другими перспективными гиполипидемическими препаратами, появление которых в Российской Федерации ожидается в 2016 году (антитела к пропротеинсубтилизин-кексинкиназе 9). 9 Глава I. Обзор литературы 1.1 Механизмы неоангиогенеза при ишемической болезни сердца Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смертности в мире. У больного с хронической ишемической болезнью сердца запускаются эндогенные защитные механизмы – неоваскуляризация, которая является совокупностью процессов ангиогенеза, артериогенеза и, потенциально, васкулогенеза. Ангиогенез заключается в формировании новых капилляров от посткапиллярных венул [26]. У пациентов с ИБС ангиогенез, в основном, стимулируется тканевой гипоксией путем активации индуцированным гипоксией фактором экспрессии (hypoxiainduciblefactor (HIF-1)), который увеличивает транскрипцию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), рецепторов flt-1 сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF receptors flt-1) и нейропилина-1 [27]. Это приводит к значительному увеличению размеров капиллярного депо, однако, в случае проксимальном наличия артериальном гемодинамически кондуите, значимого улучшение стеноза кровотока в не отмечается. Логическим завершением процесса ангиогенеза можно считать артериогенез. В противоположность ангиогенезу, артериогенез является процессом развития denovo коллатеральных кондуитов с формированием сосудов, способных значительно увеличивать кровоток [28, 29]. Размеры этих сосудов достаточны, чтобы визуализироваться ангиографически [30]. Предполагается, что первичными стимулами артериогенеза являются напряжение сдвига и скопление мононуклеарных клеток крови в местах сужения артерий, приводящее к высвобождению и продукции факторов ангиогенеза, включая фактор роста фибробластов (fibroblastgrowthfactor (FGF)), фактор роста тромбоцитов (plateletderivedgrowthfactor (PDGF)) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor 10 (VEGF)) [31]. Завершающим этапом ангиогенеза является построение базальной мембраны. В данном процессе основное участие принимают эндотелиальные клетки. Для завершения процесса артериогенеза необходимо образование гладкомышечных клеток, которые появляются за счет пролиферации и миграции [32]. Так же было предположено, что неоваскуляризация не ограничивается только процессами ангиогенеза и артериогенеза, но также может включать васкулогенез. Васкулогенез - это процесс формирования кровеносных сосудов insitu из эндотелиальных и сосудистых клеток-предшественников (EPCs и VPCs) [33, 34]. Функциональная роль васкулогенеза в формировании ишемической болезни при оценке коронарного и периферического кровотока не была установлена, и само наличие этой роли оспаривается. Поэтому ангиогенез, артериогенез и, потенциально, васкулогенез вносят свой вклад в неоваскуляризацию сердца взрослых людей. Молекулярные контролируются механизмы, регулирующие многочисленными про- и неоваскуляризацию, антиангиогенными растворимыми полипептидами, такими как сосудистый эндотелиальный фактор роста, ангиопоэтины, фактор роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста, трансформирующий фактор роста- (TGF), фактор некроза опухоли- (TNF-), колониестимулирующие факторы, такие как G-CSF и GM-CSF, CXC хемокины и др., активирующие или подавляющие процессы неоваскуляризации [35]. К тому же, некоторые мембрансвязанные белки играют огромную роль в неоваскуляризации (интегрины, кадгерины, синдеканы, эфрины). Механические стимулы также могут обладать про- и антиангиогенными эффектами [36, 37]. Несмотря на способность миокарда стимулировать неоваскуляризацию в ответ на прогрессирующее уменьшение артериального кровотока, в подавляющем большинстве случаев этот ответ довольно ограничен и 11 недостаточно компенсирует снижение кровоснабжения. В ситуациях, когда естественный неоваскуляризационный предотвратить некроз миокарда, но ответ достаточен, недостаточен для чтобы сохранения нормальной сократимости сердечной мышцы даже в покое, формируется гибернированный сократимости с миокард, целью что проявляется уменьшения локальным потребления снижением кислорода и восстановления баланса между его доставкой и потреблением [38]. Гибернированный миокард жизнеспособен, но через какое-то время могут запуститься процессы, приводящие к апоптозу кардиомиоцитов, ремоделированию миокарда и структурным изменениям, включающим потерю контрактильного субстрата кардиомиоцитов, а также увеличению количества интерстициальной соединительной ткани, ведущее к необратимому миокардиальному фиброзу. Исследование, проводившиеся на лабораторных мышах, генетически лишенных VEGF164 и VEGF188 изоформ, продемонстрировало формирование прогрессирующей сердечной недостаточности на фоне дефицита факторов роста ангиогенеза [39]. Подобным же образом, недостаток сердечного, специфичного к миоциту HIF-l приводит к снижению сократимости, высокоэнергетических фосфатов васкуляризации, [40]. Наличие таких содержания лабораторных моделей необходимо для дальнейших исследований все еще не ясной роли факторов роста ангиогенеза в развитии васкуляризации и определения эффективности экзогенных факторов роста в гибернированном миокарде. Было выявлено большое число ангиогенных факторов, способных стимулировать неоваскуляризацию ишемизированной ткани в миокарде [41]. Ингибирование ангиогенеза достаточно давно и успешно используется для лечения онкологических заболеваний, однако использование обратного процесса в кардиологии пока затруднено. Среди множества факторов роста, 12 участвующих в регуляции ангио- и артериогенеза, наиболее важными стимуляторами этих процессов являются сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), семейство факторов роста фибробластов (FGFs), фактор роста гепатоцитов (HGF), а также трансформирующий фактор роста TGFβ. Сосудистые эндотелиальные факторы роста (VEGFs), вероятно, наиболее изученная группа факторов ангиогенеза. Наиболее известным является VEGF-A. В результате альтернативного сплайсинга вырабатывается по крайней мере 4 изоформы VEGF-A, содержащие 121 (VEGF121), 165 (VEGF165), 189 (VEGF189), 206 (VEGF206) аминокислоты [42]. Есть данные и по другим изоформам (VEGF145), но их значение остается неустановленным [43]. Вследствие отличия изоформ VEGF по их способности связываться с гепарином различается и их потенциальная роль в ангиогенезе: VEGF165 имеет гораздо большее значение, чем VEGF121. VEGF121 и VEGF165 секретируются в экстрацеллюлярном пространстве, в то время, как VEGF189 и VEGF206 всегда находятся внутри клетки из-за их большого сродства к гепаринсульфату. Другие представители группы VEGF: VEGF-В (VEGF-3), VEGF-С (VEGF-2), VEGF-D, VEGF-E и плацентарный фактор роста (PlGF). VEGF-E является вирусным белком, не имеющим гомологов среди млекопитающих. Все формы VEGF с разной афинностью связываются с одним, двумя либо со всеми тремя рецепторами VEGF группы тирозин киназ: fit-1 (VEGFR-1), KDR/flk-1 (VEGFR-2) и flt-4 (VEGFR-3). Предполагается, что VEGFR-2 наиболее активны в передаче сигналов ангиогенеза, хотя, судя по активности PlGF и VEGF-D, VEGFR-1 также задействованы в передаче этих сигналов. Показано, что VEGF-D сильнее всех других представителей группы VEGF стимулирует ангиогенез и лимфогенез в скелетной мускулатуре [43]. 13 VEGF оказывают множество эффектов на эндотелиальные клетки, которые включают повышенную миграцию, увеличение выживаемости клеток, продукцию активаторов плазминогена и интерстициальных коллагеназ, все это связано с ангиогенезом [18, 19]. VEGF не индуцирует пролиферацию других клеток, таких как гладкомышечные клетки или фибробласты, хотя и усиливает миграцию гладкомышечных клеток [44]. Точная роль VEGFR-3 менее ясна, но установлено, что они участвуют в лимфогенезе [45]. Среди других полипептидов, активирующих рост сосудов, выделен способный PDGF-BB, формирующихся артериогенез стимулировать сосудистых [46]. G-CSF, структур, GM-CSF покрытие таким и образом, MCP-1 перицитами стимулируя повышают приток мононуклеарных клеток, также стимулируя артериогенез. Следствием инфаркта миокарда является структурное и молекулярное ремоделирование, ведущее к расширению полости ЛЖ, истончению стенки в зоне инфаркта, фиброзу, и, как следствие, к прогрессивному снижению сократительной функции миокарда [47]. В зарубежных публикациях показано, что увеличение количества кардиомиоцитов посредством введения экзогенной популяции стволовых клеток костного мозга может оказаться эффективным в регенерации погибших кардиомиоцитов, а также замедлить, или даже сделать обратимым, процесс ремоделирования [48]. Хотя важность миокардиального ремоделирования после повреждения и регенерации не вызывает сомнений, механизмы, лежащие в основе этих процессов остаются неясными. Биомолекулярная основа повреждения миокарда с развитием функциональных расстройств позволяет говорить о ведущей роли стресс-индуцированных цитокинов в этом процессе, в частности о роли TGFβ [49]. 14 TGFβ был впервые выделен более 20 лет назад из культуры клеток саркомы по его способности стимулировать способность эпидермального фактора роста вызывать трансформацию и пролиферацию не- неопластических (non-neoplastic) фибробластов [50, 51]. В настоящее время известно более 30 структурно сходных представителей семейства TGFβ, включая TGFβ1. Эти цитокины были разделены на подгруппы согласно сходству последовательности и специфической направленности сигнальных систем в семействах TGFβ1 [52]. TGFβ связан с широким спектром биологических процессов, включая клеточную пролиферацию, рост, дифференцировку и апоптоз. TGFβ играет роль в патофизиологии различных заболеваний гемодинамическую сердечно-сосудистой перегрузку и [53] системы. ишемию В ответ миокарда на [54] кардиомиоциты синтезируют и секретируют TGFβ1. Действие TGFβ опосредовано взаимодействием рецепторов I и II типов, стимулированным лигандами [55]. постинфарктном определяющие Доказано, что TGFβ1 ремоделировании развивающийся со играет миокарда временем важную [56]. роль в Механизмы, неоднозначный ответ поврежденного миокарда на воздействие TGFβ остаются неясными, можно предположить, что преимущественно важную роль играют тип стимулированных клеток (кардиомиоцит/фибробласт) и активированный каскад реакций [57]. В ремоделировании миокарда взрослых людей участвуют многие представители суперсемейства TGFβ. Более того, члены семейства TGFβ, включая TGFβ1, участвуют в процессе дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты и играют ведущую роль в экспрессии кардиоспецифических маркеров [58, 59]. Статья Li с соавторами [60] подтверждает значимость TGFβ1 в дифференцировке кардиомиоцитов из гемопоэтической колонии клеток костного мозга взрослых мышей. Доказана не только связь TGFβ1 со структурным 15 ремоделированием и дифференцировкой зрелых стволовых клеток, но и терапевтический потенциал применения как антагонистов TGFβ1 (при ремоделировании), так и агонистов TGFβ1 (для дифференцировки зрелых стволовых клеток). Фактор роста гепатоцитов (HGF), исходно считался специфическим для гепатоцитов фактором роста, однако сейчас известно, что он является фактором роста с большим количеством функций и его рецептор c-met присутствует не только на эпителиальных клетках, но и на кардиомиоцитах, эндотелиальных клетках и гематопоэтических клетках [61]. Основными функциями HGF является стимуляция митогенеза, подвижности, морфогенез и обеспечение усиление клеточной выживания клеток [62]. Соответственно HGF потенциально может модифицировать некоторые ключевые процессы ангиогенеза, что объясняет благоприятный эффект повышения уровня HGF у пациентов с острым коронарным синдромом [63]. HGF является мощным ангиогенным фактором, что может иметь большое значение в условиях ишемии миокарда [64]. В нескольких экспериментальных работах HGF обладал протективным эффектом при ишемии/реперфузии миокарда. Ono с соавторами показали повышение экспрессии HGF и его рецептора на экспериментальной модели инфаркта миокарда [65]. Это указывает на то, что активация системы HGF может быть частью защитной программы в условиях острой ишемии миокарда. Важно, что экспрессия HGF быстро возрастает при многих патологических процессах, тогда как повышение экспрессии рецептора HGF специфично для ишемии миокарда. Кроме того, Nakamura с соавторами обнаружили, что введение HGF крысам на модели ишемии/реперфузии приводит к значительному подавлению апоптоза в миокарде, ограничению инфарктной зоны и улучшению сердечной функции, тогда как введение антител, нейтрализующих HGF, увеличивало зону инфаркта и смертность от 16 сердечной недостаточности [66, 67]. Другие исследования выявили, что HGF обладает кардиопротективным действием у пациентов с нестабильной стенокардией. Основной мишенью HGF являются сосудистые эндотелиальные клетки. В эксперименте было показано, что HGF восстанавливает вызванную ишемией эндотелиальную дисфункцию поддерживает эндотелий-зависимую регуляцию коронарного кровотока [68]. HGF также стимулирует пролиферацию гематопоэтических клетокпредшественников. Недавние исследования продемонстрировали, что гематопоэтические клетки-предшественники способствуют регенерации эндотелия после деэндотелизации [69]. Таким образом, кроме ангиогенных эффектов, HGF способен вызывать регенерацию эндотелия обеспечивая улучшение выживания вышеизложенное, клеток повышенный соответствовать лучшему и подавляя уровень HGF апоптоз. в Учитывая сыворотке может клиническому прогнозу у больных ИБС благодаря комбинации его кардиопротективного и васкулопротективного эффектов. Вероятно, мероприятия увеличивающие уровень HGF в крови больных могут быть благоприятными для пациентов с прогностической точки зрения [70, 71]. Однако данных о влиянии уровня HGF на прогноз больных после АКШ или эндоваскулярной реваскуляризации в литературе в настоящее время нет. Другую группу, активно исследуемых в настоящее время ангиогенных факторов, представляет семейство факторов роста фибробластов – FGF [72]. Факторы роста фибробластов включают не только кислый (acidic) FGF (FGF1) и основной (basic) FGF (FGF2), но также еще 21 структурно сходных полипиптидных факторов роста [73, 74]. Биологическая функция FGF заключается в посредничестве, в первую очередь, через специфические рецепторы клеточной поверхности группы тирозин киназ и рецепторы синдекан-4 (не из группы тирозин киназ) [75, 76]. Подобно VEGF, FGF 17 стимулирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, продукцию активатора плазминогена и коллагеназ. В отличие от VEGF, FGF стимулирует пролиферацию мезодермального и большинства нейроэктодермального клеток эмбрионального происхождения, включая перициты, фибробласты, миобласты, хондроциты и остеобласты [77]. В наибольшей степени исследованы два представителя этого семейства - aFGF (кислый или FGF-1) и bFGF (щелочной или FGF-2) [78, 79]. Факторы роста фибробластов связываются со своими высоко аффинными рецепторами на поверхности эндотелиальных и гладкомышечных клеток [77]. Наряду с митогенным действием, представители семейства FGF стимулируют продукцию эндотелием различных протеаз, в том числе активаторов плазминогена и коллагеназы, способных к ферментативному расщеплению внеклеточного матрикса. bFGF также способен улучшать микроциркуляцию в ишемизированных зонах [80]. Как и VEGF, bFGF стимулирует вазодилатацию и его системное введение способно приводить к значительной гипотензивной реакции [81]. Сосуды в ишемизированной ткани особенно чувствительны к сосудорасширяющему действию факторов роста, что возможно связано с индуцированной хронической ишемией повышенной экспрессией их рецепторов. После восстановления коронарного кровотока нормализуется как чувствительность микрососудов к вазодилатирующему действию ростовых факторов, так и экспрессия рецепторов факторов роста. Ишемия приводит к усилению экспрессии FGF и его рецепторов [82], параллельно со стимуляцией роста эндотелиальных клеток. У больных с хронической ИБС уровень bFGF в сыворотке крови значительно ниже, чем у больных с острым коронарным синдромом [83], однако подобные различия достоверно не отражаются на прогнозе больных. Эти данные свидетельствуют о том, что хотя bFGF в эксперименте увеличивал коллатеральную циркуляцию, улучшал функцию и перфузию 18 миокарда изменения в уровне эндогенного bFGF у больных с острым коронарным синдромом не оказывали протективного действия [84, 85]. Показано, что у больных ИБС с хронической тотальной окклюзией коронарных артерий и хорошо развитыми коллатералями, и у больных ИБС с гемодинамически значимыми стенозами коронарных артерий статистически значимых различий между группами в концентрациях bFGF не отмечается [86]. Для многих проангиогенных факторов роста, секретируемых клетками в латентной или мембранно-связанной форме, необходим их перевод в активное состояние под действием ряда протеолитических ферментов, осуществляющих процессинг латентных форм или расщепление компонентов межклеточного матрикса, ограничивающих биологическую активность связанных с ними факторов роста. Основной каскад системы, обеспечивающий внеклеточный протеолитический процессинг, включает активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа), плазмин, а также металлопротеиназы. Урокиназа, превращающая плазминоген в плазмин, протеазу широкой субстратной специфичности, секретируется клетками крови и сосудов и является одним из компонентов системы фибринолиза, препятствующей образованию тромбов. Но наиболее важная функция урокиназы - обеспечение подвижности (миграции) клеток, а, следовательно, регуляция таких процессов как рост сосудов, ранозаживление, инвазия клеток и метастазирование [87]. Урокиназа, непосредственно или через образование плазмина, осуществляет высвобождение связанных в матриксе и активацию латентных факторов роста, таких как bFGF, VEGF, HGF, инсулиновый фактор роста (IGF), эпидермальный фактор роста (EGF) и TGF [88]. Роль урокиназы в ангиогенезе впервые была отмечена на моделях васкуляризации роговицы, а также при опухолевом ангиогенезе [89]. Помимо локализации протеолиза на клеточной поверхности 19 связывание урокиназы с ее рецептором опосредует миграцию эндотелиальных клеток и формирование капилляроподобных трубочек через механизм, независимый от ее протеолитической активности, связанный с активацией внутриклеточных сигнальных систем. Для образования капилляроподобных трубочек в фибриновом матриксе под действием ангиогенных факторов роста также необходимо присутствие урокиназы и ее связывание с рецептором [90]. Многими группами было показано, что экспрессия про-ангиогенных факторов роста (VEGF, bFGF, TGFβ) в значительной степени находится под контролем гипоксии, в условиях которой происходит усиление их синтеза. При гипоксии также наблюдалась повышенная экспрессия рецептора урокиназы [91]. Однако уровень экспрессии урокиназы при гипоксии, а особенно при ишемии тканей, в настоящее время изучен недостаточно. На модели хронической окклюзии коронарной артерии у свиней показано, что развитие коллатералей коррелирует с повышением активности и экспрессии урокиназы на уровне как белка, так и мРНК, что указывает на участие урокиназы в процессе ангио/артериогенеза [92]. При гипоксии в легочной ткани наблюдалось выраженное снижение уровня урокиназы [93]. Имеются данные о значительном уменьшении признаков ишемии миокарда и улучшения качества жизни пациентов терминальной стадии хронической ИБС после длительной (12 недель) интермиттирующей терапии урокиназой [94]. Все эти результаты свидетельствуют о важной роли урокиназы в ангио- и артериогенезе и позволяют полагать, что уровень экспрессии урокиназы при ишемии, в сочетании с экспрессией ангиогенных факторов роста может представлять собой новый важный прогностический показатель. Существует достаточно большое количество факторов, которые ингибируют ангиогенез [95]. Изменение их соотношения может приводить к 20 онкологическим заболеваниям [96, 97]. К ним относятся тромбоспондин, уровень которого регулируется белком, подавляющим рост опухоли, эндостатин, ангиостатин [98]. Фрагмент фибронектина, а также фрагмент пролактина обладают способностью подавлять выработку ангиостатина, также оказывая влияние на соотношение факторов стимулирующих и подавляющих ангиогенез Таким [99]. образом, существует класс ингибиторов ангиогенеза, который может рассматриваться как защитный механизм, предупреждающий развитие новообразований. Многие ингибиторы ангиогенеза связываются с гепарином и противодействуют механизмам реализации эффектов bFGF [100]. В конце 90-хх годов был выявлен новый ингибитор ангиогенеза – эндостатин [98]. Он представляет собой 20 kDaС-терминальный фрагмент коллагена XVIII. Этот гепарин-связывающийся фрагмент специфически ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток, соответственно ингибируя ангиогенез и рост опухолей. Эндостатин является кислотоустойчивым белком с компактной трехмерной структурой [23]. Терапия рекомбинантным эндостатином тормозила рост опухоли в экспериментальных работах, причем толерантность к терапии не возникала [101]. Хотя изучением возможности влиять на уровень эндостатина и использовать его для лечения новообразований в основном занимаются онкологи, более подробное исследование влияния на уровень эндостатина ишемии миокарда и различной терапии у больных ИБС может прояснить некоторые вопросы реализации коронарного ангиогенеза. Таким образом, ремоделирование и регенерация миокарда представляют собой сложные, динамические процессы, четко регулируемые во времени и пространстве, в которых участвует множество различных клеток и стимулирующих факторов. 21 1.2 Эндотелиальные прогениторные клетки: источники и фенотипы Эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК) привлекают внимание ученых своим участием в процессах восстановления эндотелия и в формировании новых сосудов. Термины «прогениторная клетка», «стволовая клетка» или «клетка-предшественник» относятся к клеткам иммунной системы, которые обладают способностью к самообновлению и дифференцировке в различные типы клеток. Поэтому эти клетки потенциально могут восстанавливать функцию поврежденных тканей [102, 103]. ЭПК, по аналогии с другими клетками-предшественниками, являются специфичными для определенного клеточного ряда и включают крайне разнородную популяцию клеток, способных дифференцироваться исключительно в эндотелиальные клетки [2-4]. Большинство клетокпредшественников созревают из гематопоэтических стволовых клеток, в основном находящихся в костном мозге, периферической крови и пупочном канатике, но также присутствующих в селезенке, кишечнике, печени, жировой ткани и адвентиции [104-111]. Независимо от своего источника все гематопоэтические стволовые клетки являются носителями маркеров CD34+ и CD133+. Помимо ЭПК, гематопоэтические стволовые клетки также способны вырабатывать миелоидную (за исключением эритроцитов) и гранулоцитарно- макрофагальную линии клеток. Поэтому, кроме экспрессии маркеров гематопоэтических стволовых клеток, на поверхности ЭПК экспрессируются и эндотелиальные маркеры, такие как рецептор-2 сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR-2), СD31, эндотелиальная синтаза оксида азота (NO) и сосудистый эндотелиальный кадгерин [10-12]. Гематопоэтические стволовые клетки являются главным 22 источником ЭПК, но они также могут вырабатываться и мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга. В связи с тем, что CD14+ миелоидные субпопуляции экспрессируют и гематопоэтические, и эндотелиальные маркеры, CD 14+ моноциты способны дифференцироваться в эндотелиальные клетки [112, 113]. Первая публикация о наличии в периферической крови ЭПК костномозгового происхождения была сделана Asahara с коллегами в 1997 году [5]. В настоящее время отсутствует стандартный набор маркеров для идентификации ЭПК. Используются поверхностные маркеры гематопоэтических и эндотелиальных клеточных линий, такие как CD34, CD133, рецептор 2 эндотелиального фактора роста (VEGFR2) либо рецептор домена киназы (KDR). Комбинации следующих маркеров для идентификации ЭПК использовались в исследованиях: CD34+/KDR+, CD34+/CD133+, CD133+/KDR+, СD34+/СD133+/VEGFR-2+ и CD34+/CD133+/KDR+, CD34−/KDR+, СD34–/СD133+/VEGFR-2+ [13-15]. При применении метода культивирования для функционального анализа ЭПК необходимо помнить, что в разных условиях культуры продуцируют разные фенотипы ЭПК, в частности, «ранние» недифференцированные клетки и «поздние» дифференцированные клетки либо их смесь. 1.3 Эндотелиальные прогениторные клетки и васкулогенез ЭПК участвуют в васкулогенезе – процессе формирования кровеносных сосудов insitu [114-116]. Ранее считалось, что васкулогенез происходит только во время эмбрионального развития. В настоящее время получены доказательства участия ЭПК в формировании новых сосудов во взрослом организме: диагностика в периферической крови взрослых людей ЭПК костномозгового происхождения и подтверждение их участия в формировании новых сосудов [114]. ЭПК считаются основными 23 клеточными стимуляторами постнатального васкулогенеза. При введении ЭПК экспериментальным животным с ишемией конечности происходит их накопление в очагах неоваскуляризации ишемизированных мышц, кожи, области раны [33, 114-119]. Лечение стенозирующего атеросклеротического поражения в клинике ограничено возможностями эндоваскулярного хирургического (ангиопластика) лечения (шунтирование) в комбинации и с медикаментозной терапией. В ряде исследований на экспериментальных моделях ишемии конечностей [118, 120] и у больных с ишемией конечностей, не корректирующейся традиционными методами лечения [6, 7] показано, что пересадка мононуклеарных клеток из костного мозга, включая ЭПК, ведет к увеличению количества формирующихся коллатеральных сосудов. 1.4 Роль эндотелиальных прогениторных клеток в восстановлении функции эндотелия ЭПК эффективно помогают поддерживать целостность сосудистого эндотелия, что тормозит развитие атеросклероза. Процесс привлечения и миграции ЭПК в организме, включая экзогенно введенные клетки, управляется клетками, находящимися непосредственно в зоне повреждения. Различные типы клеток внутри атеросклеротических бляшек способны мобилизировать и направить ЭПК к сосудам с поврежденным эндотелием. При атеросклеротическом поражении высвобождение ЭПК из мест их депонирования происходит в результате начала поступления молекулярных сигналов от иммунных клеток, расположенных внутри атеросклеротических бляшек. В восстановлении сосудистого повреждения принимают участие и активированные макрофаги гранулоцитарного М2 типа, посредством выработки колониестимулирующего фактора (G-CSF) ими [121], 24 который облегчает выход ЭПК в кровеносное русло. Стимулированное цитокинами высвобождение протеаз, таких как эластаза, катепсинG и матриксная металлопротеиназа 9 (ММР-9), отсоединяют ЭПК от адгезивного взаимодействия с клетками стромы [122, 123]. Далее ЭПК привлекаются и мобилизуются в зону повреждения. Важным направляющим сигналом является хемокинстромальный клеточный фактор 1 (SDF-1), который в базовом режиме вырабатывается костным мозгом и многими другими тканями. Однако в костном мозге существует градиент, который удерживает ЭПК. В условиях ишемии, воспаления и гипоксии данный градиент в костном мозге меняется на противоположный под воздействием индуцированного гипоксией фактора 1 (HIF-1), стимулирующего SDF-1 в поврежденных тканях [124-127]. Оксид азота, эстрогены, липопротеины высокой плотности (ЛВП), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и эритропоэтин также способствуют повышению плазменного титра ЭПК и привлечению ЭПК в область повреждения через расширение фосфатидил-инозитол-3-фосфат (PIP3)/Akt пути [16, 17, 128]. Связывание ЭПК с поврежденным эндотелием осуществляется с помощью молекул клеточной адгезии, таких как Р/Еселектин и ICAM-1 [4]. При выраженном повреждении сосудов происходит активация тромбоцитов экспонированными белками матрикса с адгезией тромбоцитов к лишенной эндотелия повреждённой области сосудистой стенки. Активация тромбоцитов ведет к формированию микротромбов и экспрессии SDF-1, что направляет ЭПК к поврежденному эндотелию. Более того, ЭПК способны адгезироваться не только к эндотелию, но также к тромбоцитам через взаимодействие с Р-селектином и GPIIb-интегрином [129-131]. Под воздействием напряжения сдвига ламинарного кровотока адгезировавшиеся ЭПК начинают дифференцироваться в эндотелиальные клетки [103, 132]. 25 1.5 Влияние факторов риска сердечно-сосудистых эндотелиальные прогениторные клетки осложнений на В настоящее время показано, что количество и функциональная активность циркулирующих ЭПК являются маркерами сосудистого риска для множества заболеваний, в том числе, сердечно-сосудистой системы [133]. Данный нетрадиционных биомаркер независим от риска, среди факторов гиперхолестеринемия и СРБ. Возраст, других традиционных которых мужской пол, и гипертония, артериальная гипертония, сахарный диабет, гиперлипидемия, курение, ожирение и гиподинамия являются факторами риска, способствующими развитию сосудистого повреждения [122, 134-136]. Известно, что сердечно-сосудистые факторы риска влияют на количество и функцию ЭПК. J. Hill et al продемонстрировали наличие обратной связи между количеством ЭПК и суммарным числом факторов риска [12]. Интересно, что они нашли обратную корреляцию между количеством ЭПК и функцией эндотелия. Несколько исследователей подтвердили наличие связи между количеством ЭПК и факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) [137, 138]. M. Vasa et al продемонстрировали подавление миграции ЭПК у больных ИБС, усиливающейся на фоне увеличения количества факторов риска [138]. Также известно, что мононуклеарные клетки костного мозга, полученные у больных ИБС, имеют сниженную способность к неоваскуляризации. Очевиден тот факт, что наличие сердечно-сосудистых факторов риска обратно коррелирует с количеством и функциональным состоянием ЭПК. Однако механизм подавления ЭПК у больных ССЗ до конца не ясен. Снижение уровня периферических циркулирующих ЭПК происходит за счет уменьшения их мобилизации из костного мозга и истощения пула 26 стволовых клеток. Как было указано выше, мобилизация ЭПК регулируется различными ангиогенными цитокинами, такими как VEGF, G-CSF и стромальный клеточный фактор 1, а также биодоступностью NO в костном мозге. NO участвует в регуляции функции ЭПК в ответ на различные стимулы через активацию матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9). ММР-9 индуцирует трансформацию Kitлиганды из мембраносвязанного в растворимое состояние, потенцируя последующий выход в кровоток сKitположительных стволовых клеток, включая общие предшественники гематопоэтических прогениторных клеток и ЭПС (например, гемангиобласты). Эти данные согласуются с тем фактом, что у мышей, дефицитных по NO-синтазе (NOS 3−/−), значительно снижена мобилизация ЭПК [139]. Биодоступность NO зависит от сердечно-сосудистых факторов риска, которые снижают мобилизацию ЭПК. Функциональная способность ЭПК мигрировать и встраиваться в тубулоподобные структуры при неоваскуляризации частично определяется эндотелиальным NOS-NO механизмом. Возраст является важным фактором, ведущим к снижению количества ЭПК и влияющим на их функцию. Многофакторный анализ показал, что возраст является независимым фактором снижения количества ЭПК [140]. Известно, что с возрастом биодоступность NО также снижается, что, вероятно, влияет на уровень ЭПК. Thum et al показали, что прием соматотропного гормона (гормон роста) у здоровых мужчин среднего возраста восстанавливает исходно сниженное количество ЭПК, их колониеобразующую способность, способность к миграции и образованию тубулоподобных структур через IGF-1-опосредованную стимуляцию фосфоинозитид (PI)-3-киназа/Akt/eNOS механизм[141]. VEGF известен своей способностью стимулировать мобилизацию ЭПК из костного мозга. В ишемизированных тканях экспрессия VEGF 27 усилена, что ведет к мобилизации и привлечению ЭПК в область ишемии. Перенос гена VEGF в ишемизированную ткань более чем в два раза повышает уровень циркулирующих ЭПК. Scheubel et al опубликовали данные, что у пожилых пациентов низкий уровень VEGF плазмы ассоциируется со сниженной мобилизацией ЭПК из костного мозга, однако причина пониженного уровня VEGF не известна [142]. С другой стороны, нет четких данных о связи возраста и уровня VEGF. Возникающие с возрастом клеточное повреждение и/или нестабильность генома ведут к старению ЭПК, вероятно, вследствие роста окислительного стресса. ЭПК пожилых пациентов отличаются снижением количества теломераз и более выраженными процессами старения клеток [143]. Хотя эстрогены invivo и invitro ведут к повышению количества ЭПК и активизации таких их функций как адгезия, миграция, пролиферация и подавление апоптоза, нет достоверных данных за более высокий уровень и функциональную активность ЭПК у женщин. Masuda et al показали, что количество CD34+ клеток и CD133+ клеток, включая незрелые ЭПК достигает пика в постовуляторную фазу менструального цикла, следующую за пиком сывороточной концентрации эстрогена в периовуляторную фазу, сделав предположение, что количество ЭПК регулируется менструальным циклом [144]. Kondo et al показали, что курение сокращает число ЭПК у здоровых лиц, а отказ от курения восстанавливает их количество [145]. Данные о том, что курение ведет к снижению числа ЭПК, подтверждены и в ряде других исследований [146]. Хотя достоверная связь между курением и пониженным уровнем ЭПК у больных ИБС выявлена не была. По результатам анализа, проведенного Umemura et al, курение не вело к снижению ЭПК у больных ИБС [140]. С другой стороны, здоровые лица без факторов риска ССЗ имели более низкий уровень ЭПК при наличии курения в анамнезе. Причина 28 такого несоответствия не ясна. Определение вклада других факторов риска, а также влияния продолжительности курения и отказа от курения на количество и функциональную активность ЭПК сделало бы возможным более точно установить роль курения как такового на биоактивность ЭПК. Связанная с курением выработка свободных кислородных радикалов (ROS) может быть причиной снижения биодоступности NO, что ведет к подавлению мобилизации ЭПК из костного мозга. Повышение количества свободных кислородных радикалов также меняет функциональное состояние ЭПК. Michaud et al показали, что повышенная выработка свободных радикалов кислорода у курильщиков подавляет такие свойства ЭПК, как адгезия, миграция и тубулообразование [146]. Повышение уровня ЭПК после отказа от курения было более выражено у мало курящих и менее выражено у много курящих, что может говорить о необратимом повреждении биоактивности ЭПК при активном курении. Умеренные физические нагрузки улучшают эндотелиальную функцию и снижают заболеваемость и смертность от ССЗ. Предполагается, что увеличенная выработка NO и подавление свободных кислородных радикалов через активацию антиоксидантных систем, таких как супероксид дисмутаза и глутатионпероксидаза, способствуют повышению биодоступности NO и защите от процессов, ведущих к атеросклерозу. Хотя не ясно, ведет ли гиподинамия непосредственно к снижению числа ЭПК, известно, что аэробные физические нагрузки увеличивают количество и функциональную активность ЭПК. Laufs et al показали, что контролируемое проведение дозированных физических нагрузок в течение 4-х недель у больных хронической ИБС повышает количество ЭПК и подавляет апоптоз ЭПК [147]. Они также продемонстрировали на экспериментальной модели животных, что выполнение дозированных физических упражнений более 7 дней ведет к повышению уровня ЭПК через стимуляцию VEGF и 29 активацию NO-зависимого пути. Установлено, что даже однократно спровоцированная физической нагрузкой ишемия миокарда ведет к увеличению числа ЭПК с пиком подъема через 24-48 часов после нагрузки [148]. Интересным фактом является продемонстрированная в некоторых исследованиях тенденция наличия связи между пониженным уровнем ЭПК и семейным анамнезом ССЗ. Требуются исследования для оценки связи между ЭПК и полиморфизмами генов факторов, вовлеченных в процессы регуляции ЭПК. Также показано, что уровень гомоцистеина обратно коррелирует с количеством ЭПК, а гипергомоцистеинемия подавляет способность ЭПК к миграции и адгезии. Есть данные о том, что преходящее повышение уровня мочевой кислоты стимулирует мобилизацию ЭПК. Таким образом, показано, что наличие факторов риска ССЗ ведет к подавлению числа и активности ЭПК. Имеющаяся информация по влиянию различных факторов на уровень ЭПК суммирована в таблице 1. Таблица 1. Влияние факторов риска сердечно-сосудистых осложнений на уровень ЭПК. Факторы, влияющие на уровень ЭПК Пол Пожилой возраст Артериальная гипертония Сахарный диабет Факторы риска Дислипидемия Метаболический синдром Уровень ЭПК отсутствие влияния снижение Курение* Гиподинамия неизвестно Примечание: *Показано снижение уровня ЭПК вследствие курения у здоровых лиц, но не у больных ИБС. 30 Подавление функции ЭПК донора при наличии таких сопутствующих клинических состояний, как сахарный диабет, ИБС, ишемическая кардиомиопатия, может быть следствием плохого реваскуляризационного эффекта во время терапевтического ангиогенеза. Учитывая предполагаемую положительную роль ЭПК у больных атеросклерозом повышение их уровня и улучшение функциональной активности могут быть целью терапевтического воздействия. 1.6 Влияние сопутствующих прогениторные клетки M. Vasa et al [138] заболеваний на эндотелиальные продемонстрировали, что количество и миграционная способность ЭПК снижены у больных артериальной гипертонией. При этом предполагаемое снижение мобилизации ЭПК из костного мозга может быть объяснено подавлением эндотелий-зависимой вазодилатации у больных с артериальной гипертонией вследствие снижения биодоступности NO [16]. Первичной причиной снижения биодоступности NO в данном случае считается накопление свободных кислородных радикалов (ROS), которые влияют на пролиферацию, старение и/или апоптоз ЭПК. Суммарные результаты исследований позволяют предположить, что ангиотензинII стимулирует начало старения ЭПК через gp91 phox-регулируемое усиление окислительного стресса у больных артериальной гипертонией [149]. Интересен тот факт, что у больных, принимавших ингибиторы ренин-ангиотензиновой системой (РАС), наблюдался повышенный уровень ЭПК. Bahlmann et al в проспективных исследованиях показали наличие роста числа ЭПК у больных с нормальными цифрами АД либо умеренной артериальной гипертонией на фоне приема антагониста ангиотензинII рецептора олмесартана [150]. Эти 31 данные подтверждают важную роль РАС в регуляции биоактивности ЭПК у больных артериальной гипертонией. У больных сахарным диабетом (СД) как 1, так и 2 типа количество ЭПК снижено. Tepper et al показали, что ЭПК, выделенные у больных СД, отличаются сниженной способностью к адгезии, пролиферации и образованию тубулоподобных структур [151]. Повышенный уровень гликированного гемоглобина, а также уровень глюкозы плазмы обратно коррелируют с количеством ЭПК. При инсулинорезистентность через подавление сахарном диабете PI3-киназа/Akt/eNOS пути оказывает существенное влияние на развитие эндотелиальной дисфункции и прогрессирование киназа/Akt/eNOS атеросклероза. пути является Следствием снижение инактивации биодоступности PI3NO и мобилизации ЭПК из костного мозга. Krankel et al показали, что токсическое воздействие глюкозы при наличии гипергликемии подавляет пролиферацию и усиливает апоптоз ЭПК посредством стимуляции p16Ink4a и p21Waf-1 механизмов [152]. Стимуляция p16Ink-4a и p21Waf-1 путей ведет к блокировке цикла деления клетки. Р38 митоген-активированная протеин киназа гипергликемией также имеет подавлению отношение ЭПК. к Подавление индуцированному миграционной и интегративной активности ЭПК при сахарном диабете связано с измененной биодоступностью NO и активностью ММР-9. Степень подавления функции ЭПК связана с тяжестью диабетической васкулопатии, проявлениями которой являются конечностей и стенозирующий стенозы сонных атеросклероз артерий. Эти артерий данные нижних позволяют предположить, что ЭПК играют важную роль в патогенезе диабетической васкулопатии. В ряде исследований продемонстрировано, что высокий уровень ЛНП ведет к снижению количества и подавлению функции ЭПК [153]. 32 Окисленные ЛНП индуцируют старение и подавление адгезивных, миграционных и тубулообразующих свойств ЭПК через инактивацию Akt/eNOS пути. Llevadot et al показали, что усиление мобилизации ЭПК из костного мозга симвастатином происходит через активацию Akt/eNOS пути [154]. Деактивация теломеразокисленными ЛНП нивелировалась при приеме аторвастатина, что вело к восстановлению ЭПК и обратному развитию процессов старения ЭПК. Известно, что ЛВП предупреждают прогрессирование атеросклероза. Низкий уровень ЛВП ассоциируется с повышенным риском ССЗ. Хотя точные механизмы положительного влияния ЛВП на процессы атеросклероза до конца не ясны, их протективный сосудистый эффект согласуется с данными о способности увеличивать количество и функциональную активность ЭПК. Показано, что введение ЛВП у больных сахарным диабетом ведет к увеличению количества ЭПК [155]. Усиление мобилизации и дифференцировки ЭПК под воздействием ЛВП, вероятно, происходит за счет активации PI3киназа/Akt/eNOS пути и предупреждения апоптоза. Известно, что ожирение способствует развитию эндотелиальной дисфункции и атеросклероза. Мало что известно о непосредственной связи между ожирением и ЭПК. Fadini et al показали, что больные с метаболическим синдромом имеют пониженное содержание ЭПК [156]. Накопление висцерального жира ведет к стимуляции ФНОα и ИЛ-6 и подавлению адипонектина, следствием чего является эндотелиальная дисфункция и высокая инсулинорезистентность, отрицательно коррелирующие с количеством и функциональной активностью ЭПК. Агонисты рецептора-γ, активирующего пролиферацию пероксисом (PPARγ), повышают чувствительность к инсулину и положительно влияют (снижая сосудистое воспаление, улучшая эндотелиальную функцию и подавляя гиперплазию гладко-мышечных клеток) на состояние сосудистой 33 сети. Было показано, что прием агонистов PPAR-γ, пиоглитазона либо розиглитазона, повышает количество и миграционную способность ЭПК у больных ИБС и у больных сахарным диабетом 2 типа. Redondo et al на культуре клеток invitro так же подтвердили увеличение количества ЭПК на фоне добавления пиоглитазона и выявили, что увеличение числа ЭПК соотносится с активацией адгезии и дифференцировки ЭПК, но не с усилением пролиферации и подавлением апоптоза ЭПК [157]. Вышеизложенные данные поддерживают представление о наличии связи между биоактивностью ЭПК и инсулинорезистентностью. 1.7 Эндотелиальные прогениторные клетки в терапевтическом ангиогенезе Терапевтический ангиогенез – это термин, который обозначает стимуляцию роста новых сосудов как инвазивно, введением ангиогенных факторов роста или кодирующих их генов, ЭПК, стволовых клеток костного мозга, так и неинвазивно, например, с помощью усиленной наружной контрпульсации. В настоящее время накоплен экспериментальный и клинический опыт по применению ЭПК с целью стимуляции васкулогенеза. Показано, что введение ЭПК может способствовать улучшению эндотелиальной функции и снижать риск неблагоприятных событий. Известно, что количество ЭПК, а также их регенеративная и пролиферативная способность снижены у больных ИБС [12]. Причиной чего, вероятно, является истощение запаса ЭПК, продолжающееся длительное сосудистое повреждение [158], либо нарушение мобилизации ЭПК из костного мозга [159]. В таблице 2 приведены клинические исследования по введению селективных популяций клеток при ишемии миокарда. 34 Таблица 2. Клинические исследования по введению селективных популяций клеток при ишемии миокарда. Исследования Заболевания Клетки Способ введения Ср. доза клеток (×106) Ahmadi et al [160] Недавний ИМ CD133+ Интрамиокардиаль-но (во время КШ) 1,89 18:9 НР 6 Balogh et al [161] Недавний ИМ CD34+ Интракоронарно (1–15) 8:18 НР 6 Bartunek et al [162] Boyle et al [163] Острый ИМ CD133+ Интракоронарно 12,6 19:16 Р 4 67 5:0 НР 12 69 13:13 Р 3 73 35:35 Когортное 6 0,3 18:6 Р 6 Безопасно 5,8 46:9 НР 6 Эффективно *** CD34+ Интракоронарно (+GCSF) КультивироErbs et al [164] ПИКС Интракоронарно ванные ЭПК ЭПК ПК Li et al [165] Острый ИМ Интракоронарно (+GCSF) Losordo et al Стенокардия Интрамиокардиально CD34+ [166] напряжения (NOGA) Stamm et al Недавний Интрамиокардиально CD133+ [167, 168] ИМ (во время КШ) ПИКС Пациенты Длит. (терапия: Дизайн наблюдеконтроль) ния(мес) Результат Эффективно *** Положительная тенденция* Эффективно *** Неприменим о** Эффективно *** Эффективно *** Примечания: ИМ – инфаркт миокарда; КШ – коронарное шунтирование; GCSF – гранулоцитарныйколониестимулирующий фактор; НР – нерандомизированное; ЭПК ПК – эндотелиальные прогениторные клетки периферической крови; Р – рандомизированное; NOGA – электромеханическая 3D направляющая биологическия система доставки (Johnson&Johnsoncompany, USA). * Терапия по введению ЭПК ассоциировалась с тенденцией к улучшению, но результат не достигал статистической достоверности. ** Неконтролируемое исследование. *** Улучшение клинико-инструментальных показателей без достоверного влияния на твердые конечные точки. Также проведен целый ряд клинических исследований по введению мононуклеарных клеток, а не ЭПК, что обусловлено различными причинами, среди которых удобство использования и отсутствие достоверных данных о наиболее эффективных субпопуляциях клеток [161]. Лабораторные исследования на животных позволяют предположить, что для значительного улучшения миокардиальной ишемии требуется системное введение в организм человека приблизительно 1,0х105 ЭПК на килограмм массы тела [119]. При заборе 100 мл периферической крови у здоровых добровольцев и 7-ми дней культивирования удается получить только около 5,0х106 клеток. Получается, что для лечения путем системного введения ЭПК может потребоваться забор 6-12 литров крови. Кроме того, нужно помнить, что число и функция циркулирующих ЭПК снижаются у больных, требующих восстановительного лечения, среди которых возраст [169], СД [138, 170], гиперхолестеринемия [138], гипертония [138, 171] и курение [145, 146]. Это делает внутрисистемное введение ЭПК у многих больных менее эффективным. Способами невилировать ограниченную доступность ЭПК могут быть: ‒ трансплантация ЭПК непосредственно в ишемизированные ткани; ‒ введение цитокинов или факторов роста для мобилизации ЭПК из костного мозга перед забором [116, 172]; ‒ получение большей концентрации путем аспирации костного мозга или лейкофереза; ‒ стимуляция функции ЭПК с помощью сопутствующей генной терапии; ‒ обогащение культуры ЭПК через самообновляющиеся эмбриональные стволовые/прогениторные клетки, полученные из костного мозга. В случае невозможности получения требуемого количества и качества аутологичных ЭПК при помощи вышеизложенных методик, альтернативой может быть выделение аллогенных ЭПК из крови пупочного канатика либо культивирование эмбриональных стволовых клеток человека [173, 174]. Существует два принятых подхода по трансплантации ЭПК непосредственно в ишемизированный миокард: внутрикоронарная инфузия и внутримиокардиальная инъекция. Эффект от данных способов введения по результатам нескольких небольших клинических исследованиях был умеренным. Для окончательной оценки целесообразности непосредственной трансплантации ЭПК в ткани требуется проведение крупномасштабных осуществляется исследований. через эндокард Интрамиокардиальная с помощью инъекция электромеханической направляющей системы [175-177], либо через перикард во время операции коронарного шунтирования. Нужно помнить, что миокардиальная инъекция потенциально способна увеличить выраженность миокардиального повреждения при проведении во время острой фазы инфаркта миокарда. Более того, требуется настороженность у больных с неконтролируемой выраженной гиперлипидемией, атеросклеротического поражения учитывая данные аортального по клапана стимуляции у мышей, дефицитных по АроЕ [178]. В связи с данными о возможном подавлении функции и мобилизации ЭПК в условиях наличия ряда сопутствующих заболеваний, проводятся разработки с целью восстановления потенциальной дисфункции ЭПК. Рассматривается комбинация введения ЭПК с локальной генной терапией [179] либо генетическая модификация ЭПК. Помимо увеличения активности и биодоступности ЭПК, возможными путями повышения эффективности терапии может быть стимуляция выхода ЭПК из мест депонирования, а также пролиферации ЭПК, либо стимуляция секреции цитокинов кардиомиоцитов. использование При из ЭПК, фибробластов, удачной разработке генетически сосудистых генной модифицированных ГМК и трансфекции ЭПК может 37 рассматриваться как «второе поколение» терапии ЭПК. Генетически модифицированные ЭПК могут быть использованы в качестве векторов для генной терапии, что, в отличие от голых векторов, позволит клеткам с такими встроенными векторами оставаться активными в месте неоваскуляризации более продолжительное время, и дает возможность запрограммировать их на экспрессию нескольких ангиогенных факторов одновременно. Применение клеточной генной терапии позволит уменьшить вводимый объем, в сравнении с традиционной генной или белковой терапией, что, в свою очередь, позволит предупредить индуцируемое давлением расширение зоны повреждения. Первая публикация о положительном влиянии генетически модифицированных ЭПК на неоваскуляризацию в ишемизированной задней конечности, на модели экспериментального животного, была сделана Iwaguro et al в 2002 г. [180]. Трансплантация гетерологичных ЭПК со встроенным кодирующим человеческий VEGF-165 аденовирусом улучшала неоваскуляризацию и способствовала восстановлению кровотока, а также уменьшала выраженность некроза конечности и уровень самоотторжения некротизированных тканей, при этом потребовалось 1/30 ЭПК от дозы немодифицированных ЭПК в более ранних экспериментах [117]. Есть данные по сходным исследованиям и с другими генами [180-187]. 1.8 Влияние статинов на прогениторные клетки факторы ангиогенеза и эндотелиальные Продолжающийся рост частоты сердечно-сосудистых заболеваний диктует необходимость разработки новых подходов не только к их лечению, но и к предупреждению. Доказано, что повышение уровня общего холестерина (ХС) и ХС липопротеинов низкой плотности (ЛНП) является одним из факторов риска развития ишемической болезни сердца [188]. В 38 руководстве по лечению стабильной стенокардии Американской коллегии кардиологов и Американской ассоциации сердца приводится подход к терапии больных ИБС. В этих рекомендациях подчеркивается необходимость применения статинов для достижения целевых уровней общего холестерина, холестерина ЛНП, холестерина ЛВП и триглицеридов (ТГ) [189]. В крупных исследованиях доказана взаимосвязь между уровнем ХС ЛНП и частотой сердечно-сосудистых осложнений – концепция «чем ниже, тем лучше» [190]. Помимо гиполипидемического действия, статины оказывают влияние на атеросклеротическую бляшку [191]. Корреляция уровней ХС ЛНП с данными ангиографии показана в нескольких исследованиях [192-195]. Влияние интенсивной терапии розувастатином на размеры атеросклеротической бляшки убедительно показано в исследовании Nissen и соавт. Лечение розувастатином в дозе 40 мг в течение двух лет приводил к статистически значимому регрессу атеросклеротической бляшки практически во всех подгруппах пациентов: у мужчин и женщин, у пациентов молодого и пожилого возраста, а также в подгруппах, выделенных в зависимости от достигнутого уровня липидов [196]. В целом, больным с ИБС необходима постоянная комбинированная терапия, которая доказано влияет на липидный спектр крови, эндотелиальную дисфункцию, активность симпатоадреналовой и ренинангиотензин-альдостероновой системы, показатели свертываемости крови и другие факторы, играющие роль в процессе ангиогенеза. Относительно недавно было показано, что помимо гиполипидемического и плейотропного эффектов статины оказывают влияние и на факторы ангиогенеза. Количество публикаций невелико, однако удается проследить закономерность – применение статинов снижает концентрацию некоторых факторов (VEGF, TGF) в крови. Возможно, данный эффект зависит от дозы используемого статина, исходного уровня факторов ангиогенеза, от тяжести ИБС. Этот дополнительный механизм 39 действия статинов до сих пор углубленно не изучался, хотя его понимание может внести дополнительную информацию об оптимальных дозах при подборе препарата и ответить на вопрос о влиянии статинов на процессы коронарного ангиогенеза. Это особенно актуально при использовании терапевтического ангиогенеза, так как применение статинов может стимулировать эти процессы или наоборот, влиять на них негативно. В некоторых работах показано, что ряд препаратов оказывает влияние на концентрацию факторов ангиогенеза в крови, например терапия аспирином снижает уровень VEGF, исходно повышенный у больных ИБС [197]. Это относится в первую очередь к статинам, а также к ингибиторам АПФ, блокаторам рецепторов в ангиотензинуII, гепарину, аспирину [198]. Концепция того, что неоваскуляризация может играть важную роль в патофизиологии атеросклероза была предложена около века назад. В настоящее время доказано, что усиление неоваскуляризации атеросклеротической бляшки (АСБ) ведет к ее нестабильности, разрыву покрышки и к тромбозу. Помимо влияния на ангиогенез и артериогенез, статины могут оказать влияние и на эти процессы в АСБ. Если будет показано, что эти препараты тормозят неоваскуляризацию непосредственно АСБ, то это может объяснить механизм ее стабилизации [199]. Высказываются мнения о возможности использования антиангиогенной терапии у больных ИБС [200]. Ряд авторов даже предполагают использовать ингибиторы ангиогенеза для стабилизации АСБ подобно использованию данной терапии в онкологии [201]. Помимо собственно терапии с помощью ЭПК, существует и другой подход, связанный с попыткой активации пролиферации собственных ЭПК, увеличения их выживаемости и активности в зоне повреждения с помощью медикаментозной терапии, в том числе статинами. Так, в некоторых исследованиях показано, что статины оказывают положительные эффекты 40 на стволовые клетки, снижая уровень их апоптоза и увеличивая способность к регенерации ишемизированных тканей [24, 202-209] Таким образом, в настоящее время показано, что сниженное количество ЭПК является независимым предиктором заболеваемости и смертности от ССЗ [150]. Это позволяет сделать предположение о прямом влиянии регуляции числа и функции ЭПК на развитие и прогрессирование ССЗ. Установлено, что повышение числа ЭПК, стимулированное ишемией, способствует неоваскуляризации и уменьшению площади ишемического повреждения. К прогрессированию атеросклеротического поражения ведет отсутствие баланса между процессами повреждения и регенерации сосудистой стенки. Подавление биоактивности ЭПК может быть одним из тех механизмов, через которые происходит инициация, развитие и прогрессирование атеросклероза под воздействием факторов риска. Есть ожидания, что увеличение числа и активности ЭПК под воздействием стимулирующих факторов приведет к предупреждению дальнейшего повреждения либо восстановлению повреждения сосудов. Поэтому проводятся исследования с целью поиска и подтверждения действительной эффективности той или иной методики в повышении количества и активности ЭПК у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и даже у здоровых лиц. При проведении клеточной терапии следует помнить, что введение ЭПК больным с тяжелой ишемией и нарушенной функциональной активностью ЭПК может не привести к эффективной стимуляции ангиогенеза у данных лиц. Доказательство того, что количество и функция ЭПК регулируется не только различными ангиогенными факторами роста, цитокинами и хемокинами в ответ на ишемию либо сосудистое повреждение и воздействие факторов риска ССЗ, но и изменениями в образе жизни, такими как аэробные нагрузки, и отказом от курения, и получаемой медикаментозной терапией (ингибиторы ренин-ангиотензиновой системы, 41 статины, эритропоэтин, агонисты PPAR-γ), в очередной раз подчеркивает важность аккуратного подхода к традиционной терапии по коррекции общепринятых факторов риска ССЗ. Пока не разработаны методики, обеспечивающие надежную идентификацию, оптимальную доставку и функционирование ЭПК в зоне повреждения и отсутствуют крупномасштабные исследования, реальная возможность эффективного применения ЭПК в клинике останется предметом дискуссий. Исходя из вышесказанного, представляется актуальным оценить влияние различных доз статинов на количество ЭПК, а также на факторы роста и факторы воспаления у больных ИБС, как одного из этапов дальнейшего исследования механизмов действия статинов на процессы ангиогенеза, с целью выработки оптимальной схемы комбинированной терапии больных ИБС. 42 Глава II. Материал и методы исследования 2.1 Материал исследования В исследование было включено 80 больных ИБС старше 18 лет, имеющих показания для приема статинов. Исключались пациенты с ОКС или ИМ менее чем 6-месячной давности, гемодинамически значимыми пороками сердца, недостаточностью кровообращения III-IV класса по NYHA, инфекционными заболеваниями, повышением уровня трансаминаз>2 верхней границы нормы, а также пациенты после предшествующей (менее 6 месяцев назад) терапии статинами. Группу контроля составили 15 добровольцев без клинических проявлений атеросклероза, нарушений углеводного обмена, аутоиммунных и острых воспалительных заболеваний, без онкологических и других соматических заболеваний, без гипертонической болезни и гиперлипидемии. Включённые в работы пациенты с ИБС были методом конвертов рандомизированы на 2 группы – группы пациентов, принимающих аторвастатин в дозе 10 мг в сутки – группа 1 и группу пациентов, принимающих аторвастатин в дозе 40 мг в сутки – группа 2. Через 1,5 месяца после начала терапии в соответствии с Российскими рекомендациями по ведению пациентов с нарушением липидного обмена (2012 г) было проведено промежуточное обследование с целью предварительной оценки эффекта терапии. По результатам лабораторных данных 12 пациентам из группы 1 и 6 из группы 2 доза статина была увеличена, а 4 пациентам из группы 2 – уменьшена, эти 22 пациента были исключены из анализа. Пациенты были исключены из работы, так как оценивать у них динамику количества ЭПК и факторов ангиогенеза было бы некорректно, учитывая изменение дозы статина. Таким образом, основную 43 группу составили 58 больных ИБС. Дизайн исследования представлен на схеме 1. Схема 1. Дизайн исследования Таким образом, основную группу составили 58 пациентов: 26 в группе 1, 32 в группе 2. Клинические характеристики пациентов основной группы, группы 1 (принимавших аторвастатин в дозе 10 мг/сут) и группы 2 (принимавших аторвастатин в дозе 40 мг/сут), а также контрольной группы приведены в таблице 3. В подгруппах1 и 2 анализировалась частота приема следующих препаратов: аспирин, -блокаторы, антагонисты кальция, нитраты, ингибиторы АПФ и диуретики, значимых различий в частоте приема каждой из указанных групп препаратов в подгруппах не выявлено (p>0.3). 44 Таблица 3. Клиническая характеристика групп больных ИБС и контрольной группы. ИБС (n=58) Группа 1 (10 мг, n=26) Мужчины Возраст, лет Группа 2 (40 мг, n=32) 10 (31%) 67(60-72) ИМТ, кг/м Обхват талии, см САД, мм рт. ст. ДАД, мм рт. ст. ЧСС, уд/мин Отяг. сем.анамнез Курение АГ СД ИМ 28.4 (26.031.5) 29.4 (26.7-32.3) 97(92-103) 130 (120-143) 80 (70-90) 70 (66-74) 23 (72%) 3 (9%) 27 (84%) 5 (16%) 70(65-70) 0.012* 67 (64-70) н.д.* 1 (7%) <0.01** 1 (7%) н.д.** 0 (0%) <0.01** 0 (0%) н.д.** 0 (0%) н.д.** н.д.** 7 (12%) 4 (15%) н.д.* н.д.** 6 (10%) 1 (4%) 120(120-125) н.д.** 47 (81%) 20 (77%) <0.01* н.д.** 10 (17%) 7 (27%) 76(70-82) н.д.* 42 (72%) 19 (73%) <0.01* 0.02* 68 (66-72) 68 (66-70) 23.7(23.1-24.8) 0.03* 80(70-80) 73 (70-80) н.д.* н.д.* 130(120-140) 123 (120-130) 59 (42-66) н.д.* 97(92-104) 97(87-107) н.д.** н.д.* 29.0 (26.4-32.0) 2 7 (47%) н.д.** 66 (55-70) 61(54-69) p р 22 (38%) 12 (46%) Контроль (n=15) 3 (9%) н.д.** 32 (100%) н.д.** Терапия аспирин 26 (100%) 45 -блокаторы 16 (62%) 18 (56%) н.д.** ант. кальция 6 (23%) 4 (13%) н.д.** нитраты 4 (15%) 3 (9%) н.д.** ингиб.АПФ 18 (69%) 18 (56%) н.д.** диуретики 4 (15%) 3 (9%) н.д.** * тест Манна-Уитни, ** точный тест Фишера.н.д. – недостоверно Как видно из таблицы, в исследование включено больше женщин. Группы 1 и 2 значимо не различались по возрасту, факторам риска и принимаемой терапии. Диагноз ИБС ставился на основании наличия одного из трёх критериев: 1. Перенесённый инфаркт миокарда. 2. Выявленная ишемия миокарда по данным нагрузочного теста – тредмил-тест или велоэргометрия. 3. Атеросклеротическое поражение коронарных артерий с наличием одного или более стеноза > 70%. У 12 (21%) пациентов имелась стенокардия I функционального класса (ФК), у 32 (55) – 2 ФК, у 14 (24) – 3 ФК. Пациенты со стенокардией 4 ФК в исследование не включены. Инструментальные исследования выполнены в Городской поликлинике № 131 ДЗ г. Москвы, лабораторные, включая измерение количества ЭПК, в ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ. 2.2 Методы исследования Всем пациентам проводилось стандартное клинико-лабораторное и инструментальное обследование. Забор крови в объеме 50 мл проводился натощак из кубитальной вены. До забора крови не разрешалось курение, прием короткодействующих нитратов, исключалась физическая активность. 10 мл крови отправляли в биохимическую лабораторию для проведения общего и биохимического анализа (липидный спектр, уровень глюкозы, СОЭ).20 мл инкубировалось 5-10 мин при комнатной температуре, 46 центрифугировалось в течение 20 мин при 1500 об/мин. После этого образцы хранились при температуре -70°С для последующего определения VEGF, эндостатина и MCP-1.20 мл крови использовались для определения ЭПК. Все измерения проводили двукратно – до начала терапии и через 3 месяца. У добровольцев указанные анализы проводились однократно. Определение определение уровня ЭПК. циркулирующих Ключевым ЭПК в анализом цельной в работе крови, для было чего использовали20 мл крови с EDTA. Клетки были выделены методом магнитной сепарации. Основным критерием отбора ЭПК из общего пула лейкоцитов была одновременная экспрессия ими маркеров CD34, CD133 и CD309, таким образом, отбирались “молодые” ЭПК. Число ЭПК фенотипа CD34+/CD133+/CD309+(VEGFR-2+) измеряли в тестовом образце цельной крови объемом 10 мл, с помощью набора от MiltenyiBiotecGmbH с использованием технологии MACS, методом проточной цитофлюориметрии (CytomicsFC500, BeckmanCoulter). Еще 10 мл крови использовалось в качестве контрольного образца CD309, и 200мкл крови – в качестве контрольного образца CD133. На первом этапе, во всех образцах лизировали эритроциты с помощью входящего в комплект специального раствора. Затем с помощью обогащающего реагента для ЭПК целевые клетки сепарировали в несколько этапов. Основную сложность в определении содержания указанных клеток представляет тот факт, что частота встречаемости в периферической крови у здоровых взрослых CD34+ -клеток, экспрессирующих также CD309(VEGFR-2/KDR) и CD133, составляет всего около 0.4% от всей популяции CD34+, что соответствует 0.002% от всех мононуклеарных клеток [210]. Для достоверного подсчета этого редкого фенотипа клеток, необходимо увеличивать чувствительность цитометрического анализа. Это достигается обогащением ЭПК, что приводит к снижению числа событий, которые необходимо анализировать. 47 Детекция ЭПК в образце крови происходит при их окрашивании с помощью реагента, содержащего CD34-флуоресцин-изотиоцианат (CD34FITC), CD133/2(293C3)-R-фикоэритрин (CD133/2-PE)и CD309- аллофикоцианин (CD309-APC) для позитивного окрашивания ЭПК, и CD14R-фикоэритрин-Cy5 (CD14-PE-Cy5) для исключения моноцитов. Контрольный CD309-образец использовался для контроля изотипа при окрашивании CD309-APC, он инкубировался в контрольном реагенте CD309, содержащем CD34-FITC, CD133/2(293C3)-PE и мышиный IgG1APCв качестве контроля изотипа, и CD14-PE-Cy5. Контрольный образец CD133 являлся контрольным для окрашивания CD133/2(293C3)-PE, он инкубировался с контрольным реагентом CD133, содержащем CD34-FITC, мышиный IgG2b-PE в качестве контроля изотипа, и CD14-PE-Cy5. На последнем этапе клетки анализировались с помощью 4-цветной (FITC, PE, APC, PE-Cy5) протоковой цитометрии. При этом создавались точечные графики распределения по следующим осям: - прямое рассеиваниеи боковое рассеивание (forwardscatter, FSCиsidescatter, SSC) - PE и PE-Cy5, пропидиум йодида (PI) - PE и FITC - PE и APC Ввиду крайне низкой ожидаемой частоты выявления клеток целевого фенотипа, использовались полные образцы крови, а для оценки специфичности CD133 набирали не менее 300 тыс. событий. В контрольном образце CD133 определяли CD34+-клетки с CD133-специфичностью, а в тестовом образце ЭПК и контрольном CD309 – ЭПК целевого фенотипа. Указанные действия выполняли последовательно в 5 этапов: 48 1. На графике FSC-SSC отсеивали фрагменты клеток и тромбоциты, обведя соответствующие регионыR1, содержавший целевые клетки (лейкоциты) в обоих образцах (рис. 1А,Б) А Б Рис. 1. А – контрольный образец CD133, Б – тестовый образец ЭПК (аналогично для образца CD309). 2. Отсеивали погибшие клетки и моноциты. Для этого обводили регион R2 на графике с осями IgG2b-PE и CD14-PE-Cy5 для образца CD133, и CD133/2-PEи CD14-PE-Cy5 для образца ЭПК (рис. 2Б). Статистику для образца CD133 на этом этапе сохраняли для последующего вычисления содержания CD34 среди общего пула лейкоцитов. 49 А Б Рис. 2. А – контрольный образец CD133, Б – тестовый образец ЭПК 3. В образце ЭПК – определяли CD34+-клетки, а в контрольном образце CD133 −CD34+-клетки с CD133-специфичностью. Для этого в образце CD133 на графике с осями IgG2b-PEи CD34-FITC отсекали квадрант, разграничивающий CD133- и CD133+-клетки, после чего обводили регион R3, содержащий CD34+-клетки (рис. 3А), а в образце ЭПК – на графике с осями CD133/2-PE и CD34-FITC обводили регион R4 (рис. 3Б). А Б Рис. 3. А – контрольный образец CD133, Б – тестовый образец ЭПК 4. Определяли специфичность CD133. Для этого квадрант, содержащий R3 (рис. 3А), переносили на график образца CD309 с осями CD133/2-PE и IgG1-APC, после чего корректировали квадрант специфичности CD309 в зависимости от флуоресценции IgG1-APC в контрольном образце CD309, получая регион R5 (рис. 4А). Затем аналогичный регион R5 обводили в тестовом образце ЭПК, выделяя таким образом клетки фенотипа CD34+/CD133+/CD309+ (рис. 4Б). Статистику для обоих образцов на этом этапе сохраняли для последующего вычисления содержания ЭПК среди пула CD34+. 50 А Б Рис. 4. А – контрольный образец CD309, Б – тестовый образец ЭПК 5. Идентифицировали пул ЭПК с низкими рассеиваниями. Для этого на графике с осями FSCи SSC и установленным регионом R1 обводили регион R6 (рис. 5 А, Б) А Б Рис. 5. А. Контрольный образец CD309.Б.Тестовый образец ЭПК. Полученные данные использовали для расчета числе ЭПК в 10 мл кровиследующим образом: 1. Рассчитывали число CD34+-клеток в образце CD133. Например, пусть всего в образце выявлено 150 тыс. событий, из них лейкоцитов (регион R1) – 130 тыс, из них живых (регион R2)–120 тыс, из них CD34+ – 1 тыс., т.е. 1/130 = 0.0077 = 0.77%. Тогда, если общее число лейкоцитов у 51 пациента составляло 6 млн/мл (т.е. 60 млн в 10 мл), то абсолютное число CD34+-клеток составляет (0.77%*60млн)/100=462 тыс. в 10 мл крови. 2. Рассчитывали долю ЭПК в контрольном образце CD309. Например, пусть всего в образце выявлено 140 тыс. событий, из них живых CD34+клеток (регион R4) – 100 тыс., из них живых CD34+/CD133+/IgG1+клеток – 80 (регион R1 на рис. 5А), из них 70 – целевые ЭПК (регион R6), т.е. 0.07% 3. Рассчитывали долю ЭПК в тестовом образце ЭПК. Например, если всего в образце выявлено 100 тыс. событий, из них живых CD34+-клеток (регион R4) – 70 тыс., из них живых CD34+/CD133+/CD309+-клеток – 150 (регион R1 на рис. 5Б), из них 130 – целевые ЭПК (регион R6), т.е. 0.19% 4. Абсолютное число ЭПК фенотипа CD34+/CD133+/CD309+ в 10 мл крови вычислялось как ((%ЭПК в тестовом образце) – (%ЭПК в образце CD309))*(абсолютное число CD34+-клеток)/100. Т.е., в нашем случае, число ЭПК равно (0.19%-0.07%)*462 тыс/100 = 554. 2.3 Статистическая обработка Ввиду отсутствия нормального распределения (по критерию ШапироУилка) в большинстве сравниваемых групп, данные, если не оговорено особо, анализировались непараметрическими методами: средние представлены в виде “медиана (межквартильный размах)”, корреляционный анализ проводился по Спирмену, сравнение медиан независимых групп – по Манну-Уитни, зависимых – по Уилкоксону, к качественным данным применяли точный критерий Фишера. Для анализа влияния двух факторов на изменение исследуемых параметров применяли двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA (в случае ненормального распределения выборки – после ее нормализации преобразованием Бокс-Кокса). Обработка данных выполнялась в программах MedCalc 14 и MicrosoftExcel. 52 Глава III. Результаты исследования 3.1 Содержание ЭПК, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), эндостатина и MCP-1 в крови у больных ИБС и здоровых добровольцев Было отмечено, что в группе пациентов ИБС число ЭПК достоверно ниже, чем у здоровых добровольцев (рис. 6А). Также у больных ИБС по сравнению с добровольцами отмечено достоверное снижение числа лейкоцитов и концентрации эндостатина (рис. 6Б), а также достоверное повышение концентрации ОХС (рис. 7А), ХС ЛНП (рис. 7Б), VEGF (рис. 8А), СРБ (рис. 8Б), глюкозы, а также СОЭ. А Б Рис. 6. Уровень ЭПК (А) и эндостатина (Б) у больных ИБС и здоровых добровольцев. 53 А Б Рис. 7. Уровень ОХС (А) и ХС ЛНП (Б) у больных ИБС и здоровых добровольцев. А Б Рис. 8. Уровень VEGF (А) и СРБ (Б) у больных ИБС и здоровых добровольцев. 54 Достоверных различий в уровнях ХС ЛВП, ТГ, MCP-1 между этими группами выявлено не было. В двух подгруппах больных ИБС по дозе статина не было отмечено достоверных различий в значениях исследуемых параметров. Обращают на себя внимания большие значения дисперсий числа ЭПК во всех группах, что является следствием особенностей методики подсчета числа ЭПК исследуемого фенотипа, который оказался очень редким. По-видимому, этим и объясняется недостоверное различие числа ЭПК между группами больных ИБС, хотя и отмечается тенденция к более низким значениям ЭПК в группе 2 (с большими значениями ХС ЛНП). Все данные по сравнению содержания ЭПК фенотипа CD34+/CD133+/CD309+ на 10 мл цельной крови, числа лейкоцитов, концентрации VEGF, MCP-1, СРБ и эндостатина в группах больных ИБС и в контрольной группе суммированы в таблице 4. 55 Таблица 4. Сравнение содержания исследуемых показателей в группах больных ИБС и контрольной группе. ИБС (n=58) Показатель ЭПК,кол-во на 10 мл Лейкоциты, млн/мл ОХС,ммоль/л Группа 1 (10 мг, n=26) ХС ЛВП,ммоль/л p* 938 (412-1778) <0.01 7.6 (6.5-8.1) 0.013 4.68 (4.03-4.86) <0.01 57 (98%) 0 (0%) <0.01 4.45(4.26-5.19) 2.60 (1.90-2.97) <0.01 1.15 (0.91-1.38) 0.08 Группа 2 (40 мг, n=32) p* 171 (77-435) 234 (114-434) 142 (70-443) 0.33 6.4 (5.6-7.2) 6.4 (5.9-7.1) 6.3 (5.6-7.5) 0.81 6.77(6.35-7.56) 6.55 (6.10-6.98) ОХС>5.2 ммоль/л ХС ЛНП,ммоль/л Контроль (n=15) 4.34 (3.96-4.63) 6.95 (6.42-7.84) 4.59 (4.14-5.28) 0.07 0.09 1.31 (1.10-1.66) 1.20 (1.09-1.66) 1.37 (1.11-1.66) 0.67 Таблица 4. Сравнение содержания исследуемых показателей в группах больных ИБС и контрольной группе (продолжение). ИБС (n=58) Показатель ТГ,ммоль/л VEGF, пг/мл Эндостатин, нг/мл MCP-1, пг/мл СРБ, мг/дл Глюкоза,ммоль/л СОЭ,мм/ч Группа 1 (10 мг, n=26) Группа 2 (40 мг, n=32) 1.86 (1.36-2.64) 388.4 (253.6-448.4) 156.4 (137.5-179.3) 209.6 (175.0-247.1) 0.31 (0.18-0.49) 5.62 (4.93-6.06) 11 (7-20) 0.012 200.7 (168.9-251.2) 0.57 0.13 (0.03-0.25) 0.017 4.96(4.70-5.22) 0.04 5.5(2.0-10.0) <0.01 0.52 11.5(7.0-19.0) 10 (7-14) 182.1 (154.5-187.6) 0.07 5.57(4.94-6.06) 5.44 (4.94-6.06) 0.016 0.65 0.27 (0.14-0.47) 0.22 (0.10-0.39) 259.5(144.9-310.3) 0.32 211.6 (175.0-275.8) 219.9 (175.0-278.0) 0.49 0.94 154.6 (138.1-170.0) 150.9 (139.1-160.8) 1.46(0.98-1.97) 0.10 383.7 (244.8-454.7) 375.3 (244.8-462.3) p* p* 1.67(1.25-2.43) 1.38 (1.11-2.16) Контроль (n=15) 0.59 * тест Манна-Уитни 57 3.2 Связь ЭПК, VEGF, эндостатина и MCP-1 с факторами риска у больных ИБС При сравнении уровней ЭПК, VEGF, эндостатинаи MCP-1 у мужчин и женщин достоверных различий не выявлено. Также не выявлена связь этих факторов с возрастом, индексом массы тела, наличием отягощенного анамнеза, наличием артериальной гипертонии, с перенесенным ранее инфарктом миокарда (табл. 5). Наиболее достоверные связи были выявлены в группах, разделенных по такому фактору риска, как курение. У некурящих больных ИБС уровень эндостатина был достоверно выше, чем у курящих – 156.9 (138.6-176.2)нг/мл и 140.2 (136.9-151.1)нг/мл соответственно (р=0.043, рис. 9A). Практически достигло критериев достоверности повышенное содержание ЭПК и VEGF в группе курильщиков по сравнению с некурящими пациентами ИБС (p=0.053 и 0.061, соответственно, рис. 9Б, 10А). Сахарный диабет как фактор еще более низкого содержания ЭПК (по сравнению с больными ИБС без СД) также почти достиг критериев достоверности (p=0.066, рис. 10Б). А Б Рис. 9. Уровень эндостатина (А) и ЭПК (Б) у курящих и некурящих больных ИБС. А Б Рис. 10. А. Уровень VEGF у курящих и некурящих больных ИБС. Б. Уровень ЭПК у пациентов ИБС с диабетом. 59 Таблица 5. Связь ЭПК, VEGF, эндостатина и MCP-1 с факторами риска у больных ИБС Фактор Пол Возраст ИМТ Отягощенный семейный анамнез Курение ЭПК, кол-во на 10 мл муж. n=22 248 (87-543) жен. n=36 158 (70-426) р 0.50 Корреляция да нет n=42 n=16 p да нет n=10 n=48 p АГ да нет n=47 n=11 р СД да нет n=6 n=52 р ИМ в анамнезе да нет n=7 n=51 р VEGF, пг/мл Эндостатин, нг/мл MCP-1, пг/мл 374.7 (239.9-432.4) 388.4 (261.0-488.2) 0.59 155.7 (131.1-168.4) 154.6 (138.6-176.2) 0.69 214.4 (156.0-285.4) 207.2 (175.0-275.8) 0.67 r=-0.24, p=0.07 r=0.19, p=0.15 r=-0.07, p=0.61 r=0.10, p=0.47 r=0.003, p=0.98 r=0.08, p=0.54 r=0.10, p=0.44 r=-0.15, p=0.26 215 (79-434) 149 (70-778) 0.93 413 (146-893) 158 (68-392) 0.053 146 (68-424) 300 (165-588) 0.13 65 (37-114) 215 (80-443) 0.066 236 (130-853) 165 (69-430) 0.24 388.4 (281.4-451.7) 312.4 (198.9-510.0) 0.61 436.1 (370.5-537.7) 377.6 (238.3-438.8) 0.061 380.0 (239.9-451.1) 392.5 (267.4-475.4) 0.38 388.9 (267.3-401.3) 380.0 (242.4-466.7) 0.83 391.4 (366.8-538.1) 379.9 (241.1-452.3) 0.30 154.3 (139.1-169.7) 155.5 (138.1-181.1) 0.86 140.2 (136.9-151.1) 156.9 (138.6-176.2) 0.043 154.0 (134.7-173.9) 160.0 (152.4-169.4) 0.28 165.8 (146.4-181.5) 154.3 (138.1-169.9) 0.32 139.1 (128.0-173.1) 154.7 (139.1-169.9) 0.35 211.6 (175.0-275.8) 222.4 (137.0-295.7) 0.86 201.9 (162.8-313.3) 214.4 (175.0-275.8) 0.99 209.2 (175.0-269.8) 214.7 (176.5-343.3) 0.36 217.1 (203.7-230.6) 207.2 (175.0-276.9) 0.78 228.2 (156.3-230.6) 209.2 (175.0-283.0) 0.64 3.3 Сопоставление содержания ЭПК, показателей липидного профиля и концентрации VEGF, эндостатина, MCP-1 и СРБ в крови у больных ИБС Проведен анализ корреляции содержания ЭПК с общим числом лейкоцитов, концентрацией ОХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП, ТГ, VEGF, эндостатина, MCP-1 и СРБ в исследуемых группах (у больных ИБС до терапии статинами и у здоровых добровольцев). За исключением положительной корреляции между ЭПК и ОХС в группе добровольцев, достоверных связей обнаружено не было (табл. 6, рис 11). Практически достигла критериев достоверности положительная корреляция между VEGF и ЭПК в группе больных ИБС (рис. 12) Таблица 6. Корреляции числа ЭПК и других исследуемых параметров Корреляция: ЭПК и. Лейкоциты ОХС ХС ЛНП ХС ЛВП ТГ VEGF Эндостатин MCP-1 СРБ ИБС (n=58) r* p** -0.12 0.38 0.01 0.95 -0.09 0.50 0.00 1.00 0.07 0.58 0.25 0.06 -0.04 0.74 -0.22 0.10 -0.07 0.62 * коэффициент ранговой корреляции по Спирмену ** уровень значимости для r Контроль (n=15) r* p** 0.31 0.38 0.65 0.04 0.09 0.80 -0.33 0.35 0.20 0.58 0.20 0.58 0.24 0.51 -0.44 0.20 -0.02 0.96 Рис. 11. Связь значений ОХСи уровня ЭПК в группе добровольцев.r – коэффициент ранговой корреляции по Спирмену, p – уровень значимости для r. Рис. 12. Связь значений VEGFи уровня ЭПК в группе ИБС.r – коэффициент ранговой корреляции по Спирмену, p – уровень значимости для r. 62 3.4 Влияние терапии аторвастатином в дозе 10 мг и 40 мг на уровень ЭПК, факторов ангиогенеза и показателей липидного профиля. На фоне терапии аторвастатином было выявлено достоверное увеличение числа ЭПК с 171 (77-435) до 423 (164-739), коэффициент прироста – 1.72 (1.24-2.64), что соответствует 72% (рис. 13), и значимое снижение ОХС (на 30%, рис. 14А), ХС ЛНП (на 35%, рис. 14Б), ТГ (на 18%), VEGF (на 11%, рис. 15А) и СРБ (на 26%, рис. 15Б). Рис. 13. Динамика содержания ЭПК на фоне терапии аторвастатином. Терапия аторвастатином привела к повышению количества ЭПК с 171 до 423 единиц в 10 мл. В группе 1 количество ЭПК возросло с 234 до 466 единиц в 10 мл, в группе 2 – с 142 до 382 единиц в 10 мл. Результаты оценки влияния приема аторвастатина в дозах 10 и 40 мг в течение 3 месяцев на исследуемые параметры приведены в таблице 7. 63 А Б Рис. 14. Динамика содержания ОХС (А) и ЛНП (Б) на фоне терапии аторвастатином. А Б Рис. 15. Динамика содержания VEGF (А) и СРБ (Б) на фоне терапии аторвастатином. 64 Таблица 7. Влияния приема аторвастатина в дозах 10 и 40 мг в течение 3 месяцев на исследуемые параметры ИБС (n=58) Группа 1 (10 мг, n=26) Группа 2 (40 мг, n=32) 1-2 k1 p2 k1 p2 k1 p2 p3 ЭПК 1.72 (1.24-2.64) <0.01 1.35 (1.14-2.33) <0.01 1.98 (1.38-3.50) <0.01 0.10 Лейкоциты 0.99 (0.92-1.07) 0.68 1.00 (0.94-1.06) 0.89 0.99 (0.89-1.08) 0.56 0.69 ОХС 0.70 (0.65-0.78) <0.01 0.78 (0.70-0.85) <0.01 0.66 (0.61-0.71) <0.01 <0.01 ХС ЛНП 0.65 (0.55-0.75) <0.01 0.72 (0.66-0.85) <0.01 0.58 (0.53-0.66) <0.01 <0.01 ХС ЛВП 0.99 (0.91-1.06) 0.31 1.03 (0.94-1.06) 0.85 0.98 (0.88-1.04) 0.15 0.19 ТГ 0.82 (0.62-0.96) <0.01 0.84 (0.74-1.00) <0.01 0.76 (0.56-0.92) <0.01 0.14 VEGF 0.89 (0.80-1.01) <0.01 0.89 (0.83-0.96) <0.01 0.88 (0.78-1.03) 0.016 0.99 Эндостатин 0.97 (0.90-1.06) 0.22 1.00 (0.92-1.09) 0.97 0.96 (0.86-1.03) 0.11 0.28 MCP-1 0.99(0.89-1.10) 0.42 0.97(0.87-1.08) 0.32 1.01 (0.91-1.10) 0.81 0.45 СРБ 0.74 (0.53-1.00) <0.01 0.84 (0.61-1.00) 0.057 0.72 (0.50-0.95) <0.01 0.31 Глюкоза 1.00 (0.93-1.05) 0.72 0.99 (0.95-1.10) 0.44 1.00 (0.9-1.04) 0.31 0.21 СОЭ 1.00 (0.80-1.33) 0.70 0.91 (0.75-1.13) 0.37 1.00 (0.81-1.38) 0.91 0.49 1 k - коэффициент изменения показателя (1.72 означает увеличение показателя на 72%, 0.63 – снижение на 37% и т.д.). тест Уилкоксона 3 тест Манна-Уитни (сравнение k в группах 1 и 2) 2 Остальные исследуемые показатели за время терапии не претерпели статистически значимых изменений. Следует отметить, что не было выявлено дозозависимых изменений показателей, т.е. увеличение дозы статина не приводило к достоверным изменениям динамики показателя, наблюдаемой на фоне приема стандартной дозы. Как видно из рисунка 13, рост количества ЭПК происходил как при назначении аторвастатина в дозе 10 мг/сут, так и в дозе 40 мг/сут. Разница между коэффициентами прироста была недостоверной, р=0.1. Также мы провели анализ зависимости динамики значений ОХС и ХС ЛНП на фоне терапии в зависимости от их исходных значений, раздельно в обеих группах. Связь изменения ЛНП (kЛНП) от его исходной величины представлена на рис. 16. Рис. 16. Связь исходных значений ЛНП и его изменения на фоне терапии аторвастатином в дозе 10 мг (группа 1) и 40 мг (группа 2). r – коэффициент ранговой корреляции по Спирмену, p – уровень значимости для r. Аналогичные результаты получены и для ОХС: группа 1 – r=-0.22, p=0.28, группа 2 – r=0.24, p=0.18, т.е. выявлено практически отсутствие корреляций. Таким образом, было показано, что исходные значения ЛНП и ОХС не влияли на их динамику в результате терапии. Для дополнительной проверки этого утверждения мы разбили каждую из групп 1 и 2 на две равных подгруппы согласно исходных значений ЛНП – ниже медианы и выше медианы, после чего провели над полученными четырьмя группами двухфакторный дисперсионный анализ. Аналогичная группировка и анализ были выполнены и для исходного ОХС, а также для оценки динамики уровня ЭПК. Результаты приведены в табл. 8. Таблица 8. Оценка влияния дозы статина и исходного значения параметра на его динамику. Гипотеза: на динамику параметра влияет: Исходноезначение параметра Дозастатина ОХС p Параметр ЛНП p ЭПК p 0.99 (ложно) 0.43 (ложно) 0.01 (истинно) <0.01 (истинно) <0.01 (истинно) 0.38 (ложно) Таким образом, было подтверждено, что исходные значения ОХС и ЛНП не влияли на степень их снижения в результате терапии. Результаты теста Манна-Уитни ожидаемо указывали на достоверно большее снижение ОХС и ЛНП в группе 2 (40 мг), чем в группе 1 (10 мг), p для обоих показателей <0.01. В то же время прирост ЭПК, как следует из табл. 8, от дозы статина, наоборот, не зависит, но зависит от исходного значения ЭПК. Другими словами, чем ниже были исходные значения ЭПК у пациентов перед началом терапии статином, тем более значительный их прирост наблюдался на фоне терапии. 3.5 Сопоставление динамики ЭПК с динамикой показателей липидного профиля у больных ИБС на фоне терапии аторвастатином в различных дозах В связи с полученными результатами был выполнен корреляционный анализ связи между приростом ЭПК и падением ЛНП и ОХС, а также динамикой ХС ЛВП и ТГ в группах 1 и 2 на фоне терапии аторвастатином. Были выявлены слабые и умеренные связи между динамикой ЭПК, ЛНП и ОХС, результаты приведены на рис. 17, 18 и табл. 9. 67 Рис. 17. Связь между приростом ЭПК и снижением ЛНП на фоне терапии аторвастатином у больных ИБС. Рис. 18. Связь между приростом ЭПК и снижением ОХС на фоне терапии аторвастатином у больных ИБС. Таблица 9. Корреляции динамики числа ЭПК и других исследуемых параметров Корреляция: динамика ЭПК (kЭПК) и динамика.. ОХС ХС ЛНП ХС ЛВП ТГ ИБС (n=58) Группа 1 (10 мг, n=26) Группа 2 (40 мг, n=32) r* p** r* p** r* p** -0.37 -0.41 0.00 0.00 <0.01 <0.01 1.00 0.98 -0.52 -0.44 0.06 -0.09 <0.01 0.03 0.78 0.67 -0.21 -0.26 -0.03 0.09 0.26 0.15 0.87 0.63 * коэффициент ранговой корреляции по Спирмену ** уровень значимости для r 68 Глава IV. Обсуждение Таким образом, были показаны достоверные различия ряда показателей у больных ИБС по сравнению со здоровыми добровольцами. Уровень ЭПК у больных ИБС был в среднем в 4 раза ниже (p<0,01), уровень VEGF на 52% выше (p<0,01), уровень эндостатина на 13% ниже (p<0,05), чем в контрольной группе. Терапия аторвастатином у больных ИБС в течение трех месяцев приводила к увеличению уровня ЭПК в среднем на 72% (p<0,05). Прирост ЭПК не зависел от дозы статина (p=0,38), однако он был выше при исходно низких значениях ЭПК (p=0,01). На фоне терапии отмечено снижение (на 11%) уровня VEGF (p<0,05), уровень эндостатина значимо не изменился (p=0,22). Установлена взаимосвязь между динамикой ЭПК, общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности на фоне терапии, то есть большему приросту ЭПК соответствовало большее снижение ОХС (r=0,37, p<0,01) и ХС ЛНП (r=-0,41, p<0,01). В рамках обсуждения полученных результатов, прежде всего, следует отметить важность выбора самой методики измерения уровня ЭПК, так как в зависимости от типа экспрессируемых маркеров определяются разные клетки, или же одни и те же клетки, но на разных стадиях развития. Использованная нами методика позволяла выявлять редкий фенотип «молодых» ЭПК, однако это требовало мероприятий по усилению чувствительности цитометрии. Возможно, этим и можно объяснить большой разброс полученных значений уровня ЭПК как у добровольцев, так и у больных ИБС – от 100 до 2000 клеток на 10 мл крови. Такой разброс приводил к статистически недостоверным результатам в тех группах, где при других условиях, возможно, были бы выявлены достоверные различия и зависимости. Так, дозонезависимость прироста ЭПК на фоне терапии аторвастатином имела уровень достоверности p=0,10, повышенный уровень ЭПК в группе курильщиков – 0,053, пониженный уровень ЭПК у больных с СД – 0,066. В группе курящих 69 больных ИБС отмечены более высокие уровни ЭПК и VEGF, а также достоверно более низкие уровни эндостатина. Эти результаты противоречат некоторым литературным данным и требуют дальнейшего исследования. Возможно, такое повышение проангиогенных факторов является временным включением резервов организма, которое возникает в ответ на курение как дополнительный фактор повреждения сосудистой системы. Известно, что медикаментозная терапия оказывает влияние на ростовые факторы. Так, Miura с соавторами продемонстрировали, что на процессы ангиогенеза влияет терапия статинами и ингибиторами АПФ [198]. Результаты нашей работы также указывают на то, что терапия аторвастатином ведет к снижению уровня VEGF. На уровень эндостатина, фактора, ингибирующего ангиогенез, значимого влияния терапия аторвастатином не оказала. Подобный эффект отмечался при лечении розувастатином в дозе 5 и 10 мг в сутки. Нами не было выявлено влияние исходного уровня VEGF на степень его снижения на фоне терапии аторвастатином. Возможно, гиперхолестеринемия сама по себе оказывает влияние на уровни факторов ангиогенеза. В нашей работе этот факт не проверялся, так как проведение такого исследования требует сравнения факторов ангиогенеза у здоровых добровольцев и у пациентов с повышенным уровнем холестерина и без ИБС, что должно быть подтверждено ангиографически. Имеются клинические работы, в которых такое сравнение проведено. Так в работе скандинавских кардиологов оценивалась взаимосвязь уровня VEGF с гипоксией, цитокинами и с холестерином ЛНП. Включено 18 пациентов с повышенным уровнем холестерина и 12 здоровых добровольцев. Была найдена корреляция между уровнем VEGF и холестерином, холестерином ЛНП, триглицеридами у пациентов с гиперхолестеринемией и отсутствие такой корреляции в контрольной группе. При лечении правастатином было найдено снижение уровня холестерина, факторов воспаления и VEGF [211]. 70 Статины регулируют синтез VEGF эндотелиальными и гладкомышечными клетками, модулируя таким образом формирование новых коронарных артерий. В нормальных условиях гладкомышечные и эндотелиальные клетки человека синтезируют и секретируют VEGF. Макрососудистые короткое время. эндотелиальные Статины клетки (аторвастатин, могут секретировать симвастатин, VEGF ловастатин) значительно снижают базальную секрецию VEGF, а также секрецию, индуцированную цитокинами, оксидом азота, фосфатидилхолином[212]. Некоторые авторы описывают дозозависимый эффект статинов– в низких концентрациях превалирует проангиогенетический эффект, в высоких концентрациях статины ангиогенез ингибируют [213]. Результаты нашей работы опровергают эту точку зрения, так как терапия статинами приводила к снижению как уровня VEGF вне зависимости от дозы статина. В экспериментальной работе было продемонстрировано, что правастатин положительно влияет на ремоделирование миокарда после перенесенного инфаркта за счет противовоспалительных механизмов, но не за счет усиления ангиогенеза. Инфаркт моделировался пережатием передней межжелудочковой артерии, затем либо давался правастатин либо вводились стволовые клетки. Дисфункция миокарда уменьшалась после назначения правастатина и после введения стволовых клеток. Однако микроваскуляризация инфаркт зависимой зоны возрастала только у крыс, которым вводились стволовые клетки, но не в группе, получавшей правастатин. Было отмечено уменьшение факторов воспаления при лечении правастатином. Следовательно, терапия статином не повлияла на коронарный ангиогенез [214]. Тот факт, что терапия высокими дозами статинов позволяет улучшить состояние при гиперхолестеринемией, эндотелиальной подтверждается дисфункции, обусловленной работой американских исследователей. Дизайн этой экспериментальной работы был аналогичным. 71 Аторвастатин улучшал эндотелиальную дисфункцию и не оказывал влияние на коллатеральную перфузию миокарда. Более того, терапия аторвастатином в высоких дозах приводила к увеличению экспрессии эндостатина и к снижению экспрессии VEGF [215]. В экспериментальных работах на мышах было показано, что питавастатин и аторвастатин уменьшают уровень VEGF, экспрессию генов VEGF, экспрессию лигандахемокинахемоатрактанта СС и хемоатрактантного белка моноцитов, но значимо не влияют на внутриклеточные молекулы адгезии [216, 217]. В экспериментальной работе на морских свинках было изучено влияние высоких доз статинов на коронарный ангиогенез [218]. Сначала животным назначали гиперхолестериновую аторвастатин. Хроническая диету, ишемия затем части моделировалась из них путем давали пережатия огибающей артерии на фоне 3-х недельного введения VEGF. У свинок, которые находились на гиперхолестериновой диете, отмечалось ухудшение микрососудистой релаксации в ответ на введение VEGF по сравнению со свинками, которые получали обычную пищу. Однако у тех свинок, которые получали гиперхолестериновую диету и аторвастатин, микрососудистая релаксация была сохранена. При моделировании ишемии миокарда коллатеральное кровоснабжение менялось по-разному у разных групп свинок. После введения VEGF миокардиальная перфузия (по коллатералям) у свинок с нормальным питанием улучшилась, а у свинок с гиперхолестериновой диетой не менялась. Не менялась она и у свинок с гиперхолестериновой диетой и приемом аторвастатина. В этой же группе была выявлена повышенная экспрессия ингибитора ангиогенезаэндостатина. Был сделан вывод, что терапия аторвастатином приводит к улучшению функции эндотелия, но не оказывает влияния Экспериментальные на коллатерально-зависимую данные [218] перфузию подтверждаются и миокарда. результатами клинических работ. Так симвастатин в дозе как 20 мг в день, так и 40 мг в день 72 достоверно снижал уровень VEGF у больных ИБС уже через 6 недель лечения [219]. Отмечено снижение уровня VEGF у больных ИБС при лечении их аторвастатином в дозе 20 мг [220]. Таким образом, повышенный уровень холестерина сам по себе тормозит связывание VEGF с рецепторами. Имеются работы, в которых доказано, что гиперхолестеринемия блокирует индуцирование коронарного ангиогенеза под воздействием повышенного уровня VEGF [219, 222]. То есть при повышении уровня холестерина коронарный ангиогенез не может полноценно реализовываться. Поэтому, назначение статинов хотя и снижает уровень проангиогенных факторов роста, но увеличивает их связь с рецепторами. То есть, ингибирующего влияния на ангиогенезстатины не оказывают. Более того, не исключено, что снижение уровня VEGF обусловлено отрицательной обратной связью – активация рецепторов к VEGF приводит к снижению концентрации VEGF. Как известно, васкуляризация атеросклеротической бляшки является неблагоприятным процессом [223]. Ее неоваскуляризация играет большую роль в дестабилизации бляшки и увеличивает опасность разрыва, что может привести к тромбозу и инфаркту миокарда. Статины, вероятно, ослабляют процессы фиброза, атеросклеротической что оказывает бляшки и ингибирующее является одним влияние из на механизмов рост ее стабилизации. Повышение уровня ЭПК различных фенотипов на фоне терапии статинами – известный факт, продемонстрированный в ряде работ [24, 25, 138, 224]. Однако оставалось неясным, является ли это стимулирующее влияние статинов на прогениторные клетки дозозависимым. Этот вопрос имеет важное научное и практическое значение. Результаты нашего исследования демонстрируют, что количество ЭПК у здоровых лиц достоверно выше, чем у пациентов с ИБС. Подобные различия отражены и в недавно опубликованном обзоре, показавшем, что у больных с заболеваниями, обусловленными 73 атеросклерозом коронарных артерий, уровень ЭПК снижается [225]. Из полученных результатов можно сделать вывод, что уровень ЭПК оказывает положительное влияние на функцию эндотелия, что подтверждается работами, описывающими влияние статинов на потокзависимую вазодилатацию [226]. Вполне вероятно, что в основе нормализации потокзависимой вазодилатации лежит репарация эндотелиальными прогениторными клетками сосудистого эндотелия. Однако, несмотря на то, что статинотерапия приводит к увеличению уровня ЭПК [227-229], механизмы, лежащие в основе этого эффекта, до конца не выяснены. Их изучению и была посвящена наша работа. В клинических исследованиях предпринимаются попытки использовать тот факт, что статинотерапия ведет к повышению уровня ЭПК. Так, в исследование ARMIDA продемонстрирован положительный эффект от интенсивной статинотерапии перед чрескожным коронарным вмешательством (ЧКВ) [230]. В новом исследовании HIPOCRATES (2015 г.) изучается влияние терапии статинами в высоких доза на эндотелизацию стента [202]. Авторы подчеркивают, что положительные плейотропные эффекты статинов, улучшающие исходы реваскуляризации миокарда и не связанные с гиполипидемическим их действием, до конца не изучены. Авторы предположили, что повышение ЭПК может нивелировать повреждение эндотелия, происходящее в процессе имплантации стента. В работу включали статин-наивных пациентов, или же больных, нерегулярно принимающих малые дозы статинов. Это были пациенты средней возрастной группы со стабильной или нестабильной стенокардией, направленные на эндоваскулярное лечение (n=23). Пациенты были рандомизированы на 2 группы – высоких доз статинов (80 мг за день до ЧКВ, 40 мг аторвастатина за 2-4 часа до ЧКВ) и низких доз статина. Уровень ЭПК был измерен непосредственно перед ЧКВ и через 24 часа после. Измерение проводили методом цитофлуорометрии за счет экспрессии VEGFR-2+/CD133+ и VEGFR74 2+/CD34+. Количественный культивирования клеток, анализ проводили составляющих после 7 колониеобразующий дневного пул – colonyformingunits (CFUs). Уровень ЭПК-CFUs перед ЧКВ был выше у пациентов группы высоких доз аторвастатина - 165.8 ± 58.8 против 111.7 ± 38.2 CFUs, p < 0,001. Однако через 24 часа уровень ЭПК между группами значимо не отличался – 188.0 ± 85.3 и 192.9 ± 66.5 CFUs соответственно, p = 0,15. Авторы затрудняются объяснить полученные результаты и планируют дальнейшие исследования. Результаты нашего исследования подтверждают вторую часть вышеописанной работы – при длительной терапии статинами отсутствует разница в приросте количества ЭПК на фоне интенсивной терапии и терапии статинами в низких дозах. Малое количество пациентов в работе HIPOCRATES (обусловленное, вероятно, трудоемкостью измерения ЭПК) не позволяет достоверно говорить, действительно ли повышение ЭПК носит двухфазный характер – сначала на высоких дозах статинов происходит более выраженное повышение их количества, чем на низких, но затем идет спад прироста, или же это ошибка малой выборки. Не получен ответ на вопрос, за счет каких механизмов происходит снижение количества осложнений при ЧКВ на фоне интенсивной статинотерапии [202]. Результаты нашего исследования также не отвечают на данный вопрос. Это в какой-то мере соответствует и результатам клинических исследований (TNT, IDEAL), в которых клиническое преимущество высоких доз статинов перед умеренными находилось на гране достоверности [231, 232]. Влияние статинотерапии на количество ЭПК, а также на уровень факторов ангиогенеза изучалось и у пациентов с сахарным диабетом. Так на 34 больных было показано, что терапия статинами уже в ранний период (пять дней) приводит к увеличению уровня ЭПК, однако не влияет на уровень высокочувствительного СРБ, VEGF, SDF-1α, G-CSF [233]. В нашей работе на фоне терапии отмечено снижение уровня СРБ и VEGF. Данное несовпадение 75 вероятно связано с длительностью терапии – снижение СРБ и VEGF, повидимому, происходит при длительной терапии статинами, пяти дней для значимого изменения их уровня оказывается недостаточно. В то же время, в компетентном обзоре клинических исследований (Blum, 2014) автор подчеркивает, что влияние статинов на эндотелиальную функцию и факторы воспаление можно выявить даже через несколько часов после терапии. Эти изменения не связаны с липидснижающим действием, а обусловлены другими механизмами, в частности, восстановлением функции эндотелия, которое, скорее всего, обусловлено высвобождением ЭПК из костного мозга [234]. В 2014 г. было выполнено исследование, в котором на 100 больных с ИМ изучались различия в повышении уровня ЭПК на фоне терапии статинами в высоких и низких дозах [235]. Проведен анализ прироста уровня данных клеток у пациентов, которые исходно находились на низких дозах статинов (и у статин-наивных пациентов) при переходе на высокие дозы. Измеряли уровень ЭПК (CD45dimCD34+ KDR+) через 24 ч и через 2 месяца после ИМ. У больных, ранее принимавших малые дозы статинов, уровень ЭПК был значимо выше, по сравнению со статин-наивными пациентами (p = 0,031). Кроме того, анализ подгруппы больных с СД (n = 38) также продемонстрировал, что у пациентов, исходно принимавших статины, выше уровень как CD45dim/CD34+/KDR+/CXCR4+ (p = 0,024), так и CD45dim/CD34+/KDR+/CD133+ (p = 0,022) чем у статин-наивных. Через 3 месяца был выявлен более высокий прирост уровня ЭПК в группе интенсивной статинотерапии. Результаты нашего исследования не выявили подобных различий. Это может быть обусловлено как различиями в нозологии (в нашей работе были включены больные с стабильной ИБС, а в работе Antonio – с ИМ), так и различиями в методике (мы измеряли уровень ЭПК фенотипа CD34+/CD133+/CD309+). С другой стороны, наши результаты подтверждаются исследованием Pesaro et al, в котором было показано, что у больных со стабильной ИБС увеличение дозы симвастатина с 20 до 80 мг или 76 добавление к симвастатину эзетимиба не приводит к увеличению количества ЭПК [236]. Несмотря на продолжающееся изучение роли ЭПК и влиянии на них статинотерапии, при назначении статинов в первую очередь руководствуются достижениями целевых уровней холестерина ЛНП. Для ответа на вопрос о клиническом применении информации о влиянии разных доз статинов на ЭПК требуются дальнейшие исследования. 77 Выводы 1. Уровень эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК) фенотипа CD34+/CD133+/CD309+ у больных ИБС был в среднем в 4 раза ниже, уровень VEGF на 52% выше, уровень эндостатина на 13% ниже, чем у здоровых добровольцев (p<0.05). Уровень MCP-1 в указанных группах достоверно не различался. 2. Уровень эндостатина у некурящих больных ИБС достоверно выше, чем у курящих (p<0.05). Других достоверных связей ЭПК, VEGF, MCP-1 и эндостатина с факторами риска ИБС не выявлено. 3. Корреляционных связей уровня ЭПК с показателями липидного профиля, концентрацией VEGF, эндостатина, MCP-1 и СРБ в крови у больных ИБС не выявлено. 4. На фоне терапии аторвастатином выявлено повышение уровня ЭПК в среднем на 72%. Достоверных различий в приросте ЭПК в зависимости от дозы статина не выявлено. Прирост ЭПК был более выражен при исходно низких уровнях ЭПК. 5. На фоне терапии аторвастатином выявлено достоверное снижение уровня VEGF (на 11%, p<0.05), достоверной динамики эндостатина и MCP-1 не выявлено. Все указанные изменения были дозонезависимыми. 6. Выявлены корреляционные связи слабой и средней степени между снижением ОХС и ЛНП и приростом ЭПК, более выраженные в группе стандартной дозы аторвастатина. Практические рекомендации Информация о дозонезависимом влиянии статинов на количество ЭПК, а также на VEGF и отсутствие их влияния на эндостатин и MCP-1 должна быть использована в дальнейших исследованиях, направленных на изучение не связанных с липидами эффектов данной группы препаратов. Список литературы 1. Сон И.М., Александрова Г.А., Хахалина Е.В. Медикодемографические показатели Российской Федерации в 2013 году: Стат. справочник: М.: Минздрав России; 2014. 2. Xu Q. The impact of progenitor cells in atherosclerosis. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2006;3(2):94-101. 3. Hirschi K.K., Ingram D.A., Yoder M.C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008;28(9):1584-95. 4. Zampetaki A., Kirton J.P., Xu Q. Vascular repair by endothelial progenitor cells. Cardiovasc Res. 2008;78(3):413-21. 5. Asahara T., Murohara T., Sullivan A., Silver M., van der Zee R., Li T., Witzenbichler B., Schatteman G., Isner J.M. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997;275(5302):964-7. 6. Tateishi-Yuyama E., Matsubara H., Murohara T., Ikeda U., Shintani S., Masaki H., Amano K., Kishimoto Y., Yoshimoto K., Akashi H., Shimada K., Iwasaka T., Imaizumi T. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial Lancet. 2002;360(9331):427-35. 7. Higashi Y., Kimura M., Hara K., Noma K., Jitsuiki D., Nakagawa K., Oshima T., Chayama K., Sueda T., Goto C., Matsubara H., Murohara T., Yoshizumi M. Autologous bone-marrow mononuclear cell implantation improves endothelium-dependent vasodilation in patients with limb ischemia. Circulation. 2004;109(10):1215-8. 8. Schmidt-Lucke C., Rossig L., Fichtlscherer S., Vasa M., Britten M., Kamper U., Dimmeler S., Zeiher A.M. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 2005;111(22):2981-7. 9. Werner N., Nickenig G. Influence of cardiovascular risk factors on endothelial progenitor cells: limitations for therapy? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006;26(2):257-66. 10. Yoder M.C. Defining human endothelial progenitor cells.J Thromb Haemost. 2009;7 Suppl 1:49-52. 79 11. Gallacher L., Murdoch B., Wu D.M., Karanu F.N., Keeney M., Bhatia M. Isolation and characterization of human CD34(-)Lin(-) and CD34(+)Lin(-) hematopoietic stem cells using cell surface markers AC133 and CD7. Blood. 2000;95(9):2813-20. 12. Hill J.M., Zalos G., Halcox J.P., Schenke W.H., Waclawiw M.A., Quyyumi A.A., Finkel T. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 2003;348(7):593-600. 13. Krause D.S., Fackler M.J., Civin C.I., May W.S. CD34: structure, biology, and clinical utility. Blood. 1996;87(1):1-13. 14. Shalaby F., Ho J., Stanford W.L., Fischer K.D., Schuh A.C., Schwartz L., Bernstein A., Rossant J. A requirement for Flk1 in primitive and definitive hematopoiesis and vasculogenesis.Cell. 1997;89(6):981-90. 15. Friedrich E.B., Walenta K., Scharlau J., Nickenig G., Werner N. CD34/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 2006;98(3):e20-5. 16. Aicher A., Heeschen C., Mildner-Rihm C., Urbich C., Ihling C., Technau-Ihling K., Zeiher A.M., Dimmeler S. Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells. Nat Med. 2003;9(11):1370-6. 17. Zhang Q., Yin H., Liu P., Zhang H., She M. Essential role of HDL on endothelial progenitor cell proliferation with PI3K/Akt/cyclin D1 as the signal pathway. Exp Biol Med (Maywood). 2010;235(9):1082-92. 18. Matsumoto T., Claesson-Welsh L. VEGF receptor signal transduction. Sci STKE. 2001;2001(112):re21. 19. Rissanen T.T., Markkanen J.E., Gruchala M., Heikura T., Puranen A., Kettunen M.I., Kholova I., Kauppinen R.A., Achen M.G., Stacker S.A., Alitalo K., Yla-Herttuala S. VEGF-D is the strongest angiogenic and lymphangiogenic effector among VEGFs delivered into skeletal muscle via adenoviruses. Circ Res. 2003;92(10):1098-106. 20. Lin J., Kakkar V., Lu X. Impact of MCP-1 in atherosclerosis. Curr Pharm Des. 2014;20(28):4580-8. 21. Cavalera M., Frangogiannis N.G. Targeting the chemokines in cardiac repair. Curr Pharm Des. 2014;20(12):1971-9. 22. Yadav A., Saini V., Arora S. MCP-1: chemoattractant with a role beyond immunity: a review. Clin Chim Acta. 2010;411(21-22):1570-9. 80 23. Fu Y., Wu X., Han Q., Liang Y., He Y., Luo Y. Sulfate stabilizes the folding intermediate more than the native structure of endostatin. Arch Biochem Biophys. 2008;471(2):232-9. 24. Vasa M., Fichtlscherer S., Adler K., Aicher A., Martin H., Zeiher A.M., Dimmeler S. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 2001;103(24):2885-90. 25. Mangialardi G., Monopoli A., Ongini E., Spinetti G., Fortunato O., Emanueli C., Madeddu P. Nitric oxide-donating statin improves multiple functions of circulating angiogenic cells. Br J Pharmacol. 2011;164(2b):57083. PMCID: 3188894. 26. Бокерия Л.А. Клеточно-генные технологии при эндоваскулярном и хирургическом лечении заболеваний сердца и сосудов. РосМедВести. 2004;3:75-9. 27. Pugh C.W., Ratcliffe P.J. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. Nat Med. 2003;9(6):677-84. 28. Helisch A., Schaper W. Arteriogenesis: the development and growth of collateral arteries. Microcirculation. 2003;10(1):83-97. 29. de Muinck E.D., Simons M. Re-evaluating therapeutic neovascularization. J Mol Cell Cardiol. 2004;36(1):25-32. 30. Buschmann I., Schaper W. The pathophysiology of the collateral circulation (arteriogenesis).J Pathol. 2000;190(3):338-42. 31. Schaper W., Scholz D. Factors regulating arteriogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003;23(7):1143-51. 32. Lewis B.S., Flugelman M.Y., Weisz A., Keren-Tal I., Schaper W. Angiogenesis by gene therapy: a new horizon for myocardial revascularization? Cardiovasc Res. 1997;35(3):490-7. 33. Asahara T., Masuda H., Takahashi T., Kalka C., Pastore C., Silver M., Kearne M., Magner M., Isner J.M. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res. 1999;85(3):221-8. 34. Luttun A., Carmeliet P. De novo vasculogenesis in the heart. Cardiovasc Res. 2003;58(2):378-89. 35. Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 2003;9(6):653-60. 81 36. Lei L., Zhou R., Zheng W., Christensen L.P., Weiss R.M., Tomanek R.J. Bradycardia induces angiogenesis, increases coronary reserve, and preserves function of the postinfarcted heart. Circulation. 2004;110(7):796-802. 37. Zheng W., Seftor E.A., Meininger C.J., Hendrix M.J., Tomanek R.J. Mechanisms of coronary angiogenesis in response to stretch: role of VEGF and TGF-beta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001;280(2):H909-17. 38. Kim S.J., Depre C., Vatner S.F. Novel mechanisms mediating stunned myocardium. Heart Fail Rev. 2003;8(2):143-53. 39. Carmeliet P., Ng Y.S., Nuyens D., Theilmeier G., Brusselmans K., Cornelissen I., Ehler E., Kakkar V.V., Stalmans I., Mattot V., Perriard J.C., Dewerchin M., Flameng W., Nagy A., Lupu F., Moons L., Collen D., D'Amore P.A., Shima D.T. Impaired myocardial angiogenesis and ischemic cardiomyopathy in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188. Nat Med. 1999;5(5):495-502. 40. Huang Y., Hickey R.P., Yeh J.L., Liu D., Dadak A., Young L.H., Johnson R.S., Giordano F.J. Cardiac myocyte-specific HIF-1alpha deletion alters vascularization, energy availability, calcium flux, and contractility in the normoxic heart. FASEB J. 2004;18(10):1138-40. 41. Losordo D.W., Isner J.M. Vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis: crouching tiger or hidden dragon? J Am Coll Cardiol. 2001;37(8):2131-5. 42. Ferrara N., Gerber H.P., LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003;9(6):669-76. 43. Poltorak Z., Cohen T., Sivan R., Kandelis Y., Spira G., Vlodavsky I., Keshet E., Neufeld G. VEGF145, a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix. J Biol Chem. 1997;272(11):7151-8. 44. Ishida A., Murray J., Saito Y., Kanthou C., Benzakour O., Shibuya M., Wijelath E.S. Expression of vascular endothelial growth factor receptors in smooth muscle cells. J Cell Physiol. 2001;188(3):359-68. 45. Lohela M., Saaristo A., Veikkola T., Alitalo K. Lymphangiogenic growth factors, receptors and therapies. Thromb Haemost. 2003;90(2):167-84. 46. Cao R., Brakenhielm E., Pawliuk R., Wariaro D., Post M.J., Wahlberg E., Leboulch P., Cao Y. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF2. Nat Med. 2003;9(5):604-13. 82 47. Pfeffer M.A., Braunwald E. Ventricular remodeling after myocardial infarction. Experimental observations and clinical implications.Circulation. 1990;81(4):1161-72. 48. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Bodine D.M., Leri A., Anversa P. Bone marrow stem cells regenerate infarcted myocardium. Pediatr Transplant. 2003;7 Suppl 3:86-8. 49. Mann D.L. Stress-activated cytokines and the heart: from adaptation to maladaptation. Annu Rev Physiol. 2003;65:81-101. 50. Massague J. Type beta transforming growth factor from feline sarcoma virus-transformed rat cells. Isolation and biological properties. J Biol Chem. 1984;259(15):9756-61. 51. Roberts A.B., Anzano M.A., Lamb L.C., Smith J.M., Frolik C.A., Marquardt H., Todaro G.J., Sporn M.B. Isolation from murine sarcoma cells of novel transforming growth factors potentiated by EGF. Nature. 1982;295(5848):417-9. 52. Shi Y., Massague J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 2003;113(6):685-700. 53. Ruwhof C., van Wamel A.E., Egas J.M., van der Laarse A. Cyclic stretch induces the release of growth promoting factors from cultured neonatal cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Mol Cell Biochem. 2000;208(1-2):8998. 54. Ikeuchi M., Tsutsui H., Shiomi T., Matsusaka H., Matsushima S., Wen J., Kubota T., Takeshita A. Inhibition of TGF-beta signaling exacerbates early cardiac dysfunction but prevents late remodeling after infarction. Cardiovasc Res. 2004;64(3):526-35. 55. Heldin C.H., Miyazono K., ten Dijke P. TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature. 1997;390(6659):46571. 56. Okada H., Takemura G., Kosai K., Li Y., Takahashi T., Esaki M., Yuge K., Miyata S., Maruyama R., Mikami A., Minatoguchi S., Fujiwara T., Fujiwara H. Postinfarction gene therapy against transforming growth factorbeta signal modulates infarct tissue dynamics and attenuates left ventricular remodeling and heart failure. Circulation. 2005;111(19):2430-7. 57. Azhar M., Schultz Jel J., Grupp I., Dorn G.W., 2nd, Meneton P., Molin D.G., Gittenberger-de Groot A.C., Doetschman T. Transforming growth factor 83 beta in cardiovascular development and function. Cytokine Growth Factor Rev. 2003;14(5):391-407. PMCID: 3855389. 58. Behfar A., Zingman L.V., Hodgson D.M., Rauzier J.M., Kane G.C., Terzic A., Puceat M. Stem cell differentiation requires a paracrine pathway in the heart. FASEB J. 2002;16(12):1558-66. 59. Sachinidis A., Schwengberg S., Hippler-Altenburg R., Mariappan D., Kamisetti N., Seelig B., Berkessel A., Hescheler J. Identification of small signalling molecules promoting cardiac-specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cell Physiol Biochem. 2006;18(6):303-14. 60. Li T.S., Hayashi M., Ito H., Furutani A., Murata T., Matsuzaki M., Hamano K. Regeneration of infarcted myocardium by intramyocardial implantation of ex vivo transforming growth factor-beta-preprogrammed bone marrow stem cells. Circulation. 2005;111(19):2438-45. 61. Kato M., Kato Y., Nakamura T., Sugiyama Y. Efficient extraction by the liver governs overall elimination of hepatocyte growth factor in rats. J Pharmacol Exp Ther. 1999;290(1):373-9. 62. Ohno T., Yuge T., Kariyazono H., Igarashi H., Joh-o K., Kinugawa N., Kusuhara K., Hara T. Serum hepatocyte growth factor combined with vascular endothelial growth factor as a predictive indicator for the occurrence of coronary artery lesions in Kawasaki disease. Eur J Pediatr. 2002;161(2):10511. 63. Rahman S., Patel Y., Murray J., Patel K.V., Sumathipala R., Sobel M., Wijelath E.S. Novel hepatocyte growth factor (HGF) binding domains on fibronectin and vitronectin coordinate a distinct and amplified Met-integrin induced signalling pathway in endothelial cells. BMC Cell Biol. 2005;6(1):8. PMCID: 553973. 64. Suzuki H., Murakami M., Shoji M., Iso Y., Kondo T., Shibata M., Ezumi H., Hamazaki Y., Koba S., Katagiri T. Hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor in ischaemic heart disease. Coron Artery Dis. 2003;14(4):301-7. 65. Ono K., Matsumori A., Shioi T., Furukawa Y., Sasayama S. [Enhanced expression of hepatocyte growth factor/c-Met by myocardial ischemia and reperfusion in a rat model]. J Cardiol. 1998;31(3):184-5. 66. Matsumoto K., Nakamura T. Hepatocyte growth factor: renotropic role and potential therapeutics for renal diseases. Kidney Int. 2001;59(6):2023-38. 84 67. Ueda H., Nakamura T., Matsumoto K., Sawa Y., Matsuda H. A potential cardioprotective role of hepatocyte growth factor in myocardial infarction in rats. Cardiovasc Res. 2001;51(1):41-50. 68. Yasuda S., Goto Y., Baba T., Satoh T., Sumida H., Miyazaki S., Nonogi H. Enhanced secretion of cardiac hepatocyte growth factor from an infarct region is associated with less severe ventricular enlargement and improved cardiac function. J Am Coll Cardiol. 2000;36(1):115-21. 69. Kato N., Nemoto K., Nakanishi K., Morishita R., Kaneda Y., Uenoyama M., Ikeda T., Fujikawa K. Nonviral gene transfer of human hepatocyte growth factor improves streptozotocin-induced diabetic neuropathy in rats. Diabetes. 2005;54(3):846-54. 70. Sanada F., Taniyama Y., Azuma J., Iekushi K., Dosaka N., Yokoi T., Koibuchi N., Kusunoki H., Aizawa Y., Morishita R. Hepatocyte growth factor, but not vascular endothelial growth factor, attenuates angiotensin II-induced endothelial progenitor cell senescence. Hypertension. 2009;53(1):77-82. 71. Soeki T., Tamura Y., Shinohara H., Tanaka H., Bando K., Fukuda N. Serial changes in serum VEGF and HGF in patients with acute myocardial infarction. Cardiology. 2000;93(3):168-74. 72. Iwakura A., Fujita M., Kataoka K., Tambara K., Sakakibara Y., Komeda M., Tabata Y. Intramyocardial sustained delivery of basic fibroblast growth factor improves angiogenesis and ventricular function in a rat infarct model. Heart Vessels. 2003;18(2):93-9. 73. Auguste P., Javerzat S., Bikfalvi A. Regulation of vascular development by fibroblast growth factors. Cell Tissue Res. 2003;314(1):157-66. 74. Ornitz D.M., Itoh N. Fibroblast growth factors. Genome Biol. 2001;2(3):REVIEWS3005. PMCID: 138918. 75. Horowitz A., Tkachenko E., Simons M. Fibroblast growth factor-specific modulation of cellular response by syndecan-4. J Cell Biol. 2002;157(4):71525. PMCID: 2173870. 76. Powers C.J., McLeskey S.W., Wellstein A. Fibroblast growth factors, their receptors and signaling. Endocr Relat Cancer. 2000;7(3):165-97. 77. Khurana R., Simons M. Insights from angiogenesis trials using fibroblast growth factor for advanced arteriosclerotic disease. Trends Cardiovasc Med. 2003;13(3):116-22. 85 78. Detillieux K.A., Sheikh F., Kardami E., Cattini P.A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovasc Res. 2003;57(1):8-19. 79. House S.L., Bolte C., Zhou M., Doetschman T., Klevitsky R., Newman G., Schultz Jel J. Cardiac-specific overexpression of fibroblast growth factor-2 protects against myocardial dysfunction and infarction in a murine model of low-flow ischemia. Circulation. 2003;108(25):3140-8. 80. Palmen M., Daemen M.J., De Windt L.J., Willems J., Dassen W.R., Heeneman S., Zimmermann R., Van Bilsen M., Doevendans P.A. Fibroblast growth factor-1 improves cardiac functional recovery and enhances cell survival after ischemia and reperfusion: a fibroblast growth factor receptor, protein kinase C, and tyrosine kinase-dependent mechanism. J Am Coll Cardiol. 2004;44(5):1113-23. 81. Vatner S.F. FGF induces hypertrophy and angiogenesis in hibernating myocardium. Circ Res. 2005;96(7):705-7. 82. Boodhwani M., Voisine P., Ruel M., Sodha N.R., Feng J., Xu S.H., Bianchi C., Sellke F.W. Comparison of vascular endothelial growth factor and fibroblast growth factor-2 in a swine model of endothelial dysfunction. Eur J Cardiothorac Surg. 2008;33(4):645-50; discussion 251-2. PMCID: 2329802. 83. Song H., Kwon K., Lim S., Kang S.M., Ko Y.G., Xu Z., Chung J.H., Kim B.S., Lee H., Joung B., Park S., Choi D., Jang Y., Chung N.S., Yoo K.J., Hwang K.C. Transfection of mesenchymal stem cells with the FGF-2 gene improves their survival under hypoxic conditions. Mol Cells. 2005;19(3):4027. 84. Kardami E., Detillieux K., Ma X., Jiang Z., Santiago J.J., Jimenez S.K., Cattini P.A. Fibroblast growth factor-2 and cardioprotection. Heart Fail Rev. 2007;12(3-4):267-77. 85. Tamura K., Nakajima H., Rakue H., Sasame A., Naito Y., Nagai Y., Ibukiyama C. Elevated circulating levels of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor in patients with acute myocardial infarction. Jpn Circ J. 1999;63(5):357-61. 86. Heilmann C., Kostic C., Giannone B., Grawitz A.B., Armbruster W., Lutter G., Beyersdorf F., Gobel H. Improvement of contractility accompanies angiogenesis rather than arteriogenesis in chronic myocardial ischemia. Vascul Pharmacol. 2006;44(5):326-32. 86 87. Solomatina M.A., Plekhanova O.S., Men'shikova M.Y., Ratner E.I., Tkachuk V.A., Parfenova E.V. Urokinase increases the content and activity of matrix metalloproteinases 2 and 9 during in vivo constrictive arterial remodeling. Bull Exp Biol Med. 2005;139(3):283-6. 88. Prager G.W., Breuss J.M., Steurer S., Mihaly J., Binder B.R. Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces rapid prourokinase (pro-uPA) activation on the surface of endothelial cells. Blood. 2004;103(3):955-62. 89. Zhang M., Volpert O., Shi Y.H., Bouck N. Maspin is an angiogenesis inhibitor. Nat Med. 2000;6(2):196-9. 90. Koolwijk P., van Erck M.G., de Vree W.J., Vermeer M.A., Weich H.A., Hanemaaijer R., van Hinsbergh V.W. Cooperative effect of TNFalpha, bFGF, and VEGF on the formation of tubular structures of human microvascular endothelial cells in a fibrin matrix. Role of urokinase activity. J Cell Biol. 1996;132(6):1177-88. PMCID: 2120755. 91. Busso N., Masur S.K., Lazega D., Waxman S., Ossowski L. Induction of cell migration by pro-urokinase binding to its receptor: possible mechanism for signal transduction in human epithelial cells. J Cell Biol. 1994;126(1):259-70. PMCID: 2120093. 92. Schaper W., Ito W.D. Molecular mechanisms of coronary collateral vessel growth. Circ Res. 1996;79(5):911-9. 93. Nishiuma T., Sisson T.H., Subbotina N., Simon R.H. Localization of plasminogen activator activity within normal and injured lungs by in situ zymography. Am J Respir Cell Mol Biol. 2004;31(5):552-8. 94. Leschke M., Schoebel F.C., Mecklenbeck W., Stein D., Jax T.W., Muller-Gartner H.W., Strauer B.E. Long-term intermittent urokinase therapy in patients with end-stage coronary artery disease and refractory angina pectoris: a randomized dose-response trial J Am Coll Cardiol. 1996;27(3):575-84. 95. Hanahan D., Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 1996;86(3):353-64. 96. Dameron K.M., Volpert O.V., Tainsky M.A., Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Science. 1994;265(5178):1582-4. 97. Good D.J., Polverini P.J., Rastinejad F., Le Beau M.M., Lemons R.S., Frazier W.A., Bouck N.P. A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a 87 fragment of thrombospondin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87(17):6624-8. PMCID: 54589. 98. O'Reilly M.S., Holmgren L., Shing Y., Chen C., Rosenthal R.A., Moses M., Lane W.S., Cao Y., Sage E.H., Folkman J. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell. 1994;79(2):315-28. 99. Rehn M., Pihlajaniemi T. Alpha 1(XVIII), a collagen chain with frequent interruptions in the collagenous sequence, a distinct tissue distribution, and homology with type XV collagen. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91(10):4234-8. PMCID: 43759. 100. Brown K.J., Parish C.R. Histidine-rich glycoprotein and platelet factor 4 mask heparan sulfate proteoglycans recognized by acidic and basic fibroblast growth factor. Biochemistry. 1994;33(46):13918-27. 101. Boehm T., Folkman J., Browder T., O'Reilly M.S. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance. Nature. 1997;390(6658):404-7. 102. van Os R., Kamminga L.M., de Haan G. Stem cell assays: something old, something new, something borrowed. Stem Cells. 2004;22(7):1181-90. 103. Xu Q. Stem cells and transplant arteriosclerosis. Circ Res. 2008;102(9):1011-24. 104. Aicher A., Rentsch M., Sasaki K., Ellwart J.W., Fandrich F., Siebert R., Cooke J.P., Dimmeler S., Heeschen C. Nonbone marrow-derived circulating progenitor cells contribute to postnatal neovascularization following tissue ischemia. Circ Res. 2007;100(4):581-9. 105. Miranville A., Heeschen C., Sengenes C., Curat C.A., Busse R., Bouloumie A. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 2004;110(3):349-55. 106. Sengenes C., Miranville A., Maumus M., de Barros S., Busse R., Bouloumie A. Chemotaxis and differentiation of human adipose tissue CD34+/CD31- progenitor cells: role of stromal derived factor-1 released by adipose tissue capillary endothelial cells. Stem Cells. 2007;25(9):2269-76. 107. Hu Y., Davison F., Zhang Z., Xu Q. Endothelial replacement and angiogenesis in arteriosclerotic lesions of allografts are contributed by circulating progenitor cells. Circulation. 2003;108(25):3122-7. 88 108. Sen T., Aksu T. Endothelial progenitor cell and adhesion molecules determine the quality of the coronary collateral circulation/Endothelial progenitor cells (CD34+KDR+) and monocytes may provide the development of good coronary collaterals despite the vascular risk factors and extensive atherosclerosis. Anadolu Kardiyol Derg. 2012;12(5):447; author reply -8. 109. Kocaman S.A., Yalcin M.R., Yagci M., Sahinarslan A., Turkoglu S., Arslan U., Kursunluoglu N., Ozdemir M., Timurkaynak T., Cemri M., Abaci A., Boyaci B., Cengel A. Endothelial progenitor cells (CD34+KDR+) and monocytes may provide the development of good coronary collaterals despite the vascular risk factors and extensive atherosclerosis. Anadolu Kardiyol Derg. 2011;11(4):290-9. 110. Li Q., Wang Y. [Vascular progenitor cells and atherosclerosis]. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2008;36(12):1134-7. 111. Yang C., Zhang Z.H., Li Z.J., Yang R.C., Qian G.Q., Han Z.C. Enhancement of neovascularization with cord blood CD133+ cell-derived endothelial progenitor cell transplantation. Thromb Haemost. 2004;91(6):120212. 112. Schmeisser A., Garlichs C.D., Zhang H., Eskafi S., Graffy C., Ludwig J., Strasser R.H., Daniel W.G. Monocytes coexpress endothelial and macrophagocytic lineage markers and form cord-like structures in Matrigel under angiogenic conditions. Cardiovasc Res. 2001;49(3):671-80. 113. Fujiyama S., Amano K., Uehira K., Yoshida M., Nishiwaki Y., Nozawa Y., Jin D., Takai S., Miyazaki M., Egashira K., Imada T., Iwasaka T., Matsubara H. Bone marrow monocyte lineage cells adhere on injured endothelium in a monocyte chemoattractant protein-1-dependent manner and accelerate reendothelialization as endothelial progenitor cells. Circ Res. 2003;93(10):980-9. 114. Tepper O.M., Capla J.M., Galiano R.D., Ceradini D.J., Callaghan M.J., Kleinman M.E., Gurtner G.C. Adult vasculogenesis occurs through in situ recruitment, proliferation, and tubulization of circulating bone marrow-derived cells. Blood. 2005;105(3):1068-77. 115. Reyes M., Dudek A., Jahagirdar B., Koodie L., Marker P.H., Verfaillie C.M. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. J Clin Invest. 2002;109(3):337-46. PMCID: 150857. 89 116. Takahashi T., Kalka C., Masuda H., Chen D., Silver M., Kearney M., Magner M., Isner J.M., Asahara T. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 1999;5(4):434-8. 117. Kalka C., Masuda H., Takahashi T., Kalka-Moll W.M., Silver M., Kearney M., Li T., Isner J.M., Asahara T. Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(7):3422-7. PMCID: 16255. 118. Shintani S., Murohara T., Ikeda H., Ueno T., Honma T., Katoh A., Sasaki K., Shimada T., Oike Y., Imaizumi T. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation. 2001;103(23):2776-9. 119. Kawamoto A., Gwon H.C., Iwaguro H., Yamaguchi J.I., Uchida S., Masuda H., Silver M., Ma H., Kearney M., Isner J.M., Asahara T. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 2001;103(5):634-7. 120. Takeshita S., Zheng L.P., Brogi E., Kearney M., Pu L.Q., Bunting S., Ferrara N., Symes J.F., Isner J.M. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. J Clin Invest. 1994;93(2):662-70. PMCID: 293894. 121. Lolmede K., Campana L., Vezzoli M., Bosurgi L., Tonlorenzi R., Clementi E., Bianchi M.E., Cossu G., Manfredi A.A., Brunelli S., RovereQuerini P. Inflammatory and alternatively activated human macrophages attract vessel-associated stem cells, relying on separate HMGB1- and MMP-9dependent pathways. J Leukoc Biol. 2009;85(5):779-87. 122. Rohde E., Malischnik C., Thaler D., Maierhofer T., Linkesch W., Lanzer G., Guelly C., Strunk D. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 2006;24(2):357-67. 123. Heissig B., Hattori K., Dias S., Friedrich M., Ferris B., Hackett N.R., Crystal R.G., Besmer P., Lyden D., Moore M.A., Werb Z., Rafii S. Recruitment of stem and progenitor cells from the bone marrow niche requires MMP-9 mediated release of kit-ligand. Cell. 2002;109(5):625-37. PMCID: 2826110. 90 124. Abbott J.D., Huang Y., Liu D., Hickey R., Krause D.S., Giordano F.J. Stromal cell-derived factor-1alpha plays a critical role in stem cell recruitment to the heart after myocardial infarction but is not sufficient to induce homing in the absence of injury. Circulation. 2004;110(21):3300-5. 125. Dentelli P., Rosso A., Balsamo A., Colmenares Benedetto S., Zeoli A., Pegoraro M., Camussi G., Pegoraro L., Brizzi M.F. C-KIT, by interacting with the membrane-bound ligand, recruits endothelial progenitor cells to inflamed endothelium. Blood. 2007;109(10):4264-71. 126. Lataillade J.J., Domenech J., Le Bousse-Kerdiles M.C. Stromal cellderived factor-1 (SDF-1)\CXCR4 couple plays multiple roles on haematopoietic progenitors at the border between the old cytokine and new chemokine worlds: survival, cell cycling and trafficking. Eur Cytokine Netw. 2004;15(3):177-88. 127. Petit I., Jin D., Rafii S. The SDF-1-CXCR4 signaling pathway: a molecular hub modulating neo-angiogenesis. Trends Immunol. 2007;28(7):299-307. PMCID: 2952492. 128. Ceradini D.J., Kulkarni A.R., Callaghan M.J., Tepper O.M., Bastidas N., Kleinman M.E., Capla J.M., Galiano R.D., Levine J.P., Gurtner G.C. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nat Med. 2004;10(8):858-64. 129. de Boer H.C., Verseyden C., Ulfman L.H., Zwaginga J.J., Bot I., Biessen E.A., Rabelink T.J., van Zonneveld A.J. Fibrin and activated platelets cooperatively guide stem cells to a vascular injury and promote differentiation towards an endothelial cell phenotype. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006;26(7):1653-9. 130. Langer H., May A.E., Daub K., Heinzmann U., Lang P., Schumm M., Vestweber D., Massberg S., Schonberger T., Pfisterer I., Hatzopoulos A.K., Gawaz M. Adherent platelets recruit and induce differentiation of murine embryonic endothelial progenitor cells to mature endothelial cells in vitro. Circ Res. 2006;98(2):e2-10. 131. Lev E.I., Estrov Z., Aboulfatova K., Harris D., Granada J.F., Alviar C., Kleiman N.S., Dong J.F. Potential role of activated platelets in homing of human endothelial progenitor cells to subendothelial matrix. Thromb Haemost. 2006;96(4):498-504. 91 132. Zeng L., Xiao Q., Margariti A., Zhang Z., Zampetaki A., Patel S., Capogrossi M.C., Hu Y., Xu Q. HDAC3 is crucial in shear- and VEGFinduced stem cell differentiation toward endothelial cells. J Cell Biol. 2006;174(7):1059-69. PMCID: 2064396. 133. Sen S., McDonald S.P., Coates P.T., Bonder C.S. Endothelial progenitor cells: novel biomarker and promising cell therapy for cardiovascular disease. Clin Sci (Lond). 2011;120(7):263-83. 134. Руда М.М., Арефьева Т.И., Соколова А.В., Шестакова М.В., Карпов Ю.А., Парфенова Е.В. Циркулирующие предшественники эндотелиальных клеток при нарушенном углеводном обмене у больных ишемической болезнью сердца. Кардиология. 2010;1:13-20. 135. Талицкий К.А., Булкина О.С., Арефьева Т.И., Воробьева О.Н., Левицкий И.В., Федорович А.А., Макаревич П.И., Парфенова Е.В., Карпов Ю.А. Эффективность терапевтического ангиогенеза у больных с хронической ишемией нижних конечностей. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011;VI(3):1-10. 136. Сергиенко И.В., Масенко В.П., Семенова А.Е., Габрусенко С.А., Наумов В.Г., Беленков Ю.Н. Влияние реваскуляризации миокарда на динамику факторов ангиогенеза у больных ишемической болезнью сердца. Кардиология. 2009(12):4-10. 137. Umemura T., Higashi Y., Nishioka K. Relationship Between CD34+AC133+CD45low Endothelial Progenitor Cells and Cardiovascular Risk Factors Hypertension. 2007:130. 138. Vasa M., Fichtlscherer S., Aicher A., Adler K., Urbich C., Martin H., Zeiher A.M., Dimmeler S. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res. 2001;89(1):E1-7. 139. Ozuyaman B., Ebner P., Niesler U., Ziemann J., Kleinbongard P., Jax T., Godecke A., Kelm M., Kalka C. Nitric oxide differentially regulates proliferation and mobilization of endothelial progenitor cells but not of hematopoietic stem cells. Thromb Haemost. 2005;94(4):770-2. 140. Umemura T., Higashi Y. Endothelial progenitor cells: therapeutic target for cardiovascular diseases. J Pharmacol Sci. 2008;108(1):1-6. 141. Thum T., Hoeber S., Froese S., Klink I., Stichtenoth D.O., Galuppo P., Jakob M., Tsikas D., Anker S.D., Poole-Wilson P.A., Borlak J., Ertl G., 92 Bauersachs J. Age-dependent impairment of endothelial progenitor cells is corrected by growth-hormone-mediated increase of insulin-like growth-factor1. Circ Res. 2007;100(3):434-43. 142. Scheubel R.J., Zorn H., Silber R.E., Kuss O., Morawietz H., Holtz J., Simm A. Age-dependent depression in circulating endothelial progenitor cells in patients undergoing coronary artery bypass grafting. J Am Coll Cardiol. 2003;42(12):2073-80. 143. Beausejour C. Bone marrow-derived cells: the influence of aging and cellular senescence. Handb Exp Pharmacol. 2007(180):67-88. 144. Masuda H., Kalka C., Takahashi T., Yoshida M., Wada M., Kobori M., Itoh R., Iwaguro H., Eguchi M., Iwami Y., Tanaka R., Nakagawa Y., Sugimoto A., Ninomiya S., Hayashi S., Kato S., Asahara T. Estrogen-mediated endothelial progenitor cell biology and kinetics for physiological postnatal vasculogenesis. Circ Res. 2007;101(6):598-606. 145. Kondo T., Hayashi M., Takeshita K., Numaguchi Y., Kobayashi K., Iino S., Inden Y., Murohara T. Smoking cessation rapidly increases circulating progenitor cells in peripheral blood in chronic smokers. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24(8):1442-7. 146. Michaud S.E., Dussault S., Haddad P., Groleau J., Rivard A. Circulating endothelial progenitor cells from healthy smokers exhibit impaired functional activities. Atherosclerosis. 2006;187(2):423-32. 147. Laufs U., Werner N., Link A., Endres M., Wassmann S., Jurgens K., Miche E., Bohm M., Nickenig G. Physical training increases endothelial progenitor cells, inhibits neointima formation, and enhances angiogenesis. Circulation. 2004;109(2):220-6. 148. Adams V., Lenk K., Linke A., Lenz D., Erbs S., Sandri M., Tarnok A., Gielen S., Emmrich F., Schuler G., Hambrecht R. Increase of circulating endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease after exercise-induced ischemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24(4):684-90. 149. Imanishi T., Hano T., Nishio I. Angiotensin II accelerates endothelial progenitor cell senescence through induction of oxidative stress. J Hypertens. 2005;23(1):97-104. 150. Werner N., Kosiol S., Schiegl T., Ahlers P., Walenta K., Link A., Bohm M., Nickenig G. Circulating endothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes. N Engl J Med. 2005;353(10):999-1007. 93 151. Tepper O.M., Galiano R.D., Capla J.M., Kalka C., Gagne P.J., Jacobowitz G.R., Levine J.P., Gurtner G.C. Human endothelial progenitor cells from type II diabetics exhibit impaired proliferation, adhesion, and incorporation into vascular structures. Circulation. 2002;106(22):2781-6. 152. Krankel N., Adams V., Linke A., Gielen S., Erbs S., Lenk K., Schuler G., Hambrecht R. Hyperglycemia reduces survival and impairs function of circulating blood-derived progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(4):698-703. 153. Zhou B., Ma F.X., Liu P.X., Fang Z.H., Wang S.L., Han Z.B., Poon M.C., Han Z.C. Impaired therapeutic vasculogenesis by transplantation of OxLDL-treated endothelial progenitor cells. J Lipid Res. 2007;48(3):518-27. 154. Llevadot J., Murasawa S., Kureishi Y., Uchida S., Masuda H., Kawamoto A., Walsh K., Isner J.M., Asahara T. HMG-CoA reductase inhibitor mobilizes bone marrow--derived endothelial progenitor cells. J Clin Invest. 2001;108(3):399-405. PMCID: 209363. 155. van Oostrom O., Nieuwdorp M., Westerweel P.E., Hoefer I.E., Basser R., Stroes E.S., Verhaar M.C. Reconstituted HDL increases circulating endothelial progenitor cells in patients with type 2 diabetes. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007;27(8):1864-5. 156. Fadini G.P., de Kreutzenberg S.V., Coracina A., Baesso I., Agostini C., Tiengo A., Avogaro A. Circulating CD34+ cells, metabolic syndrome, and cardiovascular risk. Eur Heart J. 2006;27(18):2247-55. 157. Redondo S., Hristov M., Gumbel D., Tejerina T., Weber C. Biphasic effect of pioglitazone on isolated human endothelial progenitor cells: involvement of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and transforming growth factor-beta1. Thromb Haemost. 2007;97(6):979-87. 158. Khakoo A.Y., Finkel T. Endothelial progenitor cells. Annu Rev Med. 2005;56:79-101. 159. Linke A., Erbs S., Hambrecht R. Exercise and the coronary circulationalterations and adaptations in coronary artery disease. Prog Cardiovasc Dis. 2006;48(4):270-84. 160. Ahmadi H., Baharvand H., Ashtiani S.K., Soleimani M., Sadeghian H., Ardekani J.M., Mehrjerdi N.Z., Kouhkan A., Namiri M., Madani-Civi M., Fattahi F., Shahverdi A., Dizaji A.V. Safety analysis and improved cardiac function following local autologous transplantation of CD133(+) enriched bone 94 marrow cells after myocardial infarction. Curr Neurovasc Res. 2007;4(3):15360. 161. Balogh L., Czuriga I., Hunyadi J., Galuska L., Kristof E., Edes I. [Effects of autologous bone marrow derived CD34+ stem cells on the left ventricular function following myocardial infarction]. Orv Hetil. 2007;148(6):243-9. 162. Bartunek J., Vanderheyden M., Vandekerckhove B., Mansour S., De Bruyne B., De Bondt P., Van Haute I., Lootens N., Heyndrickx G., Wijns W. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 2005;112(9 Suppl):I178-83. 163. Boyle A.J., Whitbourn R., Schlicht S., Krum H., Kocher A., Nandurkar H., Bergmann S., Daniell M., O'Day J., Skerrett D., Haylock D., Gilbert R.E., Itescu S. Intra-coronary high-dose CD34+ stem cells in patients with chronic ischemic heart disease: a 12-month follow-up. Int J Cardiol. 2006;109(1):21-7. 164. Erbs S., Linke A., Adams V., Lenk K., Thiele H., Diederich K.W., Emmrich F., Kluge R., Kendziorra K., Sabri O., Schuler G., Hambrecht R. Transplantation of blood-derived progenitor cells after recanalization of chronic coronary artery occlusion: first randomized and placebo-controlled study. Circ Res. 2005;97(8):756-62. 165. Li Z.Q., Zhang M., Jing Y.Z., Zhang W.W., Liu Y., Cui L.J., Yuan L., Liu X.Z., Yu X., Hu T.S. The clinical study of autologous peripheral blood stem cell transplantation by intracoronary infusion in patients with acute myocardial infarction (AMI). Int J Cardiol. 2007;115(1):52-6. 166. Losordo D.W., Schatz R.A., White C.J., Udelson J.E., Veereshwarayya V., Durgin M., Poh K.K., Weinstein R., Kearney M., Chaudhry M., Burg A., Eaton L., Heyd L., Thorne T., Shturman L., Hoffmeister P., Story K., Zak V., Dowling D., Traverse J.H., Olson R.E., Flanagan J., Sodano D., Murayama T., Kawamoto A., Kusano K.F., Wollins J., Welt F., Shah P., Soukas P., Asahara T., Henry T.D. Intramyocardial transplantation of autologous CD34+ stem cells for intractable angina: a phase I/IIa double-blind, randomized controlled trial Circulation. 2007;115(25):3165-72. 167. Stamm C., Kleine H.D., Choi Y.H., Dunkelmann S., Lauffs J.A., Lorenzen B., David A., Liebold A., Nienaber C., Zurakowski D., Freund M., Steinhoff G. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and 95 coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease: safety and efficacy studies. J Thorac Cardiovasc Surg. 2007;133(3):717-25. 168. Stamm C., Westphal B., Kleine H.D., Petzsch M., Kittner C., Klinge H., Schumichen C., Nienaber C.A., Freund M., Steinhoff G. Autologous bonemarrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet. 2003;361(9351):45-6. 169. Heiss C., Keymel S., Niesler U., Ziemann J., Kelm M., Kalka C. Impaired progenitor cell activity in age-related endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 2005;45(9):1441-8. 170. Ii M., Takenaka H., Asai J., Ibusuki K., Mizukami Y., Maruyama K., Yoon Y.S., Wecker A., Luedemann C., Eaton E., Silver M., Thorne T., Losordo D.W. Endothelial progenitor thrombospondin-1 mediates diabetesinduced delay in reendothelialization following arterial injury. Circ Res. 2006;98(5):697-704. 171. Imanishi T., Moriwaki C., Hano T., Nishio I. Endothelial progenitor cell senescence is accelerated in both experimental hypertensive rats and patients with essential hypertension. J Hypertens. 2005;23(10):1831-7. 172. Asahara T., Takahashi T., Masuda H., Kalka C., Chen D., Iwaguro H., Inai Y., Silver M., Isner J.M. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 1999;18(14):3964-72. PMCID: 1171472. 173. Murohara T., Ikeda H., Duan J., Shintani S., Sasaki K., Eguchi H., Onitsuka I., Matsui K., Imaizumi T. Transplanted cord blood-derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization. J Clin Invest. 2000;105(11):1527-36. PMCID: 300847. 174. Levenberg S., Golub J.S., Amit M., Itskovitz-Eldor J., Langer R. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(7):4391-6. PMCID: 123658. 175. Beeres S.L., Bax J.J., Dibbets-Schneider P., Stokkel M.P., Fibbe W.E., van der Wall E.E., Schalij M.J., Atsma D.E. Intramyocardial injection of autologous bone marrow mononuclear cells in patients with chronic myocardial infarction and severe left ventricular dysfunction. Am J Cardiol. 2007;100(7):1094-8. 176. Kawamoto A., Tkebuchava T., Yamaguchi J., Nishimura H., Yoon Y.S., Milliken C., Uchida S., Masuo O., Iwaguro H., Ma H., Hanley A., Silver M., 96 Kearney M., Losordo D.W., Isner J.M., Asahara T. Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia. Circulation. 2003;107(3):461-8. 177. Perin E.C., Dohmann H.F., Borojevic R., Silva S.A., Sousa A.L., Mesquita C.T., Rossi M.I., Carvalho A.C., Dutra H.S., Dohmann H.J., Silva G.V., Belem L., Vivacqua R., Rangel F.O., Esporcatte R., Geng Y.J., Vaughn W.K., Assad J.A., Mesquita E.T., Willerson J.T. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 2003;107(18):2294-302. 178. George J., Afek A., Abashidze A., Shmilovich H., Deutsch V., Kopolovich J., Miller H., Keren G. Transfer of endothelial progenitor and bone marrow cells influences atherosclerotic plaque size and composition in apolipoprotein E knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(12):2636-41. 179. Kawamoto A., Murayama T., Kusano K., Ii M., Tkebuchava T., Shintani S., Iwakura A., Johnson I., von Samson P., Hanley A., Gavin M., Curry C., Silver M., Ma H., Kearney M., Losordo D.W. Synergistic effect of bone marrow mobilization and vascular endothelial growth factor-2 gene therapy in myocardial ischemia. Circulation. 2004;110(11):1398-405. 180. Iwaguro H., Yamaguchi J., Kalka C., Murasawa S., Masuda H., Hayashi S., Silver M., Li T., Isner J.M., Asahara T. Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation. 2002;105(6):732-8. 181. Cho H.J., Youn S.W., Cheon S.I., Kim T.Y., Hur J., Zhang S.Y., Lee S.P., Park K.W., Lee M.M., Choi Y.S., Park Y.B., Kim H.S. Regulation of endothelial cell and endothelial progenitor cell survival and vasculogenesis by integrin-linked kinase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(6):1154-60. 182. Choi J.H., Hur J., Yoon C.H., Kim J.H., Lee C.S., Youn S.W., Oh I.Y., Skurk C., Murohara T., Park Y.B., Walsh K., Kim H.S. Augmentation of therapeutic angiogenesis using genetically modified human endothelial progenitor cells with altered glycogen synthase kinase-3beta activity. J Biol Chem. 2004;279(47):49430-8. 183. Griese D.P., Achatz S., Batzlsperger C.A., Strauch U.G., Grumbeck B., Weil J., Riegger G.A. Vascular gene delivery of anticoagulants by 97 transplantation of retrovirally-transduced endothelial progenitor cells. Cardiovasc Res. 2003;58(2):469-77. 184. Jiang M., Wang B., Wang C., He B., Fan H., Guo T.B., Shao Q., Gao L., Liu Y. Angiogenesis by transplantation of HIF-1 alpha modified EPCs into ischemic limbs. J Cell Biochem. 2008;103(1):321-34. 185. Kong D., Melo L.G., Mangi A.A., Zhang L., Lopez-Ilasaca M., Perrella M.A., Liew C.C., Pratt R.E., Dzau V.J. Enhanced inhibition of neointimal hyperplasia by genetically engineered endothelial progenitor cells. Circulation. 2004;109(14):1769-75. 186. Murasawa S., Llevadot J., Silver M., Isner J.M., Losordo D.W., Asahara T. Constitutive human telomerase reverse transcriptase expression enhances regenerative properties of endothelial progenitor cells. Circulation. 2002;106(9):1133-9. 187. Nagaya N., Kangawa K., Kanda M., Uematsu M., Horio T., Fukuyama N., Hino J., Harada-Shiba M., Okumura H., Tabata Y., Mochizuki N., Chiba Y., Nishioka K., Miyatake K., Asahara T., Hara H., Mori H. Hybrid cell-gene therapy for pulmonary hypertension based on phagocytosing action of endothelial progenitor cells. Circulation. 2003;108(7):889-95. 188. Khoo C.M., Tan M.L., Wu Y., Wai D.C., Subramaniam T., Tai E.S., Lee J. Prevalence and control of hypercholesterolaemia as defined by NCEPATPIII guidelines and predictors of LDL-C goal attainment in a multi-ethnic Asian population. Ann Acad Med Singapore. 2013;42(8):379-87. 189. Gibbons R.J., Abrams J., Chatterjee K., Daley J., Deedwania P.C., Douglas J.S., Ferguson T.B., Jr., Fihn S.D., Fraker T.D., Jr., Gardin J.M., O'Rourke R.A., Pasternak R.C., Williams S.V. ACC/AHA 2002 guideline update for the management of patients with chronic stable angina--summary article: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines (Committee on the Management of Patients With Chronic Stable Angina). J Am Coll Cardiol. 2003;41(1):15968. 190. Ballantyne C.M. Low-density lipoproteins and risk for coronary artery disease. Am J Cardiol. 1998;82(9A):3Q-12Q. 191. Беленков Ю.Н., Сергиенко И.В., Лякишев А.А., Кухарчук В.В. Статины в современной кардиологической практике. Монография.2007. 98 192. BlankenhornD.H., AzenS.P., KramschD.M., MackW.J., CashinHemphillL., HodisH.N., DeBoerL.W., MahrerP.R., MastellerM.J., VailasL.I., AlaupovicP., HirschL.J. Coronaryangiographicchangeswithlovastatintherapy. The Monitored Atherosclerosis Regression Study (MARS). Ann Intern Med. 1993;119(10):969-76. 193. Herd J.A., West M.S., Ballantyne C., Farmer J., Gotto A.M., Jr. Baseline characteristics of subjects in the Lipoprotein and Coronary Atherosclerosis Study (LCAS) with fluvastatin. Am J Cardiol. 1994;73(14):42D-9D. 194. Jukema J.W., Bruschke A.V., van Boven A.J., Reiber J.H., Bal E.T., Zwinderman A.H., Jansen H., Boerma G.J., van Rappard F.M., Lie K.I., et al Effects of lipid lowering by pravastatin on progression and regression of coronary artery disease in symptomatic men with normal to moderately elevated serum cholesterol levels. The Regression Growth Evaluation Statin Study (REGRESS). Circulation. 1995;91(10):2528-40. 195. Waters D., Higginson L., Gladstone P., Kimball B., Le May M., Boccuzzi S.J., Lesperance J. Effects of monotherapy with an HMG-CoA reductase inhibitor on the progression of coronary atherosclerosis as assessed by serial quantitative arteriography. The Canadian Coronary Atherosclerosis Intervention TrialCirculation. 1994;89(3):959-68. 196. Nissen S.E., Nicholls S.J., Sipahi I., Libby P., Raichlen J.S., Ballantyne C.M., Davignon J., Erbel R., Fruchart J.C., Tardif J.C., Schoenhagen P., Crowe T., Cain V., Wolski K., Goormastic M., Tuzcu E.M. Effect of very highintensity statin therapy on regression of coronary atherosclerosis: the ASTEROID trial JAMA. 2006;295(13):1556-65. 197. Gerrah R., Fogel M., Gilon D. Aspirin decreases vascular endothelial growth factor release during myocardial ischemia. Int J Cardiol. 2004;94(1):25-9. 198. Miura S., Saku K. Regulation of angiogenesis and angiogenic factors by cardiovascular medications. Curr Pharm Des. 2007;13(20):2113-7. 199. Kolodgie F.D., Narula J., Yuan C., Burke A.P., Finn A.V., Virmani R. Elimination of neoangiogenesis for plaque stabilization: is there a role for local drug therapy? J Am Coll Cardiol. 2007;49(21):2093-101. 200. Doyle B., Caplice N. Plaque neovascularization and antiangiogenic therapy for atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 2007;49(21):2073-80. 99 201. Jain R.K., Finn A.V., Kolodgie F.D., Gold H.K., Virmani R. Antiangiogenic therapy for normalization of atherosclerotic plaque vasculature: a potential strategy for plaque stabilization. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2007;4(9):491-502. 202. Eisen A., Leshem-Lev D., Yavin H., Orvin K., Mager A., Rechavia E., Bental T., Dadush O., Battler A., Kornowski R., Lev E.I. Effect of High Dose Statin Pretreatment on Endothelial Progenitor Cells After Percutaneous Coronary Intervention (HIPOCRATES Study). Cardiovasc Drugs Ther. 2015. 203. Aoki J., Kozuma K., Tanabe K., Tanimoto S., Nakajima Y., Yahagi K., Hashimoto T., Isshiki T., Hara K. Effect of olmesartan on the levels of circulating endothelial progenitor cell after drug-eluting stent implantation in patients receiving statin therapy. J Cardiol. 2014;64(6):435-40. 204. Wu V.C., Young G.H., Huang P.H., Lo S.C., Wang K.C., Sun C.Y., Liang C.J., Huang T.M., Chen J.H., Chang F.C., Chen Y.L., Kuo Y.S., Chen J.B., Chen J.W., Chen Y.M., Ko W.J., Wu K.D. In acute kidney injury, indoxyl sulfate impairs human endothelial progenitor cells: modulation by statin. Angiogenesis. 2013;16(3):609-24. 205. Leone A.M., Rutella S., Giannico M.B., Perfetti M., Zaccone V., Brugaletta S., Garramone B., Niccoli G., Porto I., Liuzzo G., Biasucci L.M., Bellesi S., Galiuto L., Leone G., Rebuzzi A.G., Crea F. Effect of intensive vs standard statin therapy on endothelial progenitor cells and left ventricular function in patients with acute myocardial infarction: Statins for regeneration after acute myocardial infarction and PCI (STRAP) trial Int J Cardiol. 2008;130(3):457-62. 206. Hristov M., Fach C., Becker C., Heussen N., Liehn E.A., Blindt R., Hanrath P., Weber C. Reduced numbers of circulating endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease associated with long-term statin treatment. Atherosclerosis. 2007;192(2):413-20. 207. Landmesser U., Engberding N., Bahlmann F.H., Schaefer A., Wiencke A., Heineke A., Spiekermann S., Hilfiker-Kleiner D., Templin C., Kotlarz D., Mueller M., Fuchs M., Hornig B., Haller H., Drexler H. Statin-induced improvement of endothelial progenitor cell mobilization, myocardial neovascularization, left ventricular function, and survival after experimental myocardial infarction requires endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 2004;110(14):1933-9. 100 208. Rupp S., Badorff C., Koyanagi M., Urbich C., Fichtlscherer S., Aicher A., Zeiher A.M., Dimmeler S. Statin therapy in patients with coronary artery disease improves the impaired endothelial progenitor cell differentiation into cardiomyogenic cells. Basic Res Cardiol. 2004;99(1):61-8. 209. Walter D.H., Rittig K., Bahlmann F.H., Kirchmair R., Silver M., Murayama T., Nishimura H., Losordo D.W., Asahara T., Isner J.M. Statin therapy accelerates reendothelialization: a novel effect involving mobilization and incorporation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Circulation. 2002;105(25):3017-24. 210. Peichev M., Naiyer A.J., Pereira D., Zhu Z., Lane W.J., Williams M., Oz M.C., Hicklin D.J., Witte L., Moore M.A., Rafii S. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors. Blood. 2000;95(3):952-8. 211. Trape J., Buxo J., de Olaguer J.P. Serum concentrations of vascular endothelial growth factor in advanced non-small cell lung cancer. Clin Chem. 2003;49(3):523-5. 212. Forsythe J.A., Jiang B.H., Iyer N.V., Agani F., Leung S.W., Koos R.D., Semenza G.L. Activation of vascular endothelial growth factor gene transcription by hypoxia-inducible factor 1. Mol Cell Biol. 1996;16(9):460413. PMCID: 231459. 213. Frick M., Dulak J., Cisowski J., Jozkowicz A., Zwick R., Alber H., Dichtl W., Schwarzacher S.P., Pachinger O., Weidinger F. Statins differentially regulate vascular endothelial growth factor synthesis in endothelial and vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 2003;170(2):229-36. 214. Li T.S., Takahashi M., Suzuki R., Kobayashi T., Ito H., Mikamo A., Hamano K. Pravastatin improves remodeling and cardiac function after myocardial infarction by an antiinflammatory mechanism rather than by the induction of angiogenesis. Ann Thorac Surg. 2006;81(6):2217-25. 215. Boodhwani M., Nakai Y., Voisine P., Feng J., Li J., Mieno S., Ramlawi B., Bianchi C., Laham R., Sellke F.W. High-dose atorvastatin improves hypercholesterolemic coronary endothelial dysfunction without improving the angiogenic response. Circulation. 2006;114(1 Suppl):I402-8. 216. Sagara N., Kawaji T., Takano A., Inomata Y., Inatani M., Fukushima M., Tanihara H. Effect of pitavastatin on experimental choroidal neovascularization in rats. Exp Eye Res. 2007;84(6):1074-80. 101 217. Yamada K., Sakurai E., Itaya M., Yamasaki S., Ogura Y. Inhibition of laser-induced choroidal neovascularization by atorvastatin by downregulation of monocyte chemotactic protein-1 synthesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48(4):1839-43. 218. Boodhwani M., Mieno S., Feng J., Sodha N.R., Clements R.T., Xu S.H., Sellke F.W. Atorvastatin impairs the myocardial angiogenic response to chronic ischemia in normocholesterolemic swine. J Thorac Cardiovasc Surg. 2008;135(1):117-22. 219. Giurgea A.G., Margeta C., Maca T., Rezaie-Majd A., Bucek R.A., Manavi M., Afarideh R., Minar E., Baghestanian M. Simvastatin reduces serum level of vascular endothelial growth factor in hypercholesterolemic patients. J Cardiovasc Pharmacol. 2006;47(1):30-6. 220. Alber H.F., Dulak J., Frick M., Dichtl W., Schwarzacher S.P., Pachinger O., Weidinger F. Atorvastatin decreases vascular endothelial growth factor in patients with coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 2002;39(12):1951-5. 221. Boodhwani M., Mieno S., Voisine P., Feng J., Sodha N., Li J., Sellke F.W. High-dose atorvastatin is associated with impaired myocardial angiogenesis in response to vascular endothelial growth factor in hypercholesterolemic swine. J Thorac Cardiovasc Surg. 2006;132(6):1299-306. 222. Voisine P., Bianchi C., Ruel M., Malik T., Rosinberg A., Feng J., Khan T.A., Xu S.H., Sandmeyer J., Laham R.J., Sellke F.W. Inhibition of the cardiac angiogenic response to exogenous vascular endothelial growth factor. Surgery. 2004;136(2):407-15. 223. Kullo I.J., Edwards W.D., Schwartz R.S. Vulnerable plaque: pathobiology and clinical implications. Ann Intern Med. 1998;129(12):105060. 224. Henrich D., Seebach C., Wilhelm K., Marzi I. High dosage of simvastatin reduces TNF-alpha-induced apoptosis of endothelial progenitor cells but fails to prevent apoptosis induced by IL-1beta in vitro. J Surg Res. 2007;142(1):13-9. 225. Psaltis P.J., Simari R.D. Vascular Wall Progenitor Cells in Health and Disease. Circ Res. 2015;116(8):1392-412. 226. Ostad M.A., Eggeling S., Tschentscher P., Schwedhelm E., Boger R., Wenzel P., Meinertz T., Munzel T., Warnholtz A. Flow-mediated dilation in patients with coronary artery disease is enhanced by high dose atorvastatin 102 compared to combined low dose atorvastatin and ezetimibe: results of the CEZAR study. Atherosclerosis. 2009;205(1):227-32. 227. Ye H., He F., Fei X., Lou Y., Wang S., Yang R., Hu Y., Chen X. Highdose atorvastatin reloading before percutaneous coronary intervention increased circulating endothelial progenitor cells and reduced inflammatory cytokine expression during the perioperative period. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2014;19(3):290-5. 228. Banerjee S., Abu Fadel M., Sarode R., Terada L., Moritz T., Luo P., Hastings J., Brilakis E.S., Reda D. Plaque regression and progenitor cell mobilization with intensive lipid elimination regimen (PREMIER) trial design. J Clin Apher. 2014;29(2):97-106. 229. Hibbert B., Simard T., Ramirez F.D., Pourdjabbar A., Raizman J.E., Maze R., Wilson K.R., Hawken S., O'Brien E.R. The effect of statins on circulating endothelial progenitor cells in humans: a systematic review. J Cardiovasc Pharmacol. 2013;62(5):491-6. 230. Di Sciascio G., Patti G., Pasceri V., Gaspardone A., Colonna G., Montinaro A. Efficacy of atorvastatin reload in patients on chronic statin therapy undergoing percutaneous coronary intervention: results of the ARMYDA-RECAPTURE (Atorvastatin for Reduction of Myocardial Damage During Angioplasty) Randomized Trial J Am Coll Cardiol. 2009;54(6):558-65. 231. Waters D.D., Guyton J.R., Herrington D.M., McGowan M.P., Wenger N.K., Shear C. Treating to New Targets (TNT) Study: does lowering lowdensity lipoprotein cholesterol levels below currently recommended guidelines yield incremental clinical benefit? Am J Cardiol. 2004;93(2):154-8. 232. Pedersen T.R., Faergeman O., Kastelein J.J., Olsson A.G., Tikkanen M.J., Holme I., Larsen M.L., Bendiksen F.S., Lindahl C., Szarek M., Tsai J. High-dose atorvastatin vs usual-dose simvastatin for secondary prevention after myocardial infarction: the IDEAL study: a randomized controlled trial JAMA. 2005;294(19):2437-45. 233. Fadini G.P., Rigato M., Boscari F., Cappellari R., Menegazzo L., Pilutti C., Iori E., Marescotti M., Plebani M., Albiero M., Avogaro A. Short-term statin discontinuation increases endothelial progenitor cells without inflammatory rebound in type 2 diabetic patients. Vascul Pharmacol. 2014. 103 234. Blum A. HMG-CoA reductase inhibitors (statins), inflammation, and endothelial progenitor cells-New mechanistic insights of atherosclerosis. Biofactors. 2014;40(3):295-302. 235. Antonio N., Fernandes R., Soares A., Soares F., Lopes A., Carvalheiro T., Paiva A., Pego G.M., Providencia L.A., Goncalves L., Ribeiro C.F. Impact of prior chronic statin therapy and high-intensity statin therapy at discharge on circulating endothelial progenitor cell levels in patients with acute myocardial infarction: a prospective observational study. Eur J Clin Pharmacol. 2014;70(10):1181-93. 236. Pesaro A.E., Serrano C.V., Jr., Katz M., Marti L., Fernandes J.L., Parra P.R., Campos A.H. Increasing doses of simvastatin versus combined ezetimibe/simvastatin: effect on circulating endothelial progenitor cells. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2013;18(5):447-52. 104
